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REGISTRO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

k ES 2 016 476 kN´umero de solicitud: 8902421 kInt. Cl. : C12P 37/02

11 N.◦ de publicaci´ on: 21

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˜ ESPANA

C12N 9/00 C12N 9/10 //A61K 31/43

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PATENTE DE INVENCION

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73 Titular/es: Antibi´ oticos, S.A.

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72 Inventor/es: Mart´ınez Blanco, Honorina;

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

22 Fecha de presentaci´ on: 10.07.89

45 Fecha de anuncio de la concesi´ on: 01.11.90

45 Fecha de publicaci´ on del folleto de patente:

01.11.90

k

Antonio L´ opez, 111 28026 Madrid, ES

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Reglero Chill´ on, Angel; Rodr´ıguez Aparicio, Leandro y Luengo Rodr´ıguez, Jos´ e M.

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k kResumen:

54 T´ıtulo: Procedimientos para sintetizar penilacetil - CoA y para producir bencilpenicilina. 57

Procedimientos para sintentizar fenilacetil-CoA y para producir bencilpenicilina. La s´ıntesis de fenilacetil-CoA se efect´ua incubando fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida con ATP, CoA, ´acido fenilac´etico y Cl2 Mg, a una temperatura de 10-45◦C y un pH de 5,0-10,0, durante 10180 minutos. La producci´on de bencilpenicilina comprende incubar fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida y acil-CoA:6-APA aciltransferasa de Penicillium chrysogenum con ´acido 6-aminopenicil´anico, ´acido fenilac´etico, ATP, CoA y Cl2 Mg, a una temperatura de 10-40◦C y un pH de 5,5-9,0, durante 30-180 minutos. El invento es aplicable a la producci´on bioqu´ımica de antibi´ oticos β-lact´amicos.

Venta de fasc´ ıculos: Registro de la Propiedad Industrial. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

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2 016 476 DESCRIPCION

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La presente invenci´on se encuadra dentro del campo t´ecnico de la producci´ on de antibi´ oticos βlact´ amicos utilizando t´ecnicas de Bioqu´ımica y, concretamente, se refiere al acoplamiento de enzimas de distinto origen microbiano con el objeto de obtener “in vitro” bencilpenicilina mediante un sistema que permite reproducir las etapas biosint´eticas utilizadas por P. chrysogenum “in vivo”. Aunque la bios´ıntesis de penicilina G (bencilpenicilina) ha sido objeto de numerosos estudios, hasta la fecha no se hab´ıa logrado la s´ıntesis enzim´atica “in vitro” de este antibi´ otico mediante la incubaci´ on de enzimas de esta ruta con diferentes intermediarios biosint´eticos (isopenicilina N, ´acido 6-aminopenicil´ anico, δ-L-α-aminoadipil -L-cisteinil-D-valina), CoA y ´acido fenilac´etico conjuntamente. La raz´ on fundamental de esta falta de resultados positivos era que no se dispon´ıa de un sistema enzim´atico que catalizase “in vitro” la formaci´ on de fenilacetil-CoA. Esta mol´ecula es el substrato natural que aporta el resto de a´cido fenilac´etico presente en la mol´ecula de penicilina G y, por tanto, sin ella no se pod´ıa lograr la s´ıntesis del antibi´ otico desde sus componentes b´asicos (CoA, fenilac´etico e isopenicilina N o 6-APA). Espec´ıficamente, todas las descripciones recogidas en la literatura cient´ıfica y/o en patentes se refieren a alguna de las enzimas individualmente consideradas, pero no existe ninguna publicaci´ on en que se describa su acoplamiento “in vitro”. Adem´ as, la fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas p´ utida U es una enzima nueva descrita por la solicitante por primera vez en esta patente. Como ejemplos m´ as destacados de la t´ecnica anterior pertinente, se incluyen a continuaci´on algunas referencias respecto a trabajos realizados con las enzimas individuales: – Isopenicilina N Sintetasa de Penicillium chrysogenum. 1) Ramos, F.R.; L´opez-Nieto, M.J.; and Mart´ın, J.F. (1.985). Isopenicillin N synthetase of P. chrysogenum, an enzyme that convert δ-(L-α-amino-adipyl) -L-cysteinyl-D-valine to isopenicillin N. Antimicrob. Agents Chemother 27: 380-87. 2) Luengo, J.M.; Alemany, M.T.; Salto F.; Ramos, F.; L´ opez-Nieto, M.J. and Mart´ın, J.F. (1986), Direct enzymatic synthesis of penicillium G using cyclases of Penicillium chrysogenum and Acremonium chrysogenum. Bio/Tecnology 4: 44-47. – Acil-CoA:6-APAciltransferasa de Penicillium chrysogenum.

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1) Luengo, J.M.; Iriso, J.L. and L´opez-Nieto, M.J. (1986), Direct evaluation of phenylacetylCoA:6 -aminopenicillanic acid acyltransferase of Penicillim chrysogenum by bioassay. J. Antibiotics 39: 1565-1573. 45

2) Alonso, M.J.; Bermejo, F.; Reglero, A.; Fern´ andez -Ca˜ no´n, J.M.; Gonz´ alez de Buitrago, G. and Luengo, J.M. (1988). Enzymatic synthesis of penicillins. J. Antibiotics 41: 1074-1084. 50

– Fenilacetil-CoA ligasa de Penicillium chrysogenum

1) Brunner, R., and Rohr, M. (1975). Phenacyl-CoA ligase. Methods Enzymol. 43: 476-481. 55

2) Kogekar, R., and Deshpande, N.V. (1982). Biosynthesis of penicillin “in vitro”, Part II. Purification and properties of phenyl/phenoxyacetic acid activating enzyme. Indian J. Biochem. Biophys, 19: 257-261. 60

3) Luengo, J.M. (1989). Recent advances in the enzymatic synthesis of penicillins. Progr. Ind. Microbiol. 27: 315-332.

2

2 016 476 Una vez establecidos los antecedentes de la presente invenci´on, se ofrece seguidamente una exposici´on detallada de la misma haciendo referencia a los dibujos adjuntos y consignando ejemplos concretos de realizaci´on pr´ actica. 5

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Figura 1(a). Cromatograma realizado mediante HPLC del producto de la reacci´ on generado cuando se incub´ o la enzima PA-CoAL con ATP, CoA, PAA y MgCl2 en las condiciones descritas; (b) Idem sin CoA; (c) cromatograma de PA-CoA comercial. Figura 2(a). Cromatograma realizado mediante HPLC del producto de reacci´on generado cuando se acoplaron “in vitro” las enzimas PA-CoAL y AT; (b) Cromatograma de bencilpenicilina pura. Figura 3. Bioensayo frente a Micrococcus luteus del producto de reacci´ on obtenida (a) tras incubar PA-CoAL y AT en las condiciones descritas y (b) idem sin CoA.

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Figura 4 (a). Cromatograma realizado mediante HPLC del producto de reacci´on generado cuando se acoplaron “in vitro” PA-CoA ligasa IPNS y AT (b) Idem sin ACV ni CoA.

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La presente invenci´on trata del aislamiento y purificaci´on de una nueva enzima (fenilacetil-CoA ligasa) de Pseudomonas putida y su acoplamiento “in vitro” con las enzimas de la ruta biosint´etica de penicilinas, isopencilina N sintetasa y acil-CoA: 6-APA (IPN) aciltransferasa (tambi´en denominada fenilacetil-CoA: 6-APA (IPN) fenilacetil -transferasa) con objeto de lograr la s´ıntesis “in vitro” de bencilpenicilina a partir de sus intermediarios biosint´eticos elementales.

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Aunque hay publicadas descripciones acerca de la existencia de una enzima parecida en P. chrysogenum hasta el momento no se hab´ıa logrado la s´ıntesis enzim´atica de bencilpenicilina utilizando un sistema acoplado que permitiese obtener este antibi´otico simulando el proceso llevado a cabo por P. chrysogenum “in vivo”.

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Tal y como se aprecia en el diagrama 1 la ruta biosint´etica de penicilinas en P. chrysogenum es una v´ıa metab´ olica lineal y ramificada que conduce por una parte a la bios´ıntesis del amino´ acido esencial L-lisina y por otra a la de diferentes antibi´ oticos β-lact´amicos denominados gen´ericamente penicilinas.

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2 016 476 DIAGRAMA 1 Ruta biosint´etica de L-lisina y penicilinas en P. chrysogenum 5

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Entre los diferentes antibi´ oticos β-lact´amicos se incluyen bencilpenicilina (penicilina G), parahidroxibencil-penicilina (penicilina X), fenoximetilpenicilina (penicilina V) y diferentes penicilinas naturales 4

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(isopenicilina N, penicilina DF, penicilina F y penicilina K entre otras), La rama metab´olica que conduce a la bios´ıntesis de bencilpenicilina incluye varias etapas biosint´eticas, catalizadas por enzima diferentes, que transcurren tal y como a continuaci´ on se detalla. En primer lugar el a´cido α-aminoad´ıpico, precursor com´ un de L-lisina y penicilinas, se condensa con una mol´ecula de L-ciste´ına y otra de L-valina dando origen a un trip´eptido carente de actividad antibacteriana y cuya estructura es δ-(L-α-aminoadipil)-Lcisteinil-D -valina (al que en adelante nos referiremos como ACV). Este compuesto es producto de la reacci´on catalizada por una sola enzima, ACV-sintetasa o trip´eptido sintetasa. En una etapa posterior, la mol´ecula de ACV es transformada por otra enzima (denominada isopenicilina N sintetasa, ACV-ciclasa o simplemente ciclasa) en isopenicilina N (IPN) en presencia de O2 , a´cido asc´orbico e iones Fe2+ . La IPN es la primera mol´ecula de la v´ıa dotada con actividad antibacteriana (fundamentalmente frente a g´ermenes Gram +). En la mol´ecula de IPN se mantiene completa la estructura del ACV aunque sufre una modificaci´ on considerable: los restos de L-ciste´ına y D-valina se ciclan dando origen a los anillos β-lact´amico y tiazolid´ınico mientras que la mol´ecula de a´cido L-α-aminoad´ıpico (α-AAA) permanece como tal dando lugar a la cadena lateral de esta penicilina. La etapa final de bios´ıntesis de penicilinas consiste en el intercambio del resto de α-AAA presente en la IPN por otras mol´eculas (que en adelante denominaremos R) de origen end´ogeno (´ acido hexanoico, hexenoico, octanoico, etc) o ex´ogeno (´ acido fenilac´etico, fenoxiac´etico, parahidroxifenilac´etico y otros) generando distintas penicilinas con un mayor espectro antibacteriano. Esta etapa se realiza al menos mediante dos pasos enzim´aticos diferentes. En el primero se produce la activaci´ on del precursor de la cadena lateral (R) mediante su condensaci´ on con una mol´ecula de coenzima A (CoA) formando el aut´entico intermediario biosint´etico (R-CoA). En el caso espec´ıfico de bencilpenicilina (que posee como grupo R una mol´ecula de ´acido fenilac´etico) esta reacci´on es catalizada por la enzima fenilacetil-CoA ligasa. La segunda reacci´ on de esta etapa consiste en el intercambio del resto de L-α-AAA de la IPN por alguno de los derivados anteriormente citados (R-CoA) con la consiguiente liberaci´on de los productos (bencilpenicilina, CoA y L-α-AAA). La enzima que lleva a cabo esta reacci´on es la acil-CoA: 6-APA (IPN) aciltransferasa. Esta prote´ına cataliza tanto la transacilaci´ on entre el α-AAA de la IPN y el grupo R del tio´ester (R-CoA) como la acilaci´on directa del grupo amino del 6-APA. Sin embargo, se ha visto que aunque extractos libres de c´elulas de P. chrysogenum conteniendo esta enzima, son capaces de transacilar, la prote´ına pura a homogeneidad u ´nicamente cataliza la acilaci´on del 6-APA. La raz´ on de este diferente comportamiento parece deberse a que durante el proceso de purificaci´on se pierde una actividad amidoli´ asica (que puede estar ligada a la misma enzima o no) y que es responsable de la hidr´olisis del resto de α-aminoad´ıpico presente en la mol´ecula de isopenicilina N. Hasta la fecha se hab´ıan descrito la puesta a punto de sistemas que permit´ıan la s´ıntesis de bencilpenicilina utilizando las enzimas isopenicilina N sintetasa (IPNS) y acil-CoA-6APA (IPN) aciltransferasa (AT) en presencia de los substratos correspondientes (ACV o IPN/6 -APA, DTT y fenilac´eticil-CoA). Sin embargo nunca se hab´ıa conseguido la s´ıntesis “in vitro” de este antibi´ otico se se subsist´ıa el fenilacetilCoA por sus componentes libres (´ acido fenilac´etico o alguna de sus sales y CoA). La raz´on fundamental de estos resultados negativos ha sido el no disponer (bien por la falta de repetitividad en los ensayos o bien por los bajos niveles detectados) de una enzima capaz de sintetizar “in vitro” eficientemente fenilacetilCoA. Por esta raz´on nosotros recurrimos a otros microorganismos tratando de identificar y aislar a partir de ellos una prote´ına que fuese capaz de catalizar la condensaci´ on del a´cido fenilac´etico y CoA originando fenilacetil-CoA. Para ello se utilizaron medios selectivos caracterizados por ser qu´ımicamente simples (de composici´ on definida) y en los que se inclu´ıa como u ´ nica fuente de carbono el a´cido fenilac´etico o alguna de sus sales metabolizables. Siguiendo esta t´ecnica pudimos seleccionar varios microbios capaces de utilizar el ´acido fenilac´etico como fuente de la energ´ıa necesaria para su multiplicaci´ on (varias estirpes de E. coli, Enterobacter aglomerans varias especies correspondientes al g´enero Kbebsiella y diferentes estirpes de Pseudomonas putida. Entre todas ellas la que mostr´ o una mayor actividad fenilacetil-CoA lig´ asica (PA-CoA lig´asica) fue P. putida U. La enzima fenilacetil -CoA ligasa (PA-CoAL) de esta capa de P. putida cataliza la conversi´on de a´cido fenilac´etico (o de sus sales no t´oxicas) a fenilacetil-CoA en presencia de ´acido fenilac´etico o de dichas sales, de ATP, CoA y MgCl2 . La reacci´on transcurre cuando la mezcla se incuba a unas temperaturas comprendidas entre 10 y 45◦C en un medio de reacci´on que contiene los substratos arriba indicados en soluci´ on acuosa tamponada en un intervalo de pH que oscila entre 5,0 y 10,0. Si se omite cualquiera de los substratos del sistema de reacci´ on no se produce s´ıntesis de fenilacetilCoA. Esta enzima cataliza tambi´en la formaci´ on de fenilacetilhidroxamato en presencia de hidroxilamina. Sin embargo, y a diferencia de otras acil-CoA ligasas o acil-CoA sintetasas, la fenilacetil-CoA ligasa de P. putida requiere la presencia de todos los substratos para la formaci´on de fenilacetil-hidroxamato. Por otra parte este enzima es espec´ıficamente inducida por fenilac´etico y muestra una especificidad de substrato limitada (reconoce como substratos el ´acido fenilac´etico al ´acido ac´etico, y al ´acido but´ırico) y adem´ as tiene una especificidad de substrato muy diferente de las acil-CoA ligasas inducidas en esta misma bacteria por ´acido ac´etico, ´acido but´ırico y ´acido octanoico. Por todo lo expuesto concluimos que la fenilacetil-CoA 5

2 016 476 ligasa de P. putida es una enzima diferente que no ha sido descrita hasta la fecha.

5

La fenilacetil-CoA ligasa de P. putida cataliza la conversi´on de fenilac´etico a fenilacetil-CoA a unas temperaturas e intervalo de pH similares a los descritos para alguno de los enzimas que participan en la ruta biosint´etica de bencilpenicilina (IPNS y AT) lo que suger´ıa que era posible conseguir su acoplamiento “in vitro” con ellas manteniendo los par´ ametros f´ısico-qu´ımicos ´optimos para todas estas enzimas. De esta forma podr´ıa conseguirse un sistema enzim´atico funcional tal como se muestra en el siguiente Diagrama 2. Diagrama 2 – Sistema enzim´ atico que acoplado “in vitro” conduce a la bios´ıntesis de bencilpenicilina.

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PA-Coa L → AMP + PPi + PA-CoA Mg2+

1) ATP + CoA + PAA

6-APA + PA-CoA 15

ATP + PAA + 6-APA 20

2) ATP + CoA + PAA

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ACV

AT → PG + CoA DTT

PA-CoA L → AMP + PPi + PG AT, Mg2+

PA-CoA L → AMP + PPi + PA-CoA Mg2+ INPS → IPN O2 , Fe2+ , DTT Ascorbato

IPN + PA-CoA 30

ATP + PAA + ACV 35

AT → α-AAA + PG + CoA DTT

PA-CoA L → AMP + PPi + α-AAA + PG IPNS, AT, O2 Fe2+ , DTT, Ascorbato

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PA-CoAL: Fenilacetil-CoA ligasa; IPNS: Isopenicilina N sintetasa; AT: acil-CoA: 6-APA (IPN) aciltransferasa; PAA: a´cido fenilac´etico; PA-CoA; fenilacetil-CoA; IPN: isopenicilina N; α-AAA: a´cido αaminoad´ıpico; ACV: δ-(L-α-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina; DTT; ditiotreitol. 1, balance del acoplamiento PA-CoAL y AT. 2, Idem PA-CoAL, IPNS y AT. 45

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La invenci´on de los m´etodos objeto de la presente solicitud de patente comprende la obtenci´ on de la enzima fenilacetil-CoA ligasa de P. putida o de otros microbios capaces de creer en medios qu´ımicamente definidos en cuya composici´ on se incluye una fuente de nitr´ ogeno, una fuente de f´ osforo diversas sales inorg´ anicas cuyos cationes sean Mg2+ , Fe2+ , K+ y Na+ , vitaminas (si son requeridos por el microorganismo) y como fuente de carbono a´cido fenilac´etico o alguna de sus sales no t´ oxicas. Adem´ as es preciso que dichos microorganismos activen el fenilac´etico o fenilacetil-CoA en el primer paso enzim´ atico de la ruta degradativa espec´ıfica para este compuesto. Los par´ ametros f´ısico-qu´ımicos deben ser los adecuados para el crecimiento del microbio: pH entre 5 y 9; temperatura de incubaci´ on entre 20 y 40◦C y una agitaci´ on que no debe ser inferior a 50 rpm.

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La obtenci´on de extractos libres de c´elulas conteniendo la actividad fenilacetil-CoA lig´asica es un paso previo para su purificaci´ on y su posterior acoplamiento “in vitro” con las enzimas IPNS y AT de P. chrysogenum. 60

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2 016 476 Ejemplo 1 Purificaci´ on de la enzima fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida 5

La bacteria P. putida se inocul´o en un medio correspondiendo a las caracter´ısticas del arriba descrito y que conten´ıa en g/l: KPO4 H2 , 13,6 g; (NH4 )2 SO4 ; 2,0; MgSO4 . 7H2 O, 0,25, FeSO4 . 7H2 O, 0,0005; biotina, 0,001 y ´acido fenilac´etico, 1,36. El pH del medio se ajust´ o a pH 7,0 con KOH. La incubaci´ on se o realiz´ o a 29 * 2◦ C en matraces Erlenmeyer de 2 l conteniendo 250 ml de medio. Cada matraz se inocul´ con 5 ml de una suspensi´ on bacteriana cuya absorbancia a 540 nm era de 1,0.

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P. putida se hizo crecer en ese medio durante 14-15 h manteniendo una agitaci´ on constante de 200 rpm. A este tiempo las c´elulas (28 g de peso h´ umedo) se recogieron por centrifugaci´ on (10.000 x g durante on amortiguadora 10 minutos a 2◦C)m se lavaron con agua esteril y se resuspendieron en 115 ml de soluci´ Tris/HCl 500 mM ajustado a pH 8,2 que conten´ıa adem´ as mercaptoetanol (5 mM) ´acido etilendiaminotetrac´etico (EDTA, 4 mM) y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF, 1 mM). Las c´elulas se rompieron con 100 g de perlas de vidrio (Ballotini, 0,17-0,18 mm de di´ ametro) utilizando un desintegrador de c´elulas modelo Braun MSK refrigerado con nieve carb´ onica. Las c´elulas no rotas y los componentes particulados de gran tama˜ no se eliminaron mediante centrifugaci´on a 17.000 x g durante 10 min a 2◦ C. El sobrenadante conteniendo la actividad enzim´ atica requerida se precipit´o con sulfato am´onico. La fracci´on que precipitaba entre el 20 y 45%de sulfato am´ onico (referido a % de saturaci´on) y que conten´ıa la casi totalidad de la enzima fenilacetil-CoA ligasa se recogi´o y se disolvi´o en 22 ml de la siguiente soluci´ on amortiguadora: odico 1 mM; DTT, 4 mM; EDTA 4 mM; K2 PO4 H/KPO4 H2 , 10 mM; pH 7,15 que conten´ıa ascorbato s´ on PG). La soluci´ on se ultracentrifug´ o a 250.000 x MgCl2 5 mM y glicerol (20 % peso/volumen) (tamp´ o para los g durante 45 min a 2◦ C y el sobrenadante conteniendo la enzima objeto de estudio se utiliz´ siguientes pasos. La purificaci´ on de la enzima requiere la presencia de glicerol (20% p/v) en el tamp´on ya que su ausencia conduce a una inevitable p´erdida de la actividad enzim´ atica.

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El proceso de purificaci´ on se desarroll´o siguiendo los pasos indicados en la Tabla I siguiente: TABLA I Purificaci´ on de la enzima PA-CoA ligasa de P. putida

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Volumen

Prote´ına (mg)

Enzima actividad (U)

Actividad espec´ıfica (U/mg)

Rendimiento %

Purificaci´on (veces)

122 22 20

1,483 443 385

60.720 59.451 58.735

40,94 134,20 152,56

100 98 97

1 3,27 3,73

30

320

53.518

167,24

88

4,08

1

21,6

42.100

1.949,07

69

47,61

21,4

3

11.207

3.735,66

18

91,25

1

0,68

3.131

4.604,41

5,1

112,47

3,1

0,033

693

21.000

1,1

512,95

Tratamiento 40

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Extracto crudo Precipitaci´on (20-45%) Ultracentrifugaci´on (250.000 x g, 45 min) Elu´ıdo de Sephadex G-25 (PD-10) Elu´ıdo de DEAE-Sephacel (1) (0,18 M KCl; fracciones 27-32 concentradas) Elu´ıdo de Sephadex G-200 (fracciones 37-43) Elu´ıdo de DEAE-Sephacel (gradiente 0,08-0,16 M KCl) fracciones 13-18 concentradas Elu´ıda de Sephacryl S-200 eluate (fracci´on n◦ 36)

(1) La muestra se ajust´ o a pH 6,25 y se pas´o a trav´es de una columna de DEAE-Sephacel equilibrada con 7

2 016 476 tamp´ on PG ajustado a ese pH. La columna se lav´o con 45 ml de esta soluci´on amortiguadora y despu´es con otros 45 ml del mismo tamp´ on ajustado a pH 7,15. DEAE Sephacel (1): fracciones de 2,83 ml; Sephadex G-200: fracciones de 3,06; DEAE Sephacel: fracciones de 2,0 ml; Sephacryl S-200: fracciones de 3,5 ml. 5

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La actividad fenilacetil-CoA lig´asica se sigui´o durante el proceso de purificaci´ on valorando por HPLC la aparici´on del producto de reacci´ on: fenilacetil-CoA (PA-CoA). Para ello se utiliz´ o un cromat´ ografo modelo Spectra-Physic SP 8800 equipado con un detector UV/VIS (SP 84500), un integrador computerizado (modelo SP 4290) y una columna microparticulada de fase reversa (RP-8) (Spheri-5, 220 x 4 6 mm) suministrada por Brownlee Laboratories. La fase m´ ovil usada fue fosfato 0,2 M, pH 4,5 e isopropanol (93:7 v/v). El caudal se mantuvo a 1,5 ml/min y el eluato se sigui´o a 254 nm. En estas condiciones a los tiempos de retenci´on para el a´cido fenilac´etico, y para el fenilacetil-CoA fueron 5 y 11 minutos respectivamente. En estas mismas condiciones el ATP, CoA y 6-APA eluyen en los tres primeros minutos mientras que la bencilpenicilina tiene un tiempo de retenci´on de 19,3 minutos.

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Ejemplo 2 S´ıntesis enzim´ atica de fenilacetil-CoA 20

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El compuesto fenilacetil-CoA, intermediario biosint´etico de la bencilpenicilina, se obtuvo mediante una reacci´on enzim´atica catalizada por la enzima fenilacetil-CoA ligasa en presencia de ATP, fenilacetato pot´ asico, CoA y MgCl2 . La mezcla de reacci´on conten´ıa: MgCl2 0,2 M, 12,5 µl; ATP 0,1 M, 50 µl; CoA 20 mM, 30 µl; fenilacetato pot´asico 0,2 M, 30 µl; soluci´on enzim´atica 100 µl (4 µg de prote´ına pura). Todos on Tris/HCl 50 mM y el pH se ajust´ o a pH los substratos excepto el MgCl2 se hab´ıan disuelto en tamp´ 8,2. El cloruro de magnesio se disolvi´ o en agua destilada. La reacci´on se incub´ o a 30◦C durante 60 min. Al cabo de este tiempo la reacci´on se detuvo mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol para precipitar la prote´ına. La soluci´on una vez filtrada se analiz´ o por HPLC. Como puede apreciarse en la Fig. 1 el producto de reacci´ on tiene un tiempo de reacci´ on id´entico al del fenilacetil-CoA obtenido asico no se detect´o formaci´on de comercialmente. En ausencia de CoA, MgCl2 , ATP o fenilacetato pot´ fenilacetil-CoA. Ejemplo 3

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S´ıntesis “in vitro” de bencilpenicilina mediante la utilizaci´ on de un sistema enzim´ atico acoplado en el que participan las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa de P. chrysogenum Se ha obtenido s´ıntesis “in vitro” de bencilpenicilina mediante la incubaci´ on de las enzimas fenilacetilCoA ligasa de P. putida y la enzima acil-CoA: 6-APA aciltransferasa de P. chrysogenum. La mezcla asico 0,2 reacci´on conten´ıa: MgCl2 0,2 M, 12,5 µl; ATP 0,1 M, 50 µl; CoA 20 mM, 30 µl; fenilacetatopot´ M, 30 µl; sal s´odica del a´cido 6-aminopenicil´anico 0,3 mM, 30 µl; DTT 20 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa pura 100 µl (8 µg de prote´ına) y acil-CoA: 6-APA aciltransferasa 100 µl (10 µg de prote´ına pura). El pH de la reacci´on se ajust´ o a 8,2 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 26◦C durante 3 horas.

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La reacci´on se par´ o mediante la adici´ on de un volumen equivalente de metanol. La presencia de bencilpenicilina se determin´ o (1) por HPLC utilizando el equipo y la fase m´ ovil anteriormente descrita (Fig. 2) y (2) por la aparici´ on de un producto con actividad antibacteriana valorado por bioensayo frente asico o de a Micrococcus luteus ATCC 9341 (Fig. 3). En ausencia de ATP, CoA, MgCl2 fenilacetato pot´ 6-APA no se obtuvo bencilpenicilina. Ejemplo 4

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S´ıntesis “in vitro” de bencilpenicilina mediante la utilizaci´ on de un sistema enzim´ atico acoplado en el que participan las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de P. putida y la isopenicilina N sintetasa y acil-CoA: 6-APA (IPN) aciltransferasa de P. chrysogenum:

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Se ha logrado sintetizar bencilpenicilina “in vitro” mediante la incubaci´on conjunta de las tres enzimas arriba mencionadas en una mezcla de reacci´on que contiene: MgCl2 0,2 M, 12,5 µl; ATP 0,1 M, 50 µl; CoA 20 mM, 30 µl; fenilacetato pot´asico 0,2 M, 30 µl, FeSO4 2 mM, 10 µl, DTT 20 mM, 10 µl; ACV 7 mM, 10 µl; fenilacetil-CoA ligasa 100 µl (8 µg de prote´ına pura); isopenicilina N sintetasa 40 µl (20 µg de prote´ına pura) y acil-CoA-6APA (IPN) acil -transferasa 10 veces purificada 20 µl (60 µg de prote´ına). 8

2 016 476 La adici´on de ascorbato no es necesaria ya que el tamp´on de purificaci´ on de la enzima fenilacetil-CoA ligasa lleva este compuesto.

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El pH de reacci´on se ajust´ o a 8,0 y la incubaci´ on se llev´o a cabo en un ba˜ no termostatizado a 25◦C durante 4 h. La reacci´ on se par´ o mediante la adici´on de un volumen equivalente de metanol y la presencia de bencilpenicilina se determin´ o por HPLC de acuerdo con las condiciones descritas en los Ejemplos 2 y 3 (Fig. 4). En ausencia de ACV o alguno de los substratos requeridos por la enzima fenilacetil-CoA ligasa no se produjo s´ıntesis de bencilpenicilina. El establecimiento de un sistema enzim´atico acoplado que conduce a la bios´ıntesis de bencilpenicilina “in vitro” permite estudiar los par´ametros cin´eticos del sistema a fin de obtener una s´ıntesis eficiente de bencilpenicilina y de este modo hacerlo u ´ til desde el punto de vista industrial no solo para la obtenci´ on de esta mol´ecula sino tambi´en para la de otras penicilinas cuya cadena lateral sea susceptible de ser activada al CoA derivado y posteriormente reconocida por las dem´ as enzimas del sistema.

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2 016 476 REIVINDICACIONES

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1. Un procedimiento para la s´ıntesis “in vitro” de fenilacetil-CoA, que es un producto intermedio en la bios´ıntesis de bencilpenicilina, caracterizado porque comprende incubar la enzima fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida con los substratos ATP, CoA, a´cido fenilac´etico y Cl2 Mg, llev´andose a cabo la on acuosa tamponada en un interincubaci´ on a una temperatura comprendida entre 10 y 45◦C, en soluci´ valo de pH que oscila entre 5,0 y 10,0, durante un periodo de tiempo comprendido entre 10 y 180 minutos. 2. Un procedimiento para la producci´ on enzim´atica de bencilpenicilina en el que se forma in situ fenilacetil-CoA seg´ un el procedimiento de la reivindicaci´on 1, caracterizado porque comprende incubar un sistema enzim´atico acoplado constituido por las enzimas fenilacetil-CoA ligasa de Pseudomonas putida y la enzima acil-CoA:6-APA aciltransferasa de Penicillium chrysogenum y, como substratos, los siguientes compuestos: ´acido 6 -aminopenicil´anico, a´cido fenilac´etico, ATP, CoA y Cl2 Mg, llev´andose a on acuosa tamponada en cabo la incubaci´ on a una temperatura comprendida entre 10 y 40◦C, en soluci´ un intervalo de pH que oscila entre 5,5 y 9,0, durante un periodo de tiempo comprendido entre 30 y 180 minutos. 3. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 2, caracterizado porque el sistema enzim´ atico comprende adem´ as la enzima isopenicilina N-sintetasa, y porque los substratos est´an constituidos por ATP, odico o pot´ asico y el trip´eptido δ-L-α -amino-adipil-L-cisteinil-D-valina, conteCoA, Cl2 Mg, fenilacetato s´ on niendo la mezcla de reacci´on adicionalmente ascorbato s´odico e iones Fe2+ , llev´andose a cabo la incubaci´ on acuosa tamponada en un intervalo de pH a una temperatura comprendida entre 10 y 40◦ C, en soluci´ que oscila entre 6 y 9, durante un tiempo comprendido entre 20 y 240 minutos. 4. Un procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 2, caracterizado porque el sistema enzim´ atico comprende las enzimas acetil-CoA:6-APA aciltransferasa de cepas de Penicillium chrysogenum capaces de producir penicilinas G, V, K, DF, F, X y penicilinas con cadenas laterales hidr´ ofobas, y la enzima fenilacetil-CoA ligasa de especies de bacterias pertenecientes a los g´eneros Pseudomonas, Escherichia, Enterobacter y Klebsiella, que, cultivadas en medios suplementados con ´acido fenilac´etico o sus sales, sean capaces de catabolizar dichos compuestos por activaci´on convirti´endolos en fenilacetil-CoA.

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