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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k kInt. Cl. : A61K 38/51

11 N´ umero de publicaci´on:

2 177 240

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˜ ESPANA

A61K 48/00 C12N 9/88 C12N 15/60

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 99906067.6 kFecha de presentaci´on: 27.01.1999 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 1 049 487 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 08.11.2000

T3

86 86 87 87

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54 T´ıtulo: Tratamiento para la porfiria aguda intermitente (PAI) y otras enfermedades porf´ıricas.

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30 Prioridad: 27.01.1998 DK 11298

30.12.1998 DK 174898

Roskildevej 12c 3400 Hellerod, DK

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72 Inventor/es: Fogh, Jens y

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74 Agente: Carpintero L´ opez, Francisco

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.12.2002

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

01.12.2002

ES 2 177 240 T3

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73 Titular/es: HemeBiotech A/S

Aviso:

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Gellerfors, Par

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 177 240 T3 DESCRIPCION Tratamiento para la porfiria aguda intermitente (PAI) y otras enfermedades porf´ıricas. 5

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Campo de la invenci´ on La presente invenci´on se refiere al uso de una cantidad efectiva de catalizador, que es una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del grupo hemo, para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento y prevenci´ on de enfermedades causadas por la ausencia o deficiencia de la actividad de enzimas pertenecientes a la ruta de bios´ıntesis del grupo hemo. M´ as en concreto, la invenci´on ata˜ ne al alivio de los s´ıntomas de ciertas porfirias, de manera notable de la porfiria aguda intermitente, incluyendo la terapia g´enica. Antecedentes de la invenci´ on

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Ruta de bios´ıntesis del hemo El grupo hemo es una mol´ecula esencial para la vida en todas las especies animales superiores vivas. El hemo est´ a involucrado en procesos tan importantes como el transporte de ox´ıgeno (hemoglobina), la desintoxicaci´on de f´ armacos (citocromo P450), y la transferencia de electrones para la generaci´ on de energ´ıa qu´ımica (ATP) durante la fosforilaci´ on oxidativa en las mitocondrias. El grupo hemo se sintetiza en ocho etapas enzim´ aticas consecutivas comenzando con glicina y succinilCoA. Sassa S. 1996, Blood Review, 10, 53-58 muestra un dibujo esquem´ atico de la ruta de bios´ıntesis del hemo indicando que la primera etapa enzim´atica (AAL-sintetasa) y las u ´ltimas tres etapas (coproporfirin´ ogeno oxidasa, protoporfirin´ ogeno oxidasa y ferroquelatasa) est´an localizadas en las mitocondrias, mientras que el resto son enzimas citos´olicas. Una importante regulaci´ on de la ruta de bios´ıntesis del hemo la desarrolla el producto final de la ruta metab´ olica, o sea el hemo, que ejerce una inhibici´ on negativa en la primera etapa enzim´atica limitante (dirigida por AAL-sintetasa) en la ruta de bios´ıntesis del hemo. (Strand y col., Proc. Natl. Acad. Sci. 1970, 67, 1315-1320). Se ha informado que las deficiencias en las enzimas de bios´ıntesis del hemo conducen a un grupo de enfermedades llamadas colectivamente porfirias. Un defecto en la tercera etapa enzim´atica conduce a la porfiria aguda intermitente, PAI. Porfiria Aguda Intermitente

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La porfiria aguda intermitente (PAI) es un trastorno autos´ omico dominante en el hombre causado por un defecto (reducci´ on de la actividad del 50 %) de la tercera enzima en la ruta de bios´ıntesis del hemo, la porfobilin´ ogeno desaminasa, (tambi´en conocida como porfobilin´ ogeno amoniaco-liasa (polimerizante)), E.C.4.3.1.8. (Waldenstr¨ om J. Acta. Med. Scand. 1937 Suppl. 82). En adelante, esta enzima se denominar´ a “PBGD”. Manifestaci´ on cl´ınica de la PAI

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La reducci´on en la actividad enzim´atica PBDG hace que esta enzima sea la del paso limitante en la ruta de bios´ıntesis del hemo, con un aumento concomitante en los niveles urinarios y s´ericos de ´acido delta-aminolevul´ınico (AAL) y de porfobilin´ ogeno (PBG). La manifestaci´on cl´ınica de la PAI conlleva dolor abdominal y una serie de disfunciones neuropsiqui´ atricas y circulatorias. Como resultado del bloqueo enzim´ atico, los precursores del hemo como el porfobilin´ ogeno (PBG) y el a´cido delta-aminolevul´ınico (AAL) son secretados en cantidades excesivas en la orina y en las heces. En ataques agudos, se encuentran niveles altos de PBG y AAL tambi´en en suero. Normalmente estos precursores no son detectables en el suero de individuos sanos. Se piensa que los trastornos neuropsiqui´ atricos observados en estos pacientes se deben a la interferencia de los precursores con el sistema nervioso o debido a la falta de hemo. Por ejemplo, AAL presenta una gran semejanza con el neurotransmisor inhibitorio a´cido 4-aminobut´ırico (GABA) y se ha sugerido que es una neurotoxina. (Jeans J., y col. American J. of Medical Genetics 1996, 65, 269-273).

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El dolor abdominal es el s´ıntoma m´as frecuente en pacientes de PAI y aparece en m´as del 90 % de los ataques agudos, que puede continuar r´ apidamente con el desarrollo de neuropat´ıas perif´ericas con debilidad en m´ usculos proximales, p´erdida de la sensaci´on al pinchazo de alfiler, y parestesia. Tambi´en pueden estar presentes taquicardia, obstipaci´ on y diarrea. Durante los ataques agudos pueden presentarse cambios en el comportamiento, confusi´ on, convulsiones, par´ alisis respiratoria, coma y alucinaciones.

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Tambi´en est´a asociada a la PAI la hipertensi´ on, con el 40 % de los pacientes mostrando una hipertensi´on mantenida entre ataques. Se ha informado sobre la asociaci´ on entre el fallo renal cr´ onico (Yeung L. y col., 1983, Q J. Med 52, 92-98) y la PAI adem´as del carcinoma hepatocelular (Lithner F. y col., 1984, Acta Med. Scand. 215, 271-274). La PAI es una enfermedad de por vida, que se manifiesta generalmente en la pubertad. Factores que precipitan los ataques agudos

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La mayor´ıa de los factores precipitantes est´an asociadas a la enzima del primer paso limitante de la ruta de bios´ıntesis del grupo hemo a trav´es del hemo, el producto final de la ruta. Una disminuci´ on de la concentraci´on de hemo aumentar´ a inmediatamente la tasa de AAL-sintetasa. Una superproducci´on de AAL hace que la enzima parcialmente deficiente PBGD (50 % de actividad) sea ahora la del paso limitante con una acumulaci´ on de los precursores del hemo AAL y PBG. Los f´armacos que inducen al citocromo P450, tales como los barbituratos, los estr´ogenos, las sulfonamidas, la progesterona, la carbamacepina, y la fenito´ına, pueden precipitar los ataques agudos. (Wetterberg L. 1976, en Doss M. Nowrocki P. eds. Porphyrias in Human Disease. Reports of the discussion. Matgurg an der Lahn, 191-202).

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La manifestaci´on cl´ınica es m´as com´ un en mujeres, especialmente durante la menstruaci´ on. Se conoce que factores endocrinos como los estr´ogenos sint´eticos y la progesterona son factores precipitantes. Un factor significativo es tambi´en la falta de aporte cal´ orico suficiente. Por tanto, la suplementaci´ on cal´ orica durante los ataques agudos reduce los s´ıntomas cl´ınicos (Welland F.H. y col. 1964, Metabolism, 13,232).

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Finalmente, se ha mostrado que varias formas de estr´es incluyendo la enfermedad, las infecciones, la cirug´ıa y el exceso de alcohol conducen a la precipitaci´on de ataques agudos. Hay tambi´en casos de ataques agudos donde no se han podido identificar factores precipitantes. Prevalencia de la PAI

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Se ha informado una prevalencia del 0,21 % (Tishler P.V. y col. 1985, Am. J. Psychiatry 142, 14301436), con una prevalencia tan alta como de 1 por cada 1500 en zonas geogr´ aficas aisladas en el norte de Suecia (Wetterberg L. 1967, Svenska bokf¨ orlaget Nordstedt, Stockholm). Se ha informado una prevalencia de hasta 200 por cada 10.000 habitantes de Arjepong en el norte de Suecia. (Andersson, Christer, Thesis, 1997, ISBN 91/7191/280/0, pp. 22-23). Tratamiento existente para la PAI

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El tratamiento para la PAI, adem´ as de para otros tipos de porfirias como la variegata, la coproporfiria hereditaria, la harderoporfiria y la deficiencia de la a´cido aminolevul´ınico deshidratasa, son b´ asicamente los mismos. Todas las terapias existentes para la PAI est´an destinadas a reducir el PGB y AAL circulantes por inhibici´ on de la enzima del paso limitante AAL-sintetasa. Esta inhibici´on de la AAL-sintetasa se consigue por el aumento del hemo circulante, ya que el hemo es un regulador de retroalimentaci´on negativo de la AAL-sintetasa. El tratamiento con hematina, el alto aporte cal´ orico o la inhibici´ on de la descomposici´on del hemo por la administraci´ on de Sn-mesoporfirina son las terapias actualmente empleadas. Estas terapias muestran una eficacia limitada. El tratamiento entre ataques agudos conlleva un aporte cal´ orico suficiente, evitar el consumo de f´ armacos y el tratamiento inmediato de infecciones.

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Los pacientes que experimentan ataques agudos son tratados con carbohidratos intravenosos, normalmente dextrosa (300 g/d´ıa) y hematina intravenosa (3-8 mg/ kg d´ıa).

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Los tratamientos con an´alogos agonistas de LHRH de acci´on prolongada han mostrado que reducen la incidencia de los ataques premenstruales por inhibici´on de la ovulaci´ on en pacientes con PAI. Finalmente, tambi´en se han probado los tratamientos con an´ alogos del hemo como la Sn-mesoporfirina, que inhibe la descomposici´on del hemo. 3

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Necesidad m´edica en la PAI

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Es bien conocida la falta de un tratamiento efectivo para la PAI. En un estudio de mortalidad en los Estados Unidos en pacientes de PAI que requer´ıan hospitalizaci´ on se concluy´o que la tasa de mortalidad era 3,2 veces mayor relacionada con la poblaci´on comparable general.

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El suicidio fue tambi´en una de las principales causas de mortalidad, con una ocurrencia 370 veces mayor que la esperada en la poblaci´ on general (Jeans J. y col. 1996, Am. J. of Medical Genetics 65, 269-273).

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La terapia con hematina se inicia generalmente cuando el aporte cal´ orico elevado no es suficiente para aliviar los ataques agudos. Se han llevado a cabo estudios con hematina, pero en estos estudios generalmente se usaron los pacientes como su propio control despu´es de que no respondieran al tratamiento con carbohidratos (Mustajoki y col. 1989, Sem. Hematol. 26, 1-9). El u ´ nico estudio controlado de un tratamiento con hematina reportado, no alcanz´ o el significado estad´ıstico suficiente debido al uso de un n´ umero demasiado peque˜ no de pacientes (Herrick A.L. y col. 1989, Lancet 1, 1295-1297).

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En conclusi´on, hay una necesidad definitiva de proporcionar procedimientos terap´euticos/ profil´ acticos nuevos destinados a estas enfermedades. Descripci´ on de la invenci´ on 25

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Los niveles de AAL y PBG encontrados en la orina de pacientes con PAI sintom´atica est´an en el intervalo de 1-203 mg/ d´ıa y 4-782 mg/ d´ıa, respectivamente. La excreci´on normal de AAL y PGB es muy baja (0-4 mg/ d´ıa). Es importante el hecho de que estos pacientes tambi´en presentan niveles elevados de AAL y PGB en suero. Se ha mostrado en un estudio que los pacientes con PAI ten´ıan niveles significativamente elevados de AAL (96 µg %) y PBG (334 µg %) en suero relacionados con los ataques agudos y que la severidad de los ataques se correlacionaba con altos niveles de AAL y PGB. Por tanto, es importante reducir los niveles circulantes de AAL y PGB con el fin de eliminar los s´ıntomas cl´ınicos y de normalizar la reserva de hemo. Los presentes inventores muestran una nueva terap´eutica u ´ til en el tratamiento de la PAI, un uso racional de PBGD, preferiblemente PBGD recombinante (rPBGD) con el fin de reducir los altos niveles circulantes de PBG en suero por metabolizaci´on (por conversi´ on enzim´atica) del PBG a hidroximetilbilano (HMB), que es el producto normal de la reacci´ on. Esta terapia de sustituci´ on conducir´ a a la normalizaci´on del PBG en suero adem´as de a la normalizaci´on de la reserva de hemo. Tambi´en conducir´a a la normalizaci´on de AAL en suero, ya que estos precursores del hemo est´an en equilibrio uno con otro. Se espera que una disminuci´ on del AAL y PBG en suero resulte en un alivio concomitante de los s´ıntomas. El producto de la reacci´ on (HMB) difundir´a de vuelta a las c´elulas y se incorporar´a a la ruta de bios´ıntesis normal del grupo hemo, y subsecuentemente ser´ a metabolizado a hemo. Por tanto, la PBGD administrada en inyecci´ on llevar´a a cabo su funci´ on catal´ıtica normal convirtiendo PBG en HMB en suero (extracelularmente, no en el interior de las c´elulas), donde funciona normalmente. La nueva idea terap´eutica se basa en la asunci´on de que AAL, PBG y HMB atraviesan las membranas celulares o son transportados espec´ıficamente a trav´es de ellas. Una alternativa a esto es la administraci´on de una forma de PBGD que sea capaz de actuar intracelularmente, bien como consecuencia de la formulaci´ on o como consecuencia de una modificaci´ on de PBGD para facilitar su entrada a las c´elulas desde el compartimento extracelular. El hecho de que los pacientes con PAI tengan grandes cantidades de estos precursores del hemo en suero apoya la idea de que el PBG no se acumula intracelularmente, sino que se libera desde las c´elulas al suero cuando la concentraci´ on intracelular aumenta debido al bloqueo enzim´ atico de PGBD. El nuevo concepto terap´eutico b´ asico para la PAI es v´alido para todas las porfirias y por tanto la invenci´on est´ a destinada en general al tratamiento de estas enfermedades por sustituci´ on de la actividad enzim´atica perdida o reducida que caracteriza a las porfirias.

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Por tanto, en su aspecto m´as amplio, la invenci´on ata˜ ne al uso de una cantidad efectiva de un catalizador que es una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo o una parte enzim´ aticamente 4

ES 2 177 240 T3 equivalente o su an´alogo junto con un portador farmac´euticamente aceptable para la preparaci´on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad causada por la deficiencia, en un sujeto, de una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo. 5

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Investigaciones alternativas en el tratamiento de las porfirias han sugerido la terapia g´enica, destinada a introducir material gen´etico en c´elulas relevantes que asumir´an la producci´ on in vivo de la enzima de inter´es. Por tanto, por el t´ermino “catalizador” se entiende en este documento o bien la enzima relevante que es sustituida, o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo. Un ejemplo de una parte de la enzima enzim´aticamente equivalente ser´ıa un dominio o subsecuencia de la enzima que ejerciera sustancialmente la misma actividad enzim´atica que la enzima completa o alternativamente un gen que codificara por el catalizador. Un ejemplo de an´ alogo de la enzima enzim´aticamente equivalente podr´ıa ser una prote´ına de fusi´ on que incluyera el sitio catal´ıtico de la enzima en forma funcional, pero tambi´en puede ser una variante hom´ ologa de la enzima derivada de otras especies. Adem´ as, las mol´eculas completamente sint´eticas que imitan la actividad enzim´atica espec´ıfica de la enzima relevante podr´ıan tambi´en constituir “an´ alogos enzim´aticos equivalentes”.

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En esencia, el concepto de la invenci´ on se basa en la idea nueva de sustituir la actividad enzim´ atica reducida en el sujeto simplemente por la administraci´ on de un catalizador que “asistir´ıa” a la enzima que est´a en d´eficit. Sin embargo, la naturaleza precisa del catalizador no es del todo importante. Lo que es importante es s´ımplemente que el catalizador pueda imitar la actividad enzim´ atica in vivo de la enzima. 25

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El t´ermino “la ruta de bios´ıntesis del hemo” se refiere a las etapas enzim´aticas bien conocidas (cf. Por ejemplo Sassa S. 1996, Blood Review, 10, 53-58) que conduce a la obtenci´on de hemo a partir de glicina y succinil-CoA, y las enzimas pertenecientes a esta ruta sint´etica son porfobilin´ ogeno desaminasa (PBGD), AAL deshidratasa, Uroporfirin´ ogeno descarboxilasa, Coproporfirin´ ogeno oxidasa, Coproporfirin´ ogeno oxidativa, Protoporfirin´ ogeno oxidasa, Uroporfirin´ ogeno III sintasa, Ferroquelatasa, y Uroporfirin´ ogeno descarboxilasa. Por tanto, en l´ınea con lo anterior, un catalizador usado de acuerdo con la invenci´on es tal enzima o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo. Debe tenerse en cuenta que todas las enzimas antes mencionadas se han secuenciado, permitiendo as´ı la recombinaci´on o su producci´ on sint´etica.

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Las enfermedades relacionadas con la actividad reducida de estas enzimas son la porfiria aguda intermitente (PAI), porfiria por deficiencia de AAL (PDA), porfiria cutanea tarda (PCT), coproporfiria hereditaria (CPH), harderoporfiria (HDP), porfiria variegata (PV), porfiria eritropoy´ etica cong´enita (PEC), protoporfiria eritropoy´etica (PPE), y porfiria hepatoeritropoy´etica (PHE). 40

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Por el t´ermino “cantidad efectiva” se entiende en este documento una dosis del catalizador que suplementa la falta o deficiencia de la actividad enzim´atica en un sujeto que sufre de porfiria causada por una actividad reducida de una de las enzimas antes mencionadas. La dosis precisa que constituye una cantidad efectiva depender´ a de una serie de factores, como la semivida del catalizador en suero, la actividad espec´ıfica del catalizador, etc, pero la persona experta ser´a capaz de determinar la dosis correcta en un caso dado por medio de procedimientos est´andar (por ejemplo, comenzando con experimentos en un modelo animal adecuado tal como los animales transg´enicos para determinar la correlaci´ on entre la concentraci´on en sangre y la actividad enzim´ atica).

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La enfermedad que es la diana preferida para el procedimiento de la invenci´on es la PAI, y por tanto el catalizador es PBGD o una parte enzim´aticamente equivalente o su an´alogo. Lo m´as adecuado es que el catalizador sea una forma recombinante de la enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo o de la parte enzim´aticamente equivalente o su an´alogo, ya que la producci´on recombinante permitir´ a la producci´ on a gran escala que, con los actuales medios disponibles, no parece posible si la enzima tiene que ser purificada de una fuente natural.

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Las formulaciones y las formas de dosificaci´ on preferidas del catalizador se ejemplifican por, pero no est´an limitadas a, PBGD en la descripci´on detallada que aparece m´as adelante, y estas formulaciones son tambi´en aparentes en las reivindicaciones. Se entender´a que estas formulaciones y las formas de dosificaci´on son aplicables a todos los catalizadores usados de acuerdo con la invenci´on.

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Una forma de realizaci´ on de la invenci´ on importante es una en donde el catalizador, tras la adminis5

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traci´on, ejerce al menos parte de su actividad enzim´atica en el compartimento intracelular. Esto puede conseguirse por ejemplo cuando el catalizador es una parte enzim´ aticamente equivalente o un an´alogo de la enzima, ya que tales variaciones de la enzima pueden ser modificadas para hacer que atraviesen membranas celulares. Por tanto, cuando el catalizador es una enzima artificial peque˜ na o un catalizador org´ anico con capacidad para polimerizar porfobilin´ogeno a hidroximetilbilano, ser´ıa posible para un experto introducir cadenas laterales relevantes que facilitaran la entrada al compartimento intracelular. Alternativamente, el catalizador es la enzima, pero formulada de tal manera que ejerce al menos parte de su actividad enzim´atica intracelularmente tras la administraci´ on al paciente. Esto se puede conseguir marcando la enzima con carbohidratos espec´ıficos u otras estructuras espec´ıficas de la c´elula hep´ atica para la captaci´ on espec´ıfica por parte del h´ıgado, es decir, la enzima (o an´ alogo) es modificada de manera que se facilita el transporte activo al interior de por ejemplo las c´elulas hep´ aticas. Aunque las formas de realizaci´ on anteriores son interesantes, se cree que la forma de realizaci´on normal y pr´ actica de la invenci´on conlleva el uso del catalizador que substancialmente ejerce toda su actividad enzim´atica extracelularmente en el torrente sangu´ıneo, ya que se cree que los productos metab´olicos de la conversi´on enzim´atica del precursor relevante del hemo pasar´ an libremente al interior del compartimento intracelular donde tendr´ an lugar el resto de las conversiones de la ruta de bios´ıntesis del hemo. Alternativamente, el producto metab´ olico puede ser excretado del sujeto por v´ıa urinaria y/o fecal al menos en alguna medida.

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Como se mencion´ o anteriormente, se prefiere que el catalizador sea producido por recombinaci´ on, es decir, por un procedimiento incluyendo

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a) la introducci´on, en un vector adecuado, de un fragmento de a´cido nucleico que incluye la secuencia del a´cido nucleico que codifica el catalizador; b) la transformaci´ on de una c´elula hospedadora compatible con el vector; c) el cultivo de la c´elula hospedadora transformada bajo condiciones que faciliten la expresi´ on de la secuencia del ´acido nucleico; y

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d) la recuperaci´on del producto de expresi´ on del medio de cultivo y opcionalmente someter al producto de expresi´on a un procesado postraduccional, tal como el replegamiento de prote´ına in vitro, la eliminaci´on enzim´ atica de compa˜ neros de fusi´ on, la alquilaci´ on de residuos de amino´acido, y la desglicosilaci´on, de manera que se obtenga el catalizador. En el caso de catalizadores relativamente peque˜ nos (por ejemplo, aquellos constituidos principalmente por el sitio activo de la enzima), el catalizador puede prepararse alternativamente por s´ıntesis pept´ıdica en fase l´ıquida o en fase s´olida.

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En una secci´ on detallada m´as adelante, se da una explicaci´on m´ as en detalle de la producci´ on por recombinaci´on del modelo enzim´atico PBGD, pero como se mencion´o en este documento se aplican las mismas consideraciones para todos los otros catalizadores pept´ıdicos de la invenci´on. Una de las principales ventajas de la producci´on del catalizador por recombinaci´ on o por medios sint´eticos es, que si se produce en una c´elula no humana, el catalizador carecer´a de cualquier otro material biol´ ogico de origen humano, reduci´endose as´ı los problemas con pat´ogenos conocidos o desconocidos tales como virus, etc. El r´egimen de dosificaci´on estar´ a comprendido normalmente de al menos una dosis diaria del catalizador (preferiblemente por v´ıa intravenosa). Normalmente ser´an necesarias 2, 3, 4 ´o 5 dosis diarias, pero si se emplean composiciones de liberaci´on sostenida, se prevee menos de una dosis diaria. La dosis diaria debe determinarse en cada caso de manera individual por un profesional experto, pero como norma general, la dosis diaria del catalizador estar´a en el intervalo de entre 0,01-1,0 mg/kg de peso corporal por d´ıa. M´ as a menudo la dosis estar´a en el intervalo de 0,05-0,5 mg/kg de peso corporal por d´ıa, pero no debe olvidarse que la dosis precisa depende de la forma de dosificaci´ on y de la actividad del catalizador adem´ as del grado de deficiencia de la enzima relevante y debe darse un tratamiento individualizado, donde la dosis se ajusta para normalizar los niveles del precursor en suero y orina del paciente. La forma m´ as correcta de determinar la dosis adecuada se basa en los niveles del precursor espec´ıfico del paciente. El precursor es el producto de la reacci´on enzim´atica. Para PBGD, la dosis diaria es aproximadamente de 0,08-0,2 mg por kg de peso corporal por d´ıa, y m´as a menudo la dosificaci´on de elecci´on ser´a 0,1 mg por kg de peso corporal por d´ıa. Se cree que ser´ an 6

ES 2 177 240 T3 aplicables dosis comparables para las otras enzimas completas.

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Finalmente, como se comprender´a a partir de la descripci´ on anterior, la invenci´ on se basa en la nueva idea de proveer sustitutos de enzimas con falta de actividad. Seg´ un el entender de los inventores, el uso terap´eutico de catalizadores con tales efectos no se ha sugerido nunca antes, y por tanto la invenci´ on tambi´en ata˜ ne al catalizador como se define en este documento para su uso como producto farmac´eutico. Lo que es m´as, tambi´en es parte de la invenci´ on el uso de tales catalizadores para la preparaci´on de composiciones farmac´euticas para el tratamiento de las enfermedades discutidas anteriormente. Leyendas de las figuras: Figura 1: Mapa circular del clon PBGD # 1.1 en pBluescript SKFigura 2: Mapa circular del pl´ asmido pExp0 expresado

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Figura 3: Mapa circular del pl´ asmido pPBGD 1.1 expresado Figura 4: Mapa circular del pl´ asmido pKK223-3 expresado Figura 5: Mapa circular del pl´ asmido pExp1 expresado

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Figura 6: Mapa circular del pl´ asmido pPBGD 1.1 Tra expresado Figura 7: Mapa circular del pl´ asmido pExp1-M2 expresado 25

Figura 8: Mapa circular del pl´ asmido pExp1-M2-Puc-BB expresado Figuras 9a-9x: Clon PBGD # 1.1 en la secuencia de pBluescript SKDescripci´ on detallada de la invenci´ on

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En una primera forma de realizaci´ on la invenci´ on se refiere al uso de una cantidad efectiva de un catalizador que es una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo junto con un portador farmac´euticamente aceptable para la preparaci´on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad causada por una deficiencia, en un sujeto, de una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo. La enfermedad puede seleccionarse del grupo de la porfiria y el catalizador puede ser una enzima seleccionada del grupo que incluye Porfobilin´ ogeno desaminasa (PBGD),

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AAL deshidratasa, Uroporfirinogeno descarboxilasa,

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Coproporfirin´ ogeno oxidasa, Coproporfirin´ ogeno oxidativa, Protoporfirin´ ogeno oxidasa,

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Uroporfirin´ ogeno III sintasa, Ferroquelatasa, y

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Uroporfirin´ ogeno descarboxilasa, o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo.

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En una forma de realizaci´ on preferida, la enfermedad es PAI y la enzima es PBGD o una parte enzim´aticamente equivalente o su an´alogo. En una realizaci´ on m´as, el catalizador es una forma recombinante de la enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo o de la parte enzim´aticamente equivalente o de su an´ alogo.

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ES 2 177 240 T3 El catalizador debe ser administrable por una v´ıa seleccionada del grupo que consiste en la v´ıa intravenosa, la v´ıa intraarterial, la v´ıa intracut´ anea, la v´ıa subcut´ anea, la v´ıa oral, la v´ıa bucal, la v´ıa intramuscular, la v´ıa anal, la v´ıa transd´ermica, la v´ıa intradermal y la v´ıa intratecal. 5

El catalizador se formula preferentemente en una soluci´on isot´ onica, tal como NaCl 0,9 % y fosfato de sodio 10-50 mM, pH 7,0 +/- 0,5 hasta pH 8,0 o fosfato de sodio, glicina, manitol o las correspondientes sales de potasio. El catalizador puede ser tambi´en liofilizado, filtrado de forma est´eril, y en una realizaci´on m´ as formulado como ves´ıculas lip´ıdicas formadas por fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina o sus combinaciones. En otra forma de realizaci´on el catalizador es incorporado en eritrocitos fantasma.

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Tambi´en se puede producir una formulaci´ on de liberaci´ on sostenida utilizando microesferas biodegradables, estando tales microesferas formadas por ´acido polil´actico, ´acido poliglic´olico o mezclas de ellos.

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Otro procedimiento de acuerdo con la invenci´on es aquel en el que el catalizador es liofilizado en un cartucho de dos compartimentos, donde el catalizador estar´ a en el compartimento frontal y el agua de reconstituci´on en el compartimento posterior. El cartucho de dos compartimentos puede combinarse con un dispositivo inyector para administrar el catalizador bien utilizando una aguja o por un dispositivo sin aguja (alta presi´ on). Tambi´en puede ser muy conveniente administrar el catalizador en una formulaci´ on de tamp´ on fisiol´ogico que contenga un intensificador para la administraci´on nasal. Entre otras formulaciones para el catalizador se incluye una formulaci´ on oral que contiene ves´ıculas lip´ıdicas, como aquellas formadas por fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, o esfingomielina, o microesferas de dextrano. Es preferible que la formulaci´ on sea una capaz de aumentar la semivida del catalizador en el torrente sangu´ıneo del sujeto. Esto se puede conseguir mediante el uso de una formulaci´ on en donde el catalizador tenga un recubrimiento de polietilenglicol.

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Tambi´en puede acomplejarse al catalizador con un metal pesado.

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En otro aspecto m´ as el catalizador es una parte enzim´ aticamente equivalente o un an´alogo de la enzima y ejerce al menos parte de su actividad enzim´atica intracelularmente tras la administraci´ on al sujeto. Esto se puede conseguir cuando el catalizador es una peque˜ na enzima artificial o un catalizador org´ anico que puede polimerizar porfobilin´ogeno a hidroximetilbilano. Lo que es m´as, el catalizador puede ser dicha enzima formulada de manera que ejerza al menos parte de su actividad enzim´atica intracelularmente tras la administraci´on al sujeto.

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Adem´as, el catalizador puede ser marcado con carbohidratos espec´ıficos u otras estructuras espec´ıficas de las c´elulas hep´ aticas para la captaci´ on espec´ıfica por parte del h´ıgado.

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En otro aspecto el catalizador ejerce substancialmente toda su actividad enzim´ atica extracelularmente en el torrente sangu´ıneo.

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En otro aspecto m´ as, la actividad enzim´atica del catalizador sobre su precursor del hemo relevante resulta en un producto metab´ olico que 1) o entra al compartimento intracelular y se convierte continuando con el resto de las etapas de la ruta de bios´ıntesis del hemo o 2) es excretado del sujeto v´ıa urinaria y/o fecal. Otra forma de realizaci´ on de la invenci´ on se refiere al uso en donde el catalizador se ha preparado por un procedimiento incluyendo

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a) la introducci´on, en un vector adecuado, de un fragmento de a´cido nucleico que incluye la secuencia del a´cido nucleico que codifica el catalizador; b) la transformaci´ on de una c´elula hospedadora compatible con el vector;

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c) el cultivo de la c´elula hospedadora transformada bajo condiciones que faciliten la expresi´ on de la secuencia del ´acido nucleico; y d) la recuperaci´on del producto de expresi´ on del medio de cultivo 8

ES 2 177 240 T3 y opcionalmente someter al producto de expresi´on a un procesado postraduccional, tal como el replegamiento de prote´ına in vitro, la eliminaci´on enzim´atica de compa˜ neros de fusi´ on, la alquilaci´ on de residuos de amino´acido, y la desglicosilaci´on, de manera que se obtenga el catalizador. 5

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El catalizador puede prepararse por s´ıntesis pept´ıdica en fase l´ıquida o en fase s´ olida y es preferible que carezca de cualquier otro material biol´ ogico de origen humano. Como se mencion´ o anteriormente el catalizador debe ser administrable al menos una vez al d´ıa, como 2, 3, 4, y 5 veces diarias dependiendo del r´egimen de tratamiento espec´ıfico descrito para el paciente en el que los niveles de precursor para cada paciente se determinan antes y/o durante el tratamiento para evaluar la dosificaci´on espec´ıfica. En consecuencia la dosificaci´ on diaria debe estar en el intervalo de 0,01-1,0 mg/kg de peso corporal por d´ıa, como por ejemplo en el intervalo de 0,05-0,5 mg/kg de peso corporal por d´ıa. Y la presente invenci´on tambi´en se refiere al uso del catalizador para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica. Se estima que la dosificaci´on ser´ a a menudo de aproximadamente 0,1 mg por kg de peso corporal por d´ıa.

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En consecuencia, la invenci´on tambi´en se refiere a un catalizador que es una enzima de la ruta de bios´ıntesis del hemo o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo, para su uso como medicamento. As´ı en otra forma de realizaci´ on, la invenci´ on se refiere a un catalizador que es una enzima de la ruta de bios´ıntesis del hemo o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo para la preparaci´ on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento o profilaxis de enfermedades causadas por la deficiencia de dicha enzima. Naturalmente, el catalizador puede ser una forma recombinante de la enzima. Un ejemplo es una PBGD recombinante humana basada en cualquiera de la Sec. ID NO 1 (clon PBGD 1.1) y la Sec. ID NO 12 (no eritro PBGD 1.1.1).

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En una forma de realizaci´ on preferida y como ser´ a discutido en detalle m´ as adelante, la invenci´on tambi´en se refiere al uso de una secuencia de ADNc de PBGD humana de una forma no eritropoy´etica o de una forma eritropoy´etica para la preparaci´ on de un medicamento para terapia g´enica por transfecci´on del paciente con la secuencia de ADNc de PBGD humana de la forma no eritropoy´etica o de la forma eritropoy´etica seg´ un el tejido en el que debe expresarse PBGD, para el tratamiento o prevenci´on de la enfermedad en un paciente con una mutaci´ on en el gen de la PBGD que causa un defecto en la enzima. Preferiblemente la deficiencia en la enzima se selecciona de entre las deficiencias de enzima que resultan en una enfermedad seleccionada de entre porfiria aguda intermitente (PAI), porfiria por deficiencia de AAL (PDA), porfiria cutanea tarda (PCT), coproporfiria hereditaria (CPH), harderoporfiria (HDP), porfiria variegata (PV), porfiria eritropoy´etica cong´enita (PEC), protoporfiria eritropoy´etica (PPE), y porfiria hepatoeritropoy´etica (PHE). En una forma de realizaci´ on preferida, la secuencia de ADNc de PBGD humana se selecciona de entre la Sec. ID NO 1 (clon PBGD 1.1) y la Sec. ID NO 12 (no eritro PBGD 1.1.1).

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La transfecci´ on se puede llevar a cabo mediante el uso de un vector seleccionado de entre adenovirus, retrovirus y adenovirus asociados. El vector transferente del gen PBGD en c´elulas humanas (eritropoy´eticas y/o no eritropoy´eticas) resulta preferentemente en una actividad PBGD normal o en una actividad con la que el paciente carece de los s´ıntomas de la enfermedad. 50

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Tambi´en se prevee el uso de una mol´ecula oligonucle´ otido espec´ıficamente dise˜ nada para la fabricaci´on de un medicamento destinado al tratamiento por terapia g´enica de pacientes con Porfiria Aguda Intermitente (PAI) por la correcci´ on de una de las mutaciones puntuales espec´ıficas identificadas como causantes de la PAI, mediante el uso de un quimeroplasto para la reparaci´on del gen. Esto conlleva el uso de oligonucle´otidos dise˜ nados espec´ıficos y un conocimiento espec´ıfico de tanto la mutaci´ on que debe ser corregida como de la secuencia a ambos lados de la mutaci´on. Una forma de realizaci´ on espec´ıfica de quimeroplastia para la reparaci´ on del gen es por medio del uso de un sistema de suministro para la transfecci´ on por el uso de vectores no v´ıricos formulados en una preparaci´ on que act´ ua como veh´ıculo formada por uno o m´ as componentes seleccionados de entre fosfol´ıpidos cati´onicos, fosfol´ıpidos, fosfol´ıpidos mezclados con l´ıpidos neutros, PEI lactosilado, o liposomas constituidos por mezclas de fosfol´ıpidos naturales y l´ıpidos neutros. 9

ES 2 177 240 T3

La mutaci´on puede seleccionarse de entre las mutaciones que se muestran en la Tabla A.

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La siguiente descripci´on de las formas de realizaci´on de la invenci´ on preferidas se centrar´ a en la producci´ on recombinante de PBGD y sus formulaciones y usos. Se entender´ a, sin embargo, que todas las descripciones relativas a este polip´eptido se aplican tambi´en a las otras enzimas mencionadas anteriormente. Por tanto, la producci´ on y el uso de PBGD solo es un ejemplo de la invenci´on, pero todas las otras enzimas de la ruta de bios´ıntesis del hemo pueden sustituir de la PBGD en las realizaciones descritas a continuaci´on.

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Producci´ on de la PBGD recombinante

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Como se mencion´ o anteriormente, se prefiere la administraci´ on de versiones recombinantes de las diferentes enzimas de la ruta de bios´ıntesis del hemo. A continuaci´on se describir´ a la producci´ on recombinante de una de esas enzimas, a saber, PBGD. El gen para la PBGD eritropoy´etica, que est´a localizado en la regi´on cromos´omica 11q24 del genoma humano, se compone de 15 exones que abarcan 10 kb de ADN y se muestra en Grandchamp B. y col. 1996. J. of Gastroenterology and Hepatology 11, 1046-1052.

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El gen que codifica la enzima PBGD eritropoy´etica (344 amino´acidos) (Raich N. y col. 1986, Nucleic Acid Res, 14, 5955-5968), ser´ a clonado de un tejido eritropoy´etico humano por la transcriptasa inversa o por amplificaci´ on por PCR (reacci´ on en cadena de la polimerasa) de la regi´ on que codifica PBGD. 25

El gen se insertar´ a en un pl´ asmido y se transformar´a a una c´elula hospedadora adecuada (una bacteria como E. coli y B. subtilis, un hongo como Saccharomyces, o una l´ınea celular de mam´ıfero, como las c´elulas CHO). La expresi´on del gen de la PBGD se regular´ a por un promotor que sea compatible con la c´elula hospedadora seleccionada.

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Para la producci´on de la bacteria: Una secuencia end´ ogena ATG est´ a localizada en el extremo NH2 terminal del gen estructural de la rPBGD para la iniciaci´ on de la traducci´ on y la expresi´ on citoplasm´atica. Alternativamente, para obtener la secreci´on en E. coli, se inserta enfrente de la regi´on codificante de PBGD una secuencia se˜ nal bacteriana, por ejemplo un p´eptido se˜ nal de enzima peripl´ asmica de E. coli o un p´eptido se˜ nal de una enterotoxina o endotoxina secretada en E. coli.

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El pl´ asmido usado para la producci´on de rPBGD en E. coli se construy´o de la siguiente manera: Construcci´ on del pl´ asmido de producci´ on de rPBGD 40

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Introducci´ on Se clon´ o y se determin´ o la secuencia de la forma eritropoy´etica expresada de porfobilin´ ogeno desaminasa (PBGD) (Raich N. y col. Molecular cloning and complete primary sequence of erythrocyte porphobilinogen deaminase. Nucleic Acids Research 1986 14(15): 5955-67). Se conocen dos formas de PBGD. La forma eritropoy´etica se expresa espec´ıficamente en progenitores eritroides y la forma constitutiva se expresa en todas las c´elulas (Grandchamnp B. y col. Tissue-specific expression of porphobilinogen deaminase. Two isoenzymes from a single gene. Eur. J. Biochem. 1987 Jan; 162(1): 105-10. mp y col. 1987). Las dos se expresan a partir del mismo gen y son id´enticas excepto por la adici´on de 17 amino´acidos en el extremo amino de la forma constitutiva mediante el uso de un ex´ on alternativo. Se decidi´ o clonar y expresar la forma eritropoy´etica. Hay tres secuencias para la PBGD en el Genebank, las dos isoformas mencionadas anteriormente y la secuencia gen´omica (Yoo H. W., y col. Hydroxymethylbilane synthase: complete genomic sequence and amplifiable polymorphisms in the human gene. Genomics 1993 Jan; 15(1): 21-9). Todas ellas tienen diferencias en los nucle´ otidos que en la traducci´ on producen cambios de amino´ acidos. Por tanto, antes de elegir una secuencia espec´ıfica para ser expresada para terap´eutica humana fue necesario determinar cu´ al era el alelo natural. Para llevarlo a cabo, los clones de ADNc de la PBGD fueron aislados de una serie de fuentes y secuenciados para definir el patr´ on de amino´ acidos m´as com´ un. Los cebadores de oligonucle´ otido fueron dise˜ nados para amplificar la regi´ on codificante de los ADNc por la Reacci´on en Cadena de la Polimerasa (PCR) (Saiki R. K., y col. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985, Dec 20; 230(4732):1350-4). Estos se usaron para aislar los ADNc de 5 fuentes de ARNm que luego fueron clonados en un vector pl´ asmido. Ocho de esos clones fueron secuenciados y junto con las secuencias publicadas definen un alelo natural, que debe ser la secuencia de amino´acidos m´as com´ un en la poblaci´ on. 10

ES 2 177 240 T3 Este alelo natural ser´ a usado para la expresi´ on de la prote´ına. Estrategia 5

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Se ide´o una estrategia PCR para clonar PBGD. Los cebadores de la primera serie (v´ease la Tabla 1), Ico379 e Ico382, est´an formados por 20 unidades que se unen a la secuencia por fuera de la regi´ on codificante. Ico379 es espec´ıfico para la regi´ on 5’ no traducida del ARNm (ADNc) de la forma eritropoy´etica de la PBGD. El sitio de uni´ on est´a en una regi´on del ex´ on que no se expresa en la forma constitutiva de la enzima. Ico382 se une a la regi´on no traducida 3’ de las dos formas de la PBGD. En el interior de estas est´a una segunda serie de cebadores de oligonucle´otidos para usarse en la segunda sesi´on de la PCR, Ico375 e Ico376, dise˜ nados en la parte distal de la regi´ on codificante de la PBGD. Ico375 tiene 22 bases de secuencia hom´ologas al extremo 5’ de la regi´ on codificante de la forma eritropoy´etica de la PBGD con el cod´on de inicio ATG seguido de un sitio de escisi´ on de endonucleasa EcoRI para clonar el producto de la PCR y 4 bases de secuencia para asegurar una restricci´ on eficiente. Ico376 tiene 33 bases hom´ ologas al extremo 3’ de la regi´ on codificante de la PBGD con 3 bases cambiadas internamente para introducir un sitio de escisi´ on de endonucleasa MunI/MfeI por mutaciones silenciosas y terminando con el cod´ on de terminaci´ on TAA. Este sitio de restricci´on ser´a usado para introducir f´ acilmente secuencias que codifiquen un His-Tag para el ADN con adaptadores de oligonucle´ otido o para permitir otras modificaciones 3’. Despu´es del cod´on de terminaci´ on hay un segundo cod´ on de terminaci´ on para asegurar la correcta terminaci´on de la traducci´ on y un sitio de escisi´on de endonucleasa HindIII para la clonaci´ on del producto de la PCR seguido de 4 bases para asegurar una restricci´on eficiente. Los sitios de escisi´on EcoRI y HindIII introducidos en los finales del producto PBGD de la PCR se ligan a sus respectivos sitios u ´ nicos de restricci´on en el vector de sobreexpresi´on pBluescrip tII SK- (Stratagene) para la secuenciaci´ on y ser´a usado para introducir el ADN de la PBGD en un vector de expresi´ on de E. coli para la producci´ on de la porfobilin´ ogeno desaminasa humana recombinante, rh-PBGD. PCR

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Se usaron seis ADNc como fuente de PCR: bazo, m´edula o´sea, ganglio linf´atico, pulm´on, cerebro completo y tejido adiposo cada uno de una reserva diferente de donantes humanos (producidos por Donald Rao usando Superscript II, BRL, con 500 ng de poly-A ARN Clontech en vol´ umenes de reacci´on de 20 µl siguiendo instrucciones del fabricante excepto para el tejido adiposo, que se hizo a partir de 5 µg de ARN total Clontech de un u ´nico donante). Se muestra lista de equipo y suministros usados (v´eanse las listas que aparecen m´as adelante). Un µl de cada ADNc (aproximadamente 25 ng) se amplific´ o con la mezcla de Advantage-cDNA polymerase (Clontech) con dNTP (PE/ABI) 0,2 mM y 0,3 µM de Ico379 e Ico382 en vol´ umenes de reacci´on de 50 µl. Se uso una PCR en dos ciclos, con una etapa inicial de desnaturalizaci´ on a 94◦ C durante 1’ 40”, luego 28 ciclos de 96◦ C durante 16” y 68◦C durante 2’. Una o que los productos de extensi´on estaban completos. Un quinto de la extensi´on final de 6’ a 74◦C asegur´ reacci´on se corri´ o en un gel de agarosa al 1,2 % con 2 µl de soluci´ on de tinci´ on ficol 6X en tamp´ on TBE 0,5X (Maniatis T., E. F. Frisch, J. Sambrook. Molecular Cloning (A laboratory manual) Cold Spring Harbor Laboratory. 1982). Se observ´ o la banda predicha de 1,1 kb por tinci´ on con bromuro de etidio en todas las fuentes excepto con el ADNc del tejido pulmonar. Las bandas fueron cortadas y se aisl´ o el ADN con insertos micropuros Microcon-30 (Amicon/Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante y el tamp´ on se intercambi´ o con dH2 O. Un d´ecimo del ADN recuperado fue amplificado con la mezcla de Advantage-cDNA polymerase (Clontech) con dNTP (PE/ABI) 0,2 mM y 0,3 µM de cada oligonucle´otido unido internamente (Ico375 e Ico376) en vol´ umenes de reacci´on de 50 µl. De nuevo se us´o una PCR en dos ciclos de reacci´on con una etapa inicial de desnaturalizaci´ on a 94◦C durante 1’ 40”, luego 2 ciclos de 96◦ C durante 16”, 68◦ C durante 2’ y luego 13 ciclos de 96◦C durante 16” y 72◦C durante 2’ con una umenes de reacci´on de 50 µl se corrieron en geles de agarosa extensi´on final de 6’ a 74◦C. Diez µl de los vol´ al 1,2 % con 2 µl de soluci´ on de tinci´ on 6X. Las bandas resultantes eran del tama˜ no esperado, 1,05 kb. El resto de las reacciones de PCR se pasaron por columnas Chromaspin-400 (Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante para eliminar los componentes de la reacci´on y para intercambiar el tamp´ on con TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0/ EDTA 1 mM). Los elu´ıdos que conten´ıan el ADN se lavaron con dH2 O y fueron concentrados con concentradores Microcon-100 (Amicon/ Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. Clonaci´ on

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El ADN de la PBGD purificado se digiri´ o durante 6 horas con 40 unidades cada uno de EcoRI y HindIII en tamp´on EcoRI “U” (New England Biolabs (NEB)) en 50 µl de reacci´on a 37◦ C. Las enzimas se inactivaron t´ermicamente durante 20 minutos a 68◦ C y las reacciones fueron centrifugadas en concentradores Microcon-100 para eliminar las peque˜ nas partes finales del ADN, se lavaron con dH2 O y se 11

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concentraron. Un quinto del ADN resultante se lig´ o con aproximadamente 50 ng de pBluescriptII SK(Stratagene) digerido con EcoRI y HindIII y purificado dos veces en gel y 200 unidades de T4 ADN ligasa (NEB unidades de terminaci´ on cohesivas) durante 15 minutos a 16◦C. La ligasa se inactiv´o t´ermicamente ◦ on de reacci´on con dH2 O y se concentr´ o en a 75 C durante 10 minutos. Despu´es se intercambi´o el tamp´ concentradores Microcon-100 y se tomaron vol´ umenes de hasta 5 µl con dH2 O. Un µl de cada una se someti´o a electroporesis en c´elulas de 25 µl DH10B Electromax(Gibco/ BRL) a 2,5 Kv/ 2.000 hms/25 µF en cubetas de 0,1 cm en un electroporador BioRad. Se a˜ nadi´ o un ml de medio SOC (Gibco/BRL) y las c´elulas fueron sobrecrecidas a 37◦C durante una hora a 250 rpm. Las c´elulas se sembraron en placas LB (Maniatis T., E. F. Fritsch, J. Sambrook. Molecular Cloning (A laboratory Manual) Cold Spring Harbor Laboratory. 1982) con 150 µg/ml de ampicilina. El rendimiento de las cinco fue de aproximadamente el doble que el fondo (vector ligado sin inserto). Se us´ o PCR sobre colonias para analizar 18 transformantes de cada electroporaci´on para la presencia de PBGD. Se us´o un cebador interno espec´ıfico para PBGD (Ico381) con un cebador espec´ıfico pBluescript (Ico385) tanto para confirmar la identidad como la orientaci´on adecuada en el vector. Las reacciones de 25 µl se introdujeron en hielo para inactivar las proteasas, con concentraciones de cebador de 0,4 µM, 0,125 U de Taq polimerasa (Fisher), y dNTP (PE/ABI) 0,2 mM. Se us´ o una PCR en dos ciclos, con una etapa inicial de desnaturalizaci´ on a 94◦C durante 1’ 40”, otra etapa de desnaturalizaci´ on a 96◦C de 20 segundos, luego 30 ciclos a 96◦C durante on final de 4’ a 74◦C. Se a˜ nadieron cinco µl de soluci´ on de tinci´ on 16”, y 68◦ C durante 1’ con una extensi´ 6X y 12,5 µl de cada uno fueron corridos en un gel de agarosa al 1,2 %. Los resultados fueron como sigue: 12/18 colonias positivas para el bazo; 10/18 para la m´edula o´sea; 8/18 para el n´ odulo linf´ atico; 9/18 para el cerebro y 10/18 para el tejido adiposo. Se crecieron dos colonias positivas para cada uno de los tres primeros y una para cada uno de los dos u ´ltimos en 25 ml de cultivo LB l´ıquido con 150 µg/ml de asmido de ADN fue purificado de los cultivos ampicilina durante toda la noche a 37◦ C a 250 rpm. El pl´ con un kit de purificaci´ on Tip-100 de Qiagen seg´ un las instrucciones del fabricante. Se us´ o la absorbancia al UV a 260 nm para determinar los rendimientos de pl´ asmido que variaron entre 131 y 169 µg de ADN de alta pureza. Secuenciaci´ on

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Se llevaron a cabo las reacciones de secuenciaci´on de pl´ asmidos de ADN de doble cadena con un kit de secuenciaci´on Big Dye Terminator Cycle en un termociclador 9700 (Perkin Elmer/Applied Biosystems). Se usaron dos vectores de cebadores (Ico383 e Ico385) y dos cebadores espec´ıficos internos para PBGD (Ico380 e Ico381) para los 8 pl´asmidos (v´ease la secuencia). Adem´as se us´o un quinto cebador de vector (Ico285) para los clones derivados del cerebro y del tejido adiposo. Las condiciones de la reacci´on fueron seg´ un el protocolo de los fabricantes como sigue: 500 ng del pl´ asmido de ADN y 4 pmol del cebador de oligonucle´ otido con 8 µl premezclados en vol´ umenes de 20 µl con 30 ciclos de 96◦C durante 12” y on se purificaron por precipitaci´ on con isopropanol. A cada 60◦C durante 4’. Los productos de la extensi´ o por inversi´on y se dej´ o reposar a reacci´on se a˜ nadieron 20 µl de dH2 O y 60 µl de isopropanol. Se mezcl´ temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se centrifug´ o durante 40’ a 3250 rpm en una centr´ıfuga Beckman GS-6KR con el rotor GH3 y con Microplaca + soportes. Las reacciones se invirtieron y luego se centrifugaron a 1680 rpm durante 1’ para eliminar el l´ıquido del ADN sedimentado. El an´ alisis de la secuencia del ADN se llev´o a cabo en el Laboratorio de secuenciaci´on del Departamento de Bioqu´ımica de la Universidad de Washington con un secuenciador Applied Biosystems 377. An´ alisis Se confirm´ o que los insertos de los 8 clones eran PBGD por an´ alisis de secuencia de doble cadena completos (v´eanse las secuencias 1-8). Cada una tiene algunos cambios respecto a las secuencias publicadas. Algunos de esos cambios son u ´nicos y otros son compartidos con otros clones (v´ease la Tabla 2 y la Tabla 3).Para las diferencias encontradas solo en un clon, es dif´ıcil distinguir entre artefactos de PCR o de clonaci´ on y variaciones al´elicas sin un muestreo adicional. Sin embargo, cuando se encuentra una diferencia en la misma base en m´as de una secuencia es improbable que provengan de errores en la clonaci´ on. En el alineamiento de las 11 secuencias de PBGD se ve una serie de bases comunes, la secuencia consenso o alelo natural. Cinco de los ocho clones (1.1, 1.3, 2.1, 3.3, y 5.3) tienen la secuencia de amino´acidos natural. Solo hay una diferencia en cuanto a a´cidos nucleicos en este grupo con la secuencia de amino´ acidos natural. En la posici´ on 555, 4 de las 5 secuencias tienen un dGTP mientras que uno con la PBGD eritropoy´etica y gen´omica publicada tiene un dTTP. Estos parecen ser dos alelos comunes, por lo que no resulta en amino´ acidos diferentes. Hay dos cambios de bases entre el clon n´ umero 1.1 y el PBGD eritropoy´etico publicado. En la base 513 (Leu 171) hay un cambio de adenina a guanina que es una mutaci´ on silenciosa, que tambi´en est´a presente en 9 de las 11 secuencias comparadas. La segunda diferencia es una sustituci´ on de citosina por adenina en la base 995 (Thr 332). Este no es un cambio silencioso, que produce una mutaci´ on de treonina a asparagina no conservativa. Parece sin embargo que 12

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la diferencia es un error en la secuencia PBGD eritropoy´etica publicada, ya que las otras 10 secuencias tienen una adenina en esa posici´ on. Adem´ as de estas variaciones naturales, hay tres mutaciones silenciosas adicionales introducidas durante la clonaci´on en las posiciones 1017, 1018 y 1020 para crear un sitio Mun-I para futuras manipulaciones. El gen PBGD se lig´ o al pl´ asmido pBluescript SK para generar el pl´ asmido pSK-PBGD 3988 bp, que fue secuenciado (v´ease la Fig. 1, la Fig. 9a-9x y la secuencia 9). Conclusi´ on

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15

Para cualquier prote´ına terap´eutica recombinante es importante que el alelo natural sea usado para reducir la inmunogenicidad potencial. Por nuestro examen de la literatura y el an´ alisis de la secuencia de PBGD de diferentes individuos estamos seguros de que el clon 1.1 representa el alelo natural mayoritario prevalente en la poblaci´ on con respecto a la secuencia de amino´acidos. El clon n´ umero 1.1 contiene la secuencia de amino´acidos natural consenso y difiere de la secuencia eritropoy´etica de PBGD publicada solo en un amino´ acido. Ya que esta diferencia se encuentra en todos los otros clones de PBGD adem´as de en la secuencia eritropoy´etica de PBGD, esto, m´ as que la secuencia eritropoy´etica publicada, parece ser la secuencia natural prevalente. Por esta raz´ on la PBGD codificada por el clon n´ umero 1.1 se eligi´o para la producci´ on de la porfobilin´ ogeno desaminasa humana recombinante (rh-PBGD). TABLA 1 Cebadores de Oligonucle´ otidos

20

25

30

35

40

Ico375-pbgds (32 unidades) regi´ on codificante sentido extremo 5’ w/sitio EcoRI 5’ CGT GGA ATT CAT GAG AGT GAT TCG CGT GGG TA 3’ Ico376-pbgda (47 unidades) regi´ on codificante antisentido extremo 3’ w/sitio HindIII 5’ GGA GAA GCT TAT TAA TGG GCA TCG TTC AAT TGC CGT GCA ACATCC AG 3’ Ico378-csnonc (20 unidades) forma constitutiva sentido no codificante 5’ TCC AAG CGG AGC CAT GTC TG 3’ Ico379-esnonc (20 unidades) forma eritropoy´etica sentido no codificante 5’ TCG CCT CCC TCT AGT CTC TG 3’ Ico380-sinter (21 unidades) interna sentido codificante 5’ CAG CAG GAG TTC AGT GCC ATC 3’ Ico381-ainter (21 unidades) interna antisentido codificante 5’ GAT GGC ACT GAA CTC CTG CTG 3’ Ico382-anonc (20 unidades) sentido no codificante 5’ CAG CAA CCC AGG CAT CTG TG 3’ Ico383-pSKT7 (22 unidades) promotor T7 pBluescript 5’ GTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG C 3’ Ico384-pSKpjrev (22 unidades) pBluescript inversa 1 5’ CTA AAG GGA ACA AAA GCT GGA G 3’ Ico385-pSKrev (21 unidades) pBluescript inversa 2 5’ CAG CTA TGA CCA TGA TTA CGC 3’ Lista de Equipo

45

50

Art´ıculo

Fabricante

N´ umero de Serie

Pipetman P-1000

Gilson

N55287E

Pipetman P-200

Gilson

N52324E

Pipetman P-20

Gilson

N53465M

Pipetman P-10

Gilson

P626586

Centrifuga 5415C

Eppendorf

5415B68381

Centr´ıfuga GS-6KR

Beckman

NGD97J18

55

60

13

ES 2 177 240 T3 Lista de Equipo (continuaci´ on)

5

10

Art´ıculo

Fabricante

N´ umero de Serie

Centr´ıfuga Avanti J-25 I

Beckman

JJY97J14

Espectrofot´ ometro DU 640B

Beckman

4323015

V´ortex Genie II

VWR

2-241186

Sistema GeneAmp PCR 2400

Perkin Elmer (PE)/ Applied Biosystems (ABI)

803N6021903

Sistema GeneAmp PCR 2400

PE/ABI

803S7100104

Sistema GeneAmp PCR 9700

PE/ABI

805S7121566

Incubador 1545

VWR

0902597

Bloque calefactor 1

VWR

0795

Bloque calefactor 1

VWR

0511

Aparato Gene Pulser II

BioRad

340BR2745

Pulse Controller Plus

BioRad

339BR1377

Power Pac 1000

BioRad

286BR00770

Sub Cell

BioRad

16S/8860

Wide-Mini Sub Cell

BioRad

02S/7951

Transiluminador Foto/Prep

Fotodyne

PTG1-0997-2831

Electro-separador Elutrap

Schleicher + Schuell

Orden N◦ . 57880

Incubador Innova 4000

New Brunswick Scientific

890165366

Ordenador Power Mac G3

Macintosh

XA8061A3BBW

Monitor Trinitron Multiscan 200GS

Sony

8057052

Software de an´ alisis de ADN: Geneworks

Intelligenetics

Version 2.5.1

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

14

ES 2 177 240 T3 Lista de Suministros Art´ıculo

Suministrador

N◦ de Cat´alogo

N◦ de Lote

Poli A+ARN bazo humano

Clontech

6542-1

7120266

Poli A+ARN m´edula ´osea humana

Clontech

6573-1

56714

Poli A+ARN pulm´ on humano

Clontech

6524-1

7050104

PoliA+ARN n´ odulo linf´ atico humano

Clontech

6594-1

6120292

Poli A+ARN cerebro humano

Clontech

6516-1

63101

ARN total adiposo humano

Clontech

D6005-01

7907005

Gibco/BRL

18064-014

JM6418

Serie dNTP 100 mM

Pharmacia

27-2035-01

6072035011

PBluescriptII SKphagemid

Stratagene

212206

0270702

Mezcla Advantage-cDNA polymerase

Clontech

8417-1

8060354

GeneAmp dNTP Endonucleasa Xba-I

PE/ABI New England Biolabs (NEB)

N-808-0007 145S

HO172.4,HO553 30

Endonucleasa Pvu-II

NEB

151L

14

Endonucleasa EcoR-I

NEB

101L

25

Endonucleasa Hind-III

NEB

104S

49

Tris six-Pack “C”

Sigma

T-PAC-C

77H9049

EDTA 0,5 M pH 8,0

Sigma

E-7889

16H8924

Chromaspin TE 400

Clontech

K1323-1

7090795

5

10

15

20

25

30

35

40

Transcriptasa inversa Superscript II

45

50

55

60

15

ES 2 177 240 T3 Lista de Suministros (continuaci´ on) Art´ıculo

Suministrador

N◦ de Cat´alogo

N◦ de Lote

Chromaspin 400 DepC dH2 O

Clontech

K1333-1

7040086

Kit extraccion Quiaquick gel

Qiagen

28704

BY97017/0397/119

Microcon-30

Amicon

42410

L8JM4330B

Microcon-100

Amicon

42413

L8DM3296A

Micropure 0.22 µm

Amicon

42544

CCB017

Agarose de Seakem GTG

FMC

50074

709397

Cadena DNA 100 bp

NEB

323-1

3

Cadena DNA 123 bp

Gibco/BRL

15613-029

JK9706

T4 ADN Ligasa

NEB

202S

64

Ampicilina

Sigma

A-9518

76H0434

Medio LB

Gibco/BRL

12795-084

12E1072B

Bacto agar

Difco

0140-07-4

106728JA

DH10B electromax

Gibco/BRL

18290-015

KHN430

Medio SOC

Gibco/BRL

15544-042

1010351

Taq Polimerasa

Fisher

FB-6000-15

HO436

Anticuerpo

Clontech

5400-1

6070479

Qiagen

12243

PO N◦ . 514

Sigma

I-9516

47H3724

PE/ABI

4303152

9803008

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Taqstart 50

55

60

Kit para aislamiento Quiafilter Midi DNA Isopropanol Kit de secuenciaci´on Big Dye terminator cycle

16

ES 2 177 240 T3 TABLA 2 Variaci´ on en los clones PBGD respecto a la secuencia eritroide publicada Diferencias respecto a ARNm eritroide

5

Clon PBGD

Silenciosa

No silenciosa

Dif. total

N◦ Genebank

Referencia/Fuente

Eritroide

0

0

0

X04217

Raich,N. y col.Nucleic Acids Res.14(15),5955-5968 (1986)

15

Constitutivo

1

2

3

X04808

Grandchamp,B. y col. Eur J.Biochem.162(1),105-110 (1987)

20

Gen´omico

1

2

3

M95623

Yoo,H.W. y col. Genomics 15 (1), 21-29 (1993)

1.1

1

1

2

-

Bazo (ARNm Clontech N◦ lote 7120266)

1.3

2

1

3

-

Bazo (ARNm Clontech)

2.1

2

1

3

-

M´edula o´sea (ARNm Clontech)

2.2

2

2

4

-

M´edula o´sea (ARNm Clontech)

3.1

2

4

6

-

N´odulo linf´ atico (ARNm Clontech)

3.3

3

1

4

-

N´odulo linf´ atico (ARNm Clontech)

5.3

2

1

3

-

Cerebro total (ARNm Clontech)

6.1

3

2

5

-

Tejido adiposo (ARNm Clontech)

10

25

30

35

40

45

TABLA 2 50

55

Resumen del n´ umero de diferencias en la secuencia de amino´acidos de nuestros clones PBGD secuenciados y clones de entradas de Genebank para la PBGD constitutiva y gen´omica con la secuencia PBGD eritropoy´etica publicada. En diferentes columnas se muestran el n´ umero total de mutaciones silenciosas con un cambio en una base de ADN que no causa un correspondiente cambio en el amino´ acido, el n´ umero de mutaciones no silenciosas con cambio en el ADN que causa una diferencia en amino´acidos y la suma de los dos tipos de mutaciones. No se incluyen en esta figura las tres mutaciones silenciosas introducidas en los clones para crear un sitio de escisi´ on interno de endonucleasa Mun-I. N´ otese que el clon n´ umero 1.1 que ser´ a usado para la producci´on de la porfobilin´ ogeno desaminasa humana recombinante (rh-PBGD) tiene solo una diferencia de cada tipo, siendo el que menos diferencias totales presenta de todos ellos.

60

17

ES 2 177 240 T3 TABLA 3 Resumen de las mutaciones encontradas en los clones de PBGD 5

10

aa aa

N◦ aa

N◦ pb

mutaci´on

Cambio de aa

Cons. Gen. 1.1 1.3 2.1 2.2 3.1 3.3 5.3 6.1 N◦ /10

Asp

19

56

A→G

Asp→Gly

Phe 108

322

deleci´on T

Marco de lectura

Lys 140

419

A→G

Lys→Arg

Leu 160

478

C→A

Leu→Met

Ala 168

503

C→T

Ala→Val

Leu 171

513

A→G

Silenciosa

Val 185

555

T→G

Silenciosa

X

Glu 193

577

G→A

Glu→Lys

X

Gly 243

729

C→T

Silenciosa

Ala 280

840

T→C

Silenciosa

X

1

Ala 286

856

G→A

Ala→Thr

X

1

Lys 328

984

A→G

Silenciosa

Thr 332

995

C→A

Thr→Asn

Gln 339 1017

G→A

Gln 339 1018

X

1

X

1 1 X

1

15

20

25

30

35

X

1 X

X

X

X

X

X

X

X

X

X

1 X

X

X

9

X

X

7 1

X

1

X X

X

1

X

X

X

X

X

X

X

X

10

Silenciosa

X

X

X

X

X

X

X

X

8

C→T

Silenciosa

X

X

X

X

X

X

X

X

8

Leu 340 1020

T→G

Silenciosa

X

X

X

X

X

X

X

7

Leu 340 1020

deleci´on T

Marco de lectura

40

45

X

1

50

TABLA 3

55

Resumen de las diferencias gen´eticas de nuestros clones de PBGD secuenciados y las entradas de Genebank para la PBGD constitutiva y gen´omica con la secuencia de PBGD eritropoy´etica del alineamiento de la secuencia de alelos. En diferentes columnas aparecen los amino´acidos, el n´ umero de base a partir del cod´ on de iniciaci´on ATG, la diferencia gen´etica con el correspondiente cambio en amino´acido si lo hay y una lista de los clones con diferencias marcados con una X. La columna final indica el n´ umero de clones con tal mutaci´ on. Las u ´ ltimas cuatro mutaciones se introducen con Ico376 durante la amplificaci´ on con PCR para crear un sitio de escisi´ on para endonucleasa Mun-I. N´ otese que el clon n´ umero 1.1 que ser´a usado para la producci´ on de rh-PBGD solo tiene diferencias que se representan en un n´ umero de clones.

60

18

ES 2 177 240 T3 Pl´ asmidos de expresi´ on

5

10

El pl´asmido de expresi´ on pExp0 (v´ease la Fig. 2) se construy´ o por escisi´on de la secuencia codificante de PBGD (nt1-1043) a partir de pPBGD1.1 (v´ease la Fig. 3) con EcoRI y HindIII e insert´andolo en el vector pKK223-3 (v´ease la Fig. 4) (Pharmacia Cat # 27-4935, Lot # 8054935011) cortado con las mismas enzimas, conect´andolo operativamente con el promotor tac inducible. Otro pl´ asmido, pExp1 (v´ease la Fig. 5) se construy´ o tambi´en con modificaciones en la regi´on 5’ no traducida y la parte inicial de la secuencia codificante, ambas destinadas a mejorar la eficiencia de la traducci´ on (aumento traduccional). Los cambios se indican adelante e incluyen la inserci´on de un segundo sitio de uni´ on a ribosoma, una secuencia rica en AT que precede a ATG y las tres sustituciones silenciosas de bases aparecen subrayadas.

15

20

25

El pl´ asmido PExp1 (Fig. 5) se hizo en un proceso en dos pasos. Los oligonucle´ otidos Ico386 (5’ AAT TCT AAC ATA AGT TAA GGA GGA AAA AAA AAT GAG AGT TAT TCG TGT CGG TAC 3’) e Ico387 (5’ CGA CAC GAA TAA CTC TCA TTT TTT TTT CCT CCT TAA CTT ATG TTA G 3’) se dise˜ naron para proporcionar en el fijado un extremo final adhesivo 5’ EcoRI y un extremo 3’ cohesivo Kpn I. Los oligonucle´otidos Ico386 e Ico387 se fijaron y ligaron con el fragmento Kpn I-Hind III de la PBGD de pPBGD1.1 en pBluescript II SK- (Stratagene Cat # 212206) EcoR I-Hind III linearizado para producir un pl´ asmido pPBGD1.1Tra (Fig. 6). En el segundo paso el fragmento EcoR I-Hind III de pPBGD1.1Tra se lig´o en pKK223-3 cortado con las mismas enzimas resultando en el pl´asmido pExp1 (Fig. 5). Cepas hospedadoras y condiciones de crecimiento

30

Para los estudios realizados se usaron dos cepas K12 de E. coli. Ambas cepas, DH12S (Life Technologies cat # 1832-017) y JM105 (Pharmacia Cat # 27-1550-01), llevaban el represor laclq . El medio usado fue principalmente caldo LB (Difco Laboratories Cat # 0446-07-5) que conten´ıa ampicilina 100 µg/ml. Los cultivos se crecieron a 37◦C y se indujeron con IPTG 4 mM durante 3 horas.

35

La elecci´on de la cepa final depender´ a en parte de la estrategia de inducci´ on usada (v´ease m´as adelante). El uso de laclts forzar´ a el uso de las cepas que no porten el represor laclq . Otras cepas deficientes en proteasas tales como La, Clp y el locus rpoH pueden ser beneficiosos si se va a usar la inducci´on t´ermica.

40

El gen hemC se deleciona en la cepa de producci´on final. Se ha construido un pl´ asmido que ser´a usado como herramienta para este prop´osito. Restauraci´ on del gen de resistencia a la tetraciclina

45

50

55

Se ha construido el pl´ asmido pExp1-M2 (Fig. 7) a partir de pExp1 con un gen funcional de resistencia a la tetraciclina. Se ha dise˜ nado para ser capaz de introducir otros elementos reguladores o genes que se requieran en el proyecto y para ser capaz de mantener la capacidad de sustituir la secuencia PBGD de “aumento traduccional” por la secuencia nativa o un poliligador para el pl´ asmido del blanco. Se us´ o la siguiente estrategia. El pl´asmido pExp1 se cort´o con Sal I y BamH I y el fragmento de 5348 pares de bases que conten´ıa parte de la secuencia codificante de tetraciclina y se aisl´o la masa del pl´ asmido. Se lig´o en esto el fragmento Sal I-Hind III de pBR322 (New England Biolabs Cat # 303-3S, Lot # 50) que conten´ıa el resto de la secuencia codificante y un adaptador formado por oligonucle´ otidos fijados Ico424 (5’ GATCACTCAT GTTTGACAGC TTATCATCGA TT 3’) e Ico425 (5’ AGCTAATCGA TGATAAGCTG TCAAACATGA GT 3’). El adaptador contiene parte del promotor de la tetraciclina y proporciona salientes Hind III y BamH I para la ligaz´on pero destruye los sitios de restricci´ on Hind III y BamH I. Inducci´ on

60

El promotor tac es un promotor fuerte cuando se induce con IPTG y otros grupos han mostrado que este o el otro promotor casi id´entico trc pueden inducirse muy bien a 42◦C cuando se usa un represor termosensible lac. Con la construcci´on pExp1-M2-Puc-BB se consigue un alto nivel de expresi´ on que se traduce en cantidades de gramos de producto en el fermentador. Bas´ andose en los datos del estudio y en 19

ES 2 177 240 T3 datos de la literatura la inducci´ on t´ermica es eficiente. Estrategia 1 5

10

El pl´ asmido pExp1 (v´ease la Fig. 5) tiene un nivel basal de expresi´on que es aproximadamente un quinto del de un cultivo completamente inducido en una cepa portadora del laclq en caldo LB. Estable y con niveles de expresi´on aceptables, se puede usar sin inducci´ on en un medio definido de fermentaci´ on. En el pl´ asmido pExp1-M2 (v´ease la Fig. 7) el gen rom se ha delecionado en el pl´asmido y el replic´on pBR223 se ha intercambiado por el replic´on pUC. Estos pl´ asmidos tienen sobreexpresi´ on elevada con on. temperatura creciente (mayor de 30◦C) y sirven como sistema de pseudo-inducci´ Estrategia 2

15

En el pl´ asmido pExp1-M2 se ha introducido un represor termol´ abil lacl bien en el sitio Sca 1 o en el sitio BsaA. El represor se deriv´o del pl´ asmido pTYB1 (New England Biolabs Cat # 6701, Lot # 3) por on t´ermica pero un alto nivel de expresi´on PCR, en donde Gly187 se cambi´o a Ser. Si funciona la inducci´ conduce a la inestabilidad, la secuencia nativa PBGD se sustituye como en pExp0 (sin las intensificaciones). En el pl´ asmido pExp0 el nivel de expresi´ on sin inducci´ on est´ a por debajo del nivel de detecci´ on del asmido o en el genoma. sistema de ensayo usado. Otras variaciones podr´ıan ser el uso de laclq ts en el pl´

20

Descripci´ on detallada de la Construcci´ on del pl´ asmido de producci´ on para rPBGD

25

30

El pl´ asmido de producci´ on pExp1-M2-Puc-BB (v´ease la Fig. 8) para rPBGD se construy´ o en un proceso en m´ ultiples pasos. Los pasos individuales y todos los pl´ asmidos intermedios usados se describen m´as abajo. Primero se construy´o el pl´ asmido de expresi´ on pExp1 en donde la secuencia codificante de PBGD est´a ligada operativamente al promotor tac del vector pKK223-3 (Pharmacia Cat # 27-4935, Lot # 8054935011) por medio de un corto adaptador dise˜ nado para incluir un sitio de uni´ on a ribosoma, una regi´on rica en AT precediendo al ATG y los primeros seis codones de la enzima eritropoy´etica humana PBGD con tres cambios de base silenciosos. La secuencia del adaptador se muestra debajo con los cambios de bases introducidos en las posiciones en negrita.

35

40

45

50

55

60

Los oligonucle´otidos Ico386 (5’ AAT TCT AAC ATA AGT TAA GGA GGA AAA AAA AAT GAG AGT TAT TCG TGT CGG TAC 3’) e Ico387 (5’ CGA CAC GAA TAA CTC TCA TTT TTT TTT CCT CCT TAA CTT ATG TTA G 3’) se dise˜ naron para proporcionar en el fijado un extremo final adhesivo 5’ EcoRI y un extremo 3’ cohesivo Kpn I. Los oligonucle´otidos Ico386 e Ico387 se fijaron y ligaron con el fragmento Kpn I-Hind III de la PBGD de pPBGD1.1 en pBluescript II SK- (Stratagene Cat # 212206) EcoR I-Hind III linearizado para producir un pl´ asmido pPBGD1.1Tra. En el segundo paso el fragmento EcoR I-Hind III de pPBGD1.1Tra se lig´o en pKK223-3 cortado con las mismas enzimas resultando en el pl´ asmido pExp1. El gen de resistencia a la tetraciclina se restaur´ o usando la siguiente estrategia. El pl´ asmido pExp1 se cort´o con Sal I y BamH I y el fragmento de 5348 pares de bases que conten´ıa parte de la secuencia codificante de tetraciclina y se aisl´o la masa del pl´asmido. Se lig´o en esto el fragmento Sal I-Hind III de pBR322 (New England Biolabs Cat # 303-3S, Lot # 50) que conten´ıa el resto de la secuencia codificante y un adaptador formado por oligonucle´ otidos fijados Ico424 (5’ GATCACTCAT GTTTGACAGC TTATCATCGA TT 3’) e Ico425 (5’ AGCTAATCGA TGATAAGCTG TCAAACATGA GT 3’). El adaptador contiene parte del promotor de la tetraciclina y proporciona salientes Hind III y BamH I para la ligaz´ on pero destruye los sitios de restricci´ on Hind III y BamH I. El pl´ asmido resultante se llam´o pExp1-M2. El pl´ asmido pExp1-M2 se digiri´ o con Pvu I y Afl III y fue aislado el mayor de los dos fragmentos correspondiente a un tama˜ no de 4745 pares de bases. Esto se lig´o al fragmento Pvu I-Afl III de 1275 pares de bases derivado de pUC19 que contiene el origen de replicaci´ on y parte del gen de resistencia a ampicilina para obtener el pl´ asmido pExp1-M2-Puc. Esto se pas´ o a trav´es de JM110 y se cort´ o con BsaA1 y BsaB1 para escindir el gen rom de extremo romo contenido entre los dos sitios para conseguir la expresi´on final del pl´ asmido pExp1-M2-Puc-BB. El pl´ asmido pExp1-M2-Puc-BB se ha secuenciado 20

ES 2 177 240 T3 completamente (v´ease la secuencia 11). Expresi´ on de rPBGD en E. coli 5

10

15

20

25

30

35

La cepa hospedadora JM105 de E. coli K12 genotipo endA thi rpsL sbcB15 hsdR4 ∆(lac-proAB) asmido de expresi´ on pExp1-M2-Puc-BB se creci´ o [F’traD36 proAB laclq ∆(lacZ)M15] que contiene el pl´ hasta fase semilogar´ıtmica a 30◦ C en caldo LB que conten´ıa 100 µg/ml de ampicilina a partir de una diluci´ on 1 a 40 de un in´ oculo incubado toda la noche. El cultivo se dividi´ o en tres y se continu´o creciendo durante otras 4 horas a 30◦ C, 37◦C y 42◦C respectivamente. Las c´elulas fueron centrifugadas de muestras de 1 ml y congeladas a -20◦ C. Los sedimentos de c´elulas descongeladas se resuspendieron en 200-300 µl de reactivo B-PER PIERCE Cat. # 78243, se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos, se centrifugaron a 16.000 durante 10 minutos y se determin´o la actividad PBGD en los sobrenadantes. La prote´ına total se estim´o por el m´etodo Bradford usando el reactivo de BioRad Cat. # 500-0006 y alb´ umina de suero bovino como est´andar. Las actividades espec´ıficas en los lisados crudos obtenidos a las tres temperaturas de crecimiento aparecen tabulados m´ as adelante. Los resultados muestran claramente un aumento de unidades de PBGD/mg con el aumento de la temperatura en el intervalo de 30◦C a 40◦ C. Temperatura

Unidades PBGD/mg

30◦C 37◦C 42◦C

363 573 1080

Otros sistemas de producci´ on para rPBGD Para la producci´on en levadura, la secuencia codificante de PBGD puede insertarse en un vector pl´ asmido, por ejemplo del tipo YEP, conteniendo 2 u de ADN circular origen (Ori) para sobreexpresi´ on en levadura. Los pl´ asmidos YEP contienen TRP 1 y URA 3 como marcadores para el mantenimiento selectivo en las cepas trp1- y ura3-levadura. Alternativamente, el gen de PBGD puede insertarse en vectores BPV del virus del papiloma bovino para sobreexpresi´on en una l´ınea celular murina C-127 (Stephens P.E. y col., Biochem J. 248, 1-11, 1987) o vectores compatibles con la expresi´on en c´elulas CHO o c´elulas COS. Se puede hacer una expresi´ on de PBGD intracelularmente.

40

Se puede a˜ nadir una se˜ nal secretora en Saccharomyces, por ejemplo una presecuencia de factor de apareamiento alfa, enfrente del gen estructural rPBGD para una secreci´ on eficiente en levadura. De igual manera, se puede a˜ nadir una secuencia que codifique para un p´eptido se˜ nal de mam´ıfero para la secreci´on de rPBGD al medio de cultivo en la expresi´ on en por ejemplo c´elulas CHO o c´elulas COS.

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50

55

60

Para una transcripci´ on eficiente en procariotas, por ejemplo en E. coli, debe insertarse antes de la regi´on codificante de PBGD un promotor bacteriano, por ejemplo el promotor de tript´ ofano (trp) o el promotor lac o alternativamente un promotor de fosfatasa alcalina. Para una transcripci´ on eficiente en levadura, por ejemplo en Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces pombe debe insertarse antes de la regi´ on codificante PBGD un promotor de levadura, por ejemplo la 3-fosfoglicerato quinasa (PGK) o quelatina o el factor de apareamiento alfa. Para una transcripci´ on eficiente en l´ıneas celulares de mam´ıfero, por ejemplo en c´elulas CHO o c´elulas COS debe insertarse antes de la regi´on codificante PBGD un promotor de mam´ıfero, por ejemplo la Metalotione´ına-1 (MT-1) o la Aspartato transcarbamilasa o la Dihidrofolato reductasa (DHFR). El pl´ asmido de levadura (Y-G&F-PBGD) que contiene un promotor de levadura, se˜ nal y/o un cod´ on ATG (metionina) enfrente de la regi´ on codificante PBGD y un vector de levadura que contiene marcadores que se pueden seleccionar, como URA 3 o TRP 1, se transformar´ an en la c´elula hospedadora de levadura, tal como Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces pombe para la producci´ on derPBGD. El pl´ asmido de mam´ıfero (M-G&F-PBGD) que contiene un promotor de mam´ıfero como por ejemplo la Metalotione´ına-1 o la Dihidrofolato reductasa y una secuencia se˜ nal de mam´ıfero o un cod´ on ATG 21

ES 2 177 240 T3 enfrente de la regi´on codificante PBGD y un vector pAT o pSV2 respectivamente. Se producir´ a la transfecci´on del pl´ asmido (M-G&F-PBGD) en la l´ınea celular, por ejemplo en c´elulas CHO,para la producci´ on de rPBGD. 5

La c´elula de E. coli incluyendo el pl´ asmido (pExp1 o pExp1-M2 Puc-BB), se fermentar´ a hasta la fase estacionaria entre 24-48 horas, en un medio que contenga un hidrolizado de case´ına, o extracto de levadura, glucosa, vitaminas y sales. El pH del ox´ıgeno se monitorizar´a durante la fermentaci´on por electrodos. La temperatura se mantendr´ a a 37 +/- 2◦C durante la fermentaci´on.

10

La c´elula de levadura incluyendo el pl´ asmido (Y-G&F-PBGD), se fermentar´a hasta la fase logar´ıtmica final entre 20-40 horas, en un medio que contenga un extracto de levadura, glucosa, sales y vitaminas. El pH y la temperatura se monitorizar´an durante la fermentaci´ on por electrodos espec´ıficos. La temperatura se mantendr´a a 30 +/- 2◦ C durante la fermentaci´on.

15

La l´ınea celular de mam´ıfero incluyendo el pl´ asmido (M-G&F-PBGD), se fermentar´a en un medio que contenga un suero de ternero fetal (o suero libre), vitaminas, glucosa, antibi´ oticos y factores de crecimiento. El pH y la temperatura se monitorizar´ an continuamente durante la fermentaci´on por electrodos espec´ıficos.

20

Fermentaci´ on y Purificaci´ on

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45

Tras la fermentaci´on se recuperar´ a rPBGD de E. coli por un procedimiento de extracci´ on que conlleva por ejemplo rotura por presi´ on, sonicado, choque osm´otico o solubilizaci´on total por detergente, por ejemplo Tween 80, Triton X-100 o Brij. La rPBGD se recuperar´a del medio de fermentaci´on tras la producci´ on en levadura o del extracto celular total usando detergentes como Triton X-100, Tween 80 o Brij. La rPBGD se recuperar´ a del medio de cultivo de mam´ıfero o del extracto celular total por cromatograf´ıa de intercambio i´onico o por cromatograf´ıa de afinidad. La rPBGD ser´a purificada de extracto de E. coli o de medio de levadura o de extracto celular total o de medio de cultivo de mam´ıfero o de extracto celular total de mam´ıfero por uni´ on a una columna de intercambio i´onico, por ejemplo DEAE-Sefarosa o MonoQ-Sefarosa, y eluida con por ejemplo NaCl y tamp´ on fosfato de sodio pH 7-8 o las correspondientes sales de potasio. De manera alternativa, la rPBGD puede recuperarse de los extractos por uni´ on a una columna de cromatograf´ıa de afinidad, por ejemplo una columna de afinidad anti-PBGD, donde la rPBGD ser´ a eluida bajando el pH a 4-2, o una columna de afinidad con grupos tiol espec´ıfica. La rPBGD se “marca” con residuos tiol cuando se usa un paso por columna de afinidad a tiol. Los tioles se eliminar´ an en un paso de escisi´on enzim´atica espec´ıfica para generar la aut´entica rPBGD. Se continuar´ a la purificaci´ on de la rPBGD purificada por afinidad o por intercambio i´ onico por cromatograf´ıa de interacci´on hidrof´ obica en, por ejemplo, columna TSK Fenil 5 PW o en columnas de Octil-Sefarosa o Fenil-Sefarosa. La uni´ on de la rPBGD puede hacerse a una fuerza i´ onica alta, por ejemplo en Tris-HCl 10-50 mM pH onica por 7-8, NaCl 1M o Fosfato de sodio 10-15 mM pH 7-8, MgSO4 0,5 M y eluida bajando la fuerza i´ ejemplo con Tris-HCl 10-50 mM pH 7-8 o Fosfato de sodio 10-50 mM pH 7-8. Se pueden aplicar consecutivamente tres pasos de interacci´ on hidrof´ obica.

50

55

Se puede continuar la purificaci´ on de la rPBGD con HPLC-RP preparativa, por ejemplo con matrices C12 o C18. La rPBGD ser´ a eluida de la columna por gradiente de tamp´ on fosfato de sodio 10-50 mM y 1-10 % acetonitrilo. La formulaci´ on de rPBGD se puede hacer pasando la enzima por una columna Sephadex G-100 y eluy´endola en una soluci´ on isot´ onica, por ejemplo NaCl 0,9 % y fosfato s´odico 10-50 mM pH 7,0 +/- 0,5 o en fosfato de sodio, glicina, manitol o las correspondientes sales de potasio. La soluci´on de formulaci´ on de rPBGD ser´ a esterilizada por filtraci´ on e introducida as´epticamente en viales de vidrio y liofilizada.

60

De manera alternativa, la soluci´ on esterilizada por filtraci´on de rPBGD ser´ a formulada en, por ejemplo, ves´ıculas lip´ıdicas constituidas por fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina o combinaciones de ellas o 22

ES 2 177 240 T3 incorporadas en eritrocitos fantasmas. La reconstituci´on de la rPBGD liofilizada se har´ a en agua para inyecci´on. 5

10

Alternativamente, la rPBGD se puede formular en una formulaci´ on de liberaci´on sostenida que incluya microesferas biodegradables, por ejemplo en a´cido polil´actico, ´acido poliglic´olico o mezclas de ellos. Opcionalmente, la rPBGD puede ser liofilizada en un cartucho de dos compartimentos, donde la rPBGD estar´a en el compartimento frontal y el agua de reconstituci´ on en el compartimento posterior. Este cartucho de dos compartimentos se combinar´ a con un dispositivo de inyecci´ on para administrar rPBGD o por medio de una aguja o por un dispositivo sin aguja (por alta presi´ on). De otra manera, la rPBGD puede formularse en un tamp´ on fisiol´ ogico incluyendo un intensificador para la administraci´ on nasal.

15

Tambi´en puede formularse la rPBGD en una formulaci´ on oral conteniendo, por ejemplo, ves´ıculas lip´ıdicas (fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, esfingomielina) o microesferas de dextrano.

20

Aunque se prefiere la producci´ on recombinante de PBGD para el tratamiento de la PAI, puede ser producida alternativamente en hemat´ıes humanos. La producci´ on y fabricaci´ on de la PBGD recombinante se har´ a siguiendo los pasos que aparecen a continuaci´on.

25

Proceso de producci´ on de PBGD recombinante; una descripci´ on A. Fermentaci´ on 1. Banco de c´elulas principal

30

2. Banco de c´elulas de trabajo 3. Producci´on de cultivo de siembra 35

4. Fermentaci´on en un fermentador de gran tama˜ no (250 l >) B. Purificaci´ on 1. Concentraci´ on de las c´elulas por filtraci´ on/centrifugaci´ on

40

2. Ruptura de las c´elulas 3. Ultrafiltraci´ on 45

4. Cromatograf´ıa de intercambio i´onico, DEAE-Sefarosa, MonoQ-Sefarosa 5. Cromatograf´ıa de interacci´on hidrof´ obica (Octil/fenil-Sefarosa, Fenil TSK, 5PW Fenil-Sefarosa) 6. Cromatograf´ıa de intercambio i´onico (MonoQ)

50

7. Formulaci´ on por filtraci´ on en gel Sephadex G-100 C. Fabricaci´ on 55

1. Filtraci´on est´eril 2. Llenado as´eptico 3. Liofilizaci´ on

60

Tratamiento de otras Porfirias

23

ES 2 177 240 T3

5

An´ alogamente al nuevo tratamiento de pacientes de PAI con PBGD (recombinante), las porfirias hep´ aticas tales como la Porfiria por deficiencia de AAL (PDA), Porfiria cutanea tarda (PCT), Coproporfiria hereditaria (CPH), y Porfiria Variegata (PV), se pueden beneficiar de la terapia de sustituci´ on por rALA deshidratasa, rUroporfirin´ ogeno descarboxilasa, rCoproporfirin´ ogeno oxidasa y rProtoporfirin´ ogeno oxidasa, respectivamente. Los pacientes con Porfirias Eritropoy´eticas como la Porfiria eritropoy´etica cong´enita (PEC) o la Protoporfiria eritropoy´etica (PPE) se beneficiar´an de la terapia de sustituci´ on con rUroporfirin´ ogeno III sintetasa y rFerroquelatasa, respectivamente.

10

Las Porfirias Hepatoeritropoy´eticas, por ejemplo las Porfirias hepatoeritropoy´eticas (PHE) se pueden tratar con rUroporfirin´ ogeno descarboxilasa.

15

Todas las porfirias pueden tratarse por la administraci´ on de la actividad enzim´atica carente o disminuida (normalmente al 50 %) en cualquiera de los ocho pasos de la ruta de bios´ıntesis del hemo como se ha descrito anteriormente. Se puede conseguir la sustituci´ on de la actividad enzim´atica por la adici´ on de la correspondiente enzima recombinante o de otras mol´eculas que proveer´ an de la actividad enzim´atica perdida.

20

Terapia g´enica como una posibilidad de tratamiento alternativo para pacientes con porfiria aguda intermitente (PAI)

25

La enzima humana Porfobilin´ ogeno desaminasa PBGD es codificada por un u ´ nico gen localizado en el cromosoma 11q24. Las mutaciones en este gen causan la enfermedad Porfiria Aguda Intermitente (PAI). Se ha mostrado que esta enfermedad es inherente de manera autos´omica dominante.

30

Actualmente se han identificado aproximadamente 100 mutaciones en el gen PBGD (Grandchamp B. J. Gastroenterology and Hepathology, 11, 1046-1052, 1996, Tabla A) y se espera que este n´ umero crezca cuando se puedan aplicar de forma m´ as rutinaria en hospitales sistemas de diagn´ ostico modernos basados en programas de selecci´on. Una serie de esas mutaciones se muestran en la Tabla A. TABLA A

35

Mutaciones reportadas en el gen PBGD

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Ex´ on 1 Intr´on 1 Ex´ on 3

45

Ex´ on 4

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Ex´ on 5

55

Intr´on 5 Ex´ on 6 Ex´ on 7

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Intr´on 7

Posici´on

Mutaci´ on

Consecuencias

Referencia

3 33 33+1 76 77 91 97 100 100 125 163 174 182 210+1 218-219 277 293 331 345-1

ATG→ATA GCG→GCT gtg→atg CGC→TGC CGC→CAC GCT→CACT Del A CAG→AAG CAG→TAG TTG→TAG GCT→TCT Del C Ins G gta→ata Del AG GTT→TTT AAG→AGG GGA→AGA cag→caa

Deterioro de la traducci´ on DS DS R26C R26H A31T Marco de lectura Q34K Q34X L42X A55S Marco de lectura Marco de lectura DS (Del ex´ on 5) Marco de lectura V93F K98R G111R AS (Del ex´ on 8)

18 17 16 25 26 24 25 27 25 19 24 24 24 24 24 24 25 28 29

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ES 2 177 240 T3 TABLA A (continuaci´on) Mutaciones reportadas en el gen PBGD 5

Ex´ on 8 Ex´ on 9 10

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Intr´on 9 Ex´ on 10

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Ex´ on 11 Intr´on 11 Ex´ on 12

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Intr´on 12 Ex´ on 13 Ex´ on 14

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55

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Intr´on 14 Ex´ on 15

Posici´on

Mutaci´ on

Consecuencias

Referencia

346 347 445 446 446 463 470 499-1 499 500 518 530 593 604 610 612 625 652-3 667 673 673 713 715-716 730-731 734 739 740 742 748 754 755 766 771 771 771+1 806 820 838 848 886 900 912+1 1062 1073

CGG→TGG CGG→CAG CGA→TGA CGA→CAA CGA→CTA CAG→TAG Ins A cag→caa CGG→TGG CGG→CAG CGG→CAG CTG→CGG TGG→TAG Del G CAG→TAG CAG→CAT GAG→AAG cag→gag GAA→AAA CGA→GGA CGA→TGA CTG→CGG Del CA Del CT CTT→CGT TGC→CGC TGC→TTC Ins 8 pb GAA→AAA GCC→ACC GCC→GTC CAC→AAC CTG→CTA GTC→CTC gta→ata ACA→ATA GGG→AGG GGA→AGA TGG→TAG CAG→TAG Del T gta→ata Ins C Del A

R116W R116Q R149X R149Q R149L Q155X Marco de lectura AS (Del ex´on 10) R167W R167Q R173Q L177R W198X Marco de lectura Q204X DS (Del 9 pb ex´ on 10) E209K AS (Del ex´ on 12) E223K R225G R225X L238R Marco de lectura Marco de lectura L245R C247R C247F Marco de lectura E250K A252T A252V H256N DS (Del ex´ on 12) DS (Del ex´ on 12) DS (Del ex´ on 12) T269I G274R G280R W283X Q296X Marco de lectura DS (Del ex´ on 14) Marco de lectura Marco de lectura

20 30 25 31 24 32 29 21 33 27, 34 34 27 19 35 30 31 28 33 24 25 25 25 19 36 31 36 18 24 24 36 36 27 39 37 19 30 30 25 30 25 31 28 38 25

En otro aspecto, la presente invenci´ on se refiere a un procedimiento terap´eutico para pacientes de PAI basado en terapia g´enica. El tratamiento por terapia g´enica conlleva los siguientes pasos. 25

ES 2 177 240 T3 1. Identificaci´ on de las mutaciones en el gen PBGD que causan PAI en humanos 2. Selecci´on de una secuencia de ADNc de PBGD humana para terapia g´enica 3. Construcci´ on de vectores terap´euticos con el gen PBGD 5

4. Producci´on de vectores de transferencia con el gen PBGD 5. Sistema de suministro del vector de transferencia con el gen PBGD 10

15

1. Identificaci´ on de las mutaciones en el gen PBGD que causan PAI en humanos Los pacientes con una mutaci´on puntual en el Ex´ on 10 en la posici´ on 593 TGG>TAG tienen un cambio en la secuencia de amino´acidos de la enzima PBGD de W198X (cod´on de terminaci´ on). Esta mutaci´on la portan aproximadamente el 50 % de todos los pacientes con PAI en Suecia (Lee JS y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 10912-10915, 1991). Los pacientes con PAI con otras mutaciones diferentes a W198X, que tambi´en pueden beneficiarse de la terapia g´enica, se muestran en la Tabla A. 2. Selecci´ on de una secuencia de ADNc de PBGD humana para terapia g´enica

20

25

Hay dos formas de isoenzima de la PBGD humana, por ejemplo la forma eritropoy´etica y la no eritropoy´etica, que se forman por un mecanismo alternativo de eliminaci´ on de intrones. La forma no eritropoy´etica tiene una extensi´ on de 17 amino´acidos en el extremo N-terminal de la forma eritropoy´etica de la PBGD. Forma no eritropoy´etica de la PBGD (nPBGD):

30

35

Forma eritropoy´etica de la PBGD (ePBGD): 40

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50

55

La secuencia de nucle´otidos y amino´acidos de la PBGD humana que se usar´ a en la terapia g´enica difiere de la publicada por Raich N. y col. Nucl. Acid. Res. 14, 5955-5968, 1986, en que el residuo amino´acido en posici´on 332 es un residuo Asn en lugar de Thr. Con el fin de hacer una “enzima natural” y evitar la formaci´ on de anticuerpos, la secuencia de PBGD tiene que contener un residuo Asn en posici´ on 332. La secuencia de ADNc que se usar´ a para la forma eritropoy´etica de PBGD se muestra m´as arriba. El paciente con un defecto de enzima eritropoy´etica PBGD ser´a transfectado con la secuencia de ADNc de la PBGD eritropoy´etica y los pacientes con un defecto en la forma no eritropoy´etica ser´an transfectados con la secuencia de ADNc no eritropoy´etica. 3. Construcci´ on de vectores terap´euticos con el gen PBGD Sistema de vector adenov´ırico

60

El vector se basa en un adenovirus tipo 5 (Ad5), que contiene tres sitios gen´eticos esenciales, por ejemplo E1, E2, E4, que codifican importantes prote´ınas reguladoras y un sitio E3 que no es esencial

26

ES 2 177 240 T3 para el crecimiento del virus. La deleci´on de las regiones E1A y E1B hace que la replicaci´on del virus in vivo sea deficiente. La complementaci´on eficiente de la funci´ on E1 (stocks virales recombinantes) se puede obtener en una l´ınea celular que exprese E1, como la l´ınea celular humana 293. 5

El ADNc de la PBGD humana ser´ a insertado en un sistema de vector de adenovirus. Los transgenes de PBGD se dirigir´an por el promotor end´ ogeno de la PBGD o un promotor de citomegalovirus (CMV).

10

Vectores Retrovirales Los vectores retrovirales son adecuados para el suministro de genes por varias razones: 1. simplicidad

15

2. capacidad de integrar insertos de ADN de hasta 8 kpb 3. su seguridad, no patog´enicos para humanos 20

4. f´ aciles de mejorar y manipular 5. sitios de integraci´ on de genes definidos 6. expresi´on regulada a largo plazo

25

Sin embargo, una de las principales desventajas de los vectores de retrovirus es que solo pueden transducir c´elulas en divisi´ on.

30

35

40

Dentro de la familia retroviridae, los considerados mayoritariamente para terapia g´enica son los lentiviridae y los viridae tipo-C de mam´ıfero. Tambi´en se considera otro tipo de retrovirus. Un ejemplo de esto es el retrovirus de leucemia murina -Moloney (Mo-MLV), que se ha usado con ´exito para transducir fibroblastos humanos y de ratones con la uroporfirin´ ogeno III sintetasa (UROIIIS). (Moreau-Gaudry y col. Human Gene Therapy 6, 13-20, 1995). La expresi´on del gen UROIIIS se dirigi´o por una repetici´ on terminal larga (LTR). El ADNc de UROIIIS se transdujo satisfactoriamente por los vectores de retrovirus en c´elulas progenitoras de sangre perif´erica humanas. La secuencia de ADNc de PBGD eritropoy´etica se puede insertar en un vector de retrovirus LXSN (Miller y col. Bio Techniques 7, 980-990, 1989) y pMFG (Dranoff y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90, 3539-3543, 1993). Esto conducir´ a a las siguientes construcciones, por ejemplo, LePSN y pMFG-ePBGD, respectivamente. LePSN:

45

> 1032 bp < LTR——/cDNA ePBGD/SV40/

Neo

/——LTR

pMFG-ePBGD: 50

> 1032 bp < LTR———/cDNA ePBGD/———LTR 55

Para la transducci´ on de tejidos no eritropoy´eticos se insertar´ a el ADNc no eritropoy´etico (v´ease la secuencia 12) en el vector LSXN y el vector pMFG resultando en los vectores LSnPN y pMFG-nPBGD, respectivamente. LnPSN:

60

> 1083 bp < LTR ——/cDNA nPBGD/SV40/Neo/—–-LTR

27

ES 2 177 240 T3 pMFG-nPBGD: > 1083 bp < LTR —–-/cDNAnPBGD/——LTR 5

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Los vectores LePSN y LnPSN se pueden convertir al correspondiente virus por transferencia en la l´ınea celular hospedadora adecuada, por ejemplo, ιCRE como se describe en Danos y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 6460-6464, 1988. Los sobrenadantes filtrados de c´elulas ect´opicas productoras de virus se a˜ nadieron a c´elulas anf´ oteras ιCRIP en presencia de Polybrene. Se pueden aislar y ensayar clones para virus. Se guardar´ an los clones que muestren t´ıtulos de aproximadamente 1.000.000 ufc/ml (resistentes a G418). El vector LnPSN ser´ a cotransfectado con el pl´asmido pMCl-Neo (Pharmacia, Suecia) en la l´ınea celular de empaquetamiento ιCRIP. Se seleccionar´an los clones que muestren integraci´on de provirus y altos niveles de expresi´on de mensaje. El filtrado proveniente de los sobrenadantes de las c´elulas productoras de virus (forma PBGD eritropoy´etica) puede mezclarse con Polybrene y ser incubado con c´elulas progenitoras de sangre perif´erica (transplante de m´edula o´sea) de pacientes con PAI durante algunas horas. Las c´elulas del progenitor transducidas pueden luego transplantarse de nuevo al paciente con PAI. El ´exito del tratamiento se determinar´a como el incremento en la actividad PBGD en eritrocitos y la excreci´on reducida de AAL y PBGD en orina. Cl´ınicamente se puede evaluar el ´exito del tratamiento como la reducci´on de la frecuencia de ataques agudos espont´aneos o de ataques inducidos por f´ armacos. Esto puede ser una forma m´as conveniente de administraci´on de la enzima PBGD recombinante que las inyecciones regulares. La eficacia de la terapia puede evaluarse por la medida de la actividad de PBGD en sangre y la excreci´ on reducida de PBGD y AAL en la orina. Cl´ınicamente, un tratamiento satisfactorio resultar´ a en menor n´ umero de ataques agudos o preferentemente en la ausencia de ataques. Sistema asociado a Adenovirus (AAV) AAV es un virus humano no patog´enico (Parvovirus) portado por m´ as del 80 % de la poblaci´ on. La ventaja que presenta el AAV respecto a los sistemas de retrovirus es que el AAV puede transducir c´elulas tanto en divisi´ on como no en divisi´ on. El genoma del virus, que es peque˜ no, contiene dos repeticiones terminales invertidas (ITR) y dos funciones REP y CAP. Las funciones REP y CAP pueden ser delecionadas e insertarse un ADNc ex´ ogeno. Se puede hacer la construcci´on de un vector AAV que contenga el ADNc de PBGD eritropoy´etica. Este vector AAV/PBGD ser´a adecuado para transducir c´elulas de m´ usculo esquel´etico de pacientes con PAI, como una “f´ abrica muscular” para la producci´ on de enzima PBGD. El ADNc de PBGD se dise˜ nar´ a de manera que la secuencia se˜ nal para la secreci´on se a˜ nada en el extremo 5’ del ADNc. Esto permitir´a que la enzima PBGD eritropoy´etica sea secretada de las c´elulas musculares al torrente sangu´ıneo. Por este sistema, los pacientes recibir´ an un suministro constante de la enzima PBGD nativa en el torrente sangu´ıneo, que podr´ a metabolizar PBG y por tanto evitar los ataques agudos. -No eritropoy´etico Alternativamente, las c´elulas del h´ıgado pueden ser transducidas con AAV que contenga el ADNc de PBGD no eritropoy´etica. La construcci´on se dise˜ nar´ a de manera que la enzima PBGD traducida permanezca en el compartimento intracelular, por ejemplo conteniendo un residuo Met en el extremo N-terminal de la enzima PBGD sin una secuencia se˜ nal para la secreci´on en c´elulas de mam´ıfero. El transgen PBGD se transcribir´ a y sufrir´ a traducci´ on a nuevas enzimas PBGD que permanecer´an en el compartimento intracelular. Los niveles de nuevas enzimas PBGD sintetizadas en el h´ıgado normalizar´ an la actividad PBGD al 100 %. Normalmente los pacientes de PAI tienen reducida la actividad PBGD (50-80 %) en el h´ıgado dependiendo de la mutaci´ on y de variaciones individuales. Este tratamiento aliviar´ıa los s´ıntomas cl´ınicos, por ejemplo los ataques agudos con dolor abdominal, y reducir´ıa la excreci´on de AAL y PBG en la orina. El AAV conteniendo la forma PBGD no eritropoy´etica tambi´en puede usarse para corregir el defecto gen´etico en otros tipos celulares tales como tejido neuronal, p´ ancreas, bazo, por ejemplo tejido no eritropoy´etico, por un mecanismo similar. -Eritropoy´etico

28

ES 2 177 240 T3 El ADNc de PBGD eritropoy´etico puede insertarse en un vector AAV y ser usado para transducir c´elulas eritropoy´eticas y c´elulas madre en pacientes con PAI, que tengan una mutaci´ on que afecte a la forma eritropoy´etica de PBGD. 5

10

15

4. Producci´ on de vectores de transferencia con el gen PBGD Los adenovirus tiene un ADN de doble cadena de aproximadamente 36 kpb, conteniendo tres sitios en principio esenciales (E1, E2 y E4) que codifican importantes prote´ınas reguladoras. El sitio E3 codifica por un producto de gen que bloquea la respuesta inmune a c´elulas infectadas por virus in vivo. El vector adenovirus de transferencia del gen PBGD puede producirse por deleci´ on de los sitios E1 y E3. El bloque de genes de PBGD se inserta en su lugar. El virus es defectivo en la replicaci´on cuando el sitio E1 se ha delecionado. En una l´ınea celular de expresi´on E1 se puede obtener una complementaci´ on eficiente de E1 y por tanto un alto rendimiento de vector de virus recombinante (PBGD), como la l´ınea celular humana 293. (Graham, F. Y col. 1977, Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus 5. J. Gen. Virol. 36, 59-72). 5. Sistemas de suministro de vectores de transferencia con el gen PBGD

20

El suministro de vectores virales se basa en la inyecci´ on a un paciente de una part´ıcula v´ırica que puede transducir c´elulas humanas in vivo. Correcci´ on de mutaciones puntuales que causan PAI por Reparaci´ on de Genes. Quimeroplastia

25

La t´ecnica b´asica conlleva la s´ıntesis de quimeras de oligonucle´otidos (ARN-ADN). El oligonucle´ otido reparar´ a mutaciones puntuales en el cromosoma por uni´on al sitio de la mutaci´ on y creaci´ on de un malapareamiento. El “sistema de reparaci´ on de malapareamiento” end´ ogeno que est´a presente en todas las c´elulas vivas corregir´a la mutaci´on. Las quimeras de oligonucle´otidos tienen las siguientes propiedades generales:

30

a. 68 unidades (65-70 es un tama˜ no aceptable) b. el ADN de 25 bases se extiende en el extremo 5’ hom´ologo a la secuencia normal del gen

35

c. el ADN de 25 bases se dise˜ na de manera que 12 pb a cada lado de la mutaci´on son complementarias con el “ADN natural” donde la mutaci´ on que se va a alterar est´a localizada en la posici´on 13. d. las 25 unidades contienen 4 bases T a cada extremo para volver a enlazar el oligo y la otra cadena de ADN con una secuencia de 25 bases hom´ologa a la otra cadena del ADN cromos´omico.

40

45

e. la segunda cadena es quim´erica ya que contiene 10 bases hom´ologas de 2’O metil ARN seguido de 5 bases de ADN (conteniendo un malapareamiento central, por ejemplo correcci´ on de la mutaci´ on puntual humana por reparaci´ on de malapareamiento) seguido de otra extensi´on de 10 bases de 2’O metil ARN hom´ ologo. Esta extensi´ on de ADN/ARN continua con una abrazadera de 5 bases de GC y 4 bases T para formar el segundo bucle y finalmente una abrazadera de 5 bases de GC complementariamente a la otra. Ejemplo 1 Correcci´ on de la mutaci´ on PBGD en posici´ on 593 TGG>TAG resultando en W198X

50

Secuencia cromos´ omica normal

55

Secuencia cromos´ omica en PAI 60

29

ES 2 177 240 T3 Terminaci´on La secuencia de la quimera de oligonucle´otido (Heme593W/X) es: 5

10

15

20

25

Se puede construir el mismo principio de quimera de oligonucle´ otido para corregir cualquiera de las mutaciones que causan la PAI recogidas en la Tabla A. 30

Las quimeras de oligonucle´otidos pueden usarse para corregir cualquier otra mutaci´ on puntual que cause cualquiera de las 8 porfirias conocidas de manera similar a la descrita anteriormente. Suministro de vectores no virales de transferencia del gen PBGD a humanos

35

La quimera de oligonucle´otido puede formularse en una preparaci´ on que act´ ua como veh´ıculo que contiene fosfol´ıpidos ani´ onicos o cati´onicos o una mezcla de fosfol´ıpidos con l´ıpidos neutros o PEI lactosilado. Alternativamente, los vectores no virales pueden formularse en liposomas que contengan mezclas de fosfol´ıpidos naturales y l´ıpidos neutros.

40

45

Pueden incorporarse secuencias espec´ıficas de prote´ınas a membranas liposomales, que reconocen receptores celulares para el marcado espec´ıfico de los vectores no virales a un tipo celular espec´ıfico como el h´ıgado, tejido neuronal o tejidos eritropoy´eticos. De manera alternativa se pueden usar anticuerpos espec´ıficos que reconozcan ant´ıgenos de superficie celular espec´ıficos para el marcado. Adem´as, se pueden usar carbohidratos en la membrana liposomal para la captaci´ on por parte del h´ıgado de las quimeras de oligonucle´ otidos. La quimera de oligonucle´otido formulada (HemeBiotech 595 W/X) se administrar´ a por inyecciones subcut´ aneas o intravenosas a pacientes con PAI.

50

La eficacia del tratamiento se evaluar´a como anteriormente. La terapia g´enica como un tratamiento alternativo para otras enfermedades porf´ıricas

55

60

Las estrategias de terapia g´enica descritas en este documento tambi´en se pueden usar para otras enfermedades porf´ıricas. El principio general es aumentar el contenido celular o sist´emico de una enzima defectiva en particular que causa la enfermedad. Con esta estrategia se pueden abarcar las siguientes enfermedades porf´ıricas: 1. Porfiria por deficiencia de AAL (PDA) 2. Porfiria cutanea tarda (PCT)

30

ES 2 177 240 T3 3. Coproporfiria hereditaria (CPH) 4. Harderoporfiria (HDP) 5

5. Porfiria Variegata (PV) 6. Porfiria eritropoy´etica cong´enita (PEC) 7. Protoporfiria eritropoy´etica (PPE)

10

8. Porfiria hepatoeritropoy´etica (PHE). Referencias 15

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40

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60

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Yoo H. W. y col. Hydroxymethylbilane synthase: complete genomic sequence and amplifiable polymorphisms in the human gene. Genomics 1993 Jan; 15(1): 21-9.

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32

ES 2 177 240 T3 REIVINDICACIONES

5

1. El uso de una cantidad efectiva de un catalizador que es una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo, junto con un portador farmac´euticamente aceptable para la preparaci´on de una composici´ on farmac´eutica para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad causada por una deficiencia, en un sujeto, de una enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo. 2. El uso de acuerdo con la reivindicaci´ on 1, en donde la enfermedad es una del grupo formado por

10

porfiria aguda intermitente (PAI) porfiria por deficiencia de AAL (PDA)

15

porfiria cutanea tarda (PCT) coproporfiria hereditaria (CPH) harderoporfiria (HDP)

20

porfiria Variegata (PV) porfiria eritropoy´etica cong´enita (PEC)

25

protoporfiria eritropoy´etica (PPE), y porfiria hepatoeritropoy´etica (PHE).

30

3. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 ´o 2, en donde el catalizador es una enzima seleccionada del grupo formado por Porfobilin´ ogeno desaminasa (PBGD), AAL deshidratasa,

35

Uroporfirinogeno descarboxilasa, Coproporfirin´ ogeno oxidasa,

40

Coproporfirin´ ogeno oxidativa, Protoporfirin´ ogeno oxidasa, Uroporfirin´ ogeno III sintasa,

45

Ferroquelatasa, y Uroporfirin´ ogeno descarboxilasa,

50

o una parte enzim´ aticamente equivalente o su an´alogo. 4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la enfermedad es PAI y la enzima es PBGD o una parte enzim´aticamente equivalente o su an´alogo.

55

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el catalizador es una forma recombinante de la enzima perteneciente a la ruta de bios´ıntesis del hemo o de una parte enzim´aticamente equivalente o de un an´alogo.

60

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el catalizador es administrable por una v´ıa seleccionada del grupo formado por la v´ıa intravenosa, la v´ıa intraarterial, la v´ıa intracut´ anea, la v´ıa subcut´ anea, la v´ıa oral, la v´ıa bucal, la v´ıa intramuscular, la v´ıa anal, la v´ıa transd´ermica, la v´ıa intradermal, y la v´ıa intratecal.

33

ES 2 177 240 T3 7. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el catalizador se formula en una soluci´ on isot´ onica, tal como NaCl 0,9 % y fosfato de sodio 10-50 mM pH 6,50 a 8 o fosfato de sodio, glicina, manitol o las correspondientes sales de potasio. 5

8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde el catalizador est´a liofilizado. 9. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el catalizador se esteriliza por filtraci´ on.

10

15

10. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 8 ´o 9, en donde el catalizador se formula como ves´ıculas lip´ıdicas que comprenden fosfatidilcolina o fosfatidiletanolamina o sus combinaciones. 11. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 8 ´o 9, en donde el catalizador se incorpora a eritrocitos fantasma. 12. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, 8 ´o 9, en donde el catalizador se formula como una formulaci´ on de liberaci´on sostenida que presenta microesferas biodegradables, tal como microesferas formadas por ´acido polil´actico, ´acido poliglic´olico o mezclas de ellos.

20

13. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el catalizador est´a liofilizado en un cartucho de dos compartimentos, donde en catalizador est´ a en el compartimento frontal y el agua para la reconstituci´ on en el compartimento posterior. 25

30

14. El uso de acuerdo con la reivindicaci´ on 13, en donde el cartucho de dos compartimentos se combina con un dispositivo inyector para administrar el catalizador bien por medio de una aguja, o por un dispositivo sin aguja (alta presi´ on). 15. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1- 9, en donde el catalizador se formula en un tamp´ on fisiol´ ogico que contiene un intensificador para la administraci´ on nasal. 16. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el catalizador se formula como una formulaci´ on oral conteniendo vesiculas lip´ıdicas, como aquellas que comprenden fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, o esfingomielina, o microesferas de dextrano.

35

17. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el catalizador se formula de manera que aumenta su semivida en el torrente sangu´ıneo del paciente.

40

18. El uso de acuerdo con la reivindicaci´ on 17, en donde el catalizador tiene un recubrimiento de polietilenglicol. 19. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 17, en donde el catalizador est´a complejado con un metal pesado.

45

50

20. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el catalizador es una parte enzim´ aticamente equivalente o un an´alogo de la enzima y ejerce al menos parte de su actividad enzim´atica intracelularmente en la administraci´on al sujeto. 21. El uso de acuerdo con la reivindicaci´ on 20, en donde el catalizador es una enzima artificial peque˜ na o un catalizador org´ anico que puede polimerizar porfobilin´ogeno a hidroximetilbilano. 22. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde el catalizador es dicha enzima formulada de manera que ejerce al menos parte de su actividad enzim´ atica intracelularmente en la administraci´on al sujeto.

55

23. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 22, en donde el catalizador se marca con carbohidratos espec´ıficos u otras estructuras espec´ıficas de las c´elulas del h´ıgado para la captaci´ on espec´ıfica por parte del h´ıgado. 60

24. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-19, en donde el catalizador ejerce subtancialmente toda su actividad enzim´ atica extracelularmente en el torrente sangu´ıneo.

34

ES 2 177 240 T3 25. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 24, en donde la actividad enzim´ atica del catalizador sobre su precursor hemo relevante resulta en un producto metab´ olico que 1) o se introduce en el compartimento intracelular y se convierte siguiendo los pasos restantes de la ruta de bios´ıntesis del hemo o 2) es excretado del sujeto v´ıa urinaria y/o fecal. 5

26. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde en catalizador se ha preparado por medio de un procedimiento que comprende

10

a) la introducci´ on, en un vector adecuado, de un fragmento de a´cido nucleico que incluye una secuencia de ´acido nucleico que codifica el catalizador; b) la transformaci´ on de una c´elula hospedadora compatible con el vector;

15

c) el cultivo de la c´elula hospedadora transformada bajo condiciones que faciliten la expresi´ on de la secuencia del ´acido nucleico; y d) la recuperaci´ on del producto de expresi´ on del cultivo

20

y opcionalmente el sometimiento del producto de expresi´ on a un procesado postraduccional, tal como replegamiento de prote´ına in vitro, eliminaci´on enzim´atica de compa˜ neros de fusi´on, alquilaci´ on de residuos amino´ acidos, y desglicosilaci´on, para obtener el catalizador. 27. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, en donde el catalizador se ha preparado por s´ıntesis pept´ıdica en fase l´ıquida o en fase s´olida.

25

28. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el catalizador carece de cualquier otro material biol´ogico de origen humano.

30

29. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el catalizador es administrable al menos una vez al d´ıa, como por ejemplo, 2, 3, 4, y 5 veces al d´ıa. 30. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la dosis diaria est´a en el intervalo de 0,01-1,0 mg/kg de peso corporal por d´ıa, como en el intervalo de 0,05-0,5 mg/kg de peso corporal por d´ıa.

35

31. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la dosis diaria es de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal por d´ıa.

40

32. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la composici´on se adapta para la administraci´ on al menos una vez al d´ıa, como 2, 3, 4, y 5 veces al d´ıa y en donde la dosis diaria es de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal por d´ıa. 33. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-31, en donde el catalizador es una forma recombinante de la enzima.

45

34. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-33, en donde el catalizador es una PBGD recombinante humana basada en cualquiera de la Seq. ID NO 1 (clon PBGD 1.1) y la Seq. ID NO 12 (no eritro PBGD 1.1.1). 50

35. Un catalizador que es una enzima de la ruta de bios´ıntesis del hemo o una parte enzim´ aticamente equivalente o un an´ alogo, para uso como medicamento. 36. Un catalizador de acuerdo con la reivindicaci´ on 35, que es una PBGD recombinante humana basada en cualquiera de la Seq. ID NO 1 (clon PBGD 1.1) y la Seq. ID NO 12 (no eritro PBGD 1.1.1).

55

60

37. El uso de la secuencia de ADNc de PBGD humana de la forma no eritropoy´etica o de la forma eritropoy´etica para la preparaci´ on de un medicamento para terapia g´enica por transfecci´on del paciente con la secuencia de ADNc de PBGD humana de la forma no eritropoy´etica o de la forma eritropoy´etica de acuerdo con el tejido en el que se debe expresar PBGD, para el tratamiento o prevenci´on de la enfermedad en un paciente que tenga una mutaci´ on en el gen PBGD causando un defecto en la enzima. 38. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 37 en donde el defecto enzim´ atico se selecciona de unas de35

ES 2 177 240 T3 ficiencias enzim´aticas que resultan en una enfermedad seleccionada de porfiria aguda intermitente (PAI), porfiria por deficiencia de AAL (PDA), Porfiria cutanea tarda (PCT), Coproporfiria hereditaria (CPH), Harderoporfiria (HDP), Porfiria Variegata (PV), Porfiria eritropoy´etica cong´enita (PEC), Protoporfiria eritropoy´etica (PPE), y Porfiria hepatoeritropoy´etica (PHE). 5

39. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 37 en donde la enfermedad es Porfiria Aguda Intermitente (PAI).

10

40. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-39 en donde la secuencia de ADNc de PBGD humana se selecciona de la Seq. ID NO 1 (clon PBGD 1.1) y la Seq. ID NO 12 (no eritro PBGD 1.1.1). 41. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-40 en donde la transfecci´on se hace mediante el uso de un vector seleccionado de adenovirus, retrovirus y adenovirus asociados.

15

42. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-41 en donde el vector de tranferencia del gen PBGD en c´elulas humanas (eritropoy´eticas y/o no eritropoy´eticas) resulta en una actividad PBGD normal. 20

43. El uso de una mol´ecula de oligonucle´ otido espec´ıfica dise˜ nada para la fabricaci´ on de un medicamento para el tratamiento por terapia g´enica de pacientes con Porfiria Aguda Intermitente (PAI) por correcci´on de una de las mutaciones puntuales espec´ıficas identificadas como causantes de PAI por el uso de un gen reparador de quimeroplastia.

25

44. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 37-43 en donde el sistema de suministro para la transfecci´ on es por el uso de vectores no virales formulados en una preparaci´ on que sirve como veh´ıculo que comprende uno o m´ as componentes seleccionados de entre fosfol´ıpidos cati´onicos, fosfol´ıpidos, fosfol´ıpidos mezclados con l´ıpidos neutros, PEI lactosilado, y liposomas que comprenden mezclas de fosfol´ıpidos naturales y l´ıpidos neutros.

30

45. El uso de acuerdo con la reivindicaci´on 43 o´ 44 en donde la mutaci´ on se selecciona de la siguiente Tabla A: TABLA A 35

Posici´on

40

Ex´ on 1

3

ATG→ATA

Intr´on 1 Ex´ on 3

33 33+1 76 77

GCG→GCT gtg→atg CGC→TGC CGC→CAC

91 97 100

GCT→CACT Del A CAG→AAG

100 125 163 174

CAG→TAG TTG→TAG GCT→TCT Del C

182 210+1 218-219

Ins G gta→ata Del AG

45

Ex´ on 4

50

Ex´ on 5 55

60

Mutaci´ on

Intr´on 5 Ex´ on 6

36

ES 2 177 240 T3 TABLA A (continuaci´on) Posici´on

Mutaci´ on

Ex´ on 7

277

GTT→TTT

Intr´on 7

293 331 345-1

AAG→AGG GGA→AGA cag→caa

346 347 445 446

CGG→TGG CGG→CAG CGA→TGA CGA→CAA

446 463 470 499-1

CGA→CTA CAG→TAG Ins A cag→caa

499 500 518 530

CGG→TGG CGG→CAG CGG→CAG CTG→CGG

593 604 610

TGG→TAG Del G CAG→TAG

612 625 652-3 667

CAG→CAT GAG→AAG cag→gag GAA→AAA

673 673 713 715-716

CGA→GGA CGA→TGA CTG→CGG Del CA

730-731 734 739 740

Del CT CTT→CGT TGC→CGC TGC→TTC

742 748 754

Ins 8 pb GAA→AAA GCC→ACC

755

GCC→GTC

5

10

Ex´ on 8 15

Ex´ on 9

20

Intr´on 9 Ex´ on 10 25

30

35

40

45

50

55

Ex´ on 11 Intr´on 11 Ex´ on 12

60

37

ES 2 177 240 T3 TABLA A (continuaci´on) Posici´on

Mutaci´ on

766

CAC→AAC

771 771 771+1

CTG→CTA GTC→CTC gta→ata

806 820 838 848

ACA→ATA GGG→AGG GGA→AGA TGG→TAG

886 900 912+1 1062

CAG→TAG Del T gta→ata Ins C

1073

Del A

5

10

Intr´ on 12 Ex´ on 13 15

Ex´ on 14

20

Intr´ on 14 Ex´ on 15 25

30

35

40

45

50

55

60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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