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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 177 547 kInt. Cl. : G01N 33/569

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

C07K 1/00 A61K 39/005

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TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93917055.1 kFecha de presentaci´on: 08.07.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 649 536 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 26.04.1995

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54 T´ıtulo: M´ etodo gradual para detectar la enfermedad de chagas y reactivos utilizados en tales

efectos.

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73 Titular/es: ABBOTT LABORATORIES

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72 Inventor/es: Winkler, Martin A. y

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74 Agente: Ungr´ıa L´ opez, Javier

30 Prioridad: 10.07.1992 US 911590

One Abbott Park Road Abbott Park, Illinois 60064-3500, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

16.12.2002

45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 177 547 T3

16.12.2002

Aviso:

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Pan, Alfred A.

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En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 177 547 T3 DESCRIPCION M´etodo gradual para detectar la enfermedad de chagas y reactivos utilizados en tales efectos. 5

Antecedentes de la invenci´ on Esta invenci´on se refiere en general a la detecci´on de enfermedades transmitidas parenteralmente y m´as en particular se refiere a Trypanosoma cruzi que es el agente causante de la enfermedad de Chagas, as´ı como a ensayos para su detecci´on en muestras de ensayo.

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El par´ asito protozoario Trypanosoma cruzi es el agente responsable de la enfermedad conocida como Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis Americana. El a´rea geogr´afica de esta enfermedad en Am´erica se extiende desde tan al norte como California y Maryland hasta tan al sur como regiones de Argentina y Chile. Se ha estimado que hay 90 millones de personas en riesgo, y que otros 12 a 63 millones de individuos ya est´an infectados con este par´ asito. V´ease, por ejemplo, G.A. Schmunis, Transfusion 31;547-557 (1991); Anonimo, WHO Tecnical Report Series (1991), 811:1-93 (1991); y S. Kingman, New Scientist 132: 16-17 (1991). El primer caso ind´ıgena de enfermedad de Chagas ocurrido en Norte Am´erica se public´o en 1955, N.C. Woody y col. JAMA 159:676-677 (1955); R, J. Schiffer y col. JAMA 251; 2983-84 (1984); J.D. Pearlman, Am. J. Med., 75:1057-1060 (1983); T.R. Navin, Am. J. Public Health 75:366-369 (1985); y Anonimo, Texas Health Bull, 159:111-13 (1955). La enfermedad de Chagas es transmisible a trav´es de productos de sangre; la transmisi´ on de la enfermedad de Chagas a trav´es de transfusi´ on de sangre se conoce desde hace tiempo en los Estados Unidos. Dos revisiones serol´ ogicas realizadas recientemente en el ´area de Washington DC han indicado que varios individuos residentes en esta ´area, originarios de El Salvador y Nicaragua, ten´ıan sueros reactivos a enfermedad de Chagas; L. V. Kirchhoff y col., Am. J. Med. 82: 915-920 (1987). Se ha estimado que seg´ un esta revisi´on hay hasta 100.000 individuos que viven en los Estados Unidos que estar´ıan infectados cr´onicamente con T. cruzi, A. Skolnik, JAMA 265:173 (1991). En un informe separado, de 1027 donaciones de sangre consecutivas en el distrito de Los Angeles durante un per´ıodo de tres meses que fueron analizadas para selecci´on (screeing) empleando un ensayo de fijaci´ on de complemento para enfermedad de Chagas, se daba cuenta de diez casos reactivos iniciales y un caso confirmado. P. Kerndt y col. Transfusion 28,31S Abstract s108 (1988) y P. Kerndt y col. Transfusion 31: 814-818 (1991). En Europa se ha sabido tambi´en de enfermedad de Chagas importada, con un caso documentado de infecci´on por T. cruzi cong´enita publicado en Suecia. P. O. Pehrson y col. Scand. J. Infect. Dis. 13:307-308 (1981). El Trypanosoma cruzi tiene uno de los ciclos de vida m´ as complejos entre los tripanosomas encontrados en el hombre. Los tripomastigotos circulan por la sangre de los hu´espedes vertebrados y se transmiten por los insectos triat´ ominidos que succionan sangre. La enfermedad se extiende tambi´en por transfusi´ on de sangre, a trav´es de uso de f´armacos intravenosos, por transmisi´ on cong´enita, por actividad sexual, por transplante de o´rganos o a trav´es de la leche materna. V´ease, por ejemplo, A. Skolnik, JAMA 262: 1433 (1989); P. Nickerson y col., Ann. Intern. Med. 111:851-853 (1989); Anonimo, Clinica 354: 16 (1989); L.V. Kirchhoff, Ann. Intern. Med. 111:773-775 (1990); G. Bonfim y col. ISBT/AABB Joint Congress, Abstract S445, 112 (Nov. 10-15, 1989); P. Kerndt y col. Transfusion 28: S108 (1988); I. H. Grant y col. Ann. Intern. Med. 111: 849-851 (1989); M. Boxaca y col. Int. Conf. AIDS 6: 437 (Abstract 3141 (1991); S. G. Sandler, Am Red Croo Blood Services Letters 89:1-10 (1989); A. J. Bittencourt, Am. J. Dis. Child 130: 97-103 (1976); R. Hoff y col. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72:247-250 (1978); M. D. Gudino y col. en in Emerging Global Patterns Transfusion-Transmitted Infections, R.G. Westphal y col. eds. Arlington, V.A, American Asotiation of Bood Banks, 65-86 (1990); L. G. Kagan y col., Rev. Biol. Trop, 14: 55-73 (1966); J. C. P. Dias y col., Mem Inst. Oswaldo Cruz 79: 139-147 (1984); y J.H. Maguire y col. “American Trypanosomiasis” en Infectious Diseases P. D. Hoepricke y col., eds., Filadelfia: J. P. Lippincott, p´ aginas 1257-1266 (1989). El diagn´ ostico de la enfermedad se lleva a cabo com´ unmente por identificaci´ on de los par´ asitos en la sangre, fluido cerebroespinal, tejido fijado o nodo de linfa durante per´ıodos de fiebre alta; sin embargo, los microorganismos pueden ser dif´ıciles de detectar durante la fase de latencia (llamada tambi´en indeterminante), o durante los estadios cr´onicos de la infecci´on. En xenodiagnosis, se examina el contenido intestinal de vectores insecto para T. cruzi varias semanas despu´es de que estos par´asitos se hayan alimentado de la sangre del paciente sospechado. Sin embargo, este procedimiento es laborioso y carece de sensibilidad. E. L. Segura, “Xenodiagnosis” en Chagas Disease vectors, R.R. Brenner y col., eds. II: 41-45, Boca Raton, FL, CRC Press (1987). Se han utilizado diversas tecnolog´ıas serol´ ogicas para diagnosticar enfermedad de Chagas. Estas metodolog´ıas incluyen inmunofluorescencia indirecta, hemaglutinaci´ on indirecta, fijaci´ on de complemento e 2

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inmunoensayo de enzima. V´ease, por ejemplo, F. Zicker y col. Bull World Health Organ, 68: 465-471 (1990); ME Carmargo, Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo 8:227-234 (1977); ME Carmargo y col. Bull. Pan. Am. Health Organ 19: 233-244 (1985); A.A.Pan y col., J. Infect. Dis. (165: 585-588 [1992]), A. A. Pan y col., Am. J. Trop. Med, Hyg. 45: 120 Abstract 66 (1991); A.F. Ferreira y col. Rev. Inst. Med. Trop. San Paulo 33: 123-128 (1991). Despu´es de la infecci´on, se pueden detectar respuestas de anticuerpos espec´ıficas para el par´ asito y las concentraciones permanecen altas durante toda la vida. D. M. Israelski y col. Am. J. Trop. Med, Hyg. 39: 445-455 (1988); R. Lelchuck y col. Clin. Exp. Immunol, 6: 547.555 (1970): N.H. Vattuone y col, Am. J. Trop. Med. Hyg. 76: 45-47 (1973). Otros antecedentes son A.A. Pan y col., Transfusion, vol. 31, No. 8s, Noviembre 1991, Arlington VA EEUU, p´ agina 15s que describen el desarrollo de un inmunoensayo de enzima para detectar anticuerpos a T. cruzi en el que se seleccionan dos ant´ıgenos candidatos. Se utiliza un ensayo de radioinmunoprecipitaci´on para confirmar muestras que se sospechan positivas. J. Scharfstein y col. J. of Immunology, Vol. 137, No. 4. Agosto de 1986, p´ agina 1336-41 describe un m´etodo para aislar glicoprote´ına de T. cruzi Gp57/51 de epimastigotos y posterior purificaci´on por FPLC seguido de cromatograf´ıa de intercambio de ani´ on. M. Schechter y col., The Lancet, Vol. ii, No. 8356, Octubre de 1983, p´ aginas 939-41 describe la purificaci´ on de glicoprote´ına de ant´ıgeno de T. cruzi Gp90 por cromatograf´ıa de afinidad de lectina y el uso de GP90 como ant´ıgeno unido a una fase s´ olida en un ensayo ELISA para diagn´ostico serol´ogico de enfermedad de Chagas causada por T. cruzi. A.C.V. Arnholdt y col., Research in Inmunology, Vol. 142, No.2, 1991, p´aginas 146-51 describe que la GP57/51 es una ciste´ına proteinasa ant´ıg´enica que tiene radicales de manosa unidos en el nitr´ ogeno. M. Slifkin y col Clinical Microbiology Reviews, Vol 3, No. 3, julio de 1990, p´ aginas 197-218 describe la especificidad de la uni´ on a hidrato de carbono de un gran n´ umero de lectinas incluyendo Galanthus nivalis, teniendo el u ´ltimo especificidad de uni´ on para radicales de manosa. Pierce InmunoTechnology Catalog & Handbook, Vol. I, julio 1990, Pierce (Rockford IL), p´ agina A-5 describe el uso de hidrocloruro de 1-etil-3-(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para acoplar una mol´ecula que contiene ´acido carbox´ılico a una mol´ecula que contiene amina primaria a trav´es de reacci´on con grupos a´cido carbox´ılico y amina, en particular para formar un inmun´ ogeno. L. Mendon¸caPreviato y col., Biochemistry, Vol. 22, No. 21, 1983, p´ agina 4980-87 describe aspectos antig´enicos de la glicoprote´ına LPPG de T. cruzi; M.V. De Arruda y col. Eur. J. Biochem. Vol. 182, No. 2, Junio 1989, p´ aginas 413-21, describe el uso de LPGG fijada a placas de ensayo en un ensayo RIA para detecci´on de anticuerpo a T. cruzi y adem´ as describe el aislamiento de glicoprote´ınas de 80-90 kDa y 50-60 kDa de T. cruzi y la obtenci´ on de antisueros para el mismo con el prop´ osito de precipitar varios ant´ıgenos en tripomastigotos y tripomastigotos metac´ıclicos. La transmisi´on natural de enfermedad de Chagas a humanos tiene lugar cuando la piel o mucosas entran en contacto con heces de chinches infectados. Los signos y s´ıntomas son tan suaves que la infeci´ on reciente no se asocia normalmente con infecci´on de T. cruzi. Incluso sin tratamiento, la mayor´ıa de los individuos se recuperan desde las etapas agudas de la enfermedad. Despu´es de un per´ıodo de latencia de a˜ nos o d´ecadas, un cierto porcentaje de individuos (20-40 %) desarrolla los s´ıntomas cardiacos o gastrointestinales que caracterizan a la enfermedad cr´onica de Chagas. La persistencia de parasitemia en individuos asintom´ aticos y la supervivencia del par´ asito en la sangre almacenada en bancos de sangre y componentes de sangre aumenta los peligros de transmisi´ on de enfermedad de Chagas por transmisi´on por sangre: la sangre infectada utilizada para transfusi´ on de bancos de sangre constituye un problema de salud p´ ublica significativo. Un ensayo r´ apido y fiable con componentes normalizados para ensayo de selecci´on (screening) y confirmaci´ on de los donantes de sangre en cuanto a enfermedad de Chagas resultar´ıa enormemente u ´ til para evitar la transfusi´ on de la enfermedad por los bancos de sangre. Compendio de la invenci´ on

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La presente invenci´on proporciona un m´etodo que puede utilizarse como ensayo confirmatorio de la presencia de anticuerpos a T. cruzi en una muestra de ensayo. El m´etodo comprende (a) determinar la presencia de un primer anticuerpo a T. cruzi en una muestra de ensayo, que comprende (i) el contacto de una primera parte al´ıcuota de una muestra de ensayo con un primer ant´ıgeno de T. cruzi unido a un soporte s´olido para formar una mezcla e incubar ´esta para formar complejos primer ant´ıgeno/anticuerpo, (ii) contacto de los citados complejos primer ant´ıgeno/anticuerpo con un reactivo indicador durante un determinado tiempo y en condiciones suficientes para formar complejos primer ant´ıgeno/anticuerpo/agente indicador, y (iii) detectar la presencia del primer anticuerpo a T. cruzi por medida de la se˜ nal generada; (b) determinar la presencia de un segundo anticuerpo a T. cruzi en una muestra de ensayo, que comprende (i) contacto de una segunda parte al´ıcuota de muestra de ensayo con un segundo ant´ıgeno de T. cruzi unido a un soporte s´olido para formar una mezcla e incubaci´ on de la misma para formar complejos segundo ant´ıgeno/anticuerpo, (ii) contacto de los citados complejos segundo ant´ıgeno/anticuerpo con un reactivo indicador durante un tiempo y en unas condiciones suficientes para formar complejos segundo 3

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ant´ıgeno/anticuerpo/reactivo indicador, y (iii) detecci´on de la presencia de un segundo anticuerpo a T. cruci por medida de la se˜ nal generada; y (c) determinar la presencia de un tercer anticuerpo para T. cruzi en una muestra de ensayo, que comprende (i) contacto de una tercera parte al´ıcuota de una muestra de ensayo con un tercer ant´ıgeno de T. cruzi unido a un soporte s´ olido para formar una mezcla e incubar la misma para formar complejos tercer ant´ıgeno/anticuerpo, (ii) contacto de los citados complejos tercer ant´ıgeno/anticuerpo con un reactivo indicador durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos tercer ant´ıgeno/anticuerpo/reactivo indicador y (iii) detecci´on de la presencia del tercer anticuerpo a T. cruzi por medida de la se˜ nal generada. La presencia de al menos dos anticuerpos espec´ıficos confirma la presencia de anticuerpo de T. cruzi en la muestra de ensayo. Los ant´ıgenos de T. cruzi que se utilizan en el ensayo incluyen Gp90, Gp 60/50 y LPPG. Los ant´ıgenos se utilizan con la condici´ on de que el ant´ıgeno empleado como primer ant´ıgeno no se utilice como segundo ant´ıgeno de la etapa (b) o tercer ant´ıgeno de la etapa (c), el ant´ıgeno utilizado como segundo ant´ıgeno no se utilice como primer ant´ıgeno de la etapa (a) o tercer ant´ıgeno en la etapa (c), y el ant´ıgeno empleado como tercer ant´ıgeno no se utilice como primer ant´ıgeno de la etapa (a) o segundo ant´ıgeno de la etapa (b). El reactivo indicador utilizado en el ensayo comprende un marcador que se selecciona del grupo que consiste en un crom´ogeno, un catalizador, un compuesto luminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un elemento radiactivo, y un marcador visual directo. La presente invenci´on proporciona tambi´en estuches (kits) de ensayo de diagn´ ostico u ´ tiles para detecci´on de anticuerpo a T. cruzi, en particular para ensayos confirmatorios, que comprenden un envase que contiene los ant´ıgenos de T. cruzi GP 90, GP 60/50 y LPPG. Se proporcionan adem´ as procedimientos de purificaci´ on del ant´ıgeno GP 60/50. El procedimiento de purificaci´ on de ant´ıgeno GP 60/50 de T. cruzi comprende (a) aislar la membrana del estadio de epimastigoto de T. cruzi por homogeneizaci´on dounce; (b) extracci´ on del ant´ıgeno Gp 60/50; (c) aplicaci´ on del extracto resultante de la etapa (b) a una columna de afinidad de lectina de Galanthus nivalis y eluci´on con un hidrato de carbono; y (d) purificaci´ on del eluato con una columna de afinidad que comprende un anticuerpo monoclonal espec´ıfico para Gp 60/50. La etapa de extracci´ on se lleva a cabo preferiblemente con un detergente no-i´ onico.

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Adem´as, la presente invenci´on proporciona un procedimiento para unir un glicol´ıpido antig´enico de T. cruzi a un veh´ıculo prote´ına, que comprende (a) obtener el glicol´ıpido lipofosfonop´eptidoglicano (LPPG) del estadio de epimastigoto de T. cruzi; (b) ligamiento de LPPG de la etapa (a) con una prote´ına utilizando etildimetil-amino-propil-carbodiimida (EDAC) por (i) contacto de LPPG con EDAC para formar una mezcla resultante e incubar la citada mezcla durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para activar la mezcla, (ii) incubar la mezcla activada con la prote´ına durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para ligar LPPG con la prote´ına; (c) purificaci´ on de la mezcla; y (d) eluci´ on de LPPG de la mezcla. La prote´ına preferida que se liga es alb´ umina de suero bovino (BSA). Adem´ as, se prefiere que la purificaci´ on de la etapa (c) se lleve a cabo por paso de la mezcla a Sepharose azul dextrano. La presente invenci´on proporciona tambi´en el conjugado LPPG-prote´ına obtenible por el anterior proceso. Breve descripci´ on de los dibujos

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La Figura 1A es un gr´ afico de barras donde el n´ umero de sueros de una poblaci´on negativa reactiva con GP 90 de T. cruzi (90 kD) se muestra a lo largo del eje vertical mientras que la relaci´on se˜ nal a negativos (S/Neg) se muestra a lo largo del eje horizontal de la gr´ afica, siendo el n´ umero de sueros ensayados 289. La Figura 1B es un gr´ afico de barras donde el n´ umero de sueros de una poblaci´on negativa reactiva con Gp 60/50 de T. cruzi se muestra a lo largo del eje vertical mientras la relaci´on se˜ nal a negativo (S/Neg) se muestra a lo largo del eje horizontal de la gr´ afica, donde el n´ umero de sueros ensayados era 289. La Figura 1C es un gr´ afico de barras donde el n´ umero de sueros de una poblaci´on negativa con LPPG de T. cruzi se muestra a lo largo eje vertical mientras que la relaci´ on se˜ nal a negativos (S/Neg) se muestra a lo largo del eje vertical mientras que la relaci´on se˜ nal a negativos (S/Neg) se muestra a lo largo del eje horizontal de la gr´ afica, donde el n´ umero de sueros ensayados era 289. Las Figuras 2 A a 2D muestran los resultados del ensayo de la invenci´ on en una gr´ afica como funci´ on de la densidad o´ptica (OD) frente al factor de diluci´ on de los sueros ensayados (previamente positivos), donde un c´ırculo lleno indica perla de gp90, un c´ırculo abierto indica perla de gp60/50, y un tri´ angulo abierto indica perla de LPPG-BSA.

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ES 2 177 547 T3 La Figura 2 A es una gr´ afica de muestra C, obtenida en San Antonio, Tejas; La Figura 2B es una gr´ afica de muestra b, obtenida en Los Angeles, CA; 5

La Figura 2C es una gr´ afica de una muestra de Brasil; La Figura D es un Control Positivo Latino Americano EIA de enfermedad de Chagas (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL).

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La Figura 3 es un esquema para confirmar la seropositividad a T. cruzi. Descripci´ on detallada de la invenci´ on

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El t´ermino “miembro de uni´ on espec´ıfica” tal como aqu´ı se usa, se refiere al miembro de un par de uni´ on espec´ıfica. Es decir, dos mol´eculas diferentes en que una de las mol´eculas se une de forma espec´ıfica por medios qu´ımicos o f´ısicos a la segunda mol´ecula. Por lo tanto, adem´ as de pares de uni´ on espec´ıfica a ant´ıgeno y anticuerpo de inmunoensayos comunes, otros pares de uni´ on espec´ıfica pueden incluir biotina y avidina, hidratos de carbono y lectina, secuencias de nucle´ otidos complementarias, mol´eculas de efector y receptor, cofactores y enzimas, inhibidores de enzimas y similares. Adem´as, los pares de uni´ on espec´ıfica pueden incluir miembros que son an´ alogos al miembro de uni´on espec´ıfica original, por ejemplo un an´ alogo del analito. Entre los miembros de uni´ on espec´ıfica inmunoreactivos se incluyen ant´ıgenos, fragmentos de ant´ıgenos; anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales; y complejos de los mismos, incluyendo los formados por m´etodos de ADN recombinante. El t´ermino “analito” tal como aqu´ı se emplea es un anticuerpo a T. cruzi cuya posible presencia en la muestra de ensayo se va a detectar. La muestra de ensayo puede ser un fluido biol´ ogico de mam´ıfero tal como sangre completa o componentes de sangre completa que incluyen c´elulas rojas de la sangre, c´elulas blancas de la sangre incluyendo linfocitos o preparaciones de subconjuntos de linfocitos, plaquetas, suero y plasma; ascites; saliva; deyecciones; fluido cerebroespinal; orina; esputo; aspirados traqueales u otros constituyentes del cuerpo que pueden contener o se sospecha que contengan el (los) analito(s) que interesa(n): La muestra de ensayo puede ser tambi´en un sobrenadante de un fluido de cultivo o una suspensi´ on de c´elulas cultivadas. Los mam´ıferos u otros seres cuyos fluidos corporales se pueden ensayar como analito de anticuerpo a T. cruzi seg´ un la presente invenci´ on incluyen seres humanos y primates as´ı como otros mam´ıferos de los que se sospecha que contengan estos analitos de inter´es. El reactivo indicador comprende t´ıpicamente un marcador conjugado a un miembro de uni´on espec´ıfica de cada analito. Cada reactivo indicador produce una se˜ nal detectable a un nivel relativo a la cantidad de analito que est´e presente en la muestra de ensayo. En un modo de realizaci´ on preferido, cada reactivo indicador, aunque comprende un miembro de uni´ on espec´ıfica de un analito diferente, est´ a conjugado al mismo compuesto (marcador) que genera la se˜ nal, que es capaz de generar una se˜ nal detectable. En general, el reactivo indicador se detecta o mide despu´es de haber sido capturado por el material de la fase s´olida. En la presente invenci´ on, la se˜ nal total generada por el (los) reactivo(s) indicador(es) indica la presencia de uno o m´as de los analitos en esta muestra de ensayo. Se contempla que, en la pr´ actica de la presente invenci´on, se pueden utilizar compuestos diferentes que generan se˜ nal. Seg´ un esto, podr´ıan utilizarse por ejemplo diferentes compuestos fluorescentes como compuestos generadores de se˜ nal, uno por cada reactivo indicador, y la detecci´ on realizarse por lectura a diferentes longitudes de onda. O se puede utilizar un compuesto quimioluminiscente de vida corta tal como un compuesto de acridinio o fenantridinio y un compuesto quimioluminiscente de vida larga tal como un dioxietano para generar se˜ nales en tiempos diferentes para diferentes analitos. M´etodos que suponen la utilizaci´ on de dos o m´ as compuestos quimioluminiscentes que son capaces de generar se˜ nales a diferentes tiempos son objeto de la Publicaci´ on internacional WO92/12255. Los compuestos de acridinio y fenantridinio est´an descritos en EP-A-0 273 115 Adem´as de ser un ant´ıgeno o un anticuerpo miembro de un par de uni´ on espec´ıfica, el miembro de uni´ on espec´ıfica del reactivo indicador puede ser un miembro de cualquier par de uni´ on espec´ıfica incluyendo biotina o avidina, un hidrato de carbono o una lectina, una secuencia de nucle´ otido complementaria, una mol´ecula de efector o receptor, un cofactor de enzima o una enzima, un inhibidor de enzima o una enzima, y similares. Un miembro de uni´on espec´ıfica inmunoreactivo puede ser un anticuerpo, un ant´ıgeno, o un complejo anticuerpo/ant´ıgeno que sea capaz de uni´ on al analito, como en un ensayo sandwich, o al 5

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miembro de uni´ on espec´ıfica ancillar como en un ensayo directo. Si se utiliza un anticuerpo, este puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo recombinante, una mezcla de ellos, o una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de uni´ on especifica. Los detalles de la preparaci´on de tales anticuerpos y su adecuabilidad para uso como miembros de uni´ on espec´ıfica son muy conocidos por los especialistas en esta ´area. El compuesto generador de se˜ nal (marcador) del reactivo indicador es capaz de generar una se˜ nal medible por medios externos. Los compuestos que generan varias se˜ nales (marcadores) que se contemplan incluyen crom´ ogenos; catalizadores tales como enzimas, por ejemplo, peroxidasa de r´ abano picante, fosfatasa alcalina, y B-galactosidasa; compuestos luminiscentes tales como fluoresce´ına y rodamina; compuestos quimioluminiscentes tales como compuestos de acridinio, compuestos de fenantridinio y compuestos de dioxietano; elementos radiactivos y marcadores visuales directos. La selecci´on de un marcador particular no es cr´ıtica, pero tendr´ a que poder producir una se˜ nal ya sea por si mismo o en uni´on de una o m´ as sustancias adicionales. Una serie de diferentes reactivos indicadores puede ser la formada por variaci´on del marcador o del miembro de uni´ on espec´ıfica. Los reactivos de captura utilizados en la presente invenci´on comprenden un ant´ıgeno de T. cruzi que es un miembro de uni´ on espec´ıfica a cada uno de los anticuerpos a T. cruzi de inter´es, estando unidos los citados ant´ıgenos al menos a una fase s´olida y estando sin marcar.

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El reactivo de captura se puede unir directa o indirectamente a un material de fase s´olida antes de la realizaci´on del ensayo, o durante la realizaci´ on del ensayo, lo que permite la separaci´on de los complejos inmovilizados de la muestra de ensayo. Esta uni´on se puede llevar a cabo, por ejemplo, por aplicaci´ on por recubrimiento del miembro de uni´ on sobre las fases s´olidas por absorci´ on o uni´ on covalente. En la t´ecnica se conocen estos m´etodos de recubrimiento as´ı como otro tipo de m´etodos de uni´ on. La “fase s´ olida” no es cr´ıtica y puede ser seleccionada por cualquier especialista. As´ı, pueden servir de ejemplos adecuados las part´ıculas de latex, micropart´ıculas, perlas magn´eticas o no-magn´eticas, membranas, tubos de pl´ astico, paredes o pocillos de las bandejas de reacci´on, laminillas de vidrio o silicio y c´elulas rojas de sangre de oveja endurecidas. M´etodos adecuados para inmovilizar reactivos de captura sobre las fases s´olidas incluyen los i´ onicos, hidr´ ofobos, interacciones covalentes y similares. El t´ermino “fase s´olida” tal como aqu´ı se emplea, se refiere a cualquier material que es insoluble o puede hacerse insoluble por subsiguiente reacci´on. La fase s´ olida se puede elegir por su capacidad intr´ınseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura. Alternativamente, la fase s´olida puede retener un receptor adicional que tenga la capacidad de atraer e inmovilizar el reactivo de captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia con carga opuesta a la del propio reactivo de captura o a una sustancia cargada conjugada con el reactivo de captura. A´ un otra alternativa es que la mol´ecula de receptor pueda ser cualquier miembro de uni´on espec´ıfica que est´e inmovilizado (unido) sobre la fase s´olida y que tenga la capacidad de inmovilizar el reactivo de captura a trav´es de una reacci´on de uni´ on espec´ıfica. La mol´ecula de receptor permite la uni´on indirecta del reactivo de captura a un material de fase s´olida antes de la realizaci´ on del ensayo o durante la realizaci´on del ensayo. Seg´ un esto, la fase s´ olida puede ser un pl´ astico, un derivado de pl´ astico, metal magn´etico o no-magn´etico, superficie de vidrio o silicio de un tubo de ensayo, pocillo de microvaloraci´ on, l´ amina, perla, micropart´ıcula, laminilla y otras configuraciones conocidas por los especialistas en esta ´area. Dentro del marco de la presente invenci´on, se contempla que la fase s´ olida pueda comprender tambi´en un material poroso adecuado con suficiente porosidad para permitir el acceso, por anticuerpos de detecci´on y una afinidad de superficie adecuada para unir ant´ıgenos. Las estructuras microporosas son las generalmente preferidas, pero se pueden emplear tambi´en materiales con estructura de gel en estado hidratado. Estos soportes s´ olidos u ´tiles incluyen: hidratos de carbono polim´ericos naturales y sus derivados modificados sint´eticamente, reticulados o sustituidos, tales como agar, agarosa, a´cido alg´ınico reticulado, gomas guar sustituidas y reticuladas, ´esteres de celulosa, especialmente con ´acido n´ıtrico y a´cidos carbox´ılicos, ´esteres de celulosa mixtos, y ´eteres de celulosa; pol´ımeros naturales que contienen nitr´ ogeno, tales como prote´ınas y derivados, que incluyen gelatinas reticuladas o modificadas; pol´ımeros hidrocarburos naturales, tales como latex y caucho; pol´ımeros sint´eticos que pueden prepararse con estructuras porosas adecuadas, tales como pol´ımeros de vinilo, que incluyen polietileno, polipropileno, poliestireno, poli cloruro de vinilo, poli acetato de vinilo y sus derivados parcialmente hidrolizados, poliacrilamidas, polimetacrilatos, copol´ımeros y terpol´ımeros de los policondensados anteriores, tales como poli´esteres, poliamidas y otros pol´ımeros, tales como poliuretanos o poliep´ oxidos; materiales inorg´ anicos porosos tales como sulfatos o carbonatos de metales alcalino-t´erreos y magnesio, incluyendo sulfato de bario, sulfato de calcio; carbonato de calcio , silicatos de metales alcalinos y alcalino-t´erreos, aluminio y magnesio; y ´oxidos 6

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o hidratos de aluminio o silicio, tales como arcillas, al´ umina, talco, caol´ın, zeolita, gel de s´ılice, o vidrio (estos materiales se pueden utilizar como filtros con los materiales polim´ericos anteriores); y mezclas de los copol´ımeros de las clases anteriores, tales como copol´ımeros de injerto obtenidos por polimerizaci´on de iniciaci´ on de pol´ımeros sint´eticos sobre un pol´ımero natural pre-existente. Todos estos materiales se pueden utilizar en formas adecuadas, tales como pel´ıculas, l´ aminas o placas, o pueden aplicarse o unirse o formar estratos con veh´ıculos inertes apropiados, tales como papel, vidrio, pel´ıculas de pl´astico o tejidos. La estructura porosa de nitrocelulosa tiene excelentes cualidades de absorci´on y adsorci´ on para una amplia variedad de reactivos que incluyen anticuerpos monoclonales. El nylon posee tambi´en caracter´ısticas similares y tambi´en es adecuado. Se contempla que tales soportes s´olidos porosos descritos aqu´ı antes est´en preferiblemente en forma de l´aminas de un espesor de aproximadamente 0,01 a 0,5 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm. El tama˜ no de poro puede variar dentro de amplios l´ımites y es, preferiblemente de aproximadamente 0,025 a 15 µm, especialmente de aproximadamente 0,15 a 15 µm. Las superficies de tales soportes se pueden activar por procesos qu´ımicos que dan lugar a enlace covalente del ant´ıgeno o anticuerpo al soporte. Por lo general sin embargo, se obtiene la uni´ on irreversible del ant´ıgeno o anticuerpo por adsorci´ on sobre el material poroso por fuerzas hidr´ ofobas no bien comprendidas.

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Los materiales de fase s´olida preferidos para dispositivos de ensayo de flujo transversal incluyen papel de filtro tal como un material de fibra de vidrio poroso u otros materiales de matriz de fibra. El espesor de tales materiales no es cr´ıtico y ser´a cuesti´on de elecci´on, bas´ andose sobre todo en las propiedades de la muestra o analito que se ensaya tal como la fluidez de la muestra de ensayo.

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Para cambiar o potenciar la carga intr´ınseca de la fase s´olida, se puede aplicar directamente una sustancia cargada al material o sobre micropart´ıculas que se retienen entonces por un material soporte de fase s´ olida. Alternativamente, las micropart´ıculas pueden servir como fase s´ olida, por retenci´ on en una columna o por suspensi´ on en la mezcla de reactivos solubles y muestra de ensayo, o las propias part´ıculas pueden ser retenidas o inmovilizadas por un material soporte en fase s´olida. Por “retenidas e inmovilizadas” se entiende que las part´ıculas sobre el material soporte o dentro de ´el no pueden moverse sustancialmente a cualquier otra posici´on dentro del material soporte. Las part´ıculas se pueden seleccionar por cualquier especialista entre cualquier tipo de material en part´ıculas adecuado, incluyendo los materiales compuestos de poliestireno, poli acrilato de metilo, polipropileno, latex, politetrafluoroetileno, poliacrilonitrilo, policarbonato, o materiales similares. El tama˜ no de las part´ıculas no es cr´ıtico, aunque se prefiere que el di´ametro medio de las part´ıculas sea m´as peque˜ no que el tama˜ no medio de poro del material soporte utilizado.

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El m´etodo de la presente invenci´ on se puede adaptar adem´ as para utilizarlo en un sistema que emplea tecnolog´ıa de micropart´ıculas que incluye sistemas automatizados y semi-automatizados, donde la fase s´olida comprende una micropart´ıcula. Estos sistemas incluyen los descritos en EP-A-0 425 633, EP-A-0 424 634 y Patente estadounidense No. 5.006.309. Un aspecto de la invenci´on es un ensayo confirmatorio para anticuerpo a T. cruzi, el agente de la enfermedad de Chagas, Este ensayo supone el recubrimiento de una primera fase s´olida con un primer ant´ıgeno de T. cruzi, recubrimiento de una segunda fase s´ olida con un segundo ant´ıgeno de T. cruzi, y recubrimiento de una tercera fase s´ olida con un tercer ant´ıgeno de T. cruzi. Una parte al´ıcuota de muestra de ensayo que, previamente ha sido sometida a an´alisis de selecci´on en cuanto a anticuerpos a T. cruzi y reactivo de repetici´ on en el ensayo de an´alisis de selecci´on, se pone en contacto con cada fase s´olida. De esta forma, una parte al´ıcuota de la muestra de ensayo se pone separadamente en contacto con cada fase s´olida y se hace reaccionar separadamente. El (los) ant´ıgeno(s) de T. cruzi preferidos para utilizarlos en este ensayo confirmatorio son Gp90, Gp 60/50 y LPPG-BSA. La mezcla resultante se incuba durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos ant´ıgeno/anticuerpo. Se pone entonces en contacto un reactivo indicador espec´ıfico para cada anticuerpo y unido a un marcador capaz de generar una se˜ nal medible con los complejos ant´ıgeno/anticuerpo y se incuba durante un tiempo y unas condiciones suficientes para formar complejos ant´ıgeno/anticuerpo/reactivo indicador. Se determina la se˜ nal generada por cada fase s´ olida. La presencia de T. cruzi se determina como funci´on de la se˜ nal generada por el reactivo indicador de fase s´ olida. Una se˜ nal generada mayor que un valor de tramo interceptado de control negativo conocido pre-determinado se considera reactiva y por tanto indicativa de la presencia de anticuerpo a T. cruzi. La presencia de anticuerpo para al menos dos de los tres ant´ıgenos de T. cruzi indica la presencia confirmada de anticuerpo de T. cruzi en la muestra de ensayo. El microorganismo eucari´ otico T. cruzi tiene m´ as de 30.000 prote´ınas; hay conservaci´ on de epitopes 7

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entre miembros de la familia Tripanosom´ıdeos/Cinetopl´ astidos (D.E. Lanar y col. Mol. Biochem. Parasitol. 3:327, 341 (1981) y S. P. Craig y col. Comp. Biochem. Physiol. 95B:657-662 (1990)). Adem´as la diversidad de T. cruzi incluye zimodemas o variabilidad de cepas de una localizaci´on geogr´ afica a otra. El xenodiagn´ostico debe realizarse con cuidado para eliminar la probabilidad de reacci´on cruzada con T. rangeli, un par´ asito que tiene vectores insecto similares pero diferentes localizaciones de tripomastigotos metac´ıclicos. Los ant´ıgenos utilizados para los anteriores formatos de ensayo descritos se purifican hasta homogeneidad desde los estadios de amastigoto o epimastigoto de T. cruzi y subsiguientemente se unen (se aplican como recubrimiento) a un soporte s´olido. Los ant´ıgenos Gp90 y LPPG han sido caracterizados previamente y el ant´ıgeno (s Gp90 ha mostrado ser inmunog´enico. V´ease, por ejemplo, M. Schechter y col. Lancet 2:939-941 (1983); L.V. Kirchhoff y col. J. Inf. Dis. 155:561-564 (1987) y J. O. Previato y col. J. Biol. Chem. 265:2518-2526 (1990). Sin embargo, no ha sido descrita hasta ahora la utilizaci´ on de la combinaci´on de los tres ant´ıgenos de T. cruzi preferidos para utilizarlos en un ensayo confirmatorio o de an´ alisis de selecci´on (screening) para anticuerpos a T. cruzi. En el ensayo confirmatorio, si la absorbancia de una muestra sospechada est´ a por encima del valor del tramo interceptado de control en tres de tres o dos de tres determinaciones que utilizan ant´ıgenos de T. cruzi, se considera como una muestra positiva confirmada para la enfermedad. Sin embargo, si la absorbancia no est´ a por encima del tramo interceptado de control en ninguno o solamente lo est´ a en uno de los tres ant´ıgenos utilizados, la muestra de ensayo se somete a ensayo de radioinmunoprecipitaci´ on (“RIPA”). En RIPA, bandas de diagn´ ostico presentan modelos de banda caracter´ısticos en 32, 34 y 90 kD. El t´ıtulo de una muestra de ensayo positiva est´ a reflejado en el modelo de bandas de 19 y 25 kD. Seg´ un esto, la muestra de ensayo puede entrar dentro de tres categor´ıas: reactiva confirmada, reactiva indeterminada o negativa. La presente invenci´on se describe a continuaci´ on por v´ıa de ejemplos, que son u ´nicamente ilustrativos y no limitativos del alcance de la presente invenci´ on que queda definida por las reivindicaciones adjuntas.

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Ejemplos Ejemplo 1 30

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Cultivo de par´ asitos Se mantuvieron cultivos de reserva de epimastigotos de T. cruzi (procedentes de la Colecci´ on de Cultivos Tipo Americano, Rockville, MD) en medio NNN modificado (descrito por C. Pan, en Am. T. Trop. Med. Hyg. 17:823-832 (1968)) con un exceso de medio UM-55 (como describe P.M. Raney y col. en Mol. Biochem. Parasitol. 49:111-118 (1991); A. Pan en Exp. Parasitol, 58: 72-80 (1984)) a 24◦ C siguiendo los procedimientos descritos por S.C. Pan en Bull World Health Organ 60:101-107 (1982); P. M. Raney y col. en Mol. Biochem. Parasitol., 41:111-118 (1991); y A.A. Pan y col. en J. Immunol, 143:1001-1008 (1989). En los experimentos se inocularon epimastigotos en 5 ml de medio UM-55 y se pasaron una vez. Se utilizaron 5 mililitros de este cultivo en una fase semi-logar´ıtmica de crecimiento para inocular un matraz rotativo con 6 litros de medio UM-55 y luego se incub´ o durante siete a diez d´ıas a 26◦ C. Ejemplo 2 Producci´ on de membranas de T. cruzi

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Se hicieron crecer epimastigotos o amastigotos de T. cruzi a fase logar´ıtmica, se recogieron y se lavaron tres veces con soluci´on salina tamponada con fosfato (PBS) (pH 7,4) por centrifugaci´ on a 6.000 x g. El aglomerado final de c´elulas se volvi´o a suspender en tamp´ on de lisis (consistente en Tris-HCl 20 mM (pH 7,3), NaCl 40 mM, EDTA 10 mM, fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) 2 mM y yodoacetamida 1mM). Los microorganismos (50 ml de epimastigotos compactados o´ 20 ml de amastigotos compactados) se desorganizaron por cavitaci´ on con nitr´ ogeno (1500 psi-10Kg/cm2 - durante 15 minutos sobre hielo) o por homogeneizaci´on dounce. Se sub-fraccionaron los lisatos por centrifugaci´ on diferencial a 48.000 x g durante 30 minutos a 4◦ C, siguiendo el m´etodo descrito por A. A. Pan y col, supra. Ejemplo 3 Preparaci´ on de ant´ıgenos de T. cruzi para ensayos

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Cp 60/50. Se purific´ o la glicoprote´ına Gp 60/50 de T. cruzi de epimastigotos como sigue. Brevemente, se solubiliz´o el aglomerado enriquecido en membranas durante dos horas a 4◦C en Tamp´on A (consistente en Tris-HCl 20 mM (pH 7,2)) que conten´ıa NaCl 150 mM, yodoacetamida 2,0 mM, EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM, aprotonina 77 µM y NP-40m al 2 % y se clarific´o por centrifugaci´ on a 48.000 8

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x g durante 30 minutos a 4◦ C. El fluido sobrenadante resultante se aplic´ o a una columna de 20 ml de lectina de Galanthus nivalis (GNA) (adquirida en E.Y. Laboratories, San Mateo, CA), equilibrada en tamp´ on A que conten´ıa NaCl 0,5 M, NP-40 al 0,1 % y EDTA 1 mM. La columna se eluy´o con alfa-metil piranosido 0,3 M en el mismo tamp´ on. Este eluato se aplic´ o a una columna de IgG Sepharosa anti-Gp 60/50 monoclonal (A.A. Pan y col supra) en soluci´on salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,2), se lav´o con PBS, y se eluy´ o con dietilamina 50 mM como se describe en M.A. Winkler y col. Proc. Natl. Acad. Sci 81:3054 3058 (1984). El ant´ıgeno se analiz´ o por electroforesis de gel de SDS-poliacrilamida al 10 % (SDS-PAGE) en condiciones reductoras (U.K.Laemmli, Nature 227:680-685 (1970) y se someti´ oa te˜ nido con plata (adquirible en Bio-Rad, Richmond, CA), tal como describe M.A. Winkler y col., supra. Este nuevo procedimiento produc´ıa una glicoprote´ına homog´enea (al menos un 20 % hidrato de carbono). La columna de Galanthus nivalis aisl´ o la glicoprote´ına con un rendimiento del 1-2 % desde la mayor parte de las prote´ınas extra´ıdas de las membranas. Gp 90. El ant´ıgeno Gp de 90 kD se aisl´o desde membranas de amastigotos de crecimiento axenical utilizando una t´ecnica similar a la empleada con GP 60/50, con las siguientes modificaciones: La columna de lectina de GNA se sustituy´ o por columna de Sepharose 4 B lentil lectina (adquirible en PharmaciaLKB, Picaway NJ), y el tamp´ on A utilizado en la aplicaci´on, lavado y eluci´ on de la columna conten´ıa Tris-HCl 50 mM (pH 7,5), CaCl2 0,5 mM, MnCl2 0,5 mM, NaCl 0,5 mM y NP-40 al 0,1 %. El material eluido se purific´o por afinidad con columna de Sepharose 4B Ig2b anti Gp 90 kD monoclonal (A.A. Pan y col, supra) como se ha descrito antes. Se midi´o la concentraci´on de prote´ına para las membranas y ant´ıgenos purificados por ensayo de uni´ on a colorante Azul G250 Coomassie Pierce (de Pierce, Rockford, IL). Este ant´ıgeno se analiz´o tambi´en por SDS-PAGE, pero se ti˜ no´ con Azul Brillante Coomassie R-250. El nuevo procedimiento produjo una glicoprote´ına homog´enea para utilizaci´ on en la captura y detecci´ on de anticuerpos a T. cruzi. Se determin´ o que aproximadamente 24 ng dieron una alta se˜ nal en el ensayo. El rendimiento de la glicoprote´ına adem´ as fue de al menos 300 g por 18 l de amastigotos. Ejemplo 4 Preparaci´ on de ant´ıgeno lipofosfonop´eptidoglicano (LPPG) para utilizar en los ensayos

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Se aisl´o LPPG del total de epimastigotos por el procedimiento de J.O. Previato y col. T. Biol. Chem. 265:2518-2526 (1990). Brevemente, se descongelaron epimastigotos, se lavaron tres veces en agua y se extrajeron con fenol al 45 por ciento en agua. Se liofiliz´ o la fase acuosa, se aplic´o a columna de filtraci´ on de gel P-100 en agua y se liofiliz´ o el pico excluido. Se extrajo el polvo con cloroformo:metanol:agua (10:3:1), se sec´o, se disolvi´o entonces en agua y se hizo precipitar con 5 vol´ umenes de metanol a -20◦ C. La cantidad de LPPG se determin´ o por ensayo con orcinal-´acido sulf´ urico en cuanto a hidratos de carbono, siguiendo el m´etodo de C.A. White y col. en “Oligosac´arides”, Carbohydrate analysis. A Practical Approach, M. F. Chaplin y col., ed. Washington DC: IRL Press, p´ aginas 37-54 (1987). Este glicol´ıpido cubr´ıa mal los soportes s´olidos utilizados (perlas de poliestireno) por lo que se desarroll´ o un procedimiento para ligado del glicol´ıpido antig´enico LPPG de T. cruzi a un soporte de prote´ına de manera que el conjugado pudiera purificarse por cromatograf´ıa de afinidad sobre azul dextrano y subsiguientemente aplicarse sobre fases s´olidas para utilizaci´on en ensayos diagn´ osticos. El LPPG se uni´o a alb´ umina de suero bovino (BSA) con etil diaminopropilcarbodiimida (EDAC, de Sigma Chem. Co., San Luis, MO) siguiendo los m´etodos descritos por S. Bauminger y col. en Methods Enzymol. 70: 151-159 (1980) y modificados como sigue: Se uni´ o LPPG a alb´ umina de suero bovino (BSA) con EDAC en un procedimiento en dos etapas empleando una relaci´ on de masas 1:2 de LPPG a BSA. En la primera etapa, el LPPG se hizo reaccionar a temperatura ambiente con EDAC y luego se dej´ o reaccionar la mezcla activada con BSA durante toda la noche. Este material se purific´o por aplicaci´on de la mezcla a una columna de afinidad azul dextrano Sepharose (de Sigma Chem. Co., San Luis, MO) (10 x 1 cm), lavando en BSA y eluyendo el conjugado LPPG-BSA con tiocianato de potasio 0,5 M. La valoraci´ on del recubrimiento de ant´ıgeno (100 ng a 20 µg por perla) mostr´ o que lo preferido era 30 ng por perla de 14 ” (0,625 cm). El eluato resultante pod´ıa ser diluido y aplicado para recubrir directamente las perlas. Ejemplo 5

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Inmunoensayo con enzima confirmatorio de tres perlas Procedimiento de recubrimiento de perlas 60

Cada uno de los ant´ıgenos anteriores se aplicaron separadamente sobre perlas de poliestireno (tama˜ no 0,625 cm) como sigue: Se lavaron perlas de poliestireno (2000 perlas, 0,635 cm, de Laboratorios Abbott, o el fluido por asAbbott Park, IL) con isopropanol-agua (71:400) durante 20 minutos a 22◦ C. Se separ´ 9

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piraci´on. A las perlas se a˜ nadieron 400 ml de PBS que conten´ıa ant´ıgeno (o bien 60 µg de LPPG-BSA preparado como en el Ejemplo 4 o´ bien 60 µg de Gp 60/50 preparado como en el Ejemplo 3, o´ bien 48 µ de Gp90 preparado como en el Ejemplo 3). Se pusieron en contacto las perlas y los ant´ıgenos con agitaci´on nadieron 400 ml de una soluci´ on durante 2 horas a 40◦C. Despu´es de la agitaci´on, se separ´o el fluido y se a˜ de bloqueo (alb´ umina de suero bovino al 3 % en PBS). La mezcla resultante se agit´o durante 1 hora a o el fluido y se a˜ nadieron 400 ml de soluci´ on de recubrimiento (5 % de sacarosa y 40◦C. Luego se separ´ 0,5 % de gelatina en agua), se incub´ o la mezcla resultante con agitaci´on durante 20 minutos a 22◦C Se ogeno. Las perlas recubiertas se almacenaron dren´ o el fluido y las perlas se secaron a 22◦ C con gas nitr´ desecadas a 4◦ C.

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Inmunoensayo

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Se realiz´ o un inmunoensayo con enzima de la manera siguiente: Se diluyeron 5 µl de una muestra de suero con 200 µl de diluyente de muestras en tres pocillos de reacci´ on de una bandeja separados y se incubaron entonces con cada una de tres perlas recubiertas con ant´ıgeno (preparadas como se ha descrito R , de antes) durante 1 hora a 40◦ C. Las perlas se lavaron entonces con agua destilada (Abbott Quikwash Abbott Laboratories, Abbott Park, IL), y se incubaron con conjugado (IgG humana-anti cabra [cadena pesada y ligera] conjugada a peroxidasa de r´ abano picante [de Kierkegaard & Perry, Gaithersburg, MD]) durante 30 minutos a 40◦ C. Las perlas se lavaron entonces, se pasaron a tubos y se incubaron con 300 µl de tableta OPD (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) disuelta en diluyente OPD (que comprend´ıa citrato-fosfato 50 mM con 0,2 % de H2 O2 ) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detuvo la ometro reacci´on por adici´ on de 1 ml de H2 SO4 1N y se analiz´o la absorbancia empleando un espectrofot´ R a 492 nm. En todos los experimentos se incluyeron un control negativo (plasma Abbott Quantum humano recalcificado) y un control positivo (plasma humano inactivado, positivo para anticuerpo a T. cruzi), y los ensayos se hicieron por triplicado. El valor del tramo interceptado se determin´ o por inspecci´on de las absorbancias de la muestra en una poblaci´on negativa (SE Wisconsin N=289). El valor del tramo interceptado (S/N) era de 3,3 para LPPG; 3,5 para Gp60/50 y 3,5 para Gp90. La presencia o ausencia de anticuerpo a T. cruzi en una muestra desconocida se determin´ o relacionando S/N con el valor del tramo interceptado.

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Ejemplo 6 Radioinmunoprecipitaci´ on (RIPA) 35

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La fracci´on enriquecida en membranas de epimastigoto obtenida de la purificaci´ on de Gp60/50 se disolvi´o en Tris-HCl 10 mM (pH 7,8), NaCl 150 mM, EDTA 1mM, PMSF 1mM, yodoacetamida 1 mM, o el material en part´ıculas de y 2,0 % NP-40. La mezcla resultante se equilibr´ o 1 hora a 4◦ C, y se separ´ la prote´ına de membrana soluble por centrifugaci´ on a 20.000 x g durante 30 minutos a 4◦ C. El material resultante se marc´o radiactivamente con Na125 I por el m´etodo de cloramina T tal como describen W.M. Humer y col. en Nature 194:495-496 (1962) . El ant´ıgeno marcado se preabsorbi´ o en Sepharose Cl-4B o a 1000 x prote´ına A recubierta de suero humano normal durante una hora a 4◦ C, y despu´es se centrifug´ g durante 10 minutos. El material sin unir (a 107 cpm en un volumen total de 20 a 25 µl) se incub´o con 10 µl del suero de ensayo durante toda la noche sobre hielo. Se a˜ nadi´ o a la mezcla una parte al´ıcuota de 50 µl de suspensi´ on al 50 % de prote´ına-A Sepharosa CL-4B (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) en PBS o entonces la muestra tres veces en PBS que conten´ıa 1 % de y se agit´o durante 30 minutos a 4◦ C. Se lav´ NP-40 y una vez en PBS que conten´ıa 1 % de NP-40 y 0,05 % de dodecilsulfato de sodio (SDS). La muestra se llev´o a ebullici´on durante 5 minutos en tamp´ on cargado de SDS (SDS al 2,3 %, glicerina al 10 %, Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8), se centrifug´o luego (12.500, 0 x g durante 5 minutos) y se separ´ o el fluido sobrenadante para an´ alisis. Se llev´o a cabo una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida siguiendo el procedimiento de Laemmli (Nature 227: 680-685 [1970]) en un gel de poliacrilamida al 12,5 %. Se realiz´o una autoradiograf´ıa durante 7-10 dias a -70◦ C con pel´ıcula de rayos X (Kodak XAR-5) y pantallas de intensificaci´on Lightnight Plus (E. I. DuPont de Nemours & Co., Wilmington, DE) Ejemplo 7

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Ensayo comparativo Muestras 60

Se obtuvieron muestras positivas a xenodiagnosis del Instituto Fatala Chaben, Buenos Aires, Argentina. Se obtuvieron sueros de malaria de Africa (Gambia) e India (Madr´ as, India). Se obtuvieron sueros de leishmaniasis africana de Sud´ an y se obtuvieron sueros de schistosomiasis de Brasil. Se ensayaron 10

ES 2 177 547 T3 tambi´en muestras negativas, obtenidas de un a´rea de ”bajo riesgo“ de los Estados Unidos (Milwaukee, WI), lupus eritematosus sist´emico (SLE) (Milwaukee, WI) y sueros de s´ıfilis (Detroit, MI) con el ensayo confirmatorio de la invenci´on. 5

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Panel de diluciones de suero positivo Se diluyeron apropiadamente varios sueros positivos a anticuerpo a T. cruzi, determinados por el ensayo confirmatorio de la invenci´ on descrito en el Ejemplo 5, para obtener un panel de diluciones para determinaci´on de la sensibilidad. El control positivo (plasma humano inactivado con calor a 56◦ C) se diluy´ o en plasma humano normal para dar una absorbancia a 492 nm de 0,500 a 1.999, y luego se diluy´ o a 1:22 y 1:100. De manera similar se diluyeron varias otras muestras positiva: a 1:4 (altamente positiva); 1:6 (medianamente positiva); 1:9 (positiva en el l´ımite); 1:13,5 (poco positiva); y 1:22 (no reactivamente positiva). Tambi´en se ensayaron controles positivos y negativos (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Todos los sueros se analizaron por el ensayo confirmatorio de la invenci´on y RIPA tal como se han descrito antes. Evaluaci´ on

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Se llev´o a cabo un estudio para evaluar el ensayo confirmatorio de la invenci´ on y RIPA. En la evaluaci´on se utilizaron muestras previamente ensayadas en un ensayo de an´ alisis de selecci´on (screening) (Chagas Antibody EIA para enfermedad de Chagas, Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) . Estas muestras se hab´ıan obtenido de ocho lugares de campo seleccionados en el suroeste de los Estados Unidos; Las muestras no ten´ıan vinculaci´ on excepto en su clasificaci´on en cada lugar espec´ıfico en grupos de apellidos hisp´ anicos o no-hisp´ anicos. Las muestras se identificaron u ´ nicamente por el n´ umero para el ensayo, se realizaron los ensayos y los resultados de los ensayos se descodificaron en fecha posterior. El n´ umero total de muestras analizadas para selecci´ on fue de 13.109. Estas muestras se obtuvieron de los siguientes lugares (hisp´anicos/no-hisp´ anicos) Alburquerque, NM (224/224); Houston, TX (986/1326); McAllen, TX (664/259); San Antonio, TX (2396/1599); Los Angeles, CA (1050/1’50); Sacramento, CA (1899/600); y San Diego (416/416). Las muestras ten´ıan S/N mayor de 3,0 (N=112) utilizando el ensayo de an´ alisis de selecci´on descrito antes y se evaluaron por el ensayo confirmatorio de la invenci´ on siguiendo el procedimiento detallado en el Ejemplo 5 y RIPA seg´ un el procedimiento del Ejemplo 6. Resultados

35

40

1. Precisi´on: La capacidad del ensayo confirmatorio de la invenci´ on para detectar anticuerpo a T. cruzi se estableci´o por comparaci´ on de muestras positivas de consenso (muestras en las que hab´ıa resultados positivos tanto por ensayo de hemaglutinaci´ on como por ensayos indirectos de anticuerpo inmunofluorescente para enfermedad de Chagas). Se utiliz´ o el ensayo de la invenci´on sobre estas 82 muestras positivas de consenso. Un n´ umero de 56 muestras mostraron un valor de la absorbancia por encima del tramo interceptado en tres de las tres perlas (sensibilidad del 68,3 % [56/82]). Veinticuatro (24) muestras estaban por encima del tramo interceptado en solo dos de los tres ant´ıgenos (29,3 %). Dos de las muestras eran positivas para u ´nicamente uno de tres ant´ıgenos; estas tuvieron que ser confirmadas por RIPA. Tal como se ve en la Tabla 1, El comportamiento global del ensayo confirmatorio de tres perlas fue de 97,56 % (80/82) sobre las muestras positivas de consenso.

45

TABLA 1 Tipo de muestra

N´ umero de muestra

Ensayos de positiva de la invenci´on

Ensayo de negativa de la invenci´on

Sensibilidad (%)∗

Xenodiagnosticado positiva

28

28

0

100

Positiva∗∗ de consenso

82

80

2

97,56

Leshmaniasis

7

0

7

50

55

60

11

ES 2 177 547 T3 TABLA 1 Continuaci´on Tipo de muestra

N´ umero de muestra

Ensayos de positiva de la invenci´on

Ensayo de negativa de la invenci´on

Malaria

6

0

6

Toxoplasmosis

6

0

6

Schistomatosis

10

0

10

Lepra

1

0

1

S´ıfilis

2

0

2

Lupus sist´emico

5

0

5

Factor reumatoide alto

2

0

2

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Sensibilidad (%)∗

∗

Sensibilidad ( %) = (No. de positivos a Chagas-EIA/No. de positivos a xenodiagnosis) x 100; ∗∗ Los positivos de consenso son reactivos en ensayos de hemaglutinaci´ on e inmunofluorescencia Se ensayaron tambi´en 289 muestras negativas de una regi´ on de “bajo riesgo” (sureste de Wisconsin) por EIA confirmatorio. Como se ve en la Figura 1 A, Figura 1B y Figura 1C, las 284 muestras estaban por debajo de los tramos interceptados en al menos dos de las tres clases de perlas recubiertas de ant´ıgeno. Cinco muestras presentaban un valor de la absorbancia (S/N) por encima del tramo interceptado en una de tres perlas. Sin embargo, dado que la confirmaci´ on se determina por reacci´on por encima de los valores del tramo interceptado en al menos dos de tres perlas, el resultado global del ensayo confirmatorio era del 100 % (289/289). EIA confirmatorio de muestras positivas por xenodiagnosis Una muestra positiva por xenodiagnosis representaba una muestra en la que hab´ıa un mayor grado de certeza de que un individuo ten´ıa enfermedad de Chagas y por tanto anticuerpos a T. cruzi. La Tabla 1 recoge los datos del ensayo confirmatorio de la invenci´on en estas muestras. Como demuestran los datos de la Tabla 1, todas las muestras presentaban una absorbancia por encima del valor del tramo interceptado con tres de tres o dos de tres perlas. Ninguna de las muestras tuvo que volverse a ensayar por RIPA. El acuerdo global del ensayo confirmatorio fue del 100 % (28/28) sobre muestras positivas a xenodiagnosis. Evaluaci´ on del ensayo confirmatorio de tres muestras con un panel de diluciones

55

El ensayo de la invenci´ on fue llevado a cabo con cuatro muestras positivas de consenso diluidas hasta doble y triple de 1:2 a 1:96. Los resultados de estos ensayos se muestran en la Figura 2A, Figura 2B, Figura 2C y Figura 2D. Como puede verse en estas figuras, todos los sueros ensayados eran positivos (por encima del valor del tramo interceptado en al menos dos de tres perlas con ant´ıgeno) por ensayo confirmatorio de la invenci´ on a trav´es de una diluci´ on de 1:16. Las muestras se consideraron positivas de consenso cuando se ensayaron por Chagas US Screen EIA (Abbott Laboratories, Abbott Park. IL), hemaglutinaci´ on y anticuerpo inmunofluorescente indirecto. Todas las muestras se diluyeron al doble o triple a una diluci´ on de 1:96.

60

Reactividad cruzada Se tomaron muestras de pacientes con otras enfermedades parasitarias con el ensayo confirmatorio de 12

ES 2 177 547 T3 la invenci´on. Como muestran los datos de la Tabla 1, las absorbancias estaban por debajo del valor del tramo interceptado, que indicaba que no hab´ıa reactividad en el ensayo. Evaluaci´ on de ensayo confirmatorio de tres perlas con muestras de un estudio de prevalencia de EE.UU 5

10

En una evaluaci´ on nacional, se analizaron para selecci´ on 13.109 muestras de sangre donada en a´reas del suroeste de los Estados Unidos con Abbott Chagas Antibody EIA (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL). Todas las muestras con se˜ nal a negativo (S/N) mayor de 3,0 se ensayaron por el ensayo confirmatorio de la invenci´on como se detalla en el Ejemplo 5. Treinta y cuatro muestras del ensayo del an´ alisis de selecci´on (screening) eran reactivas en la repetici´on (“RR”). Como puede verse en la Tabla 2, nueve muestras eran positivas en al menos dos de tres perlas, dos muestras eran positivas en una de tres perlas, y dos muestras eran negativas en las tres perlas. Cuatro muestras (dos negativas en las tres perlas y dos positivas en una sola perla) resultaban indeterminadas y requirieron an´ alisis adicional por RIPA. TABLA 2

15

Ensayo confirmatorio de la invenci´ on realizado con sueros positivos Positivo

Muestra

Tipo

Xenodiagnosis

de consenso∗

Estudio nacional

Positivos 3/3

21

56

7

Positivos 2/3

7

24

2

Positivos 1/3

0

2

3+

Positivos 0/3

0

0

2+

20

Resultados del estudio confirmatorio

25

30

35

∗

Muestras en las que los ensayos de hemaglutinaci´on e inmunofluorescencia son positivos en ambas pruebas + Muestras que han de confirmarse con RIPA 40

45

50

55

RIPA Se llev´o a cabo un ensayo RIPA de extracto de membranas solubilizado marcado con I125 de epimastigotos de T. cruzi con el panel de diluciones de sueros positivos a anticuerpo a T. cruzi. Se revelaron 9 prote´ınas mayores bajo condiciones reductoras; estas bandas ten´ıan pesos moleculares (Mr) de 19, 25, 28, 32, 34, 44, 58, 69 y 90 kD (kilodaltons). Aparec´ıan dos bandas de Mr 32 y 34 kD que precipitaron intensamente, mientras que la banda de 90 kD era de intensidad media; estas tres bandas parec´ıan ser la mayor´ıa prote´ınas de diagn´ ostico. Las bandas de 19 y 25 kD aparec´ıan como dependientes de la concentraci´on del suero, estando presentes en el control positivo 1:22, 1:100, 1:4 (altamente positivo); y en el control positivo del ensayo de an´ alisis de selecci´on (screening) (descrito previamente). Las bandas 19 y 25 kD estaban ausentes en 1:6 (medianamente positivo); 1:9 (positivo en el l´ımite); 1:13,5 (positivo bajo); 1:22 (positivo no-reactivo); y en el control negativo al ensayo de an´alisis de selecci´on para enfermedad de Chagas antes descrito aqu´ı. Las bandas que inmunoprecipitaban a 28, 44, 58 y 69 kD aparec´ıan en varias muestras negativas ensayadas y no eran espec´ıficas. Las bandas 32, 34 y 90 kD aparec´ıan en todas las diluciones ensayadas. Comparaci´ on con RIPA de muestras positivas en xenodiagnosis

60

Se analizaron por RIPA las 28 muestras positivas en xenodiagnosis. Todas las muestras mostraban las caracter´ısticas bandas de diagn´ ostico a 32, 34 y 90 kD. Varios de estos sueros mostraban tambi´en bandas de elevada concentraci´ on en 19 y 25 kD. El acuerdo global en RIPA era del 100 % (28/28) en las muestras positivas en xenodiagnosis.

13

ES 2 177 547 T3 RIPA de muestras de un estudio de prevalencia en EE.UU

5

Para demostrar la utilidad de RIPA, se ensayaron como sigue 122 muestras del estudio de prevalencia en EE.UU. antes descrito con relaci´on se˜ nal/negativas mayor de 3,0. Las muestras con S/N de 3,0 a 5,0 (N=100) eran negativas en RIPA. Como muestra la Tabla 3 dada a continuaci´ on, de las 22 muestras que ten´ıan S/N superior a 5,0, se confirmaron 13 muestras como positivas. Cuatro de las cinco muestras indeterminadas del ensayo confirmatorio se confirmaron como positivas, y una muestra permaneci´o indeterminada. Siete muestras mostraron bandas a 19 y 25 kD, lo que indicaba sueros de alta concentraci´on.

10

TABLA 3 Comparaci´ on del ensayo de tres perlas con el ensayo RIPA Resultado del ensayo de 3-perlas

15

Muestra de ensayo 20

25

RIPA

3 de 3

2 de 3

1 de 3

0 de 3

positiva

Xerodiagnosticados positivos

21

7

0

0

28

Positivos de consenso

56

24

2

0

82

Estudio nacional de campo en E.U.

7

2

3

2

13

30

35

40

45

50

55

60

Como muestran los datos antes presentados, tanto el ensayo confirmatorio de la presente invenci´ on como el RIPA ten´ıan una sensibilidad cl´ınica del 100 % en los ensayos frente a sueros positivos en xenodiagnosis. Cuando se ensayaba con sueros positivos de consenso, el ensayo confirmatorio de la invenci´ on ten´ıa una sensibilidad del 97,56 % (80/82). El restante 2,4 % (2/82) mostraba una reactividad con una de las tres perlas. Cuando se ensay´ o frente a muestras negativas de una regi´on de “bajo riesgo” del sureste de Wisconsin, el ensayo confirmatorio de la invenci´ on ten´ıa una especificidad de >99,99 %. El esquema propuesto para confirmaci´ on se muestra en la Figura 3. Seg´ un esto, se puede ver que las muestras de ensayo reactivas con dos de tres o tres de tres ant´ıgenos de T. cruzi se consideran como muestra seropositiva reactiva confirmada. Si la absorbancia de una muestra est´ a solo por encima del valor del tramo interceptado en uno de tres ant´ıgenos, o la muestra no est´ a por encima del valor del tramo interceptado con ninguno de los tres ant´ıgenos, la muestra se somete a RIPA,. En RIPA, las muestras de ensayo se confirman como reactivas cuando precipitan tres de tres o dos de tres bandas de diagn´ ostico. Las muestras de inmunoprecipitaci´ on de solo una banda se consideran indeterminantes, y las muestras en las que no inmunoprecipita ninguna banda se consideran negativas. El ensayo confirmatorio de la invenci´ on proporciona un medio de reducir el n´ umero de muestras que necesitan ser ensayadas por RIPA. Esto resulta beneficioso ya que el RIPA se considera un procedimiento lento y laborioso cuando se compara con el ensayo de la presente invenci´on; el ensayo confirmatorio de la invenci´ on requiere aproximadamente dos horas para su realizaci´ on, mientras que el RIPA puede llevar hasta diez d´ıas para obtener el resultado. El RIPA ha sido utilizado anteriormente para confirmar la presencia de anticuerpo a T. cruzi, cuando se empleaba un extracto de prote´ınas de par´ asitos marcados superficialmente al ensayar muestras reactivas a las que se hab´ıa hecho el pedigr´ı. Las bandas de prote´ınas a 72 y 90 kD en RIPA aparec´ıan como sensibles y espec´ıficas. Estos ant´ıgenos estaban muy conservados a lo largo de una amplia selecci´on geogr´ afica de cepas del par´ asito. Sin embargo, el RIPA tiene las limitaciones pr´acticas de que se utilizan radiois´otopos con vida media corta, la t´ecnica consume mucho tiempo y es una t´ecnica que no es f´acilmente adaptable al an´ alisis de selecci´on (screening) a gran escala. R.C.K. Wong y col. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 80-275-281 (1986). Se contempla que el ensayo de la invenci´on puede ser optimizado incluso por variaci´ on de las condiciones de ensayo y/o tiempos de incubaci´ on, utilizando diversas combinaciones de reactivos de captura de ant´ıgeno o anticuerpo o de sonda, y otros m´etodos, reactivos y condiciones conocidas por los especialistas en este ´area. La variaci´on del reactivo de captura de anticuerpo puede requerir entonces el empleo de un reactivo de captura de ant´ıgeno diferente. Todas estas variaciones se contemplan como dentro del alcance 14

ES 2 177 547 T3 de esta invenci´on. Adem´ as, aunque algunos de los ensayos descritos en los ejemplos han utilizado un sistema autom´atico, tambi´en quedan dentro del alcance de la presente invenci´ on los m´etodos manuales o se pueden utilizar otros analizadores autom´atico o adaptados al ensayo de la presente invenci´on. Esto significa, por tanto, que la presente invenci´ on solo queda limitada por las reivindicaciones adjuntas. 5

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ES 2 177 547 T3 REIVINDICACIONES 1. Un ensayo confirmatorio de la presencia de anticuerpo para T. cruzi en un ensayo que comprende: 5

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15

a. determinar la presencia de un primer anticuerpo a T. cruzi en una muestra de ensayo, que comprende: i) el contacto de una primera parte al´ıcuota de una muestra de ensayo con un primer ant´ıgeno de T. cruzi unido a un soporte s´ olido para formar una mezcla e incubaci´ on de la misma para formar complejos primer ant´ıgeno/anticuerpo. ii) contacto de los citados complejos primer ant´ıgeno/anticuerpo con un reactivo indicador durante un tiempo y bajo unas condiciones suficientes para formar complejos primer ant´ıgeno/anticuerpo/reactivo indicador; y iii) detecci´on de la presencia del primer ant´ıgeno de T. cruzi por medida de la se˜ nal generada; b. determinaci´ on de la presencia de un segundo anticuerpo para T. cruzi en una muestra de ensayo, que comprende:

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40

i) el contacto de una segunda parte al´ıcuota de una muestra de ensayo con un segundo ant´ıgeno de T. cruzi unido a un soporte s´ olido para formar una mezcla e incubaci´ on de la misma para formar complejos segundo ant´ıgeno/anticuerpo. ii) contacto de los citados complejos segundo ant´ıgeno/anticuerpo con un reactivo indicador durante un tiempo y bajo unas condiciones suficientes para formar complejos segundo ant´ıgeno/anticuerpo/reactivo indicador; y iii) detecci´on de la presencia del segundo anticuerpo a T. cruzi por medida de la se˜ nal generada. c. determinaci´on de la presencia de un tercer anticuerpo para T. cruzi en una muestra de ensayo, que comprende: i) el contacto de una tercera parte al´ıcuota de una muestra de ensayo con un tercer ant´ıgeno de T. cruzi unido a un soporte s´ olido para formar una mezcla e incubaci´ on de la misma para formar complejos tercer ant´ıgeno/anticuerpo. ii) contacto de los citados complejos tercer ant´ıgeno/anticuerpo con un reactivo indicador durante un tiempo y bajo unas condiciones suficientes para formar complejos tercer ant´ıgeno/anticuerpo/reactivo indicador; y iii) detecci´on de la presencia del citado tercer anticuerpo para T. cruzi por medida de la se˜ nal generada. donde la presencia de al menos dos anticuerpos confirma la presencia de anticuerpo para T. cruzi en la muestra de ensayo.

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2. El ensayo seg´ un la reivindicaci´ on 1 donde el primer ant´ıgeno de T. cruzi se selecciona del grupo que consiste en Gp90, Gp 60/50 y LPPG, donde el ant´ıgeno utilizado como primer ant´ıgeno no se utiliza para el segundo ant´ıgeno de la etapa (b) o el tercer ant´ıgeno de la etapa (c). 3. El ensayo seg´ un la reivindicaci´ on 2 donde el segundo ant´ıgeno de T. cruzi se selecciona del grupo que consiste en Gp90, Gp 60/50 y LPPG, donde el ant´ıgeno utilizado como segundo ant´ıgeno no se emplea para el primer ant´ıgeno en la etapa (a) o el tercer ant´ıgeno de la etapa (c). 4. El ensayo seg´ un la reivindicaci´ on 1 donde el citado reactivo indicador de la etapa (a), etapa (b) y etapa (c) comprende un marcador que se selecciona del grupo que consiste en un crom´ ogeno, un catalizador, un compuesto luminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un elemento radiactivo, y un marcador visual directo. 5. El ensayo seg´ un la reivindicaci´ on 1 donde la muestra de ensayo se somete a pre-ensayo y se determina si es reactiva antes de llevar a cabo las etapas (a), (b) y (c).

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6. El ensayo seg´ un la reivindicaci´ on 1 donde las etapas (a), (b) y (c) se realizan simult´ aneamente. 7. Un procedimiento para purificar el ant´ıgeno Gp 60/50 de T. cruzi que comprende: 16

ES 2 177 547 T3 a) aislar la membrana del estadio de epimastigoto de T. cruzi por homogeneizaci´on dounce; b) extracci´on del ant´ıgeno Gp 60/50; 5

c) aplicaci´on de los extractos resultantes de la etapa (b) a una columna de afinidad de lectina de Galanthus nivalis y eluci´on con un hidrato de carbono; d) purificaci´ on del eluato con una columna de afinidad que comprende un anticuerpo monoclonal espec´ıfico para Gp 60/50.

10

8. El procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 7 donde la etapa de extracci´ on (b) se realiza con un detergente no-i´onico. 9. El procedimiento para ligamiento de un glicol´ıpido antig´enico de T. cruzi a un veh´ıculo prote´ına que comprende:

15

a. obtener el glicol´ıpido lipofosfonop´eptidoglicano (LPPG) del estadio de epimastigoto de T. cruzi. b. ligamiento de LPPG de la etapa (a) con una prote´ına que utiliza etildimetilaminopropil carbodiimida (EDAC) por: 20

i) contacto de LPPG con EDAC para formar una mezcla resultante e incubaci´ on de la citada mezcla durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para activar la mezcla , ii) incubar la mezcla activada con la prote´ına durante un tiempo y bajo unas condiciones suficientes para ligamiento de LPPG con la prote´ına para producir un conjugado de LPPG-prote´ına,

25

c. purificar la mezcla, d. eluir el conjugado LPPG-prote´ına desde la mezcla. 30

10. El procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 9 donde la prote´ına es alb´ umina de suero bovino (BSA). 11. El procedimiento seg´ un la reivindicaci´ on 9 donde la etapa de purificaci´ on (c) se lleva a cabo por paso de la mezcla por Sepharosa azul dextrano.

35

12. El conjugado LPPG-prote´ına obtenible por el procedimiento de la reivindicaci´ on 9. 13. Un estuche de diagn´ ostico u ´ til para la detecci´ on de anticuerpo para T. cruzi, que comprende un recipiente que contiene ant´ıgenos de T. cruzi Gp90, Gp 80/50 y LPPG.

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14. El estuche de diagn´ ostico seg´ un la reivindicaci´ on 13 donde los citados ant´ıgenos se unen a una fase s´olida. 15. El estuche de diagn´ ostico seg´ un la reivindicaci´ on 14 donde el citado ant´ıgeno LPPG de la reivindicaci´on 13 se une a una prote´ına.

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60

NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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