Criterios de validación de cromatogramas e identificación de hemoglobinas anormales
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HEMOGLOBINA Hemoglobina A 2
Hemoglobina A
97% Hb A0
Hemoglobina F
2%
1% Hb A1 7%
90% Hb A1a
Hb A1b
0,38%
A1c>6.4% “pre-diabetic”state” - A1c >6.5% cutpoint for diagnosis
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What is A1c ? • IFCC defines A1c as the Hb that is irreversibly glycated at one or both N-terminal Valines of the beta chain
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A1c & the others
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HEMOGLOBINOPATÍAS
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Hemoglobin Disorders Distribution
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Normal & β-thalassemia Patterns
VARIANT II Dual Kit (Cat Nr. 270-2500) “Extended Program”
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What is A1c ?
• IFCC defines A1c as the Hb that is irreversibly glycated at one or both N-terminal Valines of the beta chain
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What are Hb Variants ?
• The Hb Variant has a different structure from normal Hemoglobin • Mutant forms of hemoglobin caused by variations in genetics • the genetic mutations changing a single amino acid which causes a different structure • more than 1000 documented hemoglobin variants HbVar A Database of Human Hemoglobin Variants and Thalassemias http://globin.cse.psu.edu
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Most Common Hb Variants in LA
• • • •
HbS HbC HbD HbE
Elevated HbF
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Common Variants Phenotypes Hb Variant Mutation
S C D E SC S/Bthal HbF
% in Heteroz
% in Homoz
RBC lifespan
β6 Glu→Val
AS ~30-40%
SS ~80%
Strong reduction
β6 Glu→Lys
AC ~30-50%
CC ~80%
Strong reduction
β121 Glu→Gln
AD ~30-50%
DD ~80%
Mild reduction
β26 Glu→Lys
AE ~30%
EE ~80%
none
β6 Glu→ Val β6 Glu→ Lys β6 Glu→ Val No or little β chains
α 2 γ2
--HPFH > 15% δβ-thal > 1015% β-thal > 3-5%
S ~40-45% C ~40-45% S ~ 80% F ~ 5-10%
Strong reduction Reduction
β Major F ~ 90%
Strong reduction
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Common Hemogobinopathies
Sickle Cell Disorders
Other clinically significant Hbpathies
Sickle Cell Anemia (HbSS)
Beta-Thal Major
HbSC disease
Beta-Thal Intermedia
HbS / Beta-Thal
HbH disease
HbS / D-Punjab
HbE / Beta-Thal
HbS / O-Arab
HbS / HbE
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Hb Variants and A1c measurement
• Red cell lifespan can be altered (e.g. homozygotes) • The charge of the Hb can be altered and affect certain methods • Amino acid substitution can influence glycation (e.g. Hb Raleigh, HbF)
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HPLC –Hbs Resolution J HbH, Bart’s
D Lepore
G O-Arab
Camperdown, Hope Twin peaks, Fontainebleau
E
G Philly
SHasharon C
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IE-HPLC Measurement of HbA1c HbA1c separated from HbA Correct estimation of % HbA1c
Separation of HbA from HbX, and HbA1c from HbX1c Correct estimation of % HbA1c
% A1c = HbA1c / Total HbA *100
HbA1c
Retention time
HbA Concentration
Concentration
HbA
HbA1c
HbX
HbX1c
Retention time
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HbS trait resolution Bio-Rad Variant II Dual A1c Program
HbA
HbS
Bio-Rad Variant II Dual Extended Program
HbA
HbS
HbA1c HbA1c
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Hb Variants co-eluted on A1c HbX Co-elution with HbA1c: Gross overestimation of %HbA1c
Concentration
HbX
HbX1c
HbA
Hb Camperdown heterozygote : Variant II Dual Program [β104 Arg→Ser]
HbA1c
Retention time % A1c =
↑↑ HbA1c / Total HbA *100 20
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Hb Variant interferences
HbA
HbA1c + HbX1c
HbX
Concentration
Concentration
HbA separated from HbX Overestimation of % HbA1c HbX1c elutes with HbA1c % A1c = ↑ HbA1c / Total HbA *100
Coelution of HbX and HbA HbA1c separated HbX1c Underestimation of from % HbA1c % A1c =
↓ HbA1c / Total HbA *100 HbA
HbA1c
HbX
HbX1c
Retention time Retention time 21
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Interference of Hb Variants
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VARIANT II Dual Kit (270-2500)
Short run ~3 min
Long run ~ 6 min
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Dual Kit
Easy switch from short
to extended program
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CRITERIOS DE ACEPTACIÓN VII turbo 2.0 1. 2. 3. 4. 5.
Calibración aceptada Rango de área total Control de Calidad Rango de trabajo de HbA1c Interferencias: – Hemoglobina Fetal – Hemoglobina A1c Lábil (LA1c/CHb-1) – Hemoglobina Carbamilada (LA1c/CHb-2) 6. Hemoglobina S y C 7. Intervalo de Variantes
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1. Calibración aceptada
En el inserto del set de calibración de cada lote de reactivo se indican los rangos aceptables de pendiente e intersección. Valores calculados por el equipo en el procesamiento:
EJE Y
5.5
10,2
Valores Prácticos
EJE X
5.6
10,4
Valores Teóricos
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VALORES ESPERADOS DE CALIBRADOR
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Set de Calibración
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Tiempos de Retención VII Turbo 2.0
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CRITERIOS DE ACEPTACIÓN 1. 2. 3. 4. 5.
Calibración aceptada Rango de área total Control de Calidad Rango de trabajo de HbA1c Interferencias: – Hemoglobina Fetal – Hemoglobina A1c Lábil (LA1c/CHb-1) – Hemoglobina Carbamilada (LA1c/CHb-2) 6. Hemoglobina S y C 7. Intervalo de Variantes
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RANGO DE ÁREA TOTAL • La concentración normal de hemoglobina total se corresponde con un área total de aproximadamente 2,5 millones de µvoltios x segundo.
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RANGO DE ÁREA TOTAL • El área total de cada análisis debe oscilar entre el rango establecido para cada referencia. • Si el área se encuentra fuera de este rango, los resultados no deben ser notificados.
Estuche 1
TURBO kit 2.0
Rango de área (millones de μvoltios x segundo) 1,0 – 3,5
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RANGO DE ÁREA TOTAL
• Si el área se encuentra fuera de rango, los resultados no deben ser notificados; la muestra debe PREDILUIRSE
manualmente procesarse.
O
y
CONCENTRARSE
volver
a
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RANGO DE ÁREA TOTAL • Si el área de la muestra está fuera del rango esperado, la muestra se debe prediluir (1:300) manualmente así: - 1,5 ml de solución de lavado / diluyente - 5 µ de muestra de sangre
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CRITERIOS DE ACEPTACIÓN 1. 2. 3. 4. 5.
Calibración aceptada Rango de área total Control de Calidad Rango de trabajo de HbA1c Interferencias: – Hemoglobina Fetal – Hemoglobina A1c Lábil (LA1c/CHb-1) – Hemoglobina Carbamilada (LA1c/CHb-2) 6. Hemoglobina S y C 7. Intervalo de Variantes
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CONTROL DE CALIDAD De acuerdo a los límites establecidos por el laboratorio: 1. Gráficas integradas de control de calidad 2. Valor diana 3. % ETMP
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CONTROL DE CALIDAD Herramientas: 1. Valores esperados por inserto 2. Comparación inter-laboratorios o WWR.
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CRITERIOS DE ACEPTACIÓN 1. 2. 3. 4. 5.
Calibración aceptada Rango de área total Control de Calidad Rango de trabajo de HbA1c Interferencias: – Hemoglobina Fetal – Hemoglobina A1c Lábil (LA1c/CHb-1) – Hemoglobina Carbamilada (LA1c/CHb-2) 6. Hemoglobina S y C 7. Intervalo de Variantes
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RANGO DE TRABAJO DE HbA1c “Linealidad”
Estuche TURBO KIT 2.0
Rango de Linealidad % A1c NGSP
Rango de Linealidad mmol/mol A1c IFCC
3,5 – 19,0
15 – 184
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RANGO DE TRABAJO DE HbA1c “Linealidad” • No se deben notificar los resultados fuera de este rango. • Si una muestra tiene >15% o >140 mmol/mol de HbA1c, debe contemplarse la posibilidad de que tenga una variante de hemoglobina.
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CRITERIOS DE ACEPTACIÓN 1. 2. 3. 4. 5.
Calibración aceptada Rango de área total Control de Calidad Rango de trabajo de HbA1c Interferencias: – Hemoglobina Fetal – Hemoglobina A1c Lábil (LA1c/CHb-1) – Hemoglobina Carbamilada (LA1c/CHb-2) 6. Hemoglobina S y C 7. Intervalo de Variantes