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Sección 6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO

6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO PARTE I: REGULACIÓN GENÉTICA EN EL OPERÓN lac Objetivos - Comprender la importancia de la regulación genética como mecanismo para controlar los niveles de enzimas en la célula. - Conocer los elementos que integran el operón de la lactosa. - Entender el funcionamiento del operón de la lactosa en presencia y ausencia de este carbohidrato. - Conocer el concepto de represión catabólica y cómo se lleva a cabo.

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO fuente de carbono y energía. Cuando se termina la lactosa, el represor se vuelve a unir al operador bloqueando la expresión de los genes estructurales. La presencia o ausencia de la lactosa no es el único factor que influye sobre la expresión del operón de la lactosa. Si la célula tiene una fuente de glucosa suficiente para sus requerimientos energéticos, no necesita metabolizar lactosa aún cuando esté presente. El proceso por el cual esto ocurre se denomina represión catabólica e involucra una segunda proteína reguladora, CAP (proteína activadora de catabolito), y un segundo sitio de unión, el sitio CAP, adyacente al promotor.

Introducción La regulación metabólica es el incremento o el decremento de una reacción enzimática o de toda una secuencia de reacciones enzimáticas de las rutas metabólicas. Esto surge de la necesidad de la célula de estar en equilibrio normal, distinto al equilibrio que tiene en un estado de enfermedad.

La CAP se une al sitio CAP sólo en presencia de AMP cíclico (AMPc), un nucleótido modificado derivado del ATP por la adenilato ciclasa. La cantidad de AMPc en la célula depende de la concentración de glucosa, y por ende de ATP, que inhibe a la adenilato ciclasa. Si los niveles de glucosa son altos (nivel de ATP alto) hay poco AMPc y si son bajos hay mucho AMPc (niveles de ATP bajos). Al controlar la cantidad de AMPc en la célula, la glucosa indirectamente regula la unión del complejo CAP-AMPc al sitio CAP. Esto es muy importante porque cuando el complejo CAP-AMPc está unido, se estimula la unión de la RNA polimerasa al promotor (regulación positiva), lo que ocasiona la transcripción de los genes estructurales del operón de lactosa.

La célula logra el equilibrio entre sus reacciones enzimática, a través, principalmente, de la modificación de la actividad simultánea de sus enzimas presentes. Dado que el número de enzimas es alto, lo logra a través de algunos mecanismos globales de regulación metabólica.

Material biológico Cultivo de E. coli W3110 en medio M9-glicerol.

Una de las modalidades de regulación es la que involucra la expresión diferencial en aumento o disminución de la concentración de enzima, la regulación de la expresión genética. El DNA de una célula puede contener miles de genes dependiendo de su complejidad. Sin embargo, sólo una parte de esta conformación genética es requerida por la célula en todo momento. Además, existen genes con una función más especializada y cuya participación sólo es requerida por la célula bajo ciertas circunstancias. Por ello, todos los organismos son capaces de regular la expresión de sus genes. En el caso de las bacterias, la regulación de la expresión genética les permite responder metabólicamente a los cambios en su ambiente de manera rápida y precisa. Las bases de nuestro entendimiento sobre la regulación de la expresión génica en bacterias fueron propuestas por Francois Jacob y Jacques Monod en 1961. Ambos, junto con André Lwoff, compartieron el Premio Nobel de 1965 por su teoría del operón.

Material y equipo de laboratorio 4 tubos 13x100 mm estériles con tapón de gasa y algodón 1 pipeta de 5 mL estéril 3 pipetas de 1 mL estériles 5 pipetas de 1 mL 1 propipeta 1 gradilla 1 mechero Centrífuga clínica Baño María a 37ºC

El operón de la lactosa está formado por los genes estructurales lacZ, lacY y lacA, que codifican para las enzimas β-galactosidasa, permeasa y transcetilasa respectivamente. Todos ellos se transcriben en una molécula de RNA mensajero (RNA policistrónico), a partir de un promotor localizado río arriba de lacZ. También descubrieron el gen lacI, que no se encuentra adyacente al operón, pero cuyo producto proteico es un represor que se une al operador, localizado entre el promotor y lacZ. De hecho, el operador y el promotor están traslapados, de manera que cuando el represor esta unido al operador la RNA polimerasa no puede unirse al promotor y por lo tanto no hay transcripción de los genes estructurales.

Reactivos − 1 tubo de 13X100 mm con 4 mL de medio M9-glicerol estéril − Solución de glucosa al 2% estéril − Solución de lactosa al 2% estéril − Solución de glucosa 2% + lactosa 2% estéril − Amortiguador Z − Reactivo ONPG. El reactivo debe prepararse justo antes de usarse para mejores resultados. − SDS al 0.1% − Na2CO3 1M − Cloroformo

Cuando hay lactosa presente, la bacteria toma unas pocas moléculas de ellas y las convierte en alolactosa que es capaz de unirse al represor, impidiendo que éste se pegue al operador. La subsecuente unión de la RNA polimerasa al promotor ocasiona la transcripción de los genes estructurales y la posterior traducción en las enzimas necesarias para la utilización de la lactosa como

Desarrollo de la práctica (Figura 6.1) 1. Coloca 4 mL del cultivo de E.coli W3110 en cada uno de los 4 tubos de 13x100 mm estériles y rotularlos de la A a la D. Rotular el tubo que contiene el medio M9-glicerol como E (blanco). 2. Añadir a cada tubo lo siguiente:

1

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Tubo A 1 mL de glucosa 2% Tubo B 1 mL de lactosa 2% Tubo C 1 mL de glucosa 2% + lactosa 2% Tubo D 1 mL de glucosa 2% Tubo E 1 mL de glucosa 2% + lactosa 2% 3. Incubar los tubos a 37ºC con agitación ocasional. A los 15 minutos de incubación añadir, únicamente al tubo D, 1 mL de lactosa 2% y reintegrarlo a la incubadora a 37ºC. 4. Cuando hayan transcurrido 45 minutos de incubación, centrifugar los tubos a 3000 rpm durante 25 minutos. Quitar los tapones de los tubos antes de centrifugar. Este paso y los siguientes requieren condiciones de esterilidad. 5. Decantar y resuspender cada paquete celular en 1 mL de amortiguador Z. 6. Añadir a cada tubo 0.1 mL de cloroformo y 50 uL de SDS 0.1%. Agitar durante 10 segundos. 7. Añadir a cada tubo 0.2 mL de reactivo ONPG y agitar. 8. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos o hasta el desarrollo de color amarillo. 9. Parar la reacción con 0.5 mL de Na2CO3 1M. 10. Anotar que tubos desarrollan color amarillo y con qué intensidad. 11. Analizar y reportar los resultados obtenidos.

Sección 6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO Cultivo E. coli

Colocar 4 mL / Tubo

1 mL Glucosa 2%

1 mL Lactosa 2%

1 mL Glucosa 2% Lactosa 2%

1 mL Glucosa 2%

1 mL Glucosa 2% Lactosa 2%

Incubar a 37 0C / 45 min (*A los 20 min de incubación añadir 1 mL de lactosa 2% al tubo D) Centrifugar a 3000 rpm / 25min

Decantar el sobrenadante

Resuspender el paquete celular en 1 mL amortiguador Z

Añadir 100 µL de CHCl3 + 50 µL SDS 0.1% Agitar suavemente 10 seg Añadir 0.2 mL de reactivo ONPG Agitar Incubar a Tamb / 30 min

Añadir 0.5 mL Na2CO3 1 M

Observar la intensidad de color amarillo

3

4

Figura 6.1. Protocolo de inducción de expresión de los genes involucrados en la utilización de lactosa

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PARTE II: REGULACIÓN HORMONAL DEL METABOLISMO DE LA GLUCOSA

Cuestionario 1. ¿Qué es la regulación genética? 2. ¿Cuáles son las diferencias entre la expresión genética constitutiva, la inducible y la represible? 3. ¿Cómo funcionan los mecanismos de control positivos de la expresión genética? 4. ¿Cómo funcionan los mecanismos de control negativos de la expresión genética? 5. ¿Qué son un activador y un inductor? 6. ¿Qué son un represor y un co-represor? 7. ¿Qué es un operón y cuáles son sus componentes? 8. ¿Cuál es la estructura del operón de lactosa de E.coli? 9. ¿Cómo funciona este operón en ausencia y en presencia de lactosa? 10. ¿Qué es la represión catabólica y como se ejerce este proceso sobre el operón de lactosa? 11. ¿Por qué la bacteria utilizada en la práctica fue cultivada inicialmente en medio M9-glicerol? 12. ¿Para qué se utiliza cada reactivo de la práctica? 13. Explique que ocurre en los tubos A-E en la práctica. 14. ¿Qué reacción es responsable del color amarillo observado en los tubos? 15. ¿Qué ocurriría si a los tubos B y C se agregara ATP? 16. ¿Cuál será el fenotipo en ausencia y en presencia de lactosa de cada uno de los siguientes mutantes del operón lac: i-, is, z-, y-, a-, p-, y oc? Explique por qué. 17. ¿Qué diferencias existen en la regulación de una vía metabólica como la de la degradación de la lactosa y una vía anabólica, como la de la síntesis de triptófano? 18. ¿Qué importancia tiene la regulación de la expresión genética en procariontes? 19. ¿Cuáles son las principales diferencias en la regulación genética entre procariontes y eucariontes? 20. ¿Qué aplicaciones tienen en su práctica profesional o en su vida cotidiana los conceptos adquiridos al realizar esta práctica?

Referencias • Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Regulation of gene expression. Ed John Wiley & Sons, INC, New York, 1997. Pp. 20-52. Localización QP514.2 • Gardner JE. Garder E. Principios de genética. 1998, 4a edition Ed. Limusa, pp. 390-407. Localización QH581.2 M 65 • Genética General. Manual de prácticas de laboratorio. Regulación genética en el operón lac. Facultad de Química, UNAM. Ciudad Universitaria. México, 2002. • Klug SW, Cummings RM. Conceptos de genética. Ed. Prentice Hall. Madrid 1999. Pp. 51-71. • Lodish H, Molecular Cell Biology, 2003, Ed. Freeman and company, pp. 115-125. Localización QH581.2 M 65 • Stryer L. Bioquimica, 2004, Ed.Reverté, pp.868-873.

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Objetivos - Conocer la definición de hormonas. - Conocer que las hormonas participan en la regulación del metabolismo. - Conocer los mecanismos de acción y transducción de la señal por insulina: activación de proteínas cinasas y de proteínas involucradas en transporte y metabolismo. - Manejar un modelo experimental animal para medir el efecto de insulina sobre la toma de glucosa por diferentes tejidos. - Analizar el efecto de un inhibidor de la cascada de transducción de señales en el transporte de glucosa. Introducción Los seres vivos coordinamos los eventos intracelulares a través de complejos sistemas de señales químicas. La comunicación intracelular mantiene la síntesis o la alteración de una gran variedad de moléculas, por ejemplo, controla la actividad de las vías metabólicas. Las hormonas, los factores de crecimiento y los neurotransmisores, son las señales químicas que alteran o regulan la actividad celular. Una gran variedad de moléculas mensajeras (primeros mensajeros) no entran a la célula para iniciar sus acciones biológicas, sino que interaccionan con diferentes receptores en la superficie de éstas. La unión de los ligandos con sus receptores induce un cambio conformacional en el receptor que lo convierte en una forma activa, capaz de interaccionar directa o indirectamente sobre diversas moléculas, tales como factores de acoplamiento. La asociación con otras proteínas activan o inhiben una cascada de sucesos moleculares (proceso de transducción de señales) que llevan a una respuesta biológica específica y determinada de acuerdo al ligante que se unió al receptor. La insulina es una hormona polipeptídica que al interaccionar con su receptor estimula una compleja cascada intracelular de eventos dependientes de la fosforilación o defosforilación específica de proteínas y culmina con una variada respuesta celular. Ocurren cuatro cambios principales por la presencia de la insulina: la activación del receptor, el control del transporte de la glucosa, la estimulación del metabolismo como la glucólisis y el almacenamiento de lípidos y la regulación de la transcripción de genes. La insulina tiene un papel importante en la regulación de la homeostasis de la glucosa en sangre, debido a que incrementa el transporte y utilización (metabolismo) de glucosa en ciertos tejidos. La insulina incrementa la toma de la glucosa en las células de músculo y de tejido adiposo de mamíferos. La principal causa es la movilización del transportador de glucosa, GLUT4, desde el interior celular hacia la membrana celular. El incremento en moléculas de GLUT4 en la membrana plasmática causa un incremento de 10 a 40 veces en la toma de glucosa. El mecanismo que lleva a la translocación de GLUT4 hacia la membrana celular no se ha descrito totalmente, pero se conoce que una vez que la insulina se une a su receptor, éste se autofosforila en un residuo de tirosina, lo que desencadena la fosforilación de proteínas como IRS-1 y Shc, las cuales se asocian a proteínas que contienen residuos -SH2 (Cys) como p85, SYP o GRb. La formación del complejo IR-1-p85 activa a una cinasa denominada PI3 cinasa, proteína clave involucrada en la movilización hacia la superficie celular de las vesículas de membrana que contienen al transportador GLUT4 (Figura 6.2).

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0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 1 Tijeras 1 Vaso de precipitados 1 Caja Petri 1 Cámara para el sacrificio de las ratas (por grupo) 1 Tanque de CO2 (por grupo) Baño de agua con agitación (por grupo)

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Reactivos − Solución Krebs-Ringer-Glucosa-Hepes (ver composición en el apéndice). − 0.9% NaCl − Solución de insulina 2000 µU/mL − 4 µM Wormanina Desarrollo experimental Se ha dividido está sección en tres partes, la extracción de los tejidos de las ratas, la inducción de la toma de glucosa por insulina en los tejidos y tercero la cuantificación de glucosa residual en los tubos en donde se incubó el tejido. Debido a que el procedimiento es largo, se sugiere realizar el experimento en dos sesiones.

Figura 6.2. Vía de transducción de señales por insulina. P, residuos de tyr fosforilados; GSK-3, glucógeno sintasa cinasa-3; PP1, proteína fosfatasa tipo 1; GluT, transportador de glucosa; PI3’-K, fosfatidil inositol 3’-cinasa subunidad catalítica; p85, PI3’-K subunidad regulatoria; PKB, proteína cinasa B; IRS, substrato del receptor de insulina; MAPK, proteína cinasa activada por mitógenos. Las vías conocidas se muestran con líneas continuas y las vías que aún no se demuestran pero que podrían encontrarse relacionadas a insulina se indican con líneas discontinuas. Tomado de Bradey y Saltiel, 2001. Una de los enfoques experimentales que ha ayudado a encontrar los blancos moleculares de la acción de insulina y así describir la vía de transducción de señales implicada, es el uso de inhibidores de proteínas cinasas o fosfatasas. Existen inhibidores específicos de algunas cinasas como las MAPK, p70S6 cinasas y PI3-cinasas. Un defecto en alguna de las respuestas celulares por el uso del inhibidor, nos permite asociar a la proteína inhibida como parte de los intermediarios dentro de la vía de transducción de señales encendida en este caso por insulina.

Material biológico Hígado, músculo y tejido adiposo de rata. Material y equipo 7 Tubos falcón 50 mL 1 Recipiente para hielo 1 Micropipeta con capacidad de 200-1000µL 1 Caja de puntas para micropipeta de 1000µL 1 Probeta de 50 mL 1 Piceta con agua destilada Tubos para microfuga 1 Pinzas de disección

Inducción de toma de glucosa por insulina (Figura 6.3) Se recomienda que por grupo midan el efecto de insulina sobre la captación de glucosa en tres tejidos distintos: hígado, músculo y tejido adiposo. A continuación se describe el protocolo experimental a seguir en un tejido. Preincubación del tejido con wormanina y posteriormente la incubación con insulina. 1. Colocar 2 mL de solución Krebs-Ringer-Hepes-Glucosa (KRH-Glu) en un tubo falcón de 50 mL marcado como W. Adicionarle 50 µL wormanina para una concentración final de 100 nM. 2. Pesar el tubo con el líquido. 3. Añadir un trozo del tejido. Volver a pesar el tubo. Es necesario conocer la cantidad de tejido que se coloca en el tubo. 4. Incubar por 30 min a 37°C. Este paso es la preincubación del tejido con wormanina. 5. Al finalizar la incubación añadir 0.5 mL de la solución de insulina 2000 µU/mL y 0.5 mL de NaCl 0.9%. 6. Mezclar e Incubar en baño de agua con agitación moderada a 37°C por 30 min. CUIDAR DE QUE LA TEMPERATURA DEL BAÑO NO EXCEDA LA RECOMENDADA. 7. Añadir 47 mL de agua. 8. Filtrar el tejido y pesarlo. 9. Guardar en un tubo de microfuga 1.2 mL del sobrenadante. Rotular el tubo con una W, el número de equipo y el grupo. Almacenar a –20°C hasta su uso. 10. Se determinará el contenido de glucosa en la siguiente fase. Incubación del tejido con insulina. 1. Etiquetar 6 tubos falcón de 50 mL de la siguiente manera: I. II. III. IV.

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1000 µU 500 µU 250 µU 125 µU 8

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL V. 62 µU VI. 0 µU

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Etiquetar tubos Añadir a cada tubo 1 mL 0.9% NaCl, excepto al W

Realizar diluciones seriadas de insulina (Excepto los tubos VI y W)

2. 3. 4. 5.

Añadir a cada tubo 1 mL de NaCl 0.9%. Añadir al tubo 1, 1 mL de la disolución de insulina. Agitar bien. Tomar 1 mL de la solución de insulina del tubo I y pasarlo al tubo II. Agitar. Tomar ahora 1 mL del tubo II y pasarlo al tubo III. Agitar y continuar de esa manera hasta el tubo V. 6. Tomar 1 mL del tubo V y desecharlo. 7. El tubo 6 no deberá contener insulina. 8. Añadir a cada matraz 2 mL de solución de KRH-Glu. 9. Pesar los tubos en balanza analítica y ponerlos en hielo. 10. Sacrificar las ratas una por una y aislar el hígado y el tejido adiposo de las testículos (ver descripción del procedimiento). 11. Mantener los tejidos en 0.9% NaCl y a 4°C una vez aislados. 12. Adicionar a cada tubo un fragmento de tejido de aproximadamente del mismo tamaño. Para exponer la mayor superficie posible del tejido al medio se sugiere cortar en pedazos el trozo de tejido seleccionado. 13. Volver a pesar los tubos, pero ahora con los tejidos. 14. Colocar los tubos en un baño de incubación con agitación moderada a 37°C y se incuba por 30 min. 15. Añadir 47 mL de agua al tubo, mezclar y filtrar cada tubo. Se pesa el tejido que queda en el filtro y el sobrenadante se utilizará para determinar la cantidad de glucosa residual. 16. Debido a que sólo se necesita una pequeña fracción del volumen para medir el contenido de glucosa residual, se puede tomar 1.2 mL de cada uno de los sobrenadantes y guardarlo en un tubo de microfuga. Rotular los tubos y almacenar congelado hasta su uso, siempre y cuando no se vaya a utilizar para la determinación de glucosa en esa sesión. 17. Se determinará la cantidad de glucosa en la siguiente fase experimental.

Añadir a todos 2 mL Krebs Ringer-Glucosa Añadir a W _________µL de wormanina Sacrificar las ratas una por una y aislar tejido.

-Distribuir en todos los tubos -Pesar tejido

Incubar todos los tubos a 37°C/30 min Tubos I al VI

Tubo W Añadir 0.5 mL Insulina 2000 µU/mL + 0.5 mL 0.9% NaCl Incubar a 37°C/30 min Tomar el tejido y pesarlo Ajustar el volumen del sobrenadante añadiendo 47 mL de H2O Guardar 1.2 a 1.5 mL sobrenadante en tubo de microfuga Congelar (Solamente si no se puede hacer en esa sesión la determinación de glucosa) Determinar contenido de glucosa

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Figura 6.3. Protocolo de inducción de la toma de glucosa por insulina y determinación del efecto de wormanina en el proceso de transducción de señales iniciado por insulina. 10

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Aislamiento de tejidos. Las instrucciones para el manejo de los animales del laboratorio y el sacrificio de las ratas serán proporcionadas por un profesional en el área. En nuestro caso, será el jefe del bioterio de la Facultad de Química. No obstante, a continuación se enlistan algunas recomendaciones que les pueden ser útiles en el manejo de las ratas. Manejo y sacrificio de las ratas. − Recuerden mantener la calma, los animales perciben el miedo. − Para capturar a las ratas dentro de la jaula, la manera más práctica es tomarla con una mano de la cola y con la otra sujetar la piel del cuello, con esto no puede atacar y queda inmovilizada. También es posible sujetar a la rata con una sola mano, rodeando el cuello con el pulgar y el índice, cuidando de no ejercer mucha presión. − El método de sacrificio será el químico, utilizando una cámara saturada con CO2 por 5 min. − Posteriormente se realiza la dislocación cervical, sujetando la base de la cola del animal y jalando firmemente, al hacer presión sobre la región cervical debe producirse un espacio de 2 a 4 mm entre el cráneo y las primeras vértebras cervicales. − Una vez realizado lo anterior, colocar al animal en posición decúbito dorsal (boca arriba) sobre la mesa previamente cubierta con un papel. Se sujetan los miembros con el fin de que el animal se encuentre firme a la manipulación. Para tener acceso a la cavidad torácica y abdominal se debe sujetar y levantar la piel con unas pinzas de “dientes de ratón” y hacer una incisión a lo largo de la línea media con unas tijeras y posteriormente abrir la piel a cada lado. Una vez expuestas estas cavidades se puede proceder a la recolección de los órganos que se requieran utilizando unas pinzas rectas y tijeras (Figura 6.4).

• •

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO Hacer lo mismo con el tejido adiposo que cubre el testículo del lado derecho y repetir la operación con cada una de las 2 ratas. Cortar rápidamente 7 fragmentos de tejido adiposo por rata, de aproximadamente el mismo tamaño y depositarlos en cada uno de los 7 tubos falcón previamente pesados.

Obtención de hígado • Extraerle el hígado a las 2 ratas que se sacrificaron. • Lavar los hígados con solución de 0.9% NaCl, para lograrlo se sugiere introducir la aguja de la jeringa por alguna de las dos vías por las que el hígado recibe sangre, la vena porta o la arteria hepática, bombear la solución de 0.9% NaCl fría a través de ellas, hasta que la sangre que quedo atrapada en el tejido salga (el proceso se llama “perfundir”), lo que llevará a que el hígado tome su color natural, de rosa a rojo. Procurar hacerlo rápidamente. • Cortar un hígado en 7 fragmentos de aproximadamente el mismo tamaño y distribuirlos en 7 tubos que contienen concentraciones de insulina similares al del tejido adiposo. Músculo • •

Cortar el músculo de las patas y de la región ventral. Lavar el tejido en solución 0.9% NaCl. Cortar en 7 segmentos, pesar y distribuir en los tubos indicados en el protocolo anterior.

Figura 6.4. Localización de algunos órganos de la rata.

Obtención de tejido adiposo • Abrir el abdomen ampliamente haciendo una ligera presión en la cavidad abdominal para desplazar los testículos, levantar hacia arriba el testículo izquierdo y de un solo corte separar el tejido adiposo de tal manera que no lleve sangre, en caso contrario, quitar la sangre con solución de NaCl 0.9% • Sujetar el tejido adiposo con pinzas por la parte más angosta procurando manejarlo lo menos posible. 11

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Sección 6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO -

Todos los carbohidratos con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como azúcares reductores y se transforman fácilmente en enedioles al calentarlos en soluciones alcalinas; dichos enedioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de oxígeno u otros agentes oxidantes. Por lo tanto, los carbohidratos en solución alcalina rápidamente reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63-, el carbohidrato oxidado forma mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las determinaciones cualitativas como cuantitativas. El método que se utilizará en la práctica utiliza como reactivos al Cu2+ y al arsenomolibdato. Técnica de Nelson-Somogyi empleada desde 1952 para la determinación de actividad de enzimas que degradan polisacáridos.

Tabla 6.1. Cantidades y orden en el que se realiza la cuantificación de carbohidratos 200ug/mL Sobrenadantes H2O RCuM NH4(AsMoO4)2 H2O Glucosa (mL) (mL) (mL) (mL) Tubo

Introducción Los carbohidratos son una de las fuentes principales de carbono y de energía en las células y los podemos encontrar en alimentos y en bebidas, así como también en la sangre. Dada la importancia de los carbohidratos, se han desarrollado varios métodos para su determinación: Fehling, Benedict, Somogy, Lane-Enyon, Hagerdorn-Hensen, etc., pero todos ellos se basan en el mismo principio.

Desarrollo experimental 1. Numerar los tubos de ensayo según se indica en la tabla 6.1. 2. Descongelar los sobrenadantes y agitar. 3. Añadir los reactivos en la cantidad y orden señalados.

Curva patrón

Determinación del contenido de glucosa transportada. Objetivos − Conocer el fundamento de la determinación de glucosa, método de Nelson-Somogyi. − Determinar de manera indirecta la toma de glucosa por un tejido.

Reactivos - Solución patrón de glucosa, 200 µg/mL. - Solución A para determinación de glucosa. Contiene Na2CO3, tartrato de Na y potasio, NaHCO3 y Na2SO4, ver apéndice. - Solución B para determinación de glucosa. CuSO4 y H2SO4, ver preparación en el apéndice. - Reactivo de cobre mezclado (RCuM): 24 partes de solución A + 1 parte de solución B. Prepararlo justo antes de usarlo. 13

Tejido

Material biológico Los sobrenadantes obtenidos anteriormente Material y equipo Tubos de microfuga 1 Mechero 1 tela de alambre 1 tripié 15 tubos de 16X150 13 Canicas Gradilla 1 Pipeta de 5 mL 3 Pipetas de 2 mL 1 Propipeta 1 Micropipeta de capacidad 200-1000 µL Caja de puntas para micropipeta 1000 µL 6 Celdas de plástico Vórtex Espectrofotómetro

0141 BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL Sección 6. REGULACIÓN DEL METABOLISMO Reactivo de arsenomolibdato ((NH4)6Mo7O24, Na2HAsO4 y H2SO4). Ver preparación en el apéndice.

1 2 3 4 5 6 I II III IV V VI W

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 -

2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Mezclar bien y colocar los tubos en agua en ebullición por 10 min (tapar con canicas durante la ebullición), enfriar en hielo y mezclar bien.

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2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0

Abs 520nm

4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0

Cálculo de la toma de glucosa por el tejido. a) Elaborar la curva patrón de la glucosa. • Graficar absorbancia vs contenido de glucosa en µg. • Obtener los valores de ajuste o regresión lineal de la curva. b) Determinar el contenido inicial de glucosa. Recordar que la solución KRH-Glu contenía 150 mg Glucosa/100 mL de solución y que al final de la incubación de los tejidos, se realizo una dilución de la solución. c) Glucosa incorporada en los tejidos. • Calcular el contenido de glucosa de cada uno de los sobrenadantes, utilizando los valores de regresión lineal obtenidos en el inciso a). • Calcular la diferencia entre el valor de la glucosa inicial (valor obtenido en el inciso b) y la determinada para cada muestra problema. • El resultado se divide entre el peso en gramos del tejido que se coloco en cada matraz correspondiente para obtener lo µg de glucosa transportada por gramo de tejido. d) Realizar la gráfica de toma de glucosa (µg de glucosa incorporada/ g tejido) vs concentración de insulina y añadir el resultado de insulina más wormanina. e) Interpretar los resultados.

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Cuestionario 1. 2. 3. 4. 5. 6.

¿Cuál es la función de la solución de Krebs-Ringer-Hepes en el experimento? ¿Por qué el aislamiento del tejido debe ser rápido? ¿Qué se esta removiendo al lavar el hígado con solución salina? ¿Por qué deben mantenerse en hielo los tejidos? En el sistema experimental que utilizamos, ¿qué componente representa la sangre? ¿Cuáles son los procesos celulares que se están evaluando en el tejido incubado o no con insulina? 7. ¿Cuál es el metabolito que se debe cuantificar para la determinar si la insulina tiene o no efecto en el transporte? 8. ¿Dónde se cuantifica este metabolito? 9. Describa la reacción química que utiliza para cuantificarlo. 10. ¿Cuál es el fundamento del uso de wormanina en éste trabajo? 11. ¿Qué efecto produce la wormanina en la toma de glucosa por los tejidos? 12. Elabore una gráfica comparativa del efecto de insulina en la captación de glucosa por los diferentes tejidos. 13. Analice la gráfica anterior.

Referencias • Brady MJ, Saltiel AR. 2001. Insulin and glucagon. Encyclopedia of Life Science. John Wiley & Sons, Ltd. DOI: 10.1038/npg.els.0000638 • Devlin TM. 1997. Textbook of biochemistry with clinical correlations. 4ta. Ed John Willey & Sons, INC. Biochemistry of hormones I: polypeptide hormones Pp 878-883. Localización QP514.2 • Hashiramoto M, James D. 2000. Characterization of insulin-responsive GLUT4 storage vesicles isolated from 3T3-L1 adipocytes. Molecular and cellular biology 20, 416–427. • Román-Palacios R. 1998. Regulación metabólica. Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, UNAM. • Svetlana E, 2001. Impaired muscle glycogen synthase in type 2 diabetes is associated with diminished phosphatidylinositol 3-kinase activation. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 86, 4307–4314. • Voet y JG Voet Biochemistry. Energy metabolism: Integration and organ specialization. 2da. Ed. John Willey & Sons, INC. 1995. Pp785-794.

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