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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

k 2 164 584 kN´umero de solicitud: 200000323 kInt. Cl. : A61K 31/352

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˜ ESPANA

A61K 35/78 A61P 35/00 A61P 25/00

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SOLICITUD DE PATENTE

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71 Solicitante/s:

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72 Inventor/es: Guzm´ an Pastor, Manuel;

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74 Agente: No consta

22 Fecha de presentaci´ on: 11.02.2000

43 Fecha de publicaci´ on de la solicitud: 16.02.2002

43 Fecha de publicaci´ on del folleto de la solicitud:

16.02.2002

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UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID Rectorado. Avenida de Seneca, 2 28040 Madrid, ES

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S´ anchez Garc´ıa, Cristina y Galve Roperh, Ismael

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k kResumen:

54 T´ıtulo: Terapia con cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales. 57

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Terapia con cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales. La terapia con cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales consiste en la administraci´on (intracraneal o sist´emica) de cannabinoides (naturales o sint´eticos) a mam´ıferos (humanos o no humanos) portadores de tumores cerebrales. Los cannabinoides conducen, mediante la activaci´on de sus receptores espec´ıficos, a la muerte selectiva de las c´elulas transformadas. Se consigue as´ı la regresi´ on o erradicaci´on de tumores cerebrales sin efectos colaterales significativos.

Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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DESCRIPCION Terapia con cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales. Campo t´ ecnico de la invenci´ on La presente invenci´on se encuadra en el campo de la terapia de tumores cerebrales. Objeto de la invenci´ on La presente invenci´on, seg´ un se recoge en esta memoria descriptiva, se refiere a la utilizaci´ on terap´eutica de los cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales. Las terapias utilizadas hoy en d´ıa para el tratamiento de estos tumores (cirug´ıa, radioterapia, quimioterapia, inmunoterapia, terapia g´enica) suelen ser ineficaces o a lo sumo paliativas. La invenci´ on supone una aproximaci´ on t´ecnicamente simple, carente de efectos colaterales notorios y altamente eficaz para el tratamiento de tumores cerebrales, incluidos los m´as malignos (glioblastomas). Antecedentes Dentro de los tumores cerebrales que afectan a los seres humanos, los glioblastomas son los m´as frecuentes (1 por 50.000 personas y a˜ no), malignos (mortalidad cercana al 100 %) y de evoluci´on m´as r´apida (esperanza de vida de semanas/meses tras su diagn´ ostico). Hoy en d´ıa, el tratamiento de los glioblastomas suele ser ineficaz o meramente paliativo, e implica t´ecnicas tales como cirug´ıa, radioterapia, quimioterapia e inmunoterapia (Louis, D.N. & Gusella, J.F., Trends Genet. 11, 412-415, 1995; Avgeropoulos, N.G. & Batchelor, T.T., Oncologist 4, 209-224, 1999). Adem´as, la terapia g´enica ha comenzado a ser empleada como tratamiento experimental de los glioblastomas, aunque hasta ahora ha proporcionado escasos resultados positivos (Martuza, R.L., Nature Med. 3, 1323, 1997). El ya de por s´ı poco probable ´exito de estas aproximaciones terap´euticas suele adem´as verse complicado por factores como el r´apido crecimiento, la notoria heterogeneidad, el alto nivel de infiltraci´ on y la extrema resistencia a quimioterapia que exhiben los glioblastomas (Maintz, D. et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 56, 1098-1104, 1997; Mason, W., Louis, D.N. & Cairncross, J.G., J. Clin. Oncol. 15, 3423-3426; 1997; Martuza, op. cit.; Avgeropoulos & Batchelor, op. cit.). Parece claro por tanto que es altamente recomendable el desarrollo de terapias alternativas para el tratamiento de tumores cerebrales. Los cannabinoides son compuestos que deben su nombre a que son sintetizados por la planta Cannabis sativa L. Estos compuestos, entre los que el ∆9 -tetrahidrocannabinol (THC) destaca por sus elevadas potencia y abundancia, son los responsables de los efectos centrales y perif´ericos del consumo de marihuana (Pertwee, R.G., Pharmacol Ther. 74, 129-180,1997; Felder, C.C. & Glass, M., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38, 179-200, 1998). Los cannabinoides de C. sativa (Fig. 1) llevan a cabo sus efectos debido a que son similares a determinadas mol´eculas producidas por los animales (incluidos los humanos) que probablemente desempe˜ nan funciones importantes en el sistema nervioso. Estas mol´eculas se denominan por ello cannabinoides end´ ogenos o endocannabinoides, y la anandamida (=araqui2

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donoiletanolamida) es su principal representante (Di Marzo, V., Melck, D., Bisogno, T. & De Petrocellis, L., Trends Neurosci. 21, 521-528, 1998; Martin, B.R., Mechoulam, R. & Razdan, R.K., Life Sci. 65, 573-595, 1999). Es m´as, se han conseguido obtener en el laboratorio compuestos que mimetizan la acci´ on de los cannabinoides naturales pero con una potencia mucho m´as elevada. Son los denominados cannabinoides sint´eticos, uno de cuyos representantes es el WIN55,212-2 (Fig. 2) (Pertwee, op. cit.; Barth, F., Expert Opin. Ther. Patents 8, 301-313, 1998). Los cannabinoides, tanto los naturales como los sint´eticos, act´ uan mediante su uni´ on a receptores espec´ıficos de membrana (receptores de cannabinoides o de tipo CB), de los cuales se conocen hoy en d´ıa dos subtipos diferentes: CB1 y CB2 (Pertwee, op. cit.; Howlett, A. et al., en:The IUPHAR Compendium of Receptor Characterization and Classification, eds. Godfraind, T., Humphrey, P., Ruffolo, R. & Vanhoutte, P., IUPHAR Media, pp. 97-104, 1998). No todos los tejidos del organismo poseen estos receptores, se localizan principalmente en el sistema nervioso, y por eso los cannabinoides ejercen mayoritariamente sus efectos en el cerebro (Pertwee, op. cit.; Childers, S.R. & Breivogel, C. S., Drug Alcohol Depen. 51, 173-187, 1998). Existe hoy en d´ıa un gran n´ umero de estudios acerca de las posibles aplicaciones terap´euticas de los cannabinoides. Es m´ as, en la actualidad ya se permite a los m´edicos en el Reino Unido y en diversos estados de los Estados Unidos prescribir THC o determinados cannabinoides sint´eticos como estimulantes del apetito e inhibidores del v´omito en pacientes con SIDA o c´ancer tratados cr´onicamente con quimioterapia (Grinspoon, L. & Bakalar, J.B., JAMA 273, 1875-1876,1995; Voth, E. & Schwartz, R., Ann. Intern. Med. 126, 791-798; 1997). Entre los usos terap´euticos potenciales de los cannabinoides destacan los siguientes: (a) como agentes analg´esicos se ha demostrado que act´ uan de forma altamente eficaz en la atenuaci´on del dolor agudo y cr´ onico; (b) como agentes que reducen la actividad motora se est´an probando hoy en d´ıa en el tratamiento de los trastornos asociados a la enfermedad de Parkinson, el corea de Huntington y la esclerosis m´ ultiple; (c) como agentes anticonvulsivantes se estudia su aplicaci´on en el tratamiento de la epilepsia; (d) como agentes que disminuyen la presi´on intraocular podr´ıan utilizarse en el tratamiento del glaucoma (Voth y Schwartz, op. cit.; Manzanares, J. et al., Trends Pharmacol. Sci. 20, 287294; 1999; Pop, E. Curr. Opin. CPNS Invest. Drugs 1, 587-596, 1999; Sanudo-Pena, M.C. Tsou, K. & Walker, J.M., Life Sci. 65, 703-713, 1999). Algunos de estos usos terap´euticos potenciales de los cannabinoides ya han sido patentados (ver por ejemplo US4189491, US5939429, WO9711668, WO9832441 y WO9957106). Uno de los efectos m´as intrigantes e inexplorados de los cannabinoides es su capacidad para inhibir el crecimiento de c´elulas transformadas in vitro. As´ı, se ha demostrado que diversos cannabinoides inhiben la proliferaci´ on de c´elulas de tumor de mama MCF-7 (De Petrocellis, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 95,8375-8380,1998),

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de c´elulas de glioblastoma C6 (S´ anchez, C., Galve-Roperh, I., Canova, C., Brachet, P. & Guzm´ an, M., FEBS Lett. 436, 6-10, 1998) y de c´elulas de tumor de pr´ ostata PC-3 (Ruiz, L., Miguel, A. & D´ıaz-Laviada, I., FEBS Lett. 458, 400-404, 1999). Sin embargo, estos hallazgos en sistemas de cultivo celular nunca han sido hasta ahora observados in vivo, por lo que su significado biom´edico es desconocido. Descripci´ on de la invenci´ on La presente invenci´on hace uso por primera vez de los cannabinoides para el tratamiento de tumores cerebrales, y se basa en nuestras observaciones originales de que los cannabinoides inducen una marcada regresi´ on (que conlleva un alargamiento de la vida) e incluso la erradicaci´ on (que conlleva la curaci´on) de glioblastomas en animales de laboratorio. Esta invenci´on implica la utilizaci´on de una terapia t´ecnicamente simple, carente de efectos colaterales notorios y, lo que es m´as importante, muy eficaz para el tratamiento de tumores cerebrales, que como se ha comentado anteriormente no pueden ser tratados hoy en d´ıa de manera satisfactoria con otras t´ecnicas o compuestos. Los experimentos que han conducido a la presente invenci´on se detallan a continuaci´ on. Acci´ on antitumoral de los cannabinoides en ratas La inyecci´on de c´elulas de glioblastoma C6 en el cerebro de rata se utiliza ampliamente como modelo experimental de tumor cerebral maligno (Barth, R.F., J. Neurooncol. 36, 91-102, 1998). Se inocularon c´elulas de glioblastoma C6 directamente en el cerebro de ratas Wistar, y los tumores se visualizaron por resonancia magn´etica. Todos los animales que se dejaron sin tratar murieron uniformemente 12-18 d´ıas despu´es de la inoculaci´on de las c´elulas (Fig. 3a). Para evaluar el potencial antitumoral de los cannabinoides, 12 d´ıas despu´es de la inoculaci´on de las c´elulas se administr´ o a un grupo de animales durante 7 d´ıas THC o WIN-55,212-2 a trav´es de una c´anula localizada en el sitio de inoculaci´ on. Los animales tratados con cannabinoides tuvieron una vida significativamente m´as larga que los animales control (Fig. 3a). As´ı, la administraci´ on de cannabinoides consigui´ o incrementar la supervivencia a 1935 d´ıas en 9/15 animales (tratamiento con THC) o a 19-43 d´ıas en 4/15 animales (tratamiento con WIN-55,212-2). Es m´ as, los cannabinoides erradicaron completamente el tumor en 3/15 animales (tratamiento con THC) o en 5/15 animales (tratamiento con WIN-55,212-2). En la Fig. 3b se muestra una imagen de resonancia magn´etica de uno de los animales curados con THC; tras la administraci´on del cannabinoide la masa tumoral desaparec´ıa completamente, y en su lugar se observaba una zona hipointensa residual que se interpreta como una cicatriz fibrosa en el sitio de inoculaci´on. No se observ´o recurrencia alguna en los 8 animales curados con cannabinoides. Acci´ on antitumoral de los cannabinoides en ratones inmunodeficientes Para discernir si la acci´ on antiproliferativa de los cannabinoides se debe a un efecto directo sobre las c´elulas tumorales o a un efecto indirecto mediado por una respuesta inmune, se inocularon subcut´ aneamente c´elulas de glioblastoma C6 en ratones deficientes en la recombinasa RAG-2

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(RAG-2−/−), que carecen de linfocitos T y B maduros (Shinkai, Y. et al., Cell 68, 855-867, 1992). Como se muestra en la Fig. 4a, el tama˜ no de los tumores era extraordinariamente inferior en los animales tratados con THC o WIN-55,212-2 que en los animales control. En la Fig. 4b se muestran ejemplos de ratones portadores de tumores y de tumores diseccionados despu´es del tratamiento con o sin cannabinoides durante 7 d´ıas. Seguridad del tratamiento con cannabinoides in vivo Se examinaron a continuaci´ on los posibles efectos secundarios del tratamiento con cannabinoides. Las ratas sin tumor y tratadas con cannabinoides no ve´ıan afectada en absoluto su supervivencia (Fig. 3a). Al igual que en los 8 animales antes mencionados cuyos tumores fueron erradicados con cannabinoides, el an´ alisis minucioso por resonancia magn´etica de todos los animales sin tumor revelaba que el tratamiento con cannabinoides no produc´ıa ninguna se˜ nal de da˜ no por necrosis, edema, infecci´ on, inflamaci´ on o trauma. Para descartar la posibilidad de que los cannabinoides fueran t´ oxicos para las c´elulas nerviosas en divisi´on, se realizaron tinciones de TUNEL en la zona subventricular del cerebro de las ratas, que contin´ ua en proliferaci´ on en el animal adulto. La administraci´ on de cannabinoides no s´ olo no produjo ning´ un efecto apopt´ otico significativo en el cerebro in vivo, sino que adem´ as el ligero marcaje observado en el caudado putamen de los animales control no era evidente en los animales tratados con cannabinoides. Tanto en los animales sin tumor como en los portadores de tumor, los cannabinoides no indujeron ninguna alteraci´ on significativa de par´ ametros comportamentales como coordinaci´ on motora y actividad f´ısica. La ingesta de agua y alimento, as´ı como la ganancia de peso, tampoco se vieron afectadas por los cannabinoides. As´ı mismo, en los an´alisis de sangre los par´ ametros bioqu´ımicos (glucosa, urea, ´acido u ´rico, creatinina, colesterol, bilirrubina) y los marcadores de da˜ no tisular (alanina y aspartato aminotransferasas, γ-glutamiltransferasa, creatina quinasa, lactato deshidrogenasa) no resultaron afectados ni a lo largo del periodo de 7 d´ıas de administraci´ on ni hasta 2 meses despu´es de la finalizaci´on del tratamiento con cannabinoides. Datos de otros autores apoyan la idea de que los cannabinoides no s´ olo no son compuestos t´ oxicos para las c´elulas nerviosas, sino que incluso las protegen de est´ımulos t´ oxicos tales como los agonistas glutama´ergicos (Skaper, S.D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 39843989, 1996; Shen, M. & Thayer, S.A., Mol Pharmacol. 54, 459-462, 1998), los agentes oxidantes (Hampson, A.J., Grimaldi, M., Axelrod, J. & Wink, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 82688273, 1998) y la isquemia (Nagayama, T. et al.,J. Neurosci 19, 2987-2995, 1999). Caracterizaci´ on farmacol´ ogica de la acci´ on antitumoral de los cannabinoides Se llevaron a cabo experimentos encaminados a caracterizar farmacol´ogicamente la muerte inducida por cannabinoides de c´elulas de glioblastoma C6 en cultivo. Agonistas sint´eticos de elevada potencia como WIN-55,212-2, CP-55,940 y HU-210 induc´ıan la muerte de estas c´elulas a do3

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sis menores que el THC, como cab´ıa esperar de su mayor afinidad por los receptores de cannabinoides (Pertwee, op. cit.). As´ı, tras 5 d´ıas de exposici´ on a cannabinoides, la viabilidad del glioblastoma C6 se ve´ıa reducida en un 50% a concentraciones de 20 nM WIN-55,212-2, 45 nM CP-55,940, 10 nM HU-210 y 480 nM THC (n=4). Ni el SR141716 (un antagonista selectivo de CB1 ) ni el SR144528 (un antagonista selectivo de CB2 ) (Shire, D. et al.,Life Sci. 65, 627-635, 1999) eran capaces por separado de prevenir la muerte celular inducida por el THC. Sin embargo, cuando los dos antagonistas se a˜ nad´ıan conjuntamente a las incubaciones se observaba una prevenci´ on eficaz de la muerte celular inducida por THC (Fig. 5a). De acuerdo con ello, el an´alisis por Westem blot demostr´o que las c´elulas de glioblastoma C6 expresaban tanto el receptor CB1 como el CB2 (Fig. 5b). Aplicaci´ on de la invenci´ on en otros supuestos Los experimentos que han conducido a la presente invenci´on se han llevado a cabo con ratas y ratones como animales portadores de tumores. Sin embargo, tanto por el dise˜ no experimental empleado como por la similitud que exhiben los tumores cerebrales en distintos mam´ıferos (R.F. Barth, op. cit.), la invenci´ on puede aplicarse al tratamiento de tumores cerebrales en otros mam´ıferos, incluido el ser humano. Los experimentos que han conducido a la presente invenci´on se han llevado a cabo con glioblastomas como modelo de tumor cerebral. Sin embargo, por el dise˜ no experimental que se ha utilizado para la inducci´ on y tratamiento de los tumores, la invenci´ on puede aplicarse al tratamiento de otros tumores cerebrales, por ejemplo meduloepiteliomas, meduloblastomas, neuroblastomas, germinomas, carcinomas embrionarios, astrocitomas, astroblastomas, ependimomas, oligodendrogliomas, carcinomas plexales, neuroepiteliomas, pineoblastomas, ependimoblastomas, tumores neuroectod´ermicos, meningiomas malignos, condrosarcomas, sarcomatosomas meningeales, melanomas malignos o schwanomas malignos. Los experimentos que han conducido a la presente invenci´on se han llevado a cabo con dos cannabinoides paradigm´ aticos, uno natural (THC) y otro sint´etico (WIN-55,212-2). En una realizaci´ on preferida de la invenci´ on se utilizar´a el cannabinoide con efecto antiproliferativo m´ as potente para un determinado tumor. Sin embargo, puesto que el efecto antiproliferativo de estos compuestos est´a mediado por los receptores de cannabinoides (receptores de tipo CB, Howlett et al., op. cit.), la invenci´on es aplicable a cualquier otro agonista de estos receptores, tanto cannabinoides de C. sativa (por ejemplo ∆8 -tetrahidrocannabinol, cannabinol, cannabidiol) (Fig. 1) como cannabinoides sint´eticos (por ejemplo HU-210, CP-55,940, CP-50,556) (Fig. 2) (Pertwee, op. cit.; F. Barth, op. cit.). Tambi´en se incluyen en este apartado los medicamentos que contengan en su composici´on cualquier cannabinoide. Los experimentos que han conducido a la presente invenci´on se han llevado a cabo administrando intratumoralmente el cannabinoide. En una realizaci´on preferida de la invenci´ on ´esta ser´a la v´ıa de administraci´ on elegida, ya que permite 4

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una elevada accesibilidad del cannabinoide al tumor. Sin embargo, puesto que la acci´ on del cannabinoide es directa sobre el tumor y no parece afectar sustancialmente a sistemas perif´ericos, la v´ıa de administraci´ on puede ser tambi´en sist´emica, por ejemplo intraperitoneal, intravenosa u oral. Los experimentos que han conducido a la presente invenci´on se han llevado a cabo mediante la administraci´on continua de una dosis de cannabinoide durante un tiempo determinado. En una realizaci´ on preferida de la invenci´ on se optimizar´an estos par´ ametros dependiendo de los requerimientos espec´ıficos del tratamiento estado del paciente, tama˜ no y localizaci´on del tumor, n´ umero de tumores, etc. As´ı, por ejemplo, el modo de aplicaci´on podr´ a ser continuo (modo preferido) o secuencial en una o varias dosis por d´ıa. Esto har´ a obviamente variar las dosis de compuesto administradas y el tiempo total de duraci´on del tratamiento. Breve descripci´ on de las figuras Figura 1

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F´ ormula qu´ımica de los principales cannabinoides de C. sativa Figura 2 F´ ormula qu´ımica de los principales cannabinoides sint´eticos Figura 3 Acci´ on antitumoral de los cannabinoides en ratas

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(a) Curvas de supervivencia de ratas con tumores cerebrales. Se indujeron glioblastomas en 45 ratas (d´ıa 0); 15 animales no fueron tratados con cannabinoides (- -), mientras que otros 15 se trataron con THC (–) y otros 15 con WIN-55,212-2 (· · ·) entre los d´ıas 12 y 19. Los animales tratados con cannabinoides vivieron significativamente m´as tiempo que los controles (P