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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 173 142 kInt. Cl. : G01N 33/543, G01N 33/569

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

G01N 33/577, A61L 2/08 C12M 1/26, C12M 1/12 C12M 1/14

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 95118035.5 kFecha de presentaci´on: 28.06.1990 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 701 130 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 13.03.1996

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54 T´ıtulo: Dispositivo y procedimiento para la captura y recuperaci´ on de c´ elulas.

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73 Titular/es: RORER PHARMACEUTICAL

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72 Inventor/es: Okarma, Thomas B.

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74 Agente: Elzaburu M´ arquez, Alberto

30 Prioridad: 29.06.1989 US 374091

PRODUCTS INC. 3711 Kennett Pike, Suite 200 Greenville, Delaware 19807, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.10.2002

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 173 142 T3

16.10.2002

Aviso:

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 173 142 T3 DESCRIPCION Dispositivo y procedimiento para la captura y recuperaci´ on de c´elulas. 5

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El campo del asunto trata de un m´etodo de esterilizar una superficie de poliestireno a la cual est´ a unido covalentemente un anticuerpo. La superficie se puede utilizar en un dispositivo con especificidad para prote´ınas de superficie celular, para efectuar separaciones celulares. Concretamente, la fuente de c´elulas ser´a sangre, l´ıquido espinal, m´edula o´sea, homogenados de tumor, tejido linf´ atico y similares. Hay numerosas situaciones en las que es de inter´es aislar una clase espec´ıfica de c´elulas o separar un grupo particular de c´elulas de una mezcla de c´elulas. Las t´ecnicas que se han empleado incluyen la clasificaci´on de c´elulas por fluorescencia, perlas inmunes magn´eticas, lisis mediada por complemento, cromatograf´ıa de afinidad, elutriaci´ on centr´ıfuga y revestimiento de c´elulas con poliestireno. Las c´elulas que tienen diferencias de densidad sustanciales, tales como las de entre plaquetas y gl´ obulos rojos, se pueden fraccionar groseramente mediante t´ecnicas de centrifugaci´on en gradiente. Sin embargo, las c´elulas de mam´ıfero con densidades equivalentes, tales como c´elulas tumorales, subgrupos de linfocitos, granulocitos o c´elulas pluripotenciales, requieren alguna forma de separaci´ on que utilice un reconocimiento molecular de marcadores de superficie, los cuales se correlacionan con sus fenotipos. De forma similar, se requieren dichos mecanismos moleculares para separar virus y bacterias unos de otros en mezclas complejas. Cada uno de los m´etodos antes mencionados tiene serios inconvenientes para muchas aplicaciones, donde existe un inter´es de aislar o separar subgrupos particulares de c´elulas. Las desventajas de la clasificaci´on de c´elulas activadas por fluorescencia para recuperaci´on de c´elulas clasificadas viables son la lentitud del m´etodo, el hecho de que las c´elulas aisladas est´an revestidas con un anticuerpo, y las cantidades limitadas de c´elulas que se pueden obtener mediante el m´etodo. Con las perlas inmunes, es dif´ıcil recuperar las c´elulas de las perlas despu´es de la separaci´on; las c´elulas con frecuencia est´an revestidas con un anticuerpo y perlas magn´eticas, y las distintas separaciones se consiguen solo dif´ıcilmente. La lisis mediada por complemento es problem´atica por dos razones: primera, el empobrecimiento en c´elulas diana es incompleto, y segundo, las c´elulas que no son diana pueden ser afectadas adversamente por exposici´on al complemento y a los subproductos t´ oxicos de la lisis de c´elulas diana. La cromatograf´ıa de afinidad de c´elulas utilizando, por ejemplo, Sephadex G-10 acoplada a un anticuerpo, adolece de una pobre recuperaci´ on y un ineficiente empobrecimiento en las c´elulas diana. La elutriaci´ on centr´ıfuga no puede separar diferentes subpoblaciones fenot´ıpicas de c´elulas de tama˜ no similar. La u ´ ltima metodolog´ıa, el revestimiento desarrollado por Wysocki and Sato, PNAS, 75:2844, (1978), que utiliza un anticuerpo adsorbido pasivamente en poliestireno, es particularmente inadecuada. Solamente se pueden conseguir bajas recuperaciones, y el procedimiento adolece de falta de especificidad y contaminaci´ on de las c´elulas separadas con el anticuerpo. Conforme ha llegado a elucidarse el sistema de defensa inmune, es cada vez m´ as evidente que subgrupos de c´elulas pueden tener intervalos relativamente estrechos de actividades. De esta forma, los subgrupos pueden estar especializados para responder a una enfermedad particular, tal como neoplasia, infecci´on, v´ırica o celular, etc., respuesta a trasplantes, y similares. Por lo tanto es de gran inter´es poder identificar y purificar estos subgrupos de c´elulas, no solamente para entender su acci´on, sino tambi´en para utilizar estas c´elulas con fines profil´ acticos y terap´euticos. Con el fin de conseguir los resultados deseados, es necesario que se puedan obtener poblaciones sustancialmente puras del subgrupo, o subgrupos, de c´elulas deseado. Adem´ as, la c´elulas deben estar(ser): (1) libres de anticuerpos en su superficie, (2) viables, (3) capaces de realizar su funci´ on normal y (4) sensibles a la activaci´on por productos biol´ ogicos de la misma forma que las c´elulas normales en su ambiente normal. La solicitud n◦ 90307080.3, de la cual se divide la presente solicitud, proporciona m´etodos, composiciones y dispositivos para la captura selectiva y liberaci´on de part´ıculas biol´ ogicas que pueden replicarse, particularmente part´ıculas v´ıricas y c´elulas. Se pone en contacto un medio que contiene las part´ıculas con un soporte s´ olido con una elevada densidad de sitios de receptor espec´ıficos mediante el cual part´ıculas con el ligando complementario se unen a la superficie. Los agentes biol´ogicos pueden ser liberados de los receptores mediante, bien sea activaci´on biol´ogica que da por resultado el desprendimiento y liberaci´on del ligando, o medios f´ısicos tales como pipeteado, vibraci´ on mec´anica o ultrasonidos, seg´ un convenga. Las c´elulas pueden ser ampliadas num´ericamente, someter a agentes biol´ogicos u otros factores para diferenciaci´on y/o activaci´ on, o similares, y se pueden utilizar para investigaci´on, diagn´ ostico, fines profil´acticos y/o terap´euticos.

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ES 2 173 142 T3 La presente invenci´on proporciona un m´etodo para esterilizar una superficie de poliestireno, a la cual est´a unido covalentemente un anticuerpo, m´etodo que comprende,

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aplicar a dicha superficie una composici´ on que comprende una cantidad estabilizante de la combinaci´on de seroalb´ umina humana (HSA) y sacarosa; e irradiar dicha superficie con una cantidad esterilizante de radiaci´ on gamma o de haz de electrones.

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La presente invenci´on tambi´en proporciona una superficie de poliestireno esterilizada que se puede preparar por este m´etodo. Esta superficie puede ser la superficie interna de un vaso, particularmente puede estar dentro de un recipiente de paredes r´ıgidas o flexibles que contiene l´ aminas de poliestireno superpuestas o apiladas una sobre otra y separadas una de otra para permitir que el l´ıquido fluya entre las l´ aminas. En los Dibujos que se adjuntan: La Fig. 1 es un dibujo esquem´ atico de un procedimiento para preparar c´elulas de sangre perif´erica o de m´edula o´sea para el dispositivo de captura; y

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La Fig. 2 es una perspectiva en forma de diagrama del interior de un dispositivo de captura de c´elulas. Se puede aislar una poblaci´ on concreta de part´ıculas replicables biol´ogicamente, particularmente c´elulas, de una mezcla de part´ıculas, uniendo la poblaci´ on a un sustrato s´ olido mediante la intermediaci´on de uno o m´ as receptores espec´ıficos. De forma opcional, a continuaci´on se pueden tratar las part´ıculas de una diversidad de formas para influir en el tama˜ no de la poblaci´ on y/o caracter´ısticas de las part´ıculas capturadas. A continuaci´ on las c´elulas se pueden liberar del soporte sustancialmente libre de receptor. El m´etodo implicar´a poner en contacto una fuente de part´ıculas con el receptor unido a un soporte en un dispositivo colector, donde la poblaci´ on del receptor sobre la superficie proporciona una elevada densidad de uni´ on para el(los) ligando(s) de inter´es. Las condiciones para la puesta en contacto son tales que dejan un tiempo suficiente y un bajo grado de turbulencia que permiten que las part´ıculas se unan espec´ıficamente al receptor. Despu´es de suficiente tiempo para que se produzca la uni´ on, se puede retirar el medio y lavar la superficie para separar las part´ıculas que no est´ an espec´ıficamente unidas. Puesto que las part´ıculas normalmente se unir´an a la superficie en una pluralidad de sitios, con el fin de tener una elevada avidez de uni´ on, el lavado puede ser bastante vigoroso para asegurar la retirada sustancialmente completa de todas las part´ıculas que no est´ an unidas espec´ıficamente. A continuaci´on las part´ıculas se pueden someter a una amplia variedad de condiciones o tratamientos, que normalmente implican ponerse en contacto con uno o m´as reactivos. Opcionalmente, a continuaci´on se puede retirar el medio que contiene los reactivos y se pueden liberar las part´ıculas de los receptores. La liberaci´on se puede realizar, bien sea mediante tratamiento con una combinaci´ on de un agente mitog´enico y una linfoquina, o mediante medios f´ısicos tales como pipeteado, vibraci´ on o sonicaci´on. A continuaci´ on las part´ıculas se pueden aislar y utilizar para la finalidad propuesta.

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En su mayor parte se utilizar´ an mezclas de c´elulas y, por consiguiente, el resto de la discusi´on estar´ a dirigida a c´elulas. Sin embargo, se pueden utilizar sustancialmente los mismos m´etodos para el aislamiento de virus y part´ıculas v´ıricas y en referencia a las c´elulas, se debe entender que normalmente se pueden sustituir virus y bacterias por esta raz´ on.

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El dispositivo encuentra aplicaci´on en una serie de situaciones diferentes. La primera es una situaci´ on en la que se desea capturar y separar c´elulas no deseadas de fluidos fisiol´ ogicos, empobreciendo de ese modo el fluido en las c´elulas no deseadas, para beneficio terap´eutico, o aplicaciones de diagn´ostico o investigaci´on. Esto se puede ilustrar empobreciendo la m´edula o´sea en determinados linfocitos-T para disminuir la enfermedad del injerto contra el hospedante. La m´edula o´sea, empobrecida en c´elulas no deseadas, se prepara inmediatamente para su trasplante en la m´edula hospedante.

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Una segunda situaci´on es capturar y recuperar determinadas c´elulas de fluidos fisiol´ ogicos para investigaci´ on y diagn´ ostico. Las aplicaciones de diagn´ostico pueden incluir la captura y posterior enumeraci´ on y descripci´on de (1) c´elulas malignas procedentes de sangre u otros tejidos, (2) c´elulas de mam´ıfero infectadas por virus o bacterias, (3) virus o bacterias o par´ asitos propiamente dichos de fluidos fisiol´ ogicos, (4) c´elulas fetales humanas para an´alisis cariot´ıpico de sangre, (5) c´elulas trasplantadas de sangre como un ´ındice de recuperaci´on de trasplante de m´edula o´sea, y (6) c´elulas inmunocompetentes con un marcador 3

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de superficie particular, tal como la presencia del receptor de IL-2, indicando un estado de activaci´ on; capturadas. Para investigaci´ on, se puede estar interesado en (1) el an´alisis gen´etico o modificaci´on de las c´elulas capturadas, (2) el an´ alisis y modificaci´on de la fisiolog´ıa de determinadas clases de c´elulas que se pueden activar o suprimir mediante un proceso de enfermedad concreto y (3) a nivel molecular, el an´ alisis de la composici´on de la membrana superficial y la modificaci´ on de las c´elulas implicada en la patog´enesis de una enfermedad concreta. La tercera situaci´on radica en la captura y recuperaci´ on de c´elulas de fluidos fisiol´ ogicos para modificaci´on (activaci´ on) y vuelta al paciente de origen para un efecto terap´eutico deseado. El procedimiento implica la captura y recuperaci´on celular, el procesado de las c´elulas capturadas o poblaci´ on celular empobrecida, que puede dar lugar a una expansi´ on num´erica y/o activaci´on biol´ogica, y la posterior recuperaci´on y utilizaci´on de estas c´elulas. La tercera situaci´on se puede dividir adicionalmente en tres niveles de aplicaci´ on. El primer nivel es la activaci´on biol´ogica de las c´elulas capturadas/recuperadas propiamente dichas. La activaci´on se lleva a cabo sin m´as fraccionamiento de las c´elulas. Por ejemplo, en el caso de un paciente de SIDA, las c´elulas CD8 positivas capturadas de sangre perif´erica se pueden expandir y activar para su posterior retorno al paciente de origen. El segundo nivel es la activaci´ on selectiva. Las c´elulas capturadas y recuperadas se procesan o fraccionan m´ as para proporcionar un subgrupo de c´elulas capturadas, identificadas por ejemplo, mediante especificidad antig´enica, las cuales a continuaci´ on se activan y/o expanden. Por ejemplo, se pueden seleccionar determinados subgrupos restringidos a un ant´ıgeno de las c´elulas CD8 positivas capturadas mediante determinadas condiciones de co-cultivo y concentraciones de linfoquinas, las cuales permiten que solamente se expanda o active el subgrupo deseado. Un tercer nivel es la generaci´on ´ nicas de un paciente, espec´ıficas de un ant´ıgeno, para activaci´on o supresi´on de la in vitro de c´elulas u funci´ on inmune. Un ejemplo de esta situaci´ on es la captura de monocitos o c´elulas-B y la exposici´ on de los monocitos o c´elulas-B capturadas a un complejo inmune espec´ıfico de un paciente, u otros ant´ıgenos, bajo condiciones las cuales aumentan la incorporaci´ on, procesado y presentaci´ on de ant´ıgenos frente a c´elulas-B o monocitos, junto con una mayor expresi´ on del MHC en superficie. A continuaci´ on se a˜ nadir´ıa un subgrupo de c´elulas efectoras o reguladoras capturadas del mismo paciente que interaccionen con el monocito o c´elula-B sensibilizada con el ant´ıgeno. Tendr´ıa lugar el procedimiento de activaci´on de c´elulas-T espec´ıficas de ant´ıgenos, frecuentemente en la forma en que tiene lugar en el n´odulo linf´ atico de un animal o humano intacto. Un ejemplo adicional de modificaci´on celular hecha posible por el presente m´etodo es la introducci´on de genes ex´ ogenos por medio de vectores v´ıricos u otros vectores u otros medios, en las c´elulas capturadas y la posterior captura en un segundo dispositivo de la subpoblaci´ on de c´elulas que expresa el gen ex´ ogeno. La fuente celular puede ser cualquier mezcla de c´elulas. Sin embargo, es deseable tener una poblaci´on predeterminada la cual se puede definir mediante marcadores individuales o m´ ultiples o una pluralidad de marcadores o ligandos. Las fuentes celulares de inter´es procedentes de hospedantes animales pueden incluir o´rganos, tales como sangre, cerebro, ri˜ no´n, bazo, coraz´ on, intestino, m´edula o´sea, fluido espinal cerebral, tejido linf´ atico, o similares, o c´elulas neopl´ asicas procedentes de alguno de los o´rganos anteriores. Otras fuentes pueden ser par´ asitos, virus o bacterias mezcladas con c´elulas animales. Las c´elulas se utilizan en una forma que fluya, convenientemente como una dispersi´ on. Cuando las c´elulas no se mantienen juntas, como en la sangre, la sangre normalmente tendr´a los gl´obulos rojos, las plaquetas y el plasma separados para proporcionar una mezcla de gl´ obulos blancos. Cuando las c´elulas se mantienen juntas mediante una membrana u otro material de conexi´ on, las c´elulas se pueden dispersar, bien sea mec´anicamente o enzim´aticamente, siguiendo t´ecnicas convencionales. Las c´elulas individuales a continuaci´ on se pueden dispersar en su medio de nutrientes adecuado para separaci´ on mediante el presente m´etodo.

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Con la sangre, los gl´ obulos rojos se pueden separar mediante aglutinaci´ on, lisar con cloruro am´onico, separar con lectinas, o mediante centrifugaci´on de acuerdo con m´etodos conocidos. Las plaquetas y los gl´ obulos rojos tambi´en se pueden separar mediante centrifugaci´ on por gradiente de densidad, empleando Ficoll o Leukoprep y aislando la capa amarillenta, mediante centrifugaci´ on o similar. 55

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Las diversas fuentes de c´elulas se pueden someter a una diversidad de tratamientos adem´ as de los descritos anteriormente. En algunas situaciones, puede ser deseable concentrar las c´elulas mediante cualquier forma adecuada, seguido de dispersi´ on en un medio de nutrientes adecuado. En algunas situaciones, se puede desear expandir una poblaci´ on particular, donde se puede expandir selectivamente un grupo de c´elulas frente a otro grupo de c´elulas. Para la expansi´ on, se pueden emplear varios agentes mitog´enicos o interleuquinas, factores de crecimiento, o similares. A continuaci´on estas c´elulas normalmente se concentrar´ an mediante cualquier forma conveniente para retirar sustancialmente el medio en el cual se han 4

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aislado o mantenido. Normalmente, estas c´elulas comprender´ an al menos alrededor de 10 % en volumen de la dispersi´ on a utilizar, y no m´ as de alrededor del 90 % en volumen, a fin de proporcionar una dispersi´on que fluye. La concentraci´ on de las c´elulas introducidas en el dispositivo se basa adecuadamente en el ´area superficial de la superficie de poliestireno derivatizado y variar´ a ampliamente, dependiendo de la frecuencia de la c´elula diana en la suspensi´ on celular de entrada. Normalmente, la concentraci´ on as de 1x1010 c´elulas/cm2 , normalmente entre alrededor de 1x105 ser´ a al menos 1x103 c´elulas/cm2 , y no m´ c´elulas/cm2 y 1x107 c´elulas/cm2 . El dispositivo de separaci´ on puede tomar una amplia variedad de formas. En su mayor parte, el dispositivo se compondr´ a de superficies de poliestireno, donde el poliestireno normalmente est´a libre de reticulaci´on, menos que alrededor de 0,5 %, normalmente menos que alrededor de 0,1 %, preferiblemente moldeado o extruido, a fin de tener un superficie muy plana. Las superficies de poliestireno de esta naturaleza permiten una uniformidad sustancial de derivatizaci´ on, donde la orientaci´ on del receptor proporciona un elevado nivel de accesibilidad de sitios de uni´ on. (Se debe entender en referencia al receptor, el t´ermino es completamente arbitrario. Por receptor se entiende una mol´ecula que es capaz de unirse espec´ıficamente a una mol´ecula complementaria. As´ı, el receptor puede ser un ligando, el cual incluye tanto a haptenos como a ant´ıgenos, o una prote´ına de membrana superficial que se une espec´ıficamente a otra mol´ecula, tal como una inmunoglobulina, receptor de c´elulas-T, receptor de insulina, etc., o una mol´ecula que se encuentra intracelularmente, tal como una prote´ına de uni´ on a esteroides, o mol´eculas que se encuentran en fluidos corporales, tales como la tiroglobulina, lipoprote´ınas, etc. Por consiguiente, la prote´ına de membrana que se une espec´ıficamente al “receptor” unido a la superficie, se denomina arbitrariamente como el “ligando”. Por conveniencia, se denominar´ an conjuntamente como miembros complementarios de un par de uni´ on espec´ıfica). La superficie de poliestireno funcionalizada puede ser la superficie de una pared,tabique, l´ amina, fibra hueca o similar. En su mayor parte, ser´ıa deseable utilizar una superficie plana, aunque en algunas situaciones otras superficies pueden encontrar aplicaci´ on. El dispositivo puede tener la forma de una botella, matraz T est´andar, l´ aminas, p.e., una bolsa o caja con muchas l´ aminas separadas, l´ aminas cil´ındricas o en forma de serpentina en un recipiente, caja rectangular, o similar. La elecci´on del dispositivo depender´ a de la conveniencia, la finalidad de la separaci´ on, la interacci´on con otros dispositivos, la poblaci´ on celular de inter´es, el tratamiento que se pretende, si la poblaci´ on de inter´es es como resultado de una selecci´on positiva o negativa, o similares. La superficie se derivatizar´a mediante sustituci´ on del anillo de benceno del poliestireno con un agente electr´ofilo, concretamente mediante una reacci´on de Friedel-Crafts en un solvente que no reblandezca o disuelva el poliestireno. Con este fin, el sulfolano encuentra un particular aplicaci´ on. Se pueden utilizar condiciones relativamente suaves y el benceno se puede derivatizar con una diversidad de agentes, tales como nitr´ ogeno, el cual se puede reducir a amino, halometilo, el cual se puede utilizar para formar un grupo amino, hidroxilo, o tiol, o una N-hidroximetil acetamida sustituida, donde el sustituyente es un hal´ ogeno o pseudohal´ ogeno activo. En el documento EPA 88-304516.3 se puede encontrar una descripci´ on de la reacci´on. A continuaci´ on se puede hacer reaccionar a la superficie de poliestireno derivatizada con el receptor. Bajo las condiciones de derivatizaci´on, se encuentra que se derivatizan un elevado porcentaje de los bencenos en la superficie, de modo que se puede obtener una elevada densidad de receptor en la superficie. Dependiendo de la naturaleza del receptor, se pueden llevar a cabo diversas reacciones para unir el receptor a la superficie. La uni´on de prote´ınas a la superficie es de particular inter´es. Las prote´ınas se pueden unir poniendo en contacto a las prote´ınas en un medio acuoso con la superficie funcionalizada, que tiene hal´ogeno activo, grupos carboxilo activados, p.e., ´esteres, o similares, bajo condiciones suaves durante un tiempo suficiente para completar la reacci´ on. Cualquier grupo funcional que quede que no hubiera reaccionado se puede bloquear utilizando un agente bloqueante de mol´eculas peque˜ nas adecuado. Por ejemplo, el hal´ ogeno activo se puede bloquear con aminas alif´ aticas, los tioles con maleimida, o similares. En algunas situaciones, puede no haber necesidad de bloquear el exceso de grupos reactivos, puesto que no interferir´ an con las etapas posteriores en el proceso. A continuaci´on se puede lavar la superficie para separar el receptor unido no espec´ıficamente, y evaluar para asegurar que ha tenido lugar una adecuada uni´ on al receptor. Dependiendo de la naturaleza del dispositivo colector, se variar´ a el contacto con el medio que contiene las c´elulas. Por ejemplo, con una botella giratoria, se puede introducir el medio en la botella giratoria y entonces dejar a la botella en una lenta revoluci´on durante tiempo suficiente para que las c´elulas lleguen a unirse. Con un matraz-T, o una configuraci´ on de placas en una bolsa/caja, se puede dejar al 5

ES 2 173 142 T3 dispositivo en reposo en una superficie horizontal, o agitar suavemente en una plataforma de agitaci´ on, a continuaci´ on poner el dispositivo del rev´es y repetir el proceso sobre el otro lado. Se pueden utilizar t´ecnicas similares con otros tipos de recipientes. Adicionalmente, el dispositivo se puede centrifugar para presionar a las c´elulas diana contra las superficie de contacto. 5

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De particular inter´es es un dispositivo al que se mencionar´a como una bolsa/caja colectora. La bolsa/caja ser´ a un recipiente de paredes r´ıgidas o flexibles que contiene l´ aminas de poliestireno superpuestas o apiladas unas sobre las otras y separadas unas de otras para permitir un flujo entre las l´ aminas. Las c´elulas compactadas como resultado de la concentraci´ on, p.e., centrifugaci´ on en gradiente de densidad o centrifugaci´on, se dejar´ an fluir en el interior de la bolsa/caja, la cual se mantendr´a en una posici´on horizontal. La dispersi´ on celular se extender´ a de un lado a otro de la bolsa/caja, a fin de que se ponga en contacto con sustancialmente toda la superficie de poliestireno revestida con receptor en la bolsa/caja. Despu´es de un tiempo suficiente para que las c´elulas se unan, se puede poner del rev´es la bolsa/caja a fin de dejar que las c´elulas que est´an todav´ıa dispersas, o no unidas, se fijen en las superficies en forma de pel´ıcula que est´an ahora debajo de ellas, con el fin de proporcionar una utilizaci´on eficaz de la superficie. Por otra parte, la bolsa/caja se puede centrifugar, una vez por cada lado, para presionar a las c´elulas contra las superficies de contacto. El tiempo de contacto variar´a ampliamente, dependiendo de la concentraci´on del ligando en la superficie celular, la afinidad de uni´ on del receptor, la concentraci´ on de c´elulas en el medio, la naturaleza del dispositivo colector, y similares. Normalmente los tiempos de contacto ser´an al menos alrededor de 5 min y no m´ as de alrededor de 120 min, normalmente entre 15 y 60 min. La dispersi´on celular se puede mover de un lado a otro del dispositivo colector mediante cualquier forma adecuada. Se puede realizar una presi´ on diferencial de un lado a otro del dispositivo colector por medio de una bomba. Por otra parte, un flujo gravitacional puede proporcionar una velocidad de flujo adecuada. Se puede utilizar cualquier t´ecnica conveniente que deje una velocidad de flujo de las c´elulas que permita una uni´ on a la superficie sin que se afecte significativamente a su viabilidad. Los dispositivos se pueden esterilizar utilizando radiaci´ on gamma o de haz de electrones, sin que se afecten adversamente las propiedades del dispositivo colector. Esto es, se conserva la actividad del receptor, mientras que al mismo tiempo se mantiene la naturaleza covalente de su uni´on a la superficie. De este modo, cuando se est´a utilizando el dispositivo colector, no se pierde sustancialmente nada del receptor unido a la superficie.

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Una vez que las c´elulas han llegado a unirse a la superficie, el dispositivo colector se puede someter a una amplia variedad de tratamientos. Se puede emplear el lavado vigoroso para retirar las c´elulas no adherentes, ya que las c´elulas adherentes se unen firmemente a la superficie en una pluralidad de contactos. El medio de lavado se puede bombear adentro y afuera, los ligandos fluir de un lado a otro del dispositivo, u otras formas de agitaci´ on suave, pero relativamente vigorosa. La soluci´on de lavado puede ser agua desionizada, soluci´on salina, soluci´ on salina tamponada con fosfatos, o similares. La soluci´ on de lavado particular que se emplee normalmente depender´ a de como se van a utilizar las c´elulas. Cuando el aislamiento de c´elulas tiene que ver con la separaci´ on de c´elulas de la poblaci´ on celular (empobrecimiento en c´elulas), las c´elulas capturadas se pueden desechar y recoger la poblaci´ on celular empobrecida, someter a cualquier tratamiento adicional, y a continuaci´ on utilizar para su finalidad pretendida. En su mayor parte, el aislamiento descrito aqu´ı encuentra una particular aplicaci´ on para c´elulas que se han aislado para su posterior utilizaci´ on. Dependiendo de la utilizaci´on pretendida, as´ı como de la naturaleza de las c´elulas, las c´elulas se pueden someter a una amplia variedad de tratamientos. Particularmente, cuando se trata de l´ıneas linfoides o mieloides, estas c´elulas se pueden tratar para expandir, o modificar, la actividad de un grupo o subgrupo particular de c´elulas. As´ı, se pueden a˜ nadir varios factores que dan lugar a la proliferaci´on de las c´elulas, activaci´on de las c´elulas, potenciaci´ on o reducci´ on de una o m´ as prote´ınas de membrana superficial, y similares. Dependiendo de si se desea tener todas las c´elulas unidas durante el tratamiento o permitir la formaci´ on de c´elulas libres, se puede proporcionar una proporci´ on adecuada de receptor a c´elulas unidas en el recipiente. Teniendo un gran n´ umero de receptores en comparaci´on con las c´elulas unidas inicialmente, tambi´en llegar´ a a unirse y retenerse en la superficie cualquier progenie. Esto puede servir como resoluci´on adicional, puesto que otras c´elulas que pueden haber estado presentes y haberse expandido, no llegar´ an a unirse y pueden ser separadas del vaso colector.

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En su mayor´ıa, las c´elulas de inter´es se obtendr´ an a partir de sangre, m´edula o´sea, tumores s´olidos y tejido linf´ atico. Estas c´elulas se pueden dividir en las l´ıneas linfoide y mieloide. La primera l´ınea a considerar ser´a la l´ınea linfoide. Esta l´ınea se puede dividir m´ as en las categor´ıas de c´elulas B y c´elulas T. Las c´elulas B se identifican por tener sIg como marcador de superficie y DNA de l´ınea germinal redispuesto en el locus de la inmunoglobulina. Las c´elulas-T, en su mayor parte, tienen CD2 y/o CD5 como marcadores de superficie y DNA de l´ınea germinal redispuesto en el locus del receptor de c´elulas-T. Las c´elulas B y T tambi´en incluir´ an c´elulas progenitoras espec´ıficas, si bien las c´elulas pluripotenciales se discutir´ an por separado, y en el caso de las c´elulas B, tambi´en se incluyen las c´elulas plasm´aticas. Otras c´elulas linfoides que se pueden aislar mediante marcadores incluyen: c´elulas asesinas activadas por linfoquinas (LAK), c´elulas asesinas naturales (NK), linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), c´elulas citot´ oxicas dependientes de anticuerpos (ADCC), linfocitos T citot´oxicos (CTL), etc. En la l´ınea mieloide, se puede estar interesado en aislar monocitos, macr´ ofagos, eosin´ofilos, bas´ ofilos, leucocitos polimorfonucleares, c´elulas dendr´ıticas, etc. Las c´elulas-B se pueden expandir mediante tratamiento con varias de las interleuquinas, 1-7 u otras, cuando se descubran, particularmente la IL-1, -2, -3, o similares. Las c´elulas-B se pueden seleccionar mediante ant´ıgenos unidos en superficie, marcadores de superficie (p.e., CD20), o mediante uni´ on espec´ıfica a un ant´ıgeno soluble, donde dicho ant´ıgeno se puede a˜ nadir a las c´elulas, de modo que las c´elulas que tienen una inmunoglobulina en superficie la cual reconoce al ant´ıgeno se unir´ an al ant´ıgeno para formar un complejo el cual se endocita y procesa. Entonces estar´ an presentes un fragmento del ant´ıgeno con el ant´ıgeno del MHC de la c´elula. A˜ nadiendo c´elulas-T al medio las cuales est´an restringidas por las c´elulas-B, las c´elulas-T que reconozcan el fragmento antig´enico secretar´an linfoquinas, dando lugar a una proliferaci´ on de las c´elulas-B. Proporcionando un exceso de receptor en la superficie s´ olida, o despu´es de liberar las c´elulas-B que se separan de la poblaci´ on celular en un segundo dispositivo colector, se puede aumentar sustancialmente el n´ umero de c´elulas-B y c´elulas plasm´aticas que reconocen al ant´ıgeno de inter´es. Por otra parte, se pueden seleccionar pares de fusi´ on de c´elulas-B (c´elulas de hibridoma) u otras c´elulas B procedentes de cualquier fuente, mediante uni´ on a una superficie de poliestireno la cual lleva un ant´ıgeno covalentemente unido. Las c´elulas de hibridoma deseadas u otras c´elulas-B que llevan sIg reactiva con ant´ıgeno unido a poliestireno, ser´ an capturadas en la superficie de poliestireno, permitiendo una selecci´on espec´ıfica de ant´ıgeno de las c´elulas espec´ıficas de hibridoma u otras c´elulas-B. A continuaci´on se pueden recuperar las c´elulas capturadas y expandir de acuerdo con los m´etodos descritos en el presente m´etodo. Por otra parte, se pueden capturar c´elulas T o cualquier c´elula que contenga un receptor de superficie espec´ıfico, mediante la superficie de poliestireno, cuando dicha superficie de poliestireno contiene dicho ant´ıgeno unido covalentemente. Cuando se desea empobrecer un subgrupo espec´ıfico de c´elulas-B, se puede a˜ nadir el ant´ıgeno conjugado con una toxina, emplear anticuerpos espec´ıficos de la inmunoglobulina de superficie y complemento, u otra capacidad citot´ oxica selectiva. De esta manera, se puede disminuir selectivamente la sensibilidad de las c´elulas a un ant´ıgeno particular. Por otra parte, el ant´ıgeno o marcador de c´elulas-B (p.e., CD-20), se puede inmovilizar en el poliestireno y capturar la poblaci´ on diana de c´elulas-B en la superficie. Particularmente, cuando existen c´elulas de memoria, se puede reducir la respuesta humoral empobreciendo sustancialmente la poblaci´on celular de memoria frente a un particular ant´ıgeno. La poblaci´on de c´elulas T es m´as variada que la poblaci´ on de c´elulas B en cuanto a la funci´on. Se puede dividir la poblaci´ on de c´elulas-T maduras en c´elulas supresoras o auxiliares citot´oxicas restringidas al ant´ıgeno CD4 de la clase II del MHC y c´elulas supresoras y citot´ oxicas restringidas al ant´ıgeno CD8 de la clase I del MHC, donde las c´elulas tienen diferentes funciones y puede ser de inter´es su expansi´on y empobrecimiento. Para cualquier poblaci´on de c´elulas-T (CD4 o CD8), puede ser deseable activar las c´elulas-T que reconocen un ant´ıgeno espec´ıfico. Se pueden utilizar muchas estrategias con esta finalidad. Las c´elulas B espec´ıficas de un ant´ıgeno particular se pueden exponer a ese ant´ıgeno y a continuaci´on utilizar como c´elulas que presentan un ant´ıgeno para activar el subgrupo particular de c´elulas T restringidas al ant´ıgeno. Por otra parte, se pueden emplear monocitos o macr´ ofagos como las c´elulas que presentan el ant´ıgeno. Se pueden preferir los macr´ ofagos ya que no tienen la especificidad de las c´elulas-B para un ant´ıgeno particular. Por consiguiente, se introducir´ıan monocitos y/o macr´ ofagos, los cuales se han pretratado o tratado a la vez con el ant´ıgeno, en las c´elulas T unidas, para proporcionar la expansi´ on de las c´elulas T que reconocen el fragmento antig´enico representado por el monocito/macr´ofago en el contexto de los 7

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La activaci´on biol´ogica de las c´elulas se puede llevar a cabo como resultado de una particular linfoquina soluble o inmovilizada , p.e., IL-2, o mediante la utilizaci´on de un compuesto de uni´ on espec´ıfica, tal como un anticuerpo. Por ejemplo, se pueden seleccionar c´elulas T utilizando una superficie anti-c´elula T (p.e. CD-5). A continuaci´on las c´elulas capturadas CD-5+ se pueden liberar e introducir en una superficie anti-CD3 activante, o en una superficie a la que se ha unido covalentemente una linfoquina. Las c´elulas se unir´ an y llegar´ an a activarse. Despu´es de la activaci´on, las c´elulas se pueden liberar mediante sonicaci´on, agitaci´ on mec´anica u otro medio conveniente, y recoger.

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De particular inter´es son las c´elulas pluripotenciales, las cuales se pueden obtener de m´edula o´sea o sangre perif´erica. Estas c´elulas pluripotenciales pueden servir como las progenitoras de una o m´ as de las l´ıneas de c´elulas sangu´ıneas. El aislamiento de las c´elulas pluripotenciales puede ser un resultado de ambos, el empobrecimiento (selecci´on negativa) y/o la selecci´on positiva. De esta forma, se pueden proporcionar una serie de dispositivos, o subsecciones de dispositivo, donde inicialmente los receptores se unir´ an a las c´elulas no deseadas, para su separaci´ on de las c´elulas (selecci´on negativa) del medio. A continuaci´ on se pueden aislar las c´elulas no unidas, liberar de las c´elulas capturadas, y seleccionar m´as (selecci´on positiva) para c´elulas con diferentes marcadores asociados con las c´elulas pluripotenciales, dejando una poblaci´ on de c´elulas unidas, las cuales a continuaci´ on se pueden liberar, seguido de una selecci´on positiva m´ as para un marcador espec´ıfico para una poblaci´ on que incluye las c´elulas pluripotenciales. De esta forma, mediante la etapa del procedimiento anterior, se pueden retirar otras c´elulas que tienen el marcador final an´ alogo. Cuando est´ an implicadas c´elulas diferentes a las c´elulas sangu´ıneas, las c´elulas de inter´es para su aislamiento pueden incluir los islotes de Langerhans, c´elulas gliales, astrocitos, neuronas, c´elulas endoteliales, c´elulas epitelioides, c´elulas de estroma, c´elulas pluripotenciales, c´elulas escamosas, y similares. Se pueden conseguir poblaciones de c´elulas sustancialmente homog´eneas, de m´as de alrededor del 95 %, normalmente 98 %, donde las c´elulas pueden estar en un estado quiescente o activado. Las composiciones celulares pueden incluir cualquier poblaci´on celular que expresa un marcador de superficie (ligando) reconocido por el receptor inmovilizado. Dichas composiciones incluyen c´elulas que llevan cualquiera de los ant´ıgenos leucocitarios reconocidos de la CD (serie de denominaci´ on “cluster”), u otros reconocidos por anticuerpos monoclonales frente a ligandos de superficie celular espec´ıficos. Dichas composiciones pueden incluir otras c´elulas sangu´ıneas, c´elulas tumorales, bacterias, virus, y otros par´ asitos que de forma similar comparten un marcador de superficie com´ un. Virtualmente cualquier poblaci´ on celular cuyos miembros compartan un ligando en superficie reconocido por el receptor inmovilizado, puede constituir una composici´on celular de ese tipo. Se pueden tratar una gran variedad de enfermedades y situaciones autoinmunes, neopl´ asicas, infecciosas, metab´olicas, hematol´ogicas e inmunol´ ogicas (el campo de la enfermedad), de acuerdo con esta invenci´on. Entre las enfermedades autoinmunes est´ an la diabetes, el lupus eritematoso y la artritis reumatoide. Entre las enfermedades infecciosas est´an las infecciones localizadas y sist´emicas debidas a cocos gram positivos, cocos gram negativos, bacilos gram negativos, bacterias anerobias, micobacterias, hongos, virus, protozoos, etc. Entre las enfermedades neopl´ asicas est´an todas las malignidades s´ olidas y hematol´ ogicas. Entre las enfermedades metab´ olicas est´an la arterioesclerosis y el choque s´eptico. Entre las enfermedades hematol´ ogicas est´an la anemia falciforme y la anemia por hipercolesterol familiar. Entre las enfermedades y situaciones inmunol´ ogicas est´an el trasplante de o´rganos y las situaciones de inmunodeficiencia. Estas y otras enfermedades o situaciones se pueden estudiar mediante el presente procedimiento como sigue. Mediante un procedimiento alternativo, se pueden aislar complejos inmunes asociados con la enfermedad autoinmune infecciosa o neopl´ asica (v´ease, la solicitud en tr´ amite n◦ de serie 243.786, emitida el 13 de septiembre de 1988). Se puede utilizar el ant´ıgeno obtenido de los complejos para seleccionar tanto c´elulas B como T, seg´ un se describi´ o antes, las cuales se activan mediante el ant´ıgeno concreto. De esta forma, se puede separar sangre del hospedante que padece la enfermedad autoinmune o neopl´ asica, y bien sea empobrecer selectivamente en las c´elulas B y/o T asociadas con la enfermedad, o activar las c´elulas T o B para suprimir la enfermedad autoinmune o para detectar y eliminar las c´elulas neopl´ asicas. De esta manera, se puede proporcionar una remisi´on, detenci´ on del progreso de la enfermedad, o similar. Por otra parte, en casos de infecci´ on, enfermedad autoinmune o neopl´ asica, se puede proporcionar una selecci´on de c´elulas B y T reactivas con el ant´ıgeno particular del pat´ ogeno o enfermedad. En este caso, se desear´ıa aumentar la concentraci´ on de las c´elulas B y T asociadas con la defensa inmune. De 8

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esta forma, los complejos o ant´ıgenos asociados con el pat´ogeno, enfermedad autoinmune o neopl´ asica, o el pat´ ogeno, c´elula autoreactiva o neopl´ asica propiamente dicha, se pueden utilizar para aumentar la poblaci´ on celular linfoide asociada con la defensa frente a la enfermedad. Se puede aislar el pat´ ogeno, c´elula autoreactiva o neopl´ asica utilizando el presente dispositivo, y utilizar el pat´ ogeno o c´elula aislada como el inmun´ ogeno o receptor, como se defini´o anteriormente para capturar las c´elulas T o B adecuadas, activas en defensa frente a la enfermedad. Seleccionadas de esta forma, estas c´elulas se podr´ıan recuperar, expandir, activar como se describi´ o anteriormente, para una posterior vuelta al paciente de origen. Esta t´ecnica se puede utilizar con una amplia variedad de enfermedades asociadas con virus, p.e., SIDA, HTLV-I, o II, bacterias, protozoos, hongos, helmintos y similares.

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Adem´as, el m´etodo se puede utilizar con fines profil´ acticos o de diagn´ostico en el campo de las enfermedades. El presente m´etodo tambi´en encontrar´ a utilizaci´on en la investigaci´ on para detectar respuestas de c´elulas B y T, investigar respuestas inmunes, identificar ep´ıtopos asociados con enfermedades inmunes, y en u ´ ltimo t´ermino utilizar para terapia g´enica. 15

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Tambi´en se puede utilizar el presente dispositivo para producir anticuerpos monoclonales activando las c´elulas B, seguido de inmortalizaci´on de las c´elulas B normalmente mediante fusi´ on con un par de fusi´ on adecuado. De esta forma, se pueden inmunizar linfocitos humanos frente a ant´ıgenos que no se podr´ıan administrar normalmente a un hospedante humano y proporcionar una doble selecci´ on, inicialmente para c´elulas B en general, seguido de selecci´on para las c´elulas B espec´ıficas las cuales se pueden unir al ant´ıgeno. De esta forma, se pueden concentrar mucho las c´elulas B espec´ıficas del ant´ıgeno, para aumentar mucho la probabilidad de obtener anticuerpos monoclonales espec´ıficos para el ant´ıgeno. Las c´elulas se pueden aislar del dispositivo colector mediante diferentes maneras. De particular inter´es es la utilizaci´on de un agente mitog´enico, tal como la fitohemaglutinina (PHA), junto con una compuesto que tiene una actividad similar al factor de crecimiento tal como una interleuquina o factor de crecimiento, p.e., interleuquina-2 (IL-2), GM-CSF, etc., el cual da lugar a la liberaci´on de las c´elulas mediante desprendimiento de los ligandos en la superficie celular unida al receptor. El medio puede ser un medio est´andar de cultivo de tejidos que contenga alrededor de 20 a 1.000 unidades/ml de IL-2, y alrededor de 0,1 a 5,0 µg/ml de fitohemaglutinina. Por otra parte, las c´elulas se pueden liberar por medios f´ısicos tales como ruptura mec´anica, particularmente corte, tal como vibraci´ on, pipeteado vigoroso o mediante sonicaci´on utilizando un ultrasonicador y poniendo el dispositivo colector en un ba˜ no de agua. Convenientemente, se puede utilizar un Crest modelo ultras´ onico. V´ease, Menssen, et al., J. Inmunol. Methods (1987) 104:1-6.

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Ahora se estudiar´ an las Figuras. La Fig. 1 es un diagrama de flujo de un procedimiento conforme a la presente invenci´on utilizando sangre como la fuente de c´elulas diana. El dibujo tiene una primera etapa que implica al vaso de separaci´on 10, donde los gl´ obulos rojos y las plaquetas se separan para proporcionar un sobrenadante. A continuaci´ on se transfiere el sobrenadante 12 a una centr´ıfuga 14 que tiene los tubos 16, donde se centrifuga el sobrenadante 12 para concentrar las c´elulas diana 20 en los tubos 16. A continuaci´on se transfieren las c´elulas diana 20 a un vaso de alimentaci´on 22, el cual alimenta las c´elulas diana mediante la v´ alvula 24 en el interior del dispositivo colector 26, que tambi´en se muestra en la Fig. 2. Este procedimiento no est´a limitado por el ejemplo citado. Se puede utilizar cualquier m´etodo normalmente empleado para separar gl´obulos rojos, plaquetas y plasma para conseguir la poblaci´on celular diana 20 a partir de sangre perif´erica o m´edula o´sea. Por otra parte, se puede disgregar tejido s´ olido por medios enzim´aticos o f´ısicos para conseguir la poblaci´ on celular diana 20. El dispositivo de captura 26 tiene una pluralidad de pel´ıculas o l´aminas de poliestireno 30 separadas por los soportes 32. Sobre las l´ aminas o pel´ıculas superiores 30 se indica la presencia de los receptores 34, denominados como R. Los receptores 34 solamente se indican en unas pocas de las pel´ıculas o l´aminas, indicando que los receptores est´an en ambos lados de la pel´ıcula o l´amina, aunque se debe entender que todas las pel´ıculas o l´ aminas est´an revestidas en ambos lados con receptores. Por otra parte, el dispositivo de captura de c´elulas puede ser un matraz-T, placa de microtitulaci´ on, placa de m´ ultiples pocillos, botella giratoria, granja celular u otro vaso cualquiera de poliestireno, toda, o parte de, cuya superficie interna, tiene receptor inmovilizado en ella. Las c´elulas entran en el dispositivo colector 26 a trav´es del conducto 36. Cuando el dispositivo de captura de c´elulas 26 esta sustancialmente lleno, se deja en reposo durante tiempo suficiente para que las c´elulas se fijen y se pongan en contacto con los receptores en la pel´ıcula o l´amina por debajo de la capa l´ıquida. Despu´es de tiempo suficiente para que las c´elulas se hayan fijado y unido, entonces se puede dar la vuelta al dispositivo colector 26 de modo que las c´elulas que no han llegado a unirse de forma espec´ıfica, puedan fijarse en el lado opuesto de las pel´ıculas o l´aminas 30, y lleguen a unirse a los receptores en ese 9

ES 2 173 142 T3 lado. A continuaci´ on se puede lavar el dispositivo de captura de c´elulas introduciendo una soluci´ on de lavado a trav´es del conducto 36 y dej´andola salir a trav´es del conducto 40, con el fin de retirar las c´elulas unidas no espec´ıficamente. 5

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A continuaci´ on se pueden introducir una o m´ as soluciones de tratamiento o suspensiones celulares para ampliar el n´ umero de c´elulas capturadas, activar las c´elulas capturadas, empobrecer en un subgrupo de las c´elulas capturadas, introducir genes ex´ ogenos en las c´elulas capturadas, o similares. Despu´es de que se haya completado el tratamiento, a continuaci´ on se puede lavar otra vez el vaso para retirar la soluci´on de tratamiento, restos celulares o similares, e introducir un medio adecuado para mantener la viabilidad de las c´elulas unidas. A continuaci´ on las c´elulas se pueden liberar a˜ nadiendo un medio que contiene interleuquina-2 y un agente mitog´enico, o cogiendo el dispositivo de captura 26 e introduci´endolo en un ba˜ no ultras´ onico, o someti´endolo a vibraci´ on mec´anica o pipeteado vigoroso. Despu´es de un corto per´ıodo de dicho tratamiento f´ısico o bajo una vibraci´ on s´ onica relativamente suave, se liberan las c´elulas capturadas y se pueden recoger.

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Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de ilustraci´on y no como forma de limitaci´ on. Parte experimental 20

I. Validaci´ on del dispositivo y del procedimiento A. S´ıntesis de N - (hidroximetil) 2 - bromoacetamida (HMBA) y generaci´ on de la superficie de bromoacetamida - poliestireno (BA - PS)

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La HBMA se sintetiza por medios convencionales (Leonard et al., J.Org. Chem. 50:2480 (1985)) a partir de 2-bromoacetamida, que se puede obtener de fuentes comerciales, en presencia de formalina a pH 10, lo cual proporciona un rendimiento del 93 % del reactivo de partida, la N-(hidroximetil)2bromoacetamida (HMBA).

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La segunda etapa implica la generaci´ on de la superficie de bromoacetamida-poliestireno (BA-PS). En esta etapa, se mezclan 1:1 ´acido tr´ıflico 2M y HMBA 0,2M, ambos en tetrametilen sulfona (sulfolano), en un volumen suficiente para cubrir la capa interna de un vaso de poliestireno que se esta activando. Se on de la reacci´ on, el dispositivo deja que transcurra la reacci´ on a 27◦C durante 3 horas. Se drena la soluci´ se lava con agua seguido de etanol, y las c´ amaras de poliestireno activado se secan al aire. La superficie de bromoacetamida-poliestireno resultante es estable al aire durante seis (6) meses.

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B. Preparaci´ on, estabilizaci´ on y esterilizaci´ on de la superficie de captura de c´elulas

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La siguiente etapa es la captura del receptor (el anticuerpo monoclonal que se desea unir covalentemente a la superficie de bromoacetamida-poliestireno). El anticuerpo monoclonal de inter´es se diluye hasta aproximadamente 0,1-0,05 mg/ml en soluci´on salina tamponada con fosfatos, pH 7,4. Se introduce el volumen adecuado de anticuerpo monoclonal diluido en la c´ amara de poliestireno y se deja que transcurra la reacci´on durante entre dos y veinte, preferiblemente alrededor de 2 a 4 horas, a 27◦ C con rotaci´on. El anticuerpo que queda despu´es de la reacci´on se decanta y se puede reutilizar hasta 10 veces en posteriores reacciones de revestimiento. A continuaci´ on se lava el dispositivo con el anticuerpo unido, diez veces con soluci´ on salina tamponada con fosfatos (PBS), pH 7,4, y a continuaci´ on la superficie se estabiliza mediante la adici´on a cada dispositivo de sacarosa al 2 %/seroalb´ umina humana (HSA) al 0,2 %, grado m´edico. Se deja que la soluci´on de sacarosa/alb´ umina recubra la superficie, despu´es de lo cual se decanta el exceso de soluci´on de sacarosa/HSA y las c´amaras de poliestireno estabilizadas se secan 24-96 horas en vac´ıo (> 13,33 Pa) ogeno seco y el dispositivo se limpia con gas seco, a 25◦ C. Despu´es de secar, se rompe el vac´ıo con nitr´ inerte, y se tapa fuertemente. El dispositivo se sella y a continuaci´ on se esteriliza. La esterilizaci´on se lleva a cabo mediante irradiaci´ on con 2,7 ± 0,2 megarad de un haz de electrones o irradiaci´ on gamma. Los ensayos de esterilidad mostraron que los matraces estaban est´eriles despu´es de una incubaci´ on de 14 d´ıas con medio in situ. C. Densidad del receptor en la superficie de captura celular

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Se utilizaron una variedad de grupos de funcionalizaci´ on en superficie, y se ensayaron para la estabilidad de la uni´ on de un anticuerpo a la superficie. El poliestireno se funcionaliz´ o utilizando N(hidroximetil)2-haloacetamida, donde el grupo hal´ ogeno era cloro, bromo o yodo; diazonio y sulfonio. 10

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Despu´es de la uni´on del anticuerpo monoclonal utilizando estas superficies, los matraces se lavaron cada on se ensay´o la uno 10 veces con PBS y una vez con SDS al 1 % a 55◦ C durante 14 horas. A continuaci´ superficie de pl´ astico para la radioactividad de los anticuerpos monoclonales marcados y los resultados se expresaron como la densidad en superficie del anticuerpo monoclonal en ng/cm2 . La bromoacetamida ten´ıa una densidad de superficie de alrededor de 250 ng/cm2 de anticuerpo, m´as de 2,5 veces la conseguida mediante adsorci´ on sobre una superficie de Immunolon-2T M (Dynatech). Mientras que la bromoacetamida proporcionaba la mayor densidad de superficie, la densidad de superficie para las otras funcionalidades ca´ıa entre 200 y alrededor de 240 ng/cm2 . D. Estabilidad del receptor en la superficie de captura La estabilidad de la uni´ on del anticuerpo se determin´ o cubriendo la superficie con 0,02 mg/ml de on IgG humana (35 S). Los matraces se lavaron 5 veces con tamp´on borato-carbonato, una vez con tamp´ borato-carbonato durante 8 horas y dos veces con lavados de borato-carbonato durante la noche. Se retiraron partes al´ıcuotas de cada lavado y se ensayaron para radioactividad. Despu´es del segundo lavado, no exist´ıa evidencia de ning´ un lixiviado de anticuerpos. En un segundo estudio, utilizando un ensayo de ELISA para el anticuerpo unido a la superficie, los resultados observados mostraron que la cantidad de anticuerpo extraible era menor que el l´ımite de detecci´on del ensayo, (7,7 ng/ml). E. Densidad de captura de c´elulas por la superficie de poliestireno derivatizada Debido a que la superficie de poliestireno derivatizado-receptor conserva su claridad o´ptica, se puede calcular la densidad de las c´elulas capturadas por a´rea unitaria de poliestireno derivatizado mediante visualizaci´on microsc´opica directa. Para la mayor´ıa de las aplicaciones de captura de c´elulas, la densidad de las c´elulas unidas alcanza la compactaci´ on m´as densa de esferas en un monocapa. Para linfocitos de origen de rat´ on o humano, la densidad de uni´ on est´a entre 0,5x106 c´elulas/cm2 y 1x106 c´elulas/cm2 . Dependiendo de la frecuencia y tama˜ no de la c´elula diana en la suspensi´ on celular de entrada, la densidad de las c´elulas unidas puede variar ampliamente, entre 1x103 c´elulas/cm2 para las c´elulas diana grandes, nas, abundantes, tales poco frecuentes, hasta m´ as de 1010 c´elulas/cm2 para c´elulas o part´ıculas peque˜ como bacterias o virus. F. Especificidad de captura de c´elulas por la superficie de poliestireno derivatizada

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La uni´ on de c´elulas a la superficie de poliestireno funcionalizada se determina espec´ıficamente por el receptor unido al poliestireno. El siguiente experimento ilustra la especificidad de la uni´ on de c´elulas. Se prepararon c´elulas mononucleares a partir de sangre perif´erica mediante centrifugaci´ on en gradiente de densidad est´ andar y se diluyeron hasta 3x106 c´elulas/ml de PBS. Una parte al´ıcuota de la soluci´on de entrada se reserv´o para an´ alisis fenot´ıpico mediante citometr´ıa de flujo. La suspensi´ on celular se a˜ nadi´ o a los matraces-T 25 los cuales conten´ıan en su superficie interna del fondo un anticuerpo monoclonal purificado unido covalentemente por el presente m´etodo con especificidad para, bien sea (1) Thy 1.2 (un marcador de c´elulas T de roedor), (2) CD5, (3) CD8, o (4) una mezcla equimolar de anticuerpos frente a CD8 y CD5 (marcadores de c´elulas-T humanas). Las c´elulas se dejaron incubar durante 30 min, a continuaci´on se agitaron suavemente y se dejaron que se fijaran durante 30 minutos m´ as. Se recuperaron las c´elulas no adherentes (las que no se unen a la superficie del matraz) decantando, y tambi´en se reservaron partes al´ıcuotas para la composici´on fenot´ıpica analizada por citometr´ıa de flujo. En todos los casos, excepto en el matraz Thy 1.2 en el que no se vieron c´elulas unidas al matraz, el examen microsc´opico de los matraces mostr´ o una uni´ on celular confluente, a una densidad de 0,5x106 c´elulas/min. Se llev´o a cabo el an´ alisis de citometr´ıa de flujo en todas las poblaciones celulares del flujo de entrada y salida (no adherentes) para los marcadores CD5, CD8 (c´elulas T humanas), CD14 (monocitos humanos), CD16 (c´elulas NK humanas) y CD20 (c´elulas B humanas), y se compararon para cada matraz las frecuencias relativas de estos marcadores en los flujos de entrada y salida. Los resultados muestran que no hay diferencias entre los flujos de entrada y salida para el matraz Thy 1.2. Los matraces CD5 y CD8 mostraron respectivamente, m´ as del 98 % de empobrecimiento en c´elulas CD5 y CD8 en el flujo de salida, y el matraz CD5/8 mostr´ o el empobrecimiento en c´elulas CD5 y CD8 hasta un grado equivalente al de, bien sea el matraz monoespec´ıfico CD5, o el CD8. Los marcadores para monocitos y c´elulas NK y c´elulas B mostraron un enriquecimiento relativo en el flujo de salida ya que no fueron capturados por el matraz. Estos datos muestran que (1) las c´elulas son capturadas cuantitativamente y espec´ıficamente por el dispositivo de captura de c´elulas, (2) la superficie funcionalizada no muestra uni´ on celular no espec´ıfica, y (3) se puede capturar m´ as de un fenotipo celular simult´ aneamente mediante una superficie de poliestireno bi-derivatizada.

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ES 2 173 142 T3 II. A. Transplante de m´edula ´ osea 5

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En este primer ejemplo, se pone como ejemplo el empobrecimiento en c´elulas T para un trasplante an presentes en el material de m´edula o´sea. Los datos indican que las c´elulas T CD5+ y CD8+ que est´ de m´edula o´sea producen la enfermedad del injerto contra el hu´esped. Se prepar´ o un dispositivo como el descrito anteriormente, utilizando anticuerpos monoclonales frente a c´elulas T humanas CD5 y CD8 positivas. Se introdujeron partes al´ıcuotas de m´edula o´sea humana de voluntarios humanos normales en un dispositivo de la invenci´ on y las c´elulas se incubaron seg´ un se ha descrito. Se recuperaron las c´ elulas no adherentes, se vio su fenotipo y se sometieron a cultivos in vitro para cuantificar el enriquecimiento en c´elulas progenitoras, en comparaci´on con la m´edula no fraccionada inicial. Las siguientes tablas muestran resultados t´ıpicos. TABLA 1

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Empobrecimiento en c´elulas T ( % de reducci´on del inicial) 20

CD5 91

CD8 96

CD4 65

CD14 -129

CD16 -29

CD19 4

TABLA 2

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Enriquecimiento en progenitores ( % de enriquecimiento sobre el inicial)

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CFU-EU 513

BFU-E 633

CFU-GM 376

CFU-M 311

CFU-G 244

CFU-EU = unidades formadoras de colonias, unidades eritroides 35

BFU-E = unidades formadoras de “burst” eritroides CFU-GM = unidades formadoras de colonias, granulocitos-monocitos

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CFU-M = unidades formadoras de colonias, monocitos CFUG = unidades formadoras de colonias, granulocitos

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Los datos en las Tablas muestran un empobrecimiento espec´ıfico en c´elulas CD5+ y CD8+ (las c´elulas CD14+, CD16+ se enriquecen, las c´elulas CD19+ permanecen inalteradas) y un enriquecimiento en 2-6 veces para las c´elulas progenitoras. Estos datos ilustran la utilizaci´on del presente m´etodo para empobrecer espec´ıficamente en las c´elulas que producen la enfermedad del injerto contra el hu´esped, a la vez que se enriquece en las c´elulas progenitoras deseadas. En el segundo ejemplo de aplicaciones de transplante de m´edula o´sea, se demuestra la capacidad del presente dispositivo de concentrar una particular poblaci´ on celular poco com´ un, en una mezcla de c´elulas de m´edula o´sea o sangre perif´erica. Las c´elulas a concentrar son c´elulas pluripotenciales progenitoras procedentes de m´edula o´sea humana. En este ejemplo, el presente dispositivo incorpora un anticuerpo monoclonal frente a CD34 unido covalentemente a la superficie de poliestireno. En el primer caso de este ejemplo, se introdujeron muestras de m´edula o´sea humana en el presente dispositivo CD34, las c´elulas se incubaron seg´ un se ha descrito, las c´elulas no adherentes se recuperaron mediante decantaci´ on y las c´elulas capturadas se recuperaron mediante sonicaci´ on. Las tres fracciones, c´elulas de entrada, no adherentes y adherentes, se ensayaron para CFU-C, un ensayo est´andar para c´elulas progenitoras. La siguiente tabla muestra los resultados:

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ES 2 173 142 T3 TABLA 3 CFU-C/25.000 c´elulas 5

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C´elulas de entrada C´elulas no adherentes C´elulas adherentes

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Los datos indican un incremento de 15 veces en c´elulas progenitoras conseguido por el presente dispositivo y el presente m´etodo de recuperaci´ on celular mediante sonicaci´on. En el segundo caso de este ejemplo, se introdujeron c´elulas mononucleares de sangre perif´erica en otro dispositivo de la invenci´ on CD34. Las c´elulas no adherentes se recuperaron mediante decantaci´ on, las c´elulas adherentes se recuperaron otra vez mediante sonicaci´ on. Se analizaron partes al´ıcuotas de c´elulas de entrada y adherentes para el fenotipo CD34+. Las c´elulas de entrada eran menos del 0,1 % positivas para c´elulas CD34+. Las c´elulas adherentes recuperadas por sonicaci´on eran un 15 % CD34+ , indicando la utilidad del presente dispositivo y m´etodo para recuperar c´elulas progenitoras viables de sangre perif´erica normal. B. Terapia celular anti-v´ırica, p.e., SIDA

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En el siguiente ejemplo, se pone como ejemplo un procedimiento para el tratamiento de una infecci´ on oxicas CD8+ v´ırica, p.e., el SIDA. La t´ecnica es para expandir c´elulas CD8+ capturando c´elulas T citot´ de c´elulas mononucleares de sangre perif´erica. A continuaci´on se recuperan las c´elulas CD8+ mediante un breve cultivo enun medio que contiene una lectina e IL-2 recombinante (estimulaci´ on con linfoquinas), seguido de expansi´on de las c´elulas despegadas en vasos de cultivo de tejidos est´andares durante 14 a 28 d´ıas antes del lavado final y recogida para reinfusi´ on en el paciente de origen. Espec´ıficamente, se introdujeron c´elulas mononucleares de sangre perif´erica humana (PMBC) concentradas con Ficoll-Hypaque en un matraz de poliestireno T-150 con un anticuerpo monoclonal anti-CD8 unido covalentemente. Despu´es de una hora de incubaci´on, la sangre se decant´ o y el medio de cultivo de tejidos se suplement´o con IL-2 (300 unidades/ml) y PHA (0,1 µg/ml). Despu´es de 48-72 horas de cultivo, las c´elulas CD8+ se despegaron espont´aneamente del matraz dejando al anticuerpo unido covalentemente a la superficie de poliestireno, como se demostr´ o mediante an´ alisis de citometr´ıa de flujo, mostrando la ausencia de anticuerpo monoclonal en la superficie de las c´elulas separadas. C. Linfocitos infiltrantes de tumores

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Se introdujeron suspensiones celulares obtenidas por digesti´ on enzim´ atica de tumores o tejido linf´ atico de pacientes con c´ancer, en dispositivos que contienen un anticuerpo monoclonal frente a CD4 o CD8 unido a la superficie. Despu´es de capturar las c´elulas CD4+ o CD8+ y recuperarlas bien sea mediante sonicaci´on o estimulaci´ on con linfoquinas, se vio que las c´elulas recuperadas eran m´as del 98 % viables y m´as del 95 % c´elulas CD4+ o CD8+ fenot´ıpicamente puras. En todos los casos examinados, bien sea las c´elulas CD4+ purificadas, o las c´elulas CD8+ purificadas, mostraron al menos tanta citotoxicidad tumoo ral aut´ ologa como la suspensi´on de tejidos de partida no separada. La poblaci´ on purificada no mostr´ muerte no espec´ıfica de tumor alog´enico. La poblaci´on purificada pudo tener crecimiento logar´ıtmico, mantener la viabilidad, homogeneidad fenot´ıpica y citotoxicidad tumoral aut´ ologa. El fenotipo de la c´elula citot´ oxica vari´ o entre los tipos tumorales, predominando la CD8+ para el melanoma y el carcinoma celular escamoso, predominando la CD4+ para el carcinoma de c´elulas renales. D. C´elulas asesinas activadas por linfoquinas (LAK)

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En el siguiente ejemplo, se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-CD5, anti-CD14 y anti-CD20 en los dispositivos para empobrecer en PMBC para enriquecer mediante selecci´on negativa en c´elulas as de NK. Se vio que los anticuerpos pod´ıan producir un empobrecimiento en el fenotipo CD5+ de m´ alrededor del 98 %, en el fenotipo CD14+ m´as del 50 % y del fenotipo CD20+ en m´as del 90 %. Para obtener las c´elulas LAK, se a˜ nadieron 1,5 x 108 c´elulas mononucleares al dispositivo colector que conten´ıa el anticuerpo monoclonal CD5. Despu´es de incubar durante 30 minutos, las c´elulas no adherentes se recuperaron mediante decantaci´ on, y se transfirieron a un dispositivo que conten´ıa anticuerpo anti-CD14 unido covalentemente. Despu´es de la incubaci´ on, se recuperaron otra vez las c´elulas no adherentes por decantaci´on y se transfirieron a un tercer dispositivo, conteniendo este el anticuerpo monoclonal frente a 13

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CD20 unido covalentemente a la superficie. La incubaci´ on fue nuevamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuaci´ on se cultiv´o la tercera poblaci´on de c´elulas no adherentes en IL-2 durante 48 a 72 horas, y se ensay´ o su actividad l´ıtica en ensayos est´andares de liberaci´ on con cromo de 4 horas, utilizando c´elulas K562 para actividad de NK y COLO-205 para actividad LAK. Se determin´ o el porcentaje espec´ıfico de lisis para diferentes proporciones de efector a diana, donde la proporci´on de efector a diana variaba entre 2,5 y 20. Utilizando c´elulas de diferentes donantes normales, el enriquecimiento de actividad LAK variaba entre 50 % y 300 % sobre las c´elulas de entrada cultivadas bajo id´enticas condiciones.

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La poblaci´on celular procedente del presente dispositivo se vio que estaba sustancialmente enriquecida en precursores de LAK, virtualmente libre de c´elulas T y B y significativamente empobrecida en monocitos. El fenotipo del precursor de LAK purificado mediante el presente dispositivo se encontr´o que era CD3−, CD16+ y Leu 19+ .

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En el siguiente estudio, se examin´ o la cuesti´on de si la actividad en unidades l´ıticas se incrementaba fuera de la proporci´ on para el enriquecimiento fenot´ıpico de c´elulas NK en las muestras purificadas. Las unidades l´ıticas se calcularon para el flujo de entrada y las fracciones purificadas por 106 c´elulas NK efectoras. Se produce un incremento de 2 a 50 veces en unidades l´ıticas por 106 c´elulas NK efectoras con el m´etodo descrito de empobrecimiento negativo con anticuerpo monoclonal en tres etapas. Esto estableci´o que el protocolo de empobrecimiento en c´elulas T, c´elulas B y monocitos incrementaba por un factor de 2 a 50, la actividad en unidades l´ıticas expresada por c´elula efectora NK. Este incremento se consigue mediante la separaci´on de otras c´elulas que directamente o indirectamente ejercen influencias inancer hibidoras sobre la actividad LAK. V´ease, Nii, et al., Int. J. C´ ancer (1988) 41:33-40; Hoyer, et al., C´ on descendente por monocitos aut´ologos Res. (1986) 46:2834-2938. Estos autores describen la regulaci´ activados de la actividad de c´elulas asesinas activadas por la linfoquina humana IL-2. El presente procedimiento consigui´o una reducci´ on del 90 % en el n´ umero de c´elulas totales que resulta del ahorro de las fuentes del cultivo requeridas para llevar a cabo la activaci´ on de NK; y un aumento de 2 a 50 veces en actividad l´ıtica expresada en una base por c´elula efectora NK.

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ES 2 173 142 T3 REIVINDICACIONES 1. Un m´etodo para esterilizar una superficie de poliestireno, a la cual est´ a unido covalentemente un anticuerpo, m´etodo que comprende, 5

aplicar a dicha superficie una composici´ on que comprende una cantidad estabilizante de la combinaci´on de seroalb´ umina humana (HSA) y sacarosa; e irradiar dicha superficie con una cantidad esterilizante de radiaci´ on gamma o de haz de electrones.

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2. Un m´etodo conforme a la reivindicaci´on 1, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 3. Un m´etodo de la reivindicaci´on 1 ´o 2, en el que dicha cantidad estabilizante en la composici´on aplicada comprende la combinaci´ on de 2 % de sacarosa y 0,2 % de HSA, y la cantidad esterilizante es 2,7 Mrads. 4. Un m´etodo conforme a cualquier reivindicaci´ on anterior, en el que se utiliza una composici´ on en exceso de sacarosa/HSA, siendo retirado el exceso despu´es de que la composici´on se ha aplicado a la superficie.

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5. Un m´etodo conforme a la reivindicaci´on 2, en el que el anticuerpo monoclonal es espec´ıfico para c´elulas CD8, CD4, supresoras-inductoras, hematopoy´eticas, CD34, CD3, CD5, CD14, CD19 o CD20 o c´elulas T. 6. Un m´etodo conforme a la reivindicaci´on 1, en el que dicho enlace covalente se lleva a cabo utilizando haloacetamida. 7. Una superficie de poliestireno esterilizada que se puede preparar por un m´etodo conforme a cualquier reivindicaci´on anterior.

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8. La superficie de la reivindicaci´on 7, la cual es la superficie interna de un vaso. 9. La superficie de la reivindicaci´on 8, la cual est´a dentro de un recipiente de paredes r´ıgidas o flexibles que contienen l´aminas de poliestireno superpuestas o apiladas unas sobre otras y separadas unas de otras para permitir que el l´ıquido fluya entre las l´ aminas.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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