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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 192 676 kInt. Cl. : A01N 1/02, A61K 31/41

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

A61K 31/50, A61K 31/70 A61K 31/335, A61K 31/495 C12N 5/00

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 97916935.6 kFecha de presentaci´on: 24.03.1997 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 889 690 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 13.01.1999

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54 T´ıtulo: C´ octel de antibi´ oticos y m´ etodo de uso.

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73 Titular/es: CRYOLIFE, INC.

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72 Inventor/es: Brockbank, Kelvin G. M.;

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

30 Prioridad: 29.03.1996 US 626167

1655 Roberts Boulevard, N.W. Kennesaw, Georgia 30144, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.10.2003

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 192 676 T3

16.10.2003

Aviso:

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Goldstein, Steven; Adoma, Chigoke; Sheldon, Judith K. y Dawson, Patti, E.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 192 676 T3 DESCRIPCION C´ octel de antibi´oticos y m´etodo de uso. 5

Campo de la invenci´ on Esta invenci´on se refiere a un m´etodo para descontaminar tejidos tales como v´alvulas card´ıacas para trasplante, al tiempo que se mantiene la viabilidad del tejido. La invenci´ on se refiere tambi´en a un c´ octel de antibi´ oticos para ser usado en el m´etodo.

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Fundamento de la invenci´ on

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El comportamiento cl´ınico de aloinjertos de v´ alvulas card´ıacas ha sido correlacionado con la viabilidad de los fibroblastos de las laminillas de las v´alvulas en el trasplante. V´eanse O’Brien et al., J. Card. Surg. 2 (Suppl), 153-167 (1987) y Atark, J. Thoracic Cardiovasc. Surg., 97, 1-9 (1989). En consecuencia, han de mantenerse las normas de viabilidad m´ as exigentes a lo largo de todo el procedimiento de procesado que incluye la obtenci´ on, el transporte, la descontaminaci´ on, la congelaci´on, el almacenamiento, la descongelaci´on y el trasplante.

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En relaci´on con la etapa de descontaminaci´on, se conocen c´octeles de antibi´ oticos para la descontaminaci´ on microbiana de tejidos. En particular, se conocen varios c´ octeles de antibi´ oticos que contienen una diversidad de agentes antibacterianos y un u ´nico agente antif´ ungico (anfotericina B, o bien, ocasionalmente, nistatina). V´eanse, p. ej., Watts et al., Ann. Thorac. Surg., 21, 230-36 (1976); Strickett et al., Pathology, 15, 457-62 (1983); Armiger et al., Pathology, 15, 67-73 (1983); Kirklin y Barratt-Boyes, Cardiac Surgery, 421-22 (1986); Heacox et al., en Cardiac Valve Allografts 1962-1987, 37-42 (Yankah et al., ed. 1988); Angell et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg., 98, 48-56 (1989); Lange y Hopkins, en Cardiac Reconstruction With Allograft Heart Valves, 37-63 (Hopkins ed. 1989); patente de EE.UU. n◦ 4.890.457; patente de EE.UU. n◦ 4.695.536; y solicitud PCT WO 92/12632. La anfotericina B est´a considerada como el agente antif´ ungico m´ as efectivo disponible. Sin embargo, se ha encontrado que la anfotericina B es t´ oxica para las c´elulas responsables de la longevidad del aloinjerto en pacientes, y, en consecuancia, ha sido retirada de algunas soluciones de descontaminaci´ on para v´alvulas card´ıacas. V´eanse Hu et al., Cardiovasc. Res., 23, 960-64 (1989); Lange y Hopkins, en Cardiac Reconstruction With Allograft Heart Valves, 37-63 (Hopkins, ed. 1989); McNally y Brockbank, J. Med. Engineer. and Tech., 16, 34-38 (1992). Como consecuencia, la contaminaci´on por levaduras da lugar en la actualidad a que se deseche un elevado n´ umero de v´ alvulas card´ıacas. V´ease McNallly y Brockbank, J. Med. Engineer. and Tech., 16, 34-38 (1992). Sumario de la invenci´ on

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La invenci´on proporciona un c´ octel de antibi´oticos para descontaminar tejidos. El c´octel comprende: 1) anfotericina B y fluconazol como agentes antif´ ungicos; y 2) una diversidad de agentes antibacterianos. Los agentes est´an presentes en el c´octel en cantidades efectivas para inhibir sustancialmente el crecimiento tanto de levaduras como de bacterias, manteniendo al mismo tiempo sustancialmente la viabilidad del tejido. La invenci´on proporciona tambi´en un m´etodo para descontaminar un tejido, que comprende poner en contacto el tejido con un c´ octel de antibi´ oticos de acuerdo con la invenci´ on. El tejido se pone en contacto con el c´octel de antibi´ oticos a una temperatura y durante un periodo de tiempo efectivos para inhibir sustancialmente el crecimiento de levaduras y bacterias, al tiempo que se mantiene sustancialmente la viabilidad del tejido. Como resultado del uso de los c´ octeles de antibi´ oticos de la invenci´on, muchos tejidos anteriormente desechados por la contaminaci´on por levaduras o bacterias pueden ser ahora utilizados para trasplante. Esto es un logro importante teniendo en cuenta la escasez de tejidos disponibles para trasplantes. Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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“Cantidades efectivas” se usa para significar que cada uno de los agentes est´a presente en una concentraci´on suficiente tal que el c´octel inhibe sustancialmente el crecimiento de levaduras y bacterias pero no disminuye sustancialmente la viabilidad del tejido que se est´ a descontaminando. Esas cantidades pueden determinarse por ensayos de respuesta a la dosis, que se conocen en la t´ecnica, usando ensayos microbiol´ogicos y ensayos de viabilidad est´ andar, tales como los descritos m´ as adelante. Preferentemente 2

ES 2 192 676 T3 los agentes est´an presentes en el c´octel en cantidades que son destructivas para las levaduras y bacterias aisladas frecuentemente del tejido.

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“Inhibir sustancialmente” significa que el c´ octel inhibe completamente el crecimiento de levaduras y bacterias en al menos un 90 %, preferentemente al menos 95 %, lo m´ as preferentemente al menos 99 %, de los tejidos descontaminados con el c´ octel. “Inhibir completamente el crecimiento de levaduras y bacterias” significa que el crecimiento de levaduras y bacterias no es detectable por ensayos microbiol´ ogicos est´andar despu´es de que el tejido ha sido tratado con el c´ octel. La viabilidad puede determinarse de diversas formas.. Sin embargo, preferentemente el tejido se incuba con un amino´ acido marcado radiactivamente, y la incorporaci´ on del amino´ acido a las prote´ınas se controla contando las desintegraciones por minuto (DPM) por unidad de tejido. Por consiguiente, se define “mantener sustancialmente la viabilidad” con el significado de que el tejido que ha sido tratado con el c´octel incorpora al menos aproximadamente 85 % de las DPM por unidad de tejido que incorpora el tejido no tratado con el c´ octel. Los agentes antif´ ungicos usados en los c´ octeles de la invenci´on son anfotericina B y fluconazol. El uso de estos dos agentes antif´ ungicos en combinaci´on inhibe sustancialmente el crecimiento de levaduras al tiempo que mantiene sustancialmente la viabilidad del tejido que se ha de tratar con los agentes. Este resultado es bastante sorprendente en vista de la toxicidad publicada de la anfotericina B frente al tejido (v´ease la secci´on de Fundamentos anterior). Las concentraciones adecuadas de anfotericina B y fluconazol pueden determinarse mediante pruebas de respuesta a la dosis, como se conoce en la t´ecnica usando ensayos microbiol´ ogicos est´andar y ensayos de viabilidad tales como los descritos m´as adelante. Ni la anfotericina B ni el fluconazol solos inhiben sustancialmente el crecimiento de levaduras a dosis que mantengan sustancialmente la viabilidad del tejido, pero s´ı la combinaci´on de estos dos agentes antif´ ungicos. En realidad, se ha encontrado de forma inesperada que la combinaci´ on de anfotericina B y fluconazol tiene actividad sin´ergica antilevadura (v´eanse los Ejemplos 14 y 15).

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Se prefiere una concentraci´ on de aproximadamente 0,3 µg/ml a aproximadamente 2,0 µg/ml de anfotericina B, para el uso en c´ octeles de antibi´ oticos para esterilizar v´alvulas card´ıacas. Se prefiere una concentraci´on de fluconazol de aproximadamente 50 µg/ml a aproximadamente 100 µg/ml para el uso en c´octeles de antibi´oticos para esterilizar v´alvulas card´ıacas. 35

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Los agentes antibacterianos u ´ tiles en la pr´ actica de la invenci´on se eligen de forma que la combinaci´on de agentes antibacterianos sea efectiva contra una amplia gama de baxterias, incluyendo bacterias gram-negativas, gram-positivas, aerobias y anaerobias. Adem´ as, los agentes antibacterianos se eligen de forma que la combinaci´ on de agentes sea efectiva frente a las bacterias que se encuentran normalmente contaminando el tejido que se est´a tratando. Muchas de estas bacterias (p. ej. estafilococos, estreptococos y propionibacterias) son conocidas y otras pueden ser identificadas mediante ensayos microbiol´ ogicos est´andar (v´ease, p. ej., el Ejemplo 19 m´ as adelante). As´ı, se prefieren agentes antibacterianos de amplio espectro de dos o m´ as familias. Finalmente, la combinaci´on de agentes antibacterianos no debe reducir sustancialmente la viabilidad del tejido que se est´ a tratando.

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Preferentemente, la diversidad de agentes antibacterianos se elige entre las familias siguientes: cefalosporinas, glicop´eptidos, aminoglic´ osidos, lincosamidas, beta-lactamas y rifamicinas. M´as preferentemente, la combinaci´ on de agentes antibacterianos comprende vancomicina e imipenem, y lo m´as preferentemente vancomicina, imipenem y netilmicina. Para la descontaminaci´ on de v´ alvulas card´ıacas, se prefiere una combinaci´on de 50 µg/ml de vancomicina, aproximadamente 10-100 µg/ml de imipenem y aproximadamente 20-50 µg/ml de netilmicina. El imipenem es un antibi´ otico de beta-lactama. Es activo contra la mayor parte de las bacterias aerobias gram-positivas y gram-negativas y la mayor parte de las bacterias anaerobias gram-positivas y gram-negativas. La vancomicina es un glicop´eptido tric´ıclico. Es activo contra muchos organismos gram-positivos, incluyendo estafilococos, estreptococos, enterococos, Clostridium y Corynebacterium. Es inactivo contra bacterias gram-negativas.

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La netilmicina est´ a en la familia de los aminoglic´ osidos y es efectiva contra muchas bacterias aerobias gram-negativas y algunas bacterias aerobias gram-positivas. La netilmicina es inactiva contra la mayor´ıa 3

ES 2 192 676 T3 de los estreptococos y la mayor´ıa de las bacterias anaerobias.

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Las concentraciones de los agentes antimicrobianos se eligen para que sean al menos 4 a 8 veces las concentraciones inhibidoras m´ınimas para la bacteria diana, determinadas mediante ensayos de sensibilidad microbiol´ ogica est´andar. Dentro de estos par´ ametros, las concentraciones de agentes antibacterianos pueden ser ajustadas como resultado de pruebas de respuesta a la dosis en tejidos, usando ensayos microbiol´ ogicos est´andar y ensayos de viabilidad, tales como los descritos m´ as adelante. De lo que antecede puede observarse que los c´octeles de antibi´ oticos preferidos de acuerdo con la invenci´on contienen anfotericina B, fluconazol, vancomicina, imipenem y netilmicina. Para esterilizar v´alvulas card´ıacas, se prefieren los c´octeles de antibi´ oticos contienen aproximadamente de 0,3 a 1,0 µg/ml de anfotericina B, aproximadamente de 50 a 100 µg/ml de fluconazol, aproximadamente 50 µg/ml de vancomicina, aproximadamente de 10 a 100 µg/ml de imipenem y aproximadamente de 20 a 50 µg/ml de netilmicina. Es m´as preferido el c´octel siguiente:

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1,0 µg/ml de anfotericina B, 100 µg/ml de fluconazol, 20

50 µg/ml de vancomicina, 96 µg/ml de imipenem, y 50 µg/ml de netilmicina.

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La invenci´on proporciona tambi´en un m´etodo para esterilizar un tejido, que comprende poner el contacto el tejido con un c´ octel de antibi´oticos de acuerdo con la invenci´ on. Puede descontaminarse de esta manera una diversidad de tejidos, incluyendo v´ alvulas card´ıacas, pericardio, vasos y tejido conjuntivo musculo-esquel´etico. Como se usa en el presente texto, la expresi´on “tejido conjuntivo musculoesquel´etico” incluye tejidos tales como tendones, ligamentos y meniscos, y excluye tejidos tales como el hueso.

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El tejido se pone en contacto con el c´octel de antibi´ oticos a una temperatura y durante un periodo de tiempo efectivos para inhibir sustancialmente el crecimiento de levaduras y bacterias, al tiempo que se mantiene sustancialmente la viabilidad del tejido. Tales tiempos y temperaturas pueden determinarse emp´ıricamente como se conoce en la t´ecnica. Se ha encontrado que las v´ alvulas card´ıacas pueden ser descontaminadas eficazmente incub´ andolas en un c´ octel de antibi´oticos de acuerdo con la invenci´ on durante 24 a 48 horas, a una temperatura de 35 a 39◦ C.

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Ejemplos Ejemplo 1 Este ejemplo describe el ensayo de cuatro c´octeles de antibi´oticos sobre tejido de v´ alvula card´ıaca.

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A. Obtenci´ on y preparaci´ on de las v´ alvulas card´ıacas

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V´ alvulas card´ıacas que se encontraron inadecuadas para trasplante de aloinjerto fueron asignadas para uso experimental al recibirse el consentimiento informado de la organizaci´on de obtenci´ on de o´rganos responsable de la mediaci´on con la familia del donante. Se hizo la disecci´on de las v´alvulas card´ıacas como se describe en la patente de EE.UU. n◦ 4.890.457. B. Esterilizaci´ on

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Se cortaron por la mitad laminillas de v´alvulas, y cada mitad se incub´ o en 4 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (GIBCO) tamponado con a´cido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulf´ onico (HEPES) 25 mM y que contiene 10 % de suero bovino fetal (en adelante “soluci´ on B”) y antibi´ oticos de los tipos y a las concentraciones que se indican m´as adelante. Los antibi´oticos inclu´ıan dos combinaciones de agentes antibacterianos denominados C´octel B y C´octel C, que tienen las siguientes formulaciones:

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ES 2 192 676 T3 C´ octel B: 62 µg/ml de rifampina, 5

57 µg/ml de netilmicina, 114 µg/ml de vancomicina, 136 µg/ml cefotaxime

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136 µg/ml de lincomicina. C´ octel C: 15

12 µg/ml de imipenem 50 µg/ml de vancomicina.

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Adem´as, se ensayaron otros dos c´ octeles. Estos c´octeles eran los mismos que los C´octeles B y C, excepto que tambi´en conten´ıan 100 µg/ml de fluconazol. Para preparar una soluci´ on madre de rifampina, se disolvieron 600 mg de rafampina est´eril en 10 ml de agua est´eril. La rifampina se obtuvo de Merrell Dow (nombre comercial RIFADIN).

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Una soluci´on de 100 mg/ml de sulfato de netilmicina, obtenida de Schering-Plough (nombre comercial NETROMYCIN) fue usada como soluci´on madre de este antibi´ otico. Se prepar´ o una soluci´ on madre de vancomicina disolviendo 500 mg de hidrocloruro de vancomicina est´eril en 10 ml de agua est´eril. El hidrocloruro de vancomicina se obtuvo de Eli Lilly and Co. (nombre comercial VANCOCIN HCl). Se prepar´ o una soluci´ on madre de cefotaxime disolviendo 2,0 gramos de cefotaxime s´ odica est´eril en 3 ml de agua est´eril. La cefotaxime s´odica se obtuvo de Hoechst-Roussel (nombre comercial CLAFORAN).

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Una soluci´on de 300 mg/ml de hidrocloruro de lincomicina obtenida de Upjohn (nombre comercial LINCOCIN) fue usada como soluci´on madre de ese antibi´ otico. Se prepar´ o una soluci´ on madre de imipenem a˜ nadiendo 20 ml de soluci´ on salina est´eril a un frasco de 250 mg de imipenem obtenido de Merck and Co. (nombre comercial PRIMAXIN).

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Finalmente, se us´o una soluci´ on de 2 mg/ml de fluconazol obtenida de Pfizer Roering (nombre comercial DIFLUCAN) como soluci´on madre.

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Una cantidad apropiada de cada una de las soluciones madre fue a˜ nadida a Soluci´ on B para dar las concentraciones finales usadas en los C´ octeles B y C y en los C´octeles B y C m´as fluconazol. Experimento 1

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Mitades de laminillas emparejadas fueron tratadas con C´ octel B o con C´octel B m´as fluconazol. Del mismo modo, mitades de laminillas emparejadas fueron tratadas con C´octel C o con C´octel C m´as fluconazol. Todas las mitades de laminillas de v´alvulas fueron incubadas durante 48 horas a 37◦ C en los c´octeles de antibi´oticos, y despu´es fueron crioconservadas. Experimento 2

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De nuevo se usaron mitades de laminillas emparejadas. Una mitad se us´ o como testigo fresco y se marc´o inmediatamente con 3 H-glicina para determinar la viabilidad de los fibroblastos de laminilla (v´ease m´as adelante). La otra mitad de cada laminilla fue incubada en C´octel B o en C´octel B m´as fluconazol. Del mismo modo, una mitad de otro par se us´ o como testigo fresco y la otra mitad fue incubada en C´octel C o en C´ octel C m´as fluconazol. Las laminillas tratadas con antibi´ otico se incubaron durante 48 horas a oticos y despu´es se crioconservaron. 37◦C en los c´octeles de antibi´

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ES 2 192 676 T3 B. Crioconservaci´ on

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Despu´es de completarse los tratamientos con los c´octeles de antibi´oticos, las mitades de laminillas de v´alvulas fueron empaquetadas, crioconservadas y almacenadas como se describe en la patente de EE.UU. alvulas n◦ 4.890.457, con modificaciones al programa de congelaci´on para que las mitades de laminillas de v´ individuales pudiesen ser conservadas a una velocidad de enfriamiento de aprox. -1◦C/minuto en aprox. 1,6 ml de soluci´on crioprotectora. Se us´ o un criovial Nalge de 1,8 ml para contener el tejido de la laminilla. El programa de congelaci´ on lleva al tejido desde +4◦ C a -80◦ C en aproximadamente 80 a 90 minutos. C. Almacenamiento Las mitades de laminillas de v´alvulas fueron almacenadas en un congelador de nitr´ ogeno l´ıquido durante al menos dos d´ıas, pero no m´ as de tres semanas, antes de ser descongeladas.

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D. Descongelaci´ on

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Las mitades de laminillas de v´alvulas fueron descongeladas retirando del congelador de nitr´ ogeno l´ıquido el tejido de v´ alvula a descongelar. Lo m´as r´apidamente posible, el tejido se pas´ o a un ba˜ no de oa agua a 37◦ C. Cuando se hubo disuelto todo el hielo (aproximadamente 2 minutos), el criovial se pas´ una campana y se dispensaron 4 ml a temperatura ambiente, de Ringer con lactato m´ as 5 % de dextrosa (D5LR) en un tubo de 5 ml de tap´ on de resorte (Falcon) por cada criovial descongelado. El exterior del criovial se remoj´o con isopropanol al 70 % y el posible exceso se elimin´o antes de abrir. Usando pinzas est´eriles, el tejido de las laminillas se pas´o al tubo que contiene el D5LR. Se dej´ o el tejido en D5LR durante 5 minutos.

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E. Pruebas de viabilidad

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La viabilidad del tejido se evalu´o midiendo la incorporaci´ on de 3 H-glicina a las prote´ınas de la forma siguiente. Las mitades de laminillas de v´avulas descongeladas se pusieron en tubos con tap´ on de resorte (Falcon) que contienen 16 µCi de glicina tritiada (DuPont New England Nuclear) en 1 ml de DMEM suplementado con 15 µg/ml de a´cido asc´orbico. La incorporaci´ on de glicina radiomarcada se determin´o osfera consistente en 5 % de di´oxido de carbono en despu´es de 48 horas de incubaci´on a 37◦C en una atm´ aire. Despu´es se lav´o el tejido cuatro veces con soluci´on salina tamponada con fosfato, se deshidrat´ o con etanol y ´eter, se sec´o con aire y se pes´o. Las muestras de tejido fueron despu´es rehidratadas con 200 µl de agua y solubilizadas mediante la adici´ on de 500 µl de NaOH 1 M. Despu´es de incubar a 60◦ C durante 1 hora, las muestras se trataron con ultrasonidos dos veces durante 20 segundos. Los homogeneizados se centrifugaron a 12.000 x g, y se pusieron partes al´ıcuotas de 100 µl de los sobrenadantes en discos de filtraci´on de fibra de vidrio (Whatman n◦ 1822024; Whatman Chemical Separation Inc., Clifton, N.J.). Los discos de filtraci´ on se secaron y las prote´ınas se precipitaron mediante la adici´on de a´cido tricloroac´etico al 10 % enfriado con hielo, durante 30 minutos. Esto fue seguido por cinco aclarados con etanol, dos aclarados con ´eter, y secado. Despu´es se pusieron los discos en 10 ml de fluido para centelleo (Cytoscint ES, ICN Biomedicals, Inc., Irvine, CA). La incorporaci´ on de tritio se midi´ o por conteo de centelleo usando un LS1701 (Beckman Instruments, Inc., Palo Alto, CA). En el Experimento 1, la viabilidad se ensay´o tambi´en marcando algunas de las mitades de laminillas on que conten´ıa 15 µCi/ml de con 3 H-hipoxantina para autorradiograf´ıa. Para ello, se prepar´o una soluci´ 3 H-hipoxantina (DuPont/NEN) en medio libre de suero (DMEM) que contiene 5 mg/100 ml de gentamicina (Sigma) y 15 mg/100 ml de a´cido asc´orbico (Sigma). Cada mitad de laminilla se puso en un tubo est´eril de tap´ on de resorte de 5 ml. Usando un micropipeteador, se a˜ nadieron 0,75 ml de la soluci´ on de 3 H-hipoxantina al tejido del tubo. Los tubos se incubaron a 37◦ C con 5 % de CO2 durante 48 horas. Despu´es, el medio tritiado fue decantado y el tejido se lav´ o dos veces con 3-4 ml de PBS (GIFCO). Se a˜ nadieron otros 3-4 ml de PBS y los tubos se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de retirar el l´ıquido. Despu´es, se a˜ nadieron a cada tubo 3-4 ml de PBS y los tubos se incubaron a 4◦ C durante 18 a 72 horas. El PBS fue decantado y los tejidos se pasaron a un vial de centelleo de vidrio de 7 ml. El vial se llen´ o con formalina tamponada neutra al 10 % (Fischer), se tap´ o y se almacen´o a temperatura ambiente hasta que se analiz´o la muestra mediante autorradiograf´ıa realizada como sigue. El tejido se empap´ o en sacarosa al 15 % en tamp´on de fosfato s´ odico 0,1 M, pH 7,4, durante un tiempo entre 2 horas y una noche. La soluci´ on estaba a temperatura ambiente al principio, y despu´es descendi´o o en un molde de material pl´ astico con OCT, y despu´es a 4◦ C. El tejido se someti´o a disecci´on, se embuti´ se congel´o en nitr´ ogeno l´ıquido. Se cortaron secciones congeladas en un criostato a 6 micr´ometros y se montaron descongeladas sobre portaobjetos revestidos con alumbre de cromo (portaobjetos sumergidos 6

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dos veces en una soluci´on a 37◦C que contiene 3,0 g de flor de gelatina 275 y 0,3 g de sulfato cr´ omico pot´ asico en 1000 ml de agua destilada). Los portaobjetos se secaron en estufa a 37◦ C durante un tiempo comprendido entre una noche y 48 horas, y se elimin´ o el OCT de las secciones. Despu´es se hidrataron las secciones en etanol desde 95 %, 75 % a 50 %. Los portaobjetos se dejaron en etanol al 50 % durante 10 minutos, y despu´es se aclararon en agua destilada durante 30 segundos. Las secciones se desengrasaron por deshidrataci´ on en etanol, hasta xileno. Los portaobjetos se hidrataron en las mismas soluciones de etanol hasta agua bidestilada. Los portaobjetos se pusieron en estufa a 37◦C para secarlos (entre 1 hora y una noche). Despu´es se fundi´ o Emulsi´ on L´ıquida Kodak NTB2 en un ba˜ no de agua a 40◦ C durante 30 minutos, y despu´es se diluy´o 1:1 con agua destilada. Los portaobjetos se sumergieron dos veces (6 segundos) individualmente, lentamente, en esta emulsi´ on diluida y se dejaron reposar una hora o hasta que se secaron. Las cajas se cerraron herm´eticamente y se almacenaron en un desecador en sala fr´ıa (4◦ C) hasta que se revelaron los portaobjetos. un cerrados Para revelar los portaobjetos, se dejaron llegar a aproximadamente 14◦ C permaneciendo a´ herm´eticamente (aproximadamente 11 minutos a temperatura ambiente). Esto evita la condensaci´ on sobre los portaobjetos, que reduce las se˜ nales. Todos los pasos se llevaron a cabo a una temperatura de 14◦C. Los portaobjetos se pusieron en una gradilla de vidrio para portaobjetos y se revelaron inmediatamente durante 2,5 minutos en un revelador D-19 (Cat´ alogo Kodak n◦ 146 4593). Despu´es se aclararon los portaobjetos en agua destilada durante 30 segundos, despu´es de lo cual se fijaron en fijador Kodak (fijador alogo 829-5321) durante 5 minutos. Los portaobjetos se aclararon dejando correr Polimax T, n◦ de cat´ agua de la red a 14◦ C, y la temperatura del agua se aument´o lentamente a 21◦C durante 10 minutos. Finalmente, los portaobjetos fueron te˜ nidos con Hematoxilina Harris (Cat´ alogo de Sigma n◦ HHS-32) y ◦ Eosina Y, soluci´on alcoh´olica (Cat. Sigma n 110-1-32). Los resultados se muestran en las tablas que siguen. La incorporaci´on de 3 H-glicina a las prote´ınas se expresa en desintegraciones por minuto (DPM) por mg de tejido seco. Los resultados de la autorradiograf´ıa se expresan como porcentaje de c´elulas vivas contadas, para el n´ umero total de c´elulas contadas.

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Experimento 1 30

35

Los resultados indican que el tratamiento con C´ octel C que contiene fluconazol produjo un tejido de v´alvula que era al menos tan viable como el obtenido despu´es del tratamiento con C´octel C sin fluconazol. Esto se observa en los resultados de centelleo y la autorradiograf´ıa. El C´ octel B que contiene fluconazol es tambi´en virtualmente equivalente al C´octel B sin fluconazol. Sin embargo, con el C´ octel B el tejido es menos viable para comenzar. Experimento 2

40

45

En promedio, el C´octel B que contiene fluconazol dio resultados que eran el 84 % de los obtenidos con C´ octel B que no contiene fluconazol. En promedio, el C´ octel C que contiene fluconazol dio resultados que eran el 116 % de los del C´ octel C sin fluconazol. Cuando se compara cualquiera de los tratamientos con antibi´ oticos con los valores de tejido fresco, todos ellos son m´as altos que el tejido fresco. A partir de los resultados de los Experimentos 1 y 2, puede sacarse la conclusi´on de que 100 µg/ml de fluconazol a˜ nadidos al C´ octel B o C no son perjudiciales para el tejido. Ejemplo 2

50

55

60

Se prepararon c´ octeles que contienen los antibi´oticos que siguen y en las siguientes concentraciones, y se ensayaron como se describe en el Ejemplo 1. Imipenem Vancomicina Fluconazol Rifampina

12 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 0, 10, 30 ´o 100 µg/ml

Se usaron mitades de laminillas de v´ alvulas emparejadas. Una mitad de cada laminilla fue un testigo. Se incub´ o en el c´octel de antibi´oticos que no conten´ıa rifampina. La otra mitad se trat´ o con uno de los c´octeles de antibi´ oticos que contienen rifampina. Los resultados del ensayo para la incorporaci´ on de 3 H-glicina a las prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg y porcentaje del testigo.

9

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Ejemplo 3 Se prepararon c´ octeles de antibi´ oticos y se ensayaron como se describe en el Ejemplo 1. Se usaron mitades de laminillas de v´alvulas emparejadas. Una mitad de cada laminilla se us´ o como testigo y se trat´ o con el siguiente c´octel de antibi´ oticos: Imipenem Vancomicina Fluconazol

12 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml

La otra mitad se trat´ o con uno de los siguientes c´ octeles de antibi´ oticos de ensayo: 50

Imipenem Vancomicina Fluconazol Rifampina

12, 24 ´o 48 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 10 µg/ml.

55

Los resultados del ensayo para la incoporaci´ on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg y porcentaje de control. Las columnas marcadas 12, 24 y 48 µg indican la cantidad de imipenem por ml usada en los c´octeles de ensayo (no testigos). 60

(Ver tabla en p´ agina siguiente)

10

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 4

40

45

50

Se prepararon c´ octeles que contienen los siguientes antibi´oticos en las concentraciones que siguen, y se ensayaron como se describe en el Ejemplo 1. Imipenem Vancomicina Fluconazol

12, 24, 48 o´ 96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml.

Se usaron mitades de laminillas de v´ alvulas emparejadas. Una mitad de cada laminilla se us´ o como testigo y se trat´ o con el c´octel de antibi´ oticos que contiene 12 µg/ml de imipenem. La otra mitad se trat´ o con uno de los c´octeles de antibi´ oticos de ensayo qe contienen 24, 48 ´o 96 µg/ml de imipenem. Los resultados del ensayo para la incoporaci´on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg y en porcentaje del testigo. Las columnas marcadas 24, 48 y 96 µg indican la cantidad de imipenem por ml usada en los c´octeles de antibi´oticos de ensayo.

55

(Ver tabla en p´ agina siguiente) 60

11

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 5 Se prepararon c´ octeles de antibi´oticos que contienen los siguientes antibi´ oticos en las concentraciones que siguen, y se ensayaron como se describe en el Ejemplo 1.

40

45

50

55

60

Imipenem Vancomicina Fluconazol Rifampina Anfotericina B

12 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 10 µg/ml 0, 0,3, 1,0 o´ 3,0 µg/ml.

Las diluciones de anfotericina B se prepararon como sigue. Un frasco que contiene 50 mg de anfotericina B (E.R. Squibb and Sons, Inc., Princeton, NJ; nombre comercial FUNGIZONE) fue reconstituido con 10 ml de agua est´eril. Se sac´o 1 ml de esta soluci´on y se diluy´o m´as con 9 ml de Soluci´on B para dar una concentraci´ on de 500 µg/ml. Se hicieron m´as diluciones a partir de esta soluci´on madre en Soluci´on B. Se usaron mitades de laminillas de v´ alvulas emparejadas. Una mitad de cada laminilla fue un testigo y se trat´ o con el c´octel de antibi´ oticos sin nada de anfotericina B. La otra mitad se trat´ o con uno de los c´ octeles de antibi´ oticos de ensayo que contienen anfotericina B. Los resultados del ensayo para la incorporaci´ on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue de DPM/mg y en porcentaje del testigo. En la tabla, las concentraciones se refieren a la concentraci´on de anfotericina B usada en los c´octeles de antibi´oticos de ensayo. (Ver tabla en p´ agina siguiente)

12

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

Una concentraci´ on de 0,3 µg/ml de anfotericina B en la mezcla de antibi´ oticos dio un tejido que ten´ıa una viabilidad media mayor que la del testigo. La viabilidad del tejido se redujo para 1 y 3 µg/ml de anfotericina B a 74 % y 72 % del testigo, respectivamente. Ejemplo 6

40

45

Se prepararon c´ octeles de antibi´ oticos que contienen los antibi´ oticos que siguen en las concentraciones que siguen, y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5, excepto que las mitades de laminillas de v´ alvulas se incubaron en los c´octeles de antibi´ oticos solamente durante 24 horas, en vez de 48 horas. Imipenem Vancomicina Fluconazol Rifampina Anfotericina B

48 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 0, 10, 30 o 60 µg/ml 0,3 µg/ml.

50

55

60

Se usaron mitades de laminillas de v´ alvulas emparejadas. Una mitad de cada laminilla fue un testigo y se trat´ o con el c´octel de antibi´ oticos sin nada de rifampina. La otra mitad se trat´ o con uno de los c´ octeles de antibi´ oticos de ensayo que contienen rifampina. Los resultados del ensayo para la incoporaci´ on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg y en porcentaje del testigo. En la tabla, las concentraciones se refieren a la concentraci´on de rifampina usada en los c´ octeles de antibi´oticos de ensayo. (Ver tabla en p´ agina siguiente)

13

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Ejemplo 7 Se realiz´ o un experimento para comparar la incorporaci´ on de 3 H-glicina por tejido fresco con la incorporaci´ on de 3 H-glicina por tejido procesado de varias maneras. Todos los procedimientos fueron los mismos que los descritos en los Ejemplos 1 y 5, excepto que se indique otra cosa m´as adelante.

55

Las tres laminillas se retiraron de cada una de ocho v´ alvulas, y cada laminilla se cort´o por la mitad. Las seis mitades de laminilla se trataron como sigue: 60

14

ES 2 192 676 T3

Laminilla 1A Laminilla 1B 5

Laminilla 2A Laminilla 2B 10

Laminilla 3A Laminilla 3B

Testigo fresco, sin tratamiento con antibi´ otico, sin crioconservaci´on. Incubada con Soluci´ on B durante 24 horas a 37◦ C y crioconservada. Testigo fresco, sin tratamiento con antibi´ otico, sin crioconservaci´on. Incubada con c´ octel de antibi´oticos a 37◦ C durante 24 horas y crioconservada. Incubada con Soluci´ on B durante 24 horas a 37◦C y crioconservada. Incubada con c´ octel de antibi´oticos a 37◦ C durante 24 horas y crioconservada.

15

20

Todas las mitades de laminilla de v´ alvula testigo frescas se marcaron inmediatamente con 3 H-glicina y se procesaron para recuento de centelleo. Despu´es de descongelar, las mitades de laminilla de v´ alvula tratadas con Soluci´ on B y tratadas con antibi´ otico se marcaron tambi´en con 3 H-glicina y se procesaron para recuento de centelleo. El c´octel de antibi´oticos consisti´ o en:

25

30

Imipenem Vancomicina Fluconazol Anfotericina

48 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml B 0,3 µg/ml.

Los resultados se presentan en la tabla que sigue. Los n´ umeros son DPM/mg.

35

40

45

(Ver tabla en p´ agina siguiente)

50

55

60

15

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Hay una diferencia estad´ısticamente significativa entre el grupo testigo fresco y los dos grupos incubados a 37◦C antes de la crioconservaci´on. No hay diferencia estad´ıstica significativa entre los grupos tratados con Soluci´ on B y los grupos tratados con antibi´ otico. El an´ alisis estad´ıstico se realiz´o usando el m´etodo de Student-Newman-Keuls. Ejemplo 8 Se prepararon c´ octeles de antibi´ oticos que contienen los antibi´ oticos que siguen en las concentraciones siguientes, y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5.

50

Imipenem Vancomicina Fluconazol Anfotericina B

48, 72 ´o 96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 0,3 µg/ml.

55

Los tres laminillas de cada v´alvula se cortaron por la mitad. Una mitad de cada laminilla se incub´ o con un c´ octel de antibi´ oticos que conten´ıa una concentraci´ on concreta de imipenem durante 24 horas, y la otra mitad se incub´o con el mismo c´octel de antibi´ oticos durante 48 horas como sigue: 60

16

ES 2 192 676 T3 Laminilla

5

10

1A 1B 2A 2B 3A 3B

-

48 48 72 72 96 96

µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml

de de de de de de

imipenem, imipenem, imipenem, imipenem, imipenem, imipenem,

24 48 24 48 24 48

horas horas horas horas horas horas

Los resultados del ensayo de incorporaci´on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg. En la tabla, las concentraciones se refieren a la concentraci´on de imipenem usada en los c´octeles de antibi´oticos.

15

20

25

30

35

40

El an´ alisis estad´ıstico de estos datos mediante la prueba de la t de Student indica que no hay diferencia estad´ıstica entre ninguno de los grupos de tratamiento. Ejemplo 9

45

Se prepararon c´ octeles de antibi´ oticos que contienen los antibi´ oticos que siguen en las concentraciones siguientes, y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5, excepto que las mitades de las laminillas de v´ alvula fueron incubadas en los c´ octeles de antibi´ oticos durante 24 horas solamente.

50

55

60

Imipenem Vancomicina Fluconazol

96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml,

y uno de los siguientes 0,3 µg/ml de anfotericina B 0,6 µg/ml de anfotericina B 1,0 µg/ml de anfotericina B 0,6 µg/ml de anfotericina B m´as 50 µg/ml de netilmicina 17

Testigo I II III

ES 2 192 676 T3 Los resultados del ensayo de incorporaci´on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue (unidades en DPM/mg). Obs´ervese que las v´ alvulas B1307, B1310 y B1311 ten´ıan una concentraci´ on incorrecta de netilmicina a˜ nadida al c´ octel. Por ello no se incluyeron estos datos. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

An´ alisis estad´ıstico: Testigo 0,6 Amp B 1,0 Amp B 0,6 Amp B + Netil

media 4887 5030 4878 5025 18

desv. est. 1997 2451 2502 2255

SEM 320 655 669 680

ES 2 192 676 T3 Usando el anova de una v´ıa de Kruskal-Wallis en las filas, no hay diferencia estad´ıstica entre los grupos (P = 0,994). Por consiguiente, los reg´ımenes de antibi´ oticos ensayados proporcionan un tejido que es igualmente viable. 5

10

15

Ejemplo 10 Se prepararon c´ octeles de antibi´oticos y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5, excepto que las mitades de las laminillas de v´alvula se incubaron en los c´ octeles de antibi´oticos durante 24 horas solamente. Se usaron mitades de laminillas de v´ alvula emparejadas. Una mitad de cada laminilla se us´o como testigo y se trat´o con el siguiente c´octel de antibi´ oticos: Imipenem Vancomicina Fluconazol Anfotericina

96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml B 0,6 µg/ml.

La otra mitad se trat´ o con uno de los siguientes c´ octeles de antibi´oticos de ensayo: 20

25

30

Imipenem Vancomicina Fluconazol Anfotericina Netilmicina

96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml B 0,6 µg/ml 20, 30 ´o 50 µg/ml.

Los resultados del ensayo de incorporaci´on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg y porcentaje del testigo. Las columnas marcadas 20, 30 y 50 µg/ml indican la concentraci´ on de netilmicina usada en los c´octeles de ensayo (no testigo).

35

40

45

(Ver Tabla en p´ agina siguiente)

50

55

60

19

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 11

60

Se prepararon c´ octeles de antibi´oticos y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5, excepto que las mitades de laminillas de v´alvula se incubaron en los c´ octeles de antibi´ oticos durante 24 horas solamente. Se usaron mitades de laminillas de v´alvula emparejadas. Una mitad de cada laminilla se us´o como testigo y se trat´o con el siguiente c´octel de antibi´oticos:

20

ES 2 192 676 T3

5

Imipenem Vancomicina Fluconazol Netilmicina

96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 50 µg/ml

La otra mitad se trat´ o con uno de los siguientes c´ octeles de antibi´oticos de ensayo: 10

15

20

Imipenem Vancomicina Fluconazol Netilmicina Anfotericina

96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml 50 µg/ml B 0,3; 0,6; 1,0; 2,0 o´ 3,0 µg/ml.

Los resultados del ensayo de incorporaci´on de 3 H-glicina a prote´ınas se presentan en la tabla que sigue en DPM/mg. Los resultados para la autorradigraf´ıa con 3 H-hipoxantina se presentan en la segunda tabla como porcentaje de c´elulas vivas en comparaci´on con el n´ umero total de c´elulas. Las columnas marcadas 0,3, 0,6, 1,0, 2,0 ´o 3,0 µg/ml indican la concentraci´ on de anfotericina B usada en los c´ octeles de ensayo (no testigo).

25

30

35

40

(Ver tabla en p´agina siguiente) 45

50

55

60

21

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ejemplo 12

60

Se realiz´ o un experimento para determinar la viabilidad de laminillas de v´alvula procesadas usando C´ octel C, C´ octel D o C´octel B m´as C´ octel C. V´ease el Ejemplo 1 para las formulaciones de los C´octeles B y C. El C´ octel D tiene la siguiente formulaci´on:

22

ES 2 192 676 T3 Imipinem Vancomicina Fluconazol Anfotericina 5

10

96 µg/ml 50 µg/ml 100 µg/ml B 0,3 µg/ml

A menos que se especifique otra cosa, los c´octeles se prepararon y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5. Se usaron once v´ alvulas humanas. Se incub´ o una laminilla de cada v´ alvula con C´octel D durante 24 horas (M´etodo G). Otra laminilla fue incubada en C´ octel C durante 24 horas (M´etodo D) o en C´octel C durante 24 horas, seguido por incubaci´ on en C´ octel B durante 24 horas (M´etodo E). Despu´es de descongelar, cada laminilla se cort´o por la mitad. Una mitad se marc´ o con 3 H-glicina, y la otra mitad on de 3 H-glicina a prote´ına se presentan se marc´o con 3 H-hipoxantina. Los resultados para la incorporaci´ en la tabla siguiente (unidades de DPM/mg).

15

V´ alvula B1272 B1274 B1276 B1277

20

M´etodo D D D D

Media Desv. est. 25

B1273 B1275 B1278 B1279 B1280 B1281 B1282

30

Media Desv. est.

35

40

E E E E E E E

M´etodo D/E 2008 1484 2527 3578

M´etodo G 1576 3858 2110 8432

2399 894

3994 3135

742 4449 2317 388 842 589 470

2012 6267 2383 410 1047 2122 1326

1400 1496

2224 1911

As´ı, el tratamiento con C´octel D que contiene los agentes antif´ ungicos fluconazol y anfotericina B (M´etodo G) tuvieron por resultado una viabilidad de laminillas de v´ alvula comparable o mejor que la del tratamiento con C´octeles B y C que no contienen agentes antif´ ungicos (M´etodos D y E). Ejemplo 13

45

Se llev´o a cabo un experimento para comparar la viabilidad de tejido de v´alvula card´ıaca procesado de una de las siguientes formas: M´etodo F

50

55

Tejido con tiempo isqu´emico m´as largo (potencialmente viabilidad celular m´as baja) que fue incubado con C´octel C durante 24 horas, opcionalmente seguido por incubaci´ on durante 24 horas con C´ octel B (formulaciones dadas en el Ejemplo 1). La decisi´ on de tratar el tejido con C´ octel B se adopt´ o bas´ andose en los resultados de cultivos microbiol´ ogicos de tejido tomados antes del tratamiento con antibi´oticos con C´ octel C como se describe en McNally y Brockbank, J. Med. Engineer. and Technol. 16, 34-38 (1992) y solicitud PCT WO 92/12631. M´etodo H Incubaci´on con el siguiente C´octel de antibi´ oticos, que se denominar´ a C´octel E, durante 24 horas:

60

Imipenem Vancomicina Netilmicina

94-100 µg/ml 50 µg/ml 50 µg/ml

23

ES 2 192 676 T3 Fluconazol Anfotericina

5

100 µg/ml B 1,0 µg/ml.

Los C´ octeles B, C y E se prepararon y se ensayaron como se describe en los Ejemplos 1 y 5, excepto que se indique otra cosa en el presente texto. Se retir´ o de cada v´ alvula una laminilla en la disecci´on, y se cort´ o por la mitad. Una mitad se marc´ o o inmediatamente con 3 H-hipoxantina. Estas inmediatamente con 3 H-glicina, y la otra mitad se marc´ fueron los testigos frescos.

10

15

El resto de la v´ alvula se cort´o por la mitad, dej´ andose una laminilla completa intacta en cada mitad. Una de las mitades de las v´alvulas se trat´o por el M´etodo F (C´ octel C, opcionalmente seguido por tratamiento con C´octel B). La otra mitad de v´ alvula se trat´o por el M´etodo H (C´ octel E). Las mitades de las v´alvulas congeladas se descongelaron y se cortaron por la mitad. Una mitad se marc´o con 3 H-glicina, y una mitad se marc´ o con 3 H-hipoxantina. Los resultados se presentan en la tabla que sigue (unidades de DPM/mg para la incorporaci´ on de H-glicina a prote´ınas y unidades de porcentaje de c´elulas vivas en comparaci´on con c´elulas totales para autorradiograf´ıa con 3 H-hipoxantina).

3

20

25

Se hicieron comparaciones entre grupos de tratamiento con la prueba no param´etrica de suma de filas de Mann-Whitney. Cuando se us´o 3 H-glicina para marcar el tejido no hubo diferencia significativa entre los tratamientos (P = 0,655). Del mismo modo, cuando se us´ o 3 H-hipoxantina para marcar el tejido no hubo diferencia significativa entre los dos grupos tratados (P = 0,684). Usando el anova de una v´ıa de Kruskal-Wallis en las filas, no hubo diferencias significativas entre ninguno de los 3 grupos cuando se us´o 3 H-glicina.

30

35

40

45

50

55

60

24

ES 2 192 676 T3 ∗

ND = no hecho

∗∗

5

placa muy pesada

Ejemplo 14 La Candida albicans usada en estos estudios fue la cepa 14053 de la ATCC (American Type Culture Collection). La pureza de la cepa se comprob´ o antes y despu´es del cultivo.

10

15

20

El organismo de ensayo se cultiv´ o en una placa de agar Sabouraud, se inocul´ o en l´ınea para aislamiento y se incub´o a 35◦C durante 24 horas. Se retir´o una colonia individual usando una torunda de algod´on est´eril y se puso en 5,0 ml de soluci´on salina est´eril. La mezcla se agit´o en v´ ortice y se prepararon diluciones y se compararon con un gr´ afico de turbidez est´ andar hasta que la turbidez coincidi´ o con un patr´ on de turbidez 0,5 (una suspensi´ on est´andar de turbidez McFarland 0,5). Se prepararon diluciones en serie de la forma siguiente: (1) se a˜ nadieron 0,5 ml del patr´ on de turbidez MacFarland 0,5 a 4,5 ml nadieron 0,1 ml de de soluci´ on salina normal est´eril (Tubo A; poblaci´ on esperada 105 ufc/ml); (2) se a˜ la suspensi´on del Tubo A a 9,9 ml de soluci´ on salina normal est´eril (Tubo B; poblaci´ on esperada 103 ufc/ml); y (3) se a˜ nadieron 0,1 ml de la suspensi´ on del Tubo B a 9,9 ml de soluci´ on salina normal est´eril (Tubo C; poblaci´ on esperada 10 ufc/ml). Cada diluci´ on de la serie se agit´o en v´ ortice durante 30 segundos antes de la siguiente transferencia. Se prepararon en Soluci´ on B soluciones de fluconazol y anfotericina B que tienen las concentraciones dadas en la tabla que sigue.

25

30

35

40

45

50

C´ octel

Fluconazol

Anfotericina B

Testigo I II III

0 100 µg/ml 100 µg/ml 0

0 0 0,3 µg/ml 0,6 µg/ml

Los tubos B y C fueron expuestos a estos c´ octeles. Cada c´ octel (24,0 ml) se puso en una copa de material pl´astico est´eril de 115 ml, y se a˜ nadi´ o 1,0 ml de la poblaci´ on de levadura del Tubo B o el C. Las copas se mezclaron suavemente, se taparon y se pusieron en incubador durante 24 horas a 35◦ C. Despu´es del periodo de incubaci´ on se˜ nalado, se sac´ o 1,0 ml de la mezcla de levadura-c´octel de cada tubo, y se trat´ o para obtener una enumeraci´ on de los organismos de levadura supervivientes. La mezcla restante se volvi´o a poner en el incubador durante 24 h m´ as. Despu´es de este periodo de incubaci´ on, se sacaron las copas, se removieron suavemente y se sac´o 1,0 ml, y se repiti´ o el proceso anterior. La enumeraci´on de la levadura se llev´o a cabo de la forma que sigue; cada muestra se ensay´o por duplicado. Se a˜ nadi´ o un mililitro (1,0 ml) de suspensi´ on de levadura al conjunto superior de un aparato de filtraci´ on est´eril desechable que conten´ıa 99 ml de soluci´ on salina normal est´eril. El contenido se mezcl´o suavemente y se filtr´ o. La almohadilla de filtraci´ on se sac´o as´epticamente usando pinzas est´eriles desechables y se puso en placas de Agar Sabouraud. Las placas se incubaron a 35◦ C durante 24 horas, y despu´es se contaron las colonias. Los resultados se presentan en las tablas que siguen. El Tubo B conten´ıa 734 unidades formadoras de colonias (UFC) de C. albicans/ml en el momento cero, y el Tubo C conten´ıa 13 ufc/ml en el momento cero.

55

60

25

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

Los resultados para el Tubo B indican que 100 µg/ml de fluconazol eran eficaces para reducir la biocarga de C. albicans de 734 colonias a 31 colonias a las 24 horas. A las 48 horas, el recuento de colonias (45) sugiere una tolerancia o fen´ omeno est´atico. La anfotericina B a raz´on de 0,6 µg/ml y la combinaci´ on de 100 µg/ml de fluconazol y 0,3 µg/ml de anfotericina B fueron fungicidas. Ejemplo 5 Se prepararon los siguientes c´octeles de antibi´ oticos como se describe en los Ejemplos 1 y 5 y se ensayaron frente a diez materiales aislados de levadura.

30

C´ octel

Contenido

I

Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Fluconazol - 100 µg/ml Anfotericina B - 0,3 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Fluconazol - 100 µg/ml Anfotericina B - 0,6 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Fluconazol - 100 µg/ml Anfotericina B - 1,0 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Anfotericina B - 0,3 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Anfotericina B - 0,6 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Anfotericina B - 1,0 µg/ml

35

II 40

III

45

IV

50

V

VI 55

Los diez aislados de levadura se eligieron porque se considera que son aislados de levadura humanos cl´ınicamente significativos. Los diez aislados de levadura ensayados fueron: 60

26

ES 2 192 676 T3 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10.

5

10 ∗

15

20

25

30

Rhodotorula rubra∗ Candida lusitaniae∗ Saccharomyces cervisae∗ Cryptococcus laurentii∗ Candida guilliermondii∗ Torulopsis glabrata∗ Candida tropicalis∗ Candida albicans@ Trichosporon beigeli∗ Candida parasilosis∗

Proporcionada por el American College of Pathologists.

@ El aislado de Candida albicans se obtuvo de tejido de donante en el que el aislado de levadura hab´ıa sobrevivido una incubaci´ on en c´ octel antibacteriano. La identificaci´on se confirm´o usando el ensayo Germ Tube Test o prueba de germinaci´ on para la confirmaci´ on de Candida albicans. El ensayo Germ Tube Test implica preparar una suspensi´ on de un aislado en una soluci´ on de suero bovino preparada comercialmente on (REMEL). La mezcla se incuba durante 2-4 horas a 35◦C y se examina al microscopio. La confirmaci´ de un tubo de germinaci´ on positivo es la formaci´on de gemaci´on de pseudohifas (germinaci´ on) fuera de la c´elula de levadura. Los c´octeles de antibi´ oticos fueron expuestos a diez suspensiones de levadura de carga bacteriana predeterminada individuales como se describe en el ejemplo anterior. Las placas de agar Sabouraud fueron incubadas a 35◦ C durante 5 d´ıas antes de la enumeraci´on, y comprobadas de nuevo el d´ıa 7 para observar cualquier crecimiento adicional de colonias de levadura. El periodo de 5 a 7 d´ıas de incubaci´on/enumeraci´on se eligi´o para proporcionar la recuperaci´ on o´ptima de cualquier aislado de levadura superviviente que puede crecer despu´es de recuperarse de los da˜ nos debidos a la presencia de agentes antif´ ungicos. Los resultados se presentan en las tablas siguientes. El C´octel III mostr´o la mayor actividad fungicida sobre todos los aislados de levadura. Resultados con aislados de levadura a las 24 horas (UFC/ml)

35

40

45

50

55

60

27

ES 2 192 676 T3 Resultados con aislados de levadura a las 48 horas (UFC/ml)

5

10

15

20

25

30

Comparaci´ on del C´ octel I 35

(0,3 µg de anfotericina B) despu´es de 24 y 48 horas

40

45

50

55

60

28

ES 2 192 676 T3

5

10

Una comparaci´ on del C´ octel I despu´es de 24 horas con el C´octel I despu´es de 48 horas, indica el habitual fen´ omeno de tolerancia para la levadura.

15

Comparaci´ on de los C´ octeles I y IV (0,3 µg de anfotericina B, con y sin fluconazol) despu´es de 24 horas

20

25

30

35

40

45

El C´ octel IV sin fluconazol no fue tan efectivo como el C´ octel I con fluconazol despu´es de 24 horas. Los datos indican que los dos agentes antif´ ungicos dan resultados sin´ergicos cuando se usan juntos. V´ease tambi´en el ejemplo anterior.

50

Comparaci´ on de los C´ octeles II y V (0,6 µg de anfotericina B, con y sin fluconazol) despu´es de 24 horas

55

60

29

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

El C´ octel V sin fluconazol no fue tan efectivo como el C´ octel II con fluconazol despu´es de 24 horas. Los datos indican que los dos agentes antif´ ungicos dan resultados sin´ergicos cuando se usan juntos. V´ease tambi´en el ejemplo anterior. Comparaci´ on de los C´ octeles III y VI

30

(1,0 µg de anfotericina B, con y sin fluconazol) despu´es de 24 horas

35

40

45

50

55

60

El C´ octel VI sin fluconazol no fue tan efectivo como el C´ octel III con fluconazol despu´es de 24 horas. Los datos indican que los dos agentes antif´ ungicos dan resultados sin´ergicos cuando se usan juntos. V´ease tambi´en el ejemplo anterior.

30

ES 2 192 676 T3 Ejemplo 16 Se repiti´o el Ejemplo 15 usando los siguientes c´ octeles de antibi´ oticos: 5

C´ octel

Contenido

I

Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Fluconazol - 100 µg/ml Anfotericina B - 0,3 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina -50 µg/ml Netilmicina - 50 µg/ml Fluconazol - 50 µg/ml Anfotericina B - 1,0 µg/ml Imipenem - 50 µg/ml Vancomicina - 50 µg/ml Netilmicina - 50 µg/ml Fluconazol - 100 µg/ml Anfotericina B - 1,0 µg/ml

10

VII 15

VIII 20

25

30

35

40

Se usaron diez aislados de levadura diferentes. Estos organismos se eligieron porque han sido recuperados de tejido cardiovascular de donante. Fueron: 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20.

Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Candida albicans Levadura, no Candida Levadura, no Candida Candida albicans Levadura, no Candida Levadura, no Candida

albicans albicans albicans albicans

La identificaci´on se realiz´ o usando el ensayo Germ Tube Test o prueba de germinaci´ on. Los resultados despu´es de 24 horas de incubaci´ on en los c´octeles de antibi´ oticos se presentan en la tabla siguiente (las unidades son UFC/ml). 45

50

(Ver tabla en p´ agina siguiente) 55

60

31

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

La adici´on de netilmicina a raz´ on de 50 µg/ml (C´octeles VII y VIII) no tuvo efectos adversos sobre la actividad fungicida del fluconazol y la anfotericina B. El aumento de la anfotericina B desde 0,3 µg/ml (C´ octel I) hasta 1,0 µg/ml (C´octeles VII y VIII) indica una mayor actividad fungicida. La disminuci´on del fluconazol desde 100 µg/ml hasta 50 µg/ml en presencia de 1,0 µg/ml de anfotericina B (C´ octel VII frente al C´ octel VIII) no afect´o mucho a la actividad fungicida. Ejemplo 17 V´ alvulas card´ıacas de 223 donantes fueron sometidas a disecci´on como se describe en la patente de EE.UU. n◦ 4.890.457. Las v´alvulas disecadas fueron descontaminadas usando uno de los m´etodos que se exponen m´ as adelante.

35

Se prepararon en la disecci´on juegos duplicados de espec´ımenes consistentes en aproximadamente un gramo de tejido. Un juego de espec´ımenes se trat´ o por el m´etodo de procesado de la t´ecnica anterior D, E o F (descritos en los Ejemplos 12 y 13). El juego de muestras restante se trat´ o usando una mezcla u ´ nica de antibi´ oticos, C´ octel E de acuerdo con la invenci´ on.

40

45

50

(Ver tabla en p´ agina siguiente)

55

60

32

ES 2 192 676 T3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Se realizaron an´ alisis microbiol´ ogicos de la forma siguiente. Para cada coraz´on sometido a disecci´ on, se prepararon en la disecci´on tres juegos de muestras de tejido para representar el producto antes del tratamiento con antibi´ oticos (pretratamiento) y despu´es del tratamiento con antibi´oticos (post-tratamiento). Las muestras tomadas eran piezas de tejido muscular card´ıaco externo, piezas de la v´alvula mitral o tric´ uspide, piezas de tejido muscular proximal a la v´ alvula a´ortica o pulmonar, y varios mililitros de soluci´on en el que se recibi´o el coraz´on. Despu´es de la disecci´on, el juego de muestras de pretratamiento se remiti´ o al laboratorio de microbiolog´ıa para el an´ alisis microbiol´ ogico de los organismos presentes. De los juegos de espec´ımenes por duplicado restantes, uno fue tratado junto con las v´ alvulas card´ıacas por el m´etodo D, E o F. El otro juego fue tratado por el m´etodo Z. Al final de cada periodo de tratamiento, los espec´ımenes fueron recogidos as´epticamente y enviados al laboratorio de microbiolog´ıa para su an´ alisis. Cada juego de espec´ımenes se ensay´o por separado. Las muestras de tejido fueron homogeneizadas vertiendo la muestra en una bolsa de pl´astico est´eril y poni´endola en un homogeneizador Stomacher durante 30 a 60 segundos. Las muestras de tejido homoge33

ES 2 192 676 T3 neizadas se cultivaron en los medios siguientes: placa de agar sangre; placa de agar chocolate; placa de agar sangre (anaerobio); caldo de tioglicolato enriquecido; agar de Sabouraud con gentamicina; y agar de infusi´ on de Sabouraud con sangre. 5

Tanto las placas de agar sangre como las de agar chocolate fueron incubadas en aire con 5 %-10 % de CO2 a 35◦C durante 4 d´ıas, y se observaron los d´ıas 2◦ y 4◦. Los tubos de caldo de tioglicolato fueron inodicamente cubados a 35◦ C durante 14 d´ıas y se observaron diariamente durante los 7 primeros d´ıas y peri´ a continuaci´ on. Las placas de agar de Sabouraud se incubaron a 30◦C, y las placas de observaron 2 veces la primera semana y de nuevo a los 14 d´ıas.

10

Los cultivos se observaron visualmente para ver si hab´ıa crecimiento. Se prepararon tinciones gram de todos los cultivos positivos y de cualquier caldo de tioglicolato negativo para confirmar las observaciones visuales “negativas”. Se utilizaron pruebas microbiol´ ogicas aceptadas de la t´ecnica actual, para identificar los cultivos positivos. 15

Los resultados de los an´ alisis microbiol´ ogicos se presentan como sigue: Metodo d frente a metodo H 20

25

Metodo e frente a metodo H 30

35

40

Metodo f frente a metodo H

45

50

Resultados acumulados 55

60

34

ES 2 192 676 T3

5

No se observ´ o crecimiento bacteriano ni f´ ungico en ninguno de los espec´ımenes del m´etodo H. As´ı, el C´ octel E es superior a los C´octeles B y C (usados individualmente o en combinaci´ on en los M´etodos D, E y F) en la inhibici´ on del crecimiento bacteriano, as´ı como el crecimiento de levaduras. No se observ´o crecimiento bacteriano ni f´ ungico en ninguno de los espec´ımenes del M´etodo H. As´ı, el C´ octel E es superior a los C´octeles B y C (usados individualmente o en combinaci´ on en los M´etodos D, E y F) en la inhibici´ on del crecimiento bacteriano, as´ı como el crecimiento de levaduras. Se pretende que la descripci´ on detallada precedente sea considerada ilustrativa y no limitante, y se ha de entender que son las reivindicaciones que siguen las que definen el alcance de esta invenci´ on.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

35

ES 2 192 676 T3 REIVINDICACIONES 1. Un c´ octel de antibi´ otico para descontaminar tejidos para trasplante, que comprende: 5

anfotericina B y fluconazol como agentes antif´ ungicos; y una diversidad de agentes antibacterianos;

10

estando los agentes presentes en cantidades efectivas para inhibir sustancialmente el crecimiento de levaduras y bacterias, manteniedo al mismo tiempo sustancialmente la viabilidad del tejido. 2. El c´ octel de antibi´oticos seg´ un la reivindicaci´ on 1a¯ , en el que los agentes antibacterianos comprenden vancomicina e imipenem.

15

20

3. El c´ octel de antibi´oticos seg´ un la reivindicaci´ on 2a¯ , en el que los agentes antibacterianos comprenden adem´ as netilmicina. 4. El c´ octel de antibi´ oticos seg´ un la reivindicaci´ on 1a¯ , en el que la anfotericina est´ a presente en una concentraci´on de aproximadamente 0,3 µg/ml a aproximadamente 2,0 µg/ml y el fluconazol est´a presente en una concentraci´ on de aproximadamente 50 µg/ml a aproximadamente 100 µg/ml. 5. El c´ octel de antibi´oticos seg´ un la reivindicaci´ on 4a¯ , en el que los agentes antibacterianos comprenden vancomicina e imipenem.

25

30

6. El c´ octel de antibi´ oticos seg´ un la reivindicaci´ on 5a¯ , en el que la vancocina est´a presente en una concentraci´on de aproximadamente 50 µg/ml y el imipenem est´a presente en una concentraci´ on de aproximadamente 10 a 100 µg/ml. a presente en una 7. El c´ octel de antibi´ oticos seg´ un la reivindicaci´ on 6a¯ , en el que la anfotericina est´ concentraci´on de 0,3 µg/ml, el fluconazol est´a presente en una concentraci´on de 100 µg/ml, la vancomicina est´a presente en una concentraci´on de 50 µg/ml y el imipenem est´a presente en una concentraci´on de 96 µg/ml.

35

8. El c´ octel de antibi´oticos seg´ un la reivindicaci´ on 5a¯ , en el que los agentes antibacterianos comprenden adem´ as netilmicina.

40

9. El c´ octel de antibi´ oticos seg´ un la reivindicaci´on 8a¯ , en el que, la vancomicina est´a presente en una concentraci´ on de aproximadamente 50 µg/ml, el imipenem est´a presente en una concentraci´on de aproximadamente 10-100 µg/ml y la netilmicina est´ a presente en una concentraci´on de aproximadamente 20-50 µg/ml.

45

10. El c´ octel de antibi´ oticos seg´ un la reivindicaci´ on 9a¯ , en el que la anfotericina B est´ a presente en una concentraci´ on de 1,0 µg/ml, el fluconazol est´a presente en una concentraci´on de 100 µg/ml, la vancomicina est´a presente en una concentraci´ on de 50 µg/ml, el imipenem est´a presente en una concentraci´ on de 96 µg/ml y la netilmicina est´ a presente en una concentraci´on de 50 µg/ml. 11. Un m´etodo para descontaminar un tejido para trasplante, que comprende:

50

poner en contacto el tejido con el c´ octel de antibi´ oticos seg´ un una cualquiera de las reivindicaciones 1a¯ a 10a¯ a una temperatura y durante un periodo de tiempo efectivos para inhibir sustancialmente el crecimiento de levaduras y bacterias, manteniendo sustancialmente la viabilidad del tejido. 12. El m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 11a¯ , en el que el tejido es una v´ alvula card´ıaca, un vaso, peri-

55

60

36

ES 2 192 676 T3 cardio o tejido musculoesquel´etico. 13. El m´etodo seg´ un la reivindicaci´ on 12a¯ , en el que la temperatura es 35-39◦C y el periodo de tiempo es 24-48 horas. 5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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