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˜ OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS

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k 2 164 667 kInt. Cl. : C07K 14/655

11 N´ umero de publicaci´on: 7

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˜ ESPANA

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A61K 51/08

TRADUCCION DE PATENTE EUROPEA

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kN´umero de solicitud europea: 93918129.3 kFecha de presentaci´on: 23.06.1993 kN´umero de publicaci´on de la solicitud: 0 649 434 kFecha de publicaci´on de la solicitud: 26.04.1995

T3

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54 T´ıtulo: P´ eptidos derivados de somatostatina marcados radiol´ ogicamente para representar en

im´ agenes y usos terap´ euticos.

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73 Titular/es: Diatide, Inc.

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72 Inventor/es: Dean, Richard T. y

30 Prioridad: 23.06.1992 US 902935

9 Delta Drive Londonderry, NH 03053, US

45 Fecha de la publicaci´ on de la menci´on BOPI:

01.03.2002

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45 Fecha de la publicaci´ on del folleto de patente:

ES 2 164 667 T3

01.03.2002

Aviso:

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Lister-James, John

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74 Agente: Lehmann Novo, Mar´ıa Isabel

En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicaci´on en el Bolet´ın europeo de patentes, de la menci´on de concesi´on de la patente europea, cualquier persona podr´a oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposici´on deber´a formularse por escrito y estar motivada; s´olo se considerar´a como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposici´ on (art. 99.1 del Convenio sobre concesi´on de Patentes Europeas). Venta de fasc´ ıculos: Oficina Espa˜ nola de Patentes y Marcas. C/Panam´ a, 1 – 28036 Madrid

ES 2 164 667 T3 DESCRIPCION P´eptidos derivados de somatostatina marcados radiol´ ogicamente para representar en im´agenes y usos terap´euticos. 5

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Campo del invento Este invento se refiere a reactivos y p´eptidos terap´euticos, a reactivos y p´eptidos para diagn´ ostico radiol´ ogico y a m´etodos para producir agentes marcados de diagn´ ostico radiol´ogico y terap´euticos radiol´ ogicos. Espec´ıficamente, el invento se refiere a derivados pept´ıdicos de, y compuestos an´alogos a, somatostatina, y a realizaciones de dichos p´eptidos marcados con tecnecio-99m (Tc-99m), as´ı como a m´etodos y a estuches para preparar, marcar radiol´ ogicamente y usar dichos p´eptidos en sitios a representar en im´ agenes en el cuerpo de un mam´ıfero. El invento se refiere tambi´en a derivados pept´ıdicos de, y compuestos an´alogos a, somatostatina, marcados con renio -186 (186 Re) y renio-188 (188 Re), y a m´etodos y estuches para preparar, marcar radiol´ ogicamente y usar dichos p´eptidos terap´euticamente en el cuerpo de un mam´ıfero. Descripci´ on de la t´ ecnica anterior

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La somatostatina es un tetradecap´eptido que es producido end´ ogenamente por el hipot´ alamo y el p´ ancreas en seres humanos y otros mam´ıferos. El p´eptido tiene la f´ ormula: F´ ormula I

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AGCKNFFWKTFTSC |——S——S—— | [Las abreviaturas de una sola letra para amino´ acidos pueden encontrarse en la obra de G. Zubay, agina 33]. Este p´eptido ejerce Biochemistry (2a ¯ edici´on), 1988 (MacMillan Publishing: Nueva York), p´ una amplia diversidad de efectos biol´ ogicos in vivo. Es conocido actuar fisiol´ ogicamente sobre el sistema nervioso central, el hipot´ alamo, el p´ ancreas y el tracto gastrointestinal. La somatostatina inhibe la liberaci´on de insulina y glucag´ on a partir del p´ ancreas, inhibe la liberaci´on de la hormona del crecimiento a partir del hipot´ alamo, y reduce las secreciones g´astricas. Por lo tanto, la somatostatina tiene aplicaciones cl´ınicas y terap´euticas para el alivio de cierto n´ umero de dolencias y enfermedades, tanto en seres humanos como en otros animales. La somatostatina nativa presenta limitada utilidad, sin embargo, debido a su corta semivida in vivo, en cuyo caso es degradada r´ apidamente por las peptidasas. Por esta raz´ on, se han desarrollado en la t´ecnica anterior compuestos an´ alogos a somatostatina que tienen una mejorada estabilidad in vivo. Freidinger, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.235.886, describe compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de hexap´eptidos c´ıclicos que son u ´ tiles en el tratamiento de cierto n´ umero de enfermedades en seres humanos. Freidinger, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.611.054, describe compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de hexap´eptidos c´ıclicos que son u ´ tiles en el tratamiento de cierto n´ umero de enfermedades en seres humanos. Nutt, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.612.366, describe compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de hexap´eptidos c´ıclicos que son u ´ tiles en el tratamiento de cierto n´ umero de enfermedades en seres humanos. Coy y colaboradores, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.853.371, describen compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de octap´eptidos sint´eticos.

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Coy y Murphy, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.871.717, describen compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de heptap´eptidos sint´eticos. Coy y Murphy, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.485.101, describen compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de dodecap´eptidos sint´eticos.

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Coy y colaboradores, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.904.642, describen compuestos an´alogos a somatostatina del tipo de octap´eptidos sint´eticos.

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ES 2 164 667 T3 Brady, en el documento de solicitud de patente europea EP-A-0.113.029, describe compuestos an´ alogos a somatostatina del tipo de hexap´eptidos dic´ıclicos que son u ´ tiles en el tratamiento de cierto n´ umero de enfermedades de seres humanos. 5

Bauer y colaboradores, en el documento EP-A-0.187.622, describen derivados de somatostatina que son u ´ tiles en el tratamiento de cierto n´ umero de enfermedades de seres humanos. Eck y Moreau, en el documento EP-A-0.389.180, describen compuestos terap´euticos an´ alogos a somatostatina del tipo de octap´eptidos.

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Abraham y colaboradores, en el documento de solicitud de patente francesa FR-A-2.336.943, describen compuestos an´ alogos a somatostatina que contienen diez amino´ acidos, en el que el enlace de disulfuro se puede reemplazar por un enlace de carba o tio´eter. 15

Bean y colaboradores, en “Peptides, Chemistry, Structure and Biology”, coordinadores de edici´ on J.E. Rivier y colaboradores, (pub. Escom, Leiden 1990) en las p´ aginas 443-445, describen una impureza del compuesto an´ alogo a somatostatina, denominada Sandostatina, en que el enlace de disulfuro se puede reemplazar por un enlace de tio´eter.

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Kolbeck y colaboradores, en el documento de solicitud de patente internacional WO-A-93/03056, describen compuestos an´alogos c´ıclicos a p´eptidos biol´ ogicamente activos, inclusive a la somatostatina, que contienen un puente de lantionina-tio´eter.

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Cox, en el documento WO-A-92/21383, describe derivados de somatostatina marcados radiol´ ogicamente, que contienen dos residuos de ciste´ına.

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La somatostatina ejerce sus efectos por fijaci´on a receptores espec´ıficos expresados en la superficie celular de c´elulas que comprenden el sistema nervioso central, el hipot´ alamo, el p´ ancreas y el tracto gastrointestinal. Se ha encontrado que estos sitios de fijaci´ on de somatostatina con alta afinidad son expresados abundantemente en la superficie celular de la mayor parte de los tumores activos endocr´ınicamente, que surgen a partir de estos tejidos. La expresi´ on de sitios de fijaci´on con alta afinidad para la somatostatina es una marcadora para estas c´elulas tumorales, y la fijaci´ on espec´ıfica con somatostatina se puede aprovechar para localizar e identificar c´elulas tumorales in vivo.

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Los m´etodos para marcar radiol´ ogicamente compuestos an´ alogos a somatostatina, que han sido modificados de manera tal que contengan un amino´ acido tirosina (Tyr o Y), se conocen en la t´ecnica anterior.

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Albert y colaboradores, en el documento de solicitud de patente brit´ anica GB-A-2.225.579, describen la representaci´on radiol´ogica en im´agenes usando derivados de somatostatina tales como el octre´otido marcado con 123 I. Bakker y colaboradores, en J. Nucl. Med. 31: 1.501-1.509 (1990), describen la yodaci´on radiactiva de un compuesto an´ alogo a somatostatina y su utilidad para detectar tumores in vivo.

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nan la utilidad de la somatostaBakker y colaboradores, en J.Nucl. Med. 32:1.184-1.189 (1991), ense˜ tina marcada radiol´ ogicamente para representar im´agenes radiol´ ogicas in vivo. De manera alternativa, se han descrito en la t´ecnica anterior m´etodos para marcar radiol´ ogicamente a la somatostatina por modificaci´ on covalente del p´eptido de modo que contenga un grupo quelante con radion´ uclidos. Albert y colaboradores, en el documento WO-A-90/06949, describen compuestos an´alogos a somatostatina que contienen disulfuro, los cuales contienen un grupo quelante unido al amino´ acido terminal en N del p´eptido.

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Albert y colaboradores, en el citado documento GB-A -2.225.579, describen la formaci´ on de im´agenes radiol´ ogicas usando derivados de somatostatina, tales como el octre´ otido marcado con 111 In a trav´es de un grupo quelante unido al extremo terminal de amino. 60

Albert y colaboradores, en el documento WO-A-91/01144 describen la formaci´on de im´agenes radiol´ ogicas usando p´eptidos marcados radiol´ ogicamente, que est´an relacionados con factores de crecimiento, hormonas, interferones y citocinas y se componen de un p´eptido de reconocimiento espec´ıfico, enlazado 3

ES 2 164 667 T3 covalentemente a un grupo quelante con radion´ uclidos. Albert y colaboradores, en el documento EP-A-0.515.313 describen p´eptidos de somatostatina que tienen agentes queladores enlazados en el extremo terminal de amino. 5

Bogden y Moreau, en el documento WO-A-92/13554, describen composiciones y m´etodos para tratar enfermedades proliferativas de la piel.

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Faglia y colaboradores, 1991, en J. Clin. Endocrinol. Metab. 73: 850-856, describen la detecci´on de receptores de somatostatina en pacientes. Kwekkeboom y colaboradores, en J. Nucl. Med. 32: 981 (1991) resumen N◦ 305, se refieren a marcar alogos a somatostatina. radiol´ ogicamente con 111 In a compuestos an´

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Albert y colaboradores, en el resumen LM10, 12th American Peptide Symposium: 1991, describen usos para compuestos an´ alogos a somatostatina derivatizados con a´cido dietilen-triamino-pentaac´etico marcados con 111In. Krenning y colaboradores, 1992, en J. Nucl. Med. 33: 652-658, describen una escintigraf´ıa cl´ınica otido. usando el [111 In][DTPA]-octre´ Estos m´etodos se pueden adaptar con facilidad para hacer posible la detecci´on de c´elulas tumorales in vivo por representaci´on en im´agenes radiol´ ogicas, bas´andose en la expresi´ on de sitios de fijaci´on con alta afinidad para somatostatina en c´elulas tumorales. Los radion´ uclidos que emiten radiaci´ on gamma de alta energ´ıa se pueden detectar con facilidad por escintigraf´ıa despu´es de su inyecci´on a un ser humano o a un animal- Se sabe que una diversidad de radion´ uclidos son u ´ tiles para formar im´agenes radiol´ ogicas, inclusive 67 Ga, 68 Ga, 99mTc (Tc-99m), 111In, 123 I o´ 125 I. La sensibilidad de los m´etodos para representar en im´agenes usando p´eptidos marcados radiol´ ogicamente es mucho mayor que las de otras t´ecnicas conocidas en el sector tecnol´ogico, puesto que la fijaci´ on espec´ıfica del p´eptido radiactivo concentra a la se˜ nal radiactiva sobre las c´elulas que interesan, por ejemplo, c´elulas tumorales. Esto es particularmente importante para tumores gastrointestinales activos endocr´ınicamente, que usualmente son peque˜ nos, crecen con lentitud y son dif´ıciles de detectar por m´etodos convencionales. La marcaci´on con tecnecio-99m (Tc-99m) es ventajosa puesto que las propiedades nucleares y radiactivas de este is´ otopo lo convierten en un ideal agente para la representaci´ on escintigr´ afica en im´agenes. El Tc-99m tiene una energ´ıa de un u ´ nico fot´ on de 140 keV y una semivida radiactiva de aproximadamente 6 horas, y est´ a disponible con uclidos tienen semividas efectivas que son facilidad a partir de un generador de 99 Mo-99m Tc. Otros radion´ oxicos (por ejemplo, mucho m´ as largas (por ejemplo, el 111In, que tiene una semivida de 60-70 h), o son t´ 125 I). Aunque el Tc-99m es un ideal reactivo para marcaci´ on radiol´ogica, no ha sido ampliamente usado el en el sector tecnol´ogico antes del presente invento [v´ease, por ejemplo, Lamberts, en J. Nucl. Med. 32: 1.189-1.191 (1991)]. La somatostatina y los compuestos an´alogos a somatostatina marcados radiol´ogicamente se pueden tambi´en usar terap´euticamente. Para estas aplicaciones, son particularmente ventajosos los is´ otopos de renio 186Re y 188 Re.

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Taylor y colaboradores, en la patente de los EE.UU. N◦ 5.073.541, describen un m´etodo para tratar un c´ ancer de pulm´ on de c´elulas peque˜ nas. Coy y Murphy, en el documento WO-A-91/09056, describen compuestos an´ alogos a somatostatina para usos terap´euticos. Schally y colaboradores, en el documento EP-A -0.450.480, describen p´eptidos c´ıclicos para uso terap´eutico.

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otido Bomanji y colaboradores, 1992, en J. Nucl. Med. 33: 1.121-1.124 describen el uso de un octre´ yodado (Tyr -3) para representar en im´ agenes tumores carcinoides metast´asicos. El uso de agentes quelantes para marcar radiol´ogicamente a prote´ınas es conocido en la t´ecnica anterior, y se describen m´etodos para marcar p´eptidos con Tc-99m en la patente de los EE.UU. N◦ 5.225.180 y en los documentos WO-A-92/13527, WO-A-93/10747, WO-A-93/17719, WO -A-93/21692 y WO-A93/23085.

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ES 2 164 667 T3 Fritzberg, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.444.690, describe una serie de agentes quelantes con tecnecio, basados en 2,3-bis(mercapto-acetamido)-propanoato.

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nan m´etodos para producir Gansow y colaboradores, en la patente de los EE.UU. N◦ 4.472.509, ense˜ y purificar anticuerpos monoclonales conjugados con quelatos de Tc-99m. Reno y Bottino, en el documento EP-A-0.237.150, describen la marcaci´on radiol´ogica de anticuerpos con Tc -99m.

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Pak y colaboradores, en el documento WO-A-88/07382, describen un m´etodo para marcar anticuerpos con Tc-99m. nan la marcaci´ on de alb´ umina de suero humano Rhodes, en Sem. Nucl. Med. 4: 281-293 (1974), ense˜ con tecnecio-99m.

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Khaw y colaboradores, en J. Nucl. Med. 23:1.011-1.019, (1982), describen m´etodos para marcar con Tc-99m macromol´eculas biol´ogicamente activas.

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Byrne y Tolman, supra, describen un agente quelante del tipo de tiolactona bifuncional para acoplar Tc-99m a mol´eculas biol´ogicas. Cox y colaboradores, resumen, 7th International Symposium on Radiopharmacology, p´agina 16, 1991, describen el uso de compuestos an´ alogos a somatostatina, marcados con Tc-99m, 131 I y 111 In, en la localizaci´on radiol´ ogica de tumores endocrinos in vivo por escintigraf´ıa.

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M´etodos para marcar directamente somatostatina, derivados de somatostatina, compuestos an´ alogos a somatostatina o p´eptidos que se fijan al receptor de somatostatina y contienen por lo menos 2 residuos de ciste´ına que forman un disulfuro o en los que el disulfuro es reducido a la forma de sulfhidrilo, se describen en la patente de los EE.UU. N◦ 5.225.180, expedida el 6 de julio de 1993. 30

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Subsiste una necesidad en cuanto a compuestos an´ alogos a somatostatina sint´eticos (para hacer practicable la preparaci´ on rutinaria y para facilitar la aceptaci´ on reguladora) que tengan una estabilidad in vivo incrementada, que se usen terap´euticamente y como agentes escintigr´aficos cuando est´an marcados radiol´ ogicamente con Tc-99m para su uso en la representaci´on en im´agenes de tumores in vivo. Se proporcionan por este invento peque˜ nos compuestos an´ alogos a somatostatina sint´eticos que satisfacen espec´ıficamente esta necesidad. Sumario del invento

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El presente invento proporciona reactivos pept´ıdicos an´ alogos a somatostatina para aplicaciones terap´euticas y para la representaci´on escintigr´ afica en im´agenes. Espec´ıficamente, el invento proporciona reactivos pept´ıdicos para preparar agentes para la representaci´ on escintigr´ afica en im´agenes, que est´an marcados con tecnecio-99m (Tc-99m). Los agentes del invento para representaci´on escintigr´ afica en im´ agenes se componen de un p´eptido que es un compuesto an´ alogo a somatostatina, enlazado covalentemente a una unidad de fijaci´ on de Tc-99m y marcado con Tc-99m. Adem´as, el invento proporciona compuestos an´ alogos a somatostatina que son u ´ tiles terap´euticamente, estando marcados radiol´ogicamente alogos. con 186Re y 188 Re dichos compuestos an´ Los reactivos pept´ıdicos an´ alogos a somatostatina proporcionados por este invento, son p´eptidos que se fijan a receptores de somatostatina y un resto que se fija a marcas radiol´ ogicas, enlazado covalentemente con ellos, en el que dichos p´eptidos tienen la siguiente f´ ormula: R1 (CR2 )-[C(R3 R4 )]m -CO-(X1 )n A1 A2 A3 A4 (X2 )q NH-CH-X3 | | S ——————(CR7R8 ) —————————— (Cr5 R6 )p en la que R1 y R2 son independientemente H, alquilo inferior o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; R3 y R4 son cada uno independientemente H, alquilo inferior o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, o R4 es N (R10 )2 , en que cada R10 es independientemente H, alquilo inferior o una o cualquiera de los R3 ´ secuencia pept´ıdica de no m´ as que 10 amino´acidos, y m es un n´ umero entero comprendido entre 0 y 3; acido, y n y q son independientemente ya X1 y X2 son cada uno independientemente un D- o´ L -amino´ 5

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sea 0 ´o 1; A1 es D- ´o L-Phe o D- ´o L-Tyr o 2-naftil-alanina (Nal); A2 es D- ´o L-Trp; A3 es D- ´o L-Lys u homolisina (Hly), 4-amino -ciclohexil-alanina (Achxa), d-aminometil-fenil-alanina (Amf), S-(2-aminoetil) ciste´ına (Aec), S-(3-amino-propil) -ciste´ına (Apc), O-(2-amino-etil)serina (Aes), O-(3-amino -propil) serina (Aps); A4 es Thr, Ser, Val, Phe, Leu, Ile o a´cido 2-amino-isobut´ırico (Aib), a´cido 2-amino-but´ırico (Abu), norvalina (Nva) o norleucina (Nle); X3 es H, -COOR9 , -CH2 OH, CH2 COOR9 ´o -CON(R9 )2 , en que cada R9 es independientemente H, alquilo inferior lineal o c´ıclico, o un p´eptido que tiene una secuencia de amino´ acidos con no m´ as de 10 residuos; R5 y R6 son cada uno independientemente H o alquilo inferior y p es uno cualquiera entre 0, 1 o´ 2; y R7 y R8 son independientemente H, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o uno cualquiera de los R7 y R8 es -COOH o un derivado de ´este, y en que un resto quelante no est´a enlazado covalentemente a grupos funcionales que comprenden las cadenas laterales de on preferida, A1 es Phe ´o Tyr, A2 es amino´acidos de los amino´acidos A1 , A2 , A3 ´o A4 . En una realizaci´ 3 4 Trp o lo m´as preferiblemente D-Trp, A es Lys y A es Thr ´o Val. En un primer aspecto del presente invento se proporcionan reactivos pept´ıdicos marcados radiol´ ogicamente, que son compuestos an´alogos a somatostatina como aqu´ı se describen y que tienen una estabilidad in vivo incrementada en comparaci´on con la de la somatostatina nativa, y que son u ´tiles terap´euticamente para aliviar enfermedades u otras dolencias en seres humanos u otros animales. El invento proporciona tambi´en composiciones farmac´euticas que comprenden los p´eptidos del invento que se fijan a receptores de somatostatina, marcados radiol´ogicamente, en un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. Otro aspecto del presente invento proporciona reactivos para preparar agentes para la representaci´ on escintigr´afica en im´agenes, comprendiendo cada uno de los reactivos un p´eptido que es un compuesto an´ alogo a somatostatina y est´a enlazado covalentemente a un resto que se fija a Tc-99m. Una ventaja de los compuestos an´alogos a somatostatina proporcionados por este invento consiste en que el enlace de tio´eter contenido en ellos es estable en las condiciones de conjugaci´on de Tc-99m al resto que se fija a Tc-99m enlazado covalentemente. En contraste, la conjugaci´ on de Tc-99m a un resto que se fija a Tc-99m enlazado covalentemente a somatostatina nativa, o a un compuesto an´ alogo a somatostatina que tiene un enlace de disulfuro, puede dar como resultado la reducci´on del disulfuro acompa˜ nada por una p´erdida de actividad biol´ ogica. Dicha p´erdida de actividad biol´ ogica puede producirse tambi´en in vivo usando somatostatina nativa, o en cualquier compuesto an´ alogo a somatostatina que tenga un enlace de disulfuro. El presente invento no est´ a sujeto a p´erdidas similares en cuanto a la actividad biol´ogica in vivo, puesto que el enlace de tio´eter en cada uno de los compuestos an´ alogos a somatostatina del invento es un enlace covalente estable.

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Otra ventaja de los compuestos an´ alogos a somatostatina proporcionados por este invento consiste en que el enlace covalente entre el extremo terminal de amino y el resto protector de ciste´ına act´ ua protegiendo al p´eptido con respecto a la degradaci´on por exopeptidasas.

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Un primer aspecto de los reactivos proporcionados por el invento para preparar los agentes del invento para la representaci´ on escintigr´ afica en im´agenes son reactivos, cada uno de los que se compone de un p´eptido que es un compuesto an´ alogo a somatostatina que est´a enlazado covalentemente a un resto que se fija a Tc-99m que tiene la f´ormula: C(pgp)s -(aa)-C(pgp)s

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en la que (pgp)s es H o un grupo protector de tiol y (aa) es un amino´ acido. En una realizaci´ on preferida, el amino´acido es glicina.

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En una segunda realizaci´on, el invento proporciona reactivos pept´ıdicos capaces de ser marcados con Tc-99m para representar en im´ agenes sitios situados dentro del cuerpo de un mam´ıfero, comprendiendo cada uno de ellos un compuesto an´ alogo a somatostatina que est´a enlazado covalentemente a un resto que se fija a Tc-99m, que tiene la f´ ormula: II A-CZ(B)-[C(R’R”)]n -X

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en la que A es H, HOOC, H2 NOC, (p´eptido) -NHOC, (p´eptido) -OOC o´ R””; B es H, SH o´ -NHR”’, -N(R”’) - (p´eptido) o´ R””; X es SH ´o -NHR”’, -N(R”’)-(p´eptido) o´ R””; Z es H ´o R””; R’, R”, R”’ y R”” son independientemente H o alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o c´ıclico; n es 0, 1 ´o 2; y: (1) cuando B es -NHR”’ o´ -N(R”’) -(p´eptido), X ha de ser SH y n ha de ser 1 o´ 2; (2) cuando X es -NHR”’ 6

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´ -N(R”’)-(p´eptido), B ha de ser SH y n ha de ser 1 ´o 2; (3) cuando B es H o´ R””, A ha de ser HOOC, o H2 NOC, (p´eptido) -NHOC, (p´eptido)-OOC, X ha de ser SH y n ha de ser 0 o´ 1; (4) cuando A es H o´ R””, entonces cuando B es SH, X ha de ser -NHR”’ o´ -N(R”’)-(p´eptido) y cuando X es SH, B ha de ser -NHR”’ o´ -N(R”’)-(p´eptido); (5) cuando X es H ´o R””, A ha de ser HOOC, H2 NOC, (p´eptido)-NHOC, (p´eptido)-OOC y B ha de ser SH; (6) cuando Z es metilo, X ha de ser metilo, A ha de ser HOOC, H2 NOC, (p´eptido) -NHOC, (p´eptido) -OOC y B ha de ser SH y n ha de ser 0; y (7) cuando B es SH y X es SH, n no ha de ser 0; y en que el resto de tiol est´a en la forma reducida. En otra realizaci´ on, el invento proporciona reactivos pept´ıdicos capaces de ser marcados con Tc-99m para representar en im´ agenes sitios situados dentro del cuerpo de un mam´ıfero, comprendiendo cada uno de ellos un compuesto an´ alogo a somatostatina que est´a enlazado covalentemente a un resto que se fija a Tc-99m, de la f´ormula:

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[para las finalidades de este invento, los restos que se fijan a marcas radiol´ogicas que tienen esta estructura se citar´an como restos basados en ´acido picol´ınico (Pic)] o

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en que X es H o un grupo protector; (amino´ acido) es cualquier amino´acido y el resto que se fija a una marca radiol´ogica est´a enlazado covalentemente al p´eptido. Con las finalidades de este invento, los restos que se fijan a marcas radiol´ ogicas que tienen esta estructura se citar´ an como restos basados en picolil-amina (Pica) En una realizaci´ on preferida, el amino´ acido es glicina y X es un grupo protector acetamido-metilo. Todav´ıa otra realizaci´on del invento proporciona reactivos pept´ıdicos capaces de ser marcados con Tc-99m para representar en im´ agenes sitios situados dentro del cuerpo de un mam´ıfero, comprendiendo cada uno de ellos un compuesto an´ alogo a somatostatina que est´a enlazado covalentemente a un resto que se fija a Tc-99m, que es un resto que se fija a Tc-99m del tipo de bisamino-bistiol. El resto que se fija a Tc-99m del tipo de bisamino-bistiol en esta realizaci´ on del invento tiene la f´ ormula: (CR2 )a / \ NH N-A-CO-X / \ (CR2 )p (CR2 )m | | S-(pgp)s S-(pgp)s en la que cada R puede ser independientemente H, CH3 ´o C2 H5 ; cada (pgp)s puede ser independientemente un grupo protector de tiol o´ H; m, n y p son independientemente 2 ´o 3; A es alquilo inferior lineal o c´ıclico, arilo, heterociclilo, combinaciones o derivados sustituidos de ´estos; y X es un p´eptido; o

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(CR2 )a / \ NH N-A-CH(V)NHR’ / \ (CR2 )p (CR2 )m | | SH SH 7

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en la que cada R es independientemente H, CH3 ´o C2 H5 ; m, n y p son independientemente 2 o´ 3; A es alquilo inferior lineal o c´ıclico, arilo, heterociclilo, combinaciones o derivados sustituidos de ´estos; V es H ´o -CO-p´eptido; R’ es H o p´eptido; con la condici´ on de que cuando V es H, R’ es p´eptido y cuando R’ es H, V es -CO-p´eptido. Para las finalidades de este invento, los restos que se fijan a marcas radiol´ ogicas que tienen estas estructuras se citar´ an como restos “BAT”. El invento comprende tambi´en agentes para la representaci´on escintigr´afica en im´agenes, que son complejos de los reactivos pept´ıdicos del invento con Tc -99m y m´etodos para marcar radiol´ ogicamente con Tc-99m los reactivos pept´ıdicos del invento. Los complejos marcados radiol´ ogicamente proporcionados por el invento, se forman haciendo reaccionar con Tc-99m los reactivos pept´ıdicos del invento en la presencia de un agente reductor. Agentes reductores preferidos incluyen, pero no se limitan a, el ion de ditionito, el ion estannoso y el ion ferroso. Los complejos del invento se forman tambi´en marcando los reactivos pept´ıdicos del invento con Tc-99m por intercambio de ligandos de un complejo con Tc-99m previamente reducido, como aqu´ı se proporciona.

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El invento proporciona tambi´en estuches para preparar agentes para la representaci´on escintigr´ afica en im´ agenes, que son los reactivos pept´ıdicos del invento marcados radiol´ ogicamente con Tc-99m. Los estuches para marcar los reactivos pept´ıdicos del invento con Tc-99m se componen de un vial herm´eticamente cerrado que contiene una cantidad previamente determinada de un reactivo pept´ıdico del invento y una cantidad suficiente de un agente reductor para marcar el p´eptido con Tc-99m. Este invento proporciona m´etodos para preparar los reactivos pept´ıdicos del invento por s´ıntesis qu´ımica in vitro. En una realizaci´ on preferida, los p´eptidos se sintetizan por una s´ıntesis de p´eptidos en fase s´olida.

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Los agentes para la representaci´on escintigr´ afica en im´agenes, que son reactivos pept´ıdicos marcados con Tc-99m, se usan para representar en im´agenes sitios situados dentro del cuerpo de un mam´ıfero para obtener in vivo im´ agenes escintigr´aficas gamma. Estos m´etodos comprenden administrar una cantidad eficaz para diagnosticar de los reactivos pept´ıdicos del invento marcados con Tc-99m y detectar la radiaci´on gamma emitida por la marca Tc-99m localizada en el sitio dentro del cuerpo de un mam´ıfero. Este invento proporciona reactivos para preparar un agente que se fija a receptores de somatostatina marcados radiol´ogicamente, que comprende los p´eptidos del invento que se fijan a receptores de somatostatina y que est´ an enlazados covalentemente a un resto que se fija a marcas radiol´ ogicas. En una realizaci´on preferida, el reactivo es marcado radiactivamente con Tc-99m. En otra realizaci´on preferida, el reactivo es marcado radiactivamente con 186 Re ´o 188 Re. Los compuestos marcados radiol´ ogicamente del invento se pueden usar para aliviar enfermedades relacionadas con somatostatina en animales, preferiblemente seres humanos por administraci´ on al animal de una cantidad terap´euticamente eficaz de los reactivos pept´ıdicos marcados radiol´ogicamente del invento, que se fijan a somatostatina. En realizaciones preferidas, el reactivo est´ a marcado radiol´ ogicamente con 186 Re ´o 188Re. Los reactivos del invento se pueden componer tambi´en de un resto enlazador polivalente. Los restos enlazadores polivalentes del invento se componen de por lo menos 2 grupos funcionales enlazadores id´enticos capaces de enlazarse covalentemente a p´eptidos an´ alogos a somatostatina o a restos que se fijan a Tc-99m. Preferidos grupos funcionales enlazadores son aminas primarias o secundarias, grupos hidroxilo, grupos de a´cidos carbox´ılicos o grupos reactivos con tiol. En realizaciones preferidas, los restos enlazadores polivalentes se componen de bis-succinimidil-metil-´eter (BSME), a´cido 4-(2,2 -dimetilacetil)benzoico (DMBA), N-[2-(N’,N’-bis(2 -succinimido-etil)amino-etil)]-N6,N9 -bis(2-metil-2-mercapto propil)-6,9-diaza-nonanamida (BAT-BS), tris(succinimidil -etil)amina (TSEA), bis-succinimido-hexano (BSH), 4-(O -CH2 CO-Gly-Gly-CyS-amido)-acetofenona (ETAC) o un derivado de estos compuestos. Realizaciones preferidas especificas del presente invento resultar´an evidentes a partir de la siguiente descripci´on m´ as detallada de ciertas realizaciones preferidas y de las reivindicaciones. Descripci´ on detallada del invento

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El presente invento proporciona reactivos pept´ıdicos para preparar agentes para la representaci´ on en im´agenes marcadas radiol´ogicamente con el fin de representar en im´agenes sitios situados dentro del cuerpo de un mam´ıfero. Los reactivos pept´ıdicos del invento comprenden cada uno de ellos un compuesto an´ alogo a somatostatina, que est´a enlazado covalentemente a un resto que se fija a Tc-99m. 8

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La marcaci´on con Tc-99m es una ventaja del presente invento, puesto que las propiedades nucleares y radiactivas de este is´otopo lo convierten en un agente ideal de representaci´ on escintigr´ afica en im´ agenes. Este is´otopo tiene una energ´ıa de un u ´nico fot´ on de 140 keV y una semivida radiactiva de aproximadamente 6 horas, y est´ a disponible con facilidad a partir de un generador de 99 Mo -99mTc. Otros radion´ uclidos conocidos en la t´ecnica anterior tienen unas semividas efectivas que son mucho m´as largas oxicas (por ejemplo, el 125 I). (por ejemplo, el 111 In que tiene una semivida de 67,4 h) o son t´ Las realizaciones terap´euticas radiol´ ogicas del invento, por otra parte, son marcadas ventajosamente ´ tiles para el tratamiento de enfermedades relacionadas con con 186 Re ´o 188 Re. Tales realizaciones son u somatostatina u otras afecciones en animales, preferiblemente seres humanos, que incluyen, pero no se limitan a, c´ anceres y otras enfermedades caracterizadas por el crecimiento de tumores malignos o benignos que son capaces de fijar a somatostatina o compuestos an´alogos a somatostatina por la v´ıa de la expresi´on de receptores de somatostatina sobre la superficie celular de c´elulas que comprenden dichos tumores.

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En los restos que se fijan a Tc-99m y en los p´eptidos enlazados covalentemente a dichos restos que contienen un tiol enlazado covalentemente a un grupo protector de tiol [(pgp)s ], proporcionados por el invento, los grupos protectores de tiol pueden ser iguales o diferentes y pueden ser, pero no se limitan a: 20

-CH2 -arilo (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi); -CH-(arilo)2 (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi);

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-C-(arilo)3 (arilo es fenilo o fenilo sustituido con alquilo o alquiloxi); -CH2 -(4-metoxi-fenilo) -CH-(4-piridil)(fenilo)2;

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-C(CH3 )3 -9-fenil-fluorenilo; -CH2 NHCOR (R es alquilo o arilo sin sustituir o sustituido);

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-CH2 -NHCOOR (R es alquilo o arilo sin sustituir o sustituido); -CONHR (R es alquilo o arilo sin sustituir o sustituido); -CH2 -S-CH2 -fenilo.

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Los grupos protectores preferidos tienen la f´ormula -CH2 -NHCOR en que R es un alquilo inferior que tiene de 1 a 8 ´atomos de carbono, fenilo o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxilo, alcoxi inferior, carboxi o alcoxi inferior-carbonilo. El grupo protector m´ as preferido es un grupo acetamido-metilo. Cada realizaci´on del invento, que contiene un p´eptido que se fija al receptor de somatostatina, se compone de una secuencia de amino´ acidos. El t´ermino amino´ acido, como se usa en este invento, est´a destinado a incluir todos los L- y D-amino´ acidos, presentes en la naturaleza o de otros tipos. Los reactivos que comprenden p´eptidos que se fijan a receptores de somatostatina, proporcionados por el invento, incluyen pero no se limitan a los siguientes ejemplos ilustrativos de las realizaciones de p´eptidos del invento:

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CH2 CO.YWD KTCTCAcm GCAcm .amida CH2 CO.YWD KTC CH2 CO.YWD KTC.amida CH2 CO.YWD KTCTGGCM ob .amida CH2 CO.FFWD KTFC CH2 CO.FFWD KTFC.[BAM] CH2 CO.FFWD KTFC.amida CH2 CO.FWD KT.Hcy CH2 CO.FWD KTCD CH2 CO.FWD KT.Hcy.amida CH2 CO.FWD KT.Pen CH2 CO.FFWD KTFCCAcm GCAcm .amida CH2 CO.FFWD KTF.Hcy PhCH2 CHCO.YWD KTC CH2 CO.YWD KT.Hhc CH2 CO.YWD KT.Hhc.amida CH2 CO.FFWD KTF.Hhc CH2 CO.FYWD KTFC Como se usan en el presente contexto, los siguientes amino´ acidos y compuestos an´alogos a amino´ acidos se destinan a ser representados por las siguientes abreviaturas: Hcy es homociste´ına, preparada por hidr´ olisis en condiciones alcalinas de la lactona de L-homociste´ına; Hhc es homohomociste´ına; Pen es penicil-amina; Mob es el grupo protector de sulfhidrilo 4-metoxi-bencilo; Acm es el grupo protector de sulfhidrilo acetamido-metilo; [BAM] es N1 ,N4 -bis(2-mercapto-2-metil-propil)-1,4,10-triaza-decano; Aib es ´acido amino-isobut´ırico; Nal es 2-naftil-alanina; Ain es a´cido 2-amino-indanoico; Hly es homolisina; Achxa es 4 -amino-ciclohexil-alanina; Amf es 4-aminometil-fenil -alanina; Aec es S-(2-amino-etil)ciste´ına; Apc es S-(3 -amino-propil)ciste´ına; Aes es O-(2-amino-etil)serina; Aps es O-(3-amino-propil) serina; Abu es ´acido 2-amino-but´ırico; Nva es norvalina; Aca es a´cido 6-amino-caproico; y Nle es norleucina. Todos los amino´ acidos presentes en la naturaleza se representan abreviadamente usando abreviaturas cl´ asicas (que se pueden encontrar en la obra de G. Zubay, Biochemistry (2a¯ edici´on), 1988 (MacMillen Publishing: Nueva York) p´ agina 33). T(CH2 OH) representa un residuo de treoninol, en el que el grupo carboxilo del amino´ acido ha sido reducido a un alcohol primario, que se incorpora en el p´eptido usando el procedimiento de Neugebauer y colaboradores (1990, Peptides: Proceedings of the 11th American Pentide Symposium, p´ aginas 1020-21). Se entender´a tambi´en por los que poseen experiencia en el sector tecnol´ ogico que se usa en el presente contexto el convenio de representar subray´andolo un enlace covalente entre el a´tomo de azufre de cadena lateral de un residuo de ciste´ına o un derivado de ´este y un grupo protector u otro residuo. Los p´eptidos an´ alogos a somatostatina del presente invento se pueden sintetizar qu´ımicamente in vitro. Los p´eptidos del presente invento se pueden preparar ventajosamente en t´erminos generales en un aparato sintetizador de p´eptidos. Se pueden sintetizar los p´eptidos de este invento en los que el resto que se fija a marcas radiol´ ogicas es enlazado covalentemente al p´eptido durante una s´ıntesis qu´ımica in vitro, usando t´ecnicas bien conocidas por los que poseen experiencia en el sector tecnol´ogico. Dichos p´eptidos enlazados covalentemente al resto que se fija a marcas radiol´ogicas durante la s´ıntesis, son ventajosos puesto que se pueden determinar sitios espec´ıficos de enlace covalente. Los restos del invento que se fijan a marcas radiol´ ogicas se pueden introducir en los p´eptidos an´ alogos a somatostatina que se buscan durante la s´ıntesis de estos p´eptidos. Para realizaciones que comprenden ´acido picol´ınico [(Pic); p.ej., Pic-Gly-Cys(grupo protector)-], el resto que se fija a marcas radiol´ ogicas se puede sintetizar como el u ´ ltimo residuo (es decir, el terminal de amino) en la s´ıntesis. Adem´as, el resto que se fija a marcas radiol´ ogicas, que contiene ´acido picol´ınico, se puede enlazar covalentemente al grupo ε-amino de la lisina para dar, por ejemplo, αN(Fmoc)-Lys -εN[Pic-Gly-Cys(grupo protector)], que se puede incorporar en cualquier posici´on apropiada en la cadena del p´eptido. Esta secuencia es particularmente ventajosa puesto que proporciona un modo f´ acil de incorporaci´ on en el p´eptido an´ alogo a somatostatina que se busca. Similarmente, el resto que se fija a marcas radiol´ogicas, que contiene picolil-amina (Pica) [-Cys (grupo protector)-Gly-Pica] se puede preparar durante la s´ıntesis del p´eptido por inclusi´ on de la secuencia [Cys(grupo protector)-Gly-] en el extremo terminal de carboxilo de la cadena del p´eptido. Despu´es de 10

ES 2 164 667 T3 haber disociado el p´eptido a partir de la resina, el extremo terminal de carboxilo del p´eptido es activado y acoplado a picolil-amina. Esta ruta sint´etica requiere que las funcionalidades de cadenas laterales reactivas permanezcan enmascaradas (protegidas) y no reaccionen durante la conjugaci´ on de la picolil-amina. 5

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Este invento proporciona tambi´en peque˜ nos p´eptidos sint´eticos que son compuestos an´alogos a somatostatina e incorporan agentes queladores de bisamino-bistiol (BAT) que se pueden marcar con Tc-99m. Este invento proporciona la incorporaci´ on de estos agentes queladores virtualmente en cualquier posici´on en el p´eptido, a trav´es de un enlace covalente a cualquier grupo funcional apropiado del p´eptido, excepto que los restos quelantes del invento no est´an enlazados covalentemente a grupos funcionales que comprenden las cadenas laterales de amino´acidos de los amino´acidos A1 , A2 , A3 ´o A4. Para formar un complejo con tecnecio radiactivo con los reactivos de este invento, el complejo con tecnecio, preferiblemente una sal de pertecnetato Tc-99m, se hace reaccionar con el reactivo en la presencia de un agente reductor. Agentes reductores preferidos son los iones de ditionito, estannoso y ferroso; el agente reductor m´ as preferido es cloruro estannoso. Los medios para preparar dichos complejos se proporcionan convenientemente en una forma de estuche que comprende un vial cerrado herm´eticamente que contiene una cantidad previamente determinada de un reactivo del invento que se ha de marcar y una cantidad suficiente del agente reductor para marcar el reactivo con Tc-99m. Alternativamente, el complejo se puede formar haciendo reaccionar un reactivo de este invento con un complejo inestable previamente formado de tecnecio y otro compuesto conocido como un ligando de transferencia. Este procedimiento es conocido como de intercambio de ligandos y es bien conocido por los expertos en el sector tecnol´ogico. El complejo inestable se puede formar usando ligandos de transferencia tales como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo. Entre las sales de pertecnetatos Tc-99m u ´tiles con el presente invento, se incluyen las sales de metales alcalinos tales como la sal de sodio o las sales de amonio o las sales de alquil inferior-amonio. En una realizaci´ on preferida del invento, se proporciona un estuche para preparar p´eptidos marcados con tecnecio. Una cantidad apropiada del reactivo pept´ıdico se introduce en un vial que contiene un agente reductor, tal como cloruro estannoso, en una cantidad suficiente para marcar el p´ eptido con Tc-99m. Se puede incluir tambi´en una cantidad apropiada de un ligando de transferencia como se ha descrito (tal como tartrato, citrato, gluconato o manitol, por ejemplo). El estuche puede contener tambi´en materiales adjuntos farmac´euticos convencionales, tales como, por ejemplo, sales farmac´euticamente aceptables para ajustar la presi´ on osm´otica, tampones, conservantes y similares. Los componentes del estuche pueden estar en una forma l´ıquida, congelada o seca. En una realizaci´ on preferida, los componentes del estuche se proporcionan en forma liofilizada. Los reactivos para la representaci´on en im´agenes, marcados radiol´ogicamente, de acuerdo con el presente invento, se pueden preparar por la adici´on de una cantidad apropiada de Tc-99m o de un complejo con Tc-99m dentro de los viales y en las condiciones de reacci´on que se describen en el Ejemplo 2 presentado seguidamente. Se proporcionan agentes para la representaci´ on escintigr´ afica en im´ agenes, marcados radiol´ogicamente, proporcionados por el presente invento, que tienen una cantidad apropiada de radiactividad. Para formar complejos radiactivos con Tc-99m, se prefiere generalmente formar complejos radiactivos en soluciones que contienen la radiactividad en concentraciones de desde aproximadamente 0,01 milicurios (mCi) hasta 100 mCi por ml. Los reactivos para la representaci´on en im´agenes proporcionados por el presente invento, se pueden usar para visualizar o´rganos, tales como un ri˜ no´n, para diagnosticar trastornos en estos ´organos, y tambi´en se pueden representar en im´agenes tumores, en particular tumores gastrointestinales, mielomas, carcinomas de pulm´ on de c´elulas peque˜ nas u otros APUDomas, tumores endocrinos tales como carcinomas de tiroides medulares y tumores de la pituitaria, tumores cerebrales, tales como meningiomas y astrocitomas, y tumores de la pr´ ostata, de mama, de colon y ovarios. De acuerdo con este invento, los reactivos pept´ıdicos marcados con Tc-99m se administran en una dosis inyectable unitaria u ´nica. Los reactivos pept´ıdicos marcados con Tc-99m, proporcionados por el invento, se pueden administrar por v´ıa intravenosa en cualquier medio convencional para inyecci´ on intravenosa, tal como un medio salino acuoso, o en un medio de plasma sangu´ıneo. En t´erminos generales, la dosis unitaria que se ha de administrar tiene una radiactividad de aproximadamente 0,01 mCi hasta aproximadamente 100 mCi, preferiblemente de 1 mCi a 20 mCi. La soluci´on que se ha de inyectar en una dosificaci´on unitaria es de aproximadamente 0,01 ml a aproximadamente 10 ml. Despu´es de administraci´on por v´ıa intravenosa, la representaci´on en im´ agenes in vivo puede tener lugar en cuesti´on de unos pocos minutos. Sin embargo, la representaci´on 11

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en im´agenes puede tener lugar, si se desea, en el transcurso de horas o incluso durante m´ as largo tiempo, despu´es de que el p´eptido marcado radiol´ ogicamente haya sido inyectado en un paciente. En la mayor parte de los casos, una cantidad suficiente de la dosis administrada se acumular´ a en la zona que se ha de representar en im´ agenes en el transcurso de aproximadamente 0,1 horas para permitir la toma de fotograf´ıas escintigr´ aficas. Cualquier m´etodo convencional de representaci´on escintigr´ afica en im´agenes para finalidades de diagn´ ostico se puede utilizar de acuerdo con este invento. Este invento proporciona tambi´en p´eptidos marcados radiol´ ogicamente con renio-186 o renio-188 que se pueden usar para la radioterapia de ciertos tumores como antes se han descrito. Para esta finalidad, se puede administrar una cantidad de is´otopos radiactivos de aproximadamente 10 mCi a aproximadamente 200 mCi por v´ıa de cualquier ruta cl´ınica apropiada, preferiblemente por inyecci´ on intravenosa. Los m´etodos para preparar y marcar estos compuestos se ilustran m´as completamente en los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos ilustran ciertos aspectos del m´etodo antes descrito y resultados ventajosos, y se muestran a modo de ilustraci´ on y no de limitaci´on. Ejemplo 1 S´ıntesis de p´ eptidos en fase s´ olida

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La s´ıntesis de p´eptidos en fase s´olida (SPPS) se llev´ o a cabo a una escala de 0,25 milimoles (mmol) usando un Aparato Sintetizador de P´eptidos de Applied Biosystems Modelo 431A y usando una protecci´on del extremo terminal de amino con 9-fluorenil-metiloxicarbonilo (Fmoc), acoplando con una mezcla de diciclohexil-carbodiimida e hidroxi -benzotriazol, o con una mezcla de hexafluorofosfato de 2 -(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio e hidroxi -benzotriazol (HBTU/HOBT), y usando una resina de p -hidroximetil-fenoximetil-poliestireno (HMP) para los ´acidos del extremo terminal de carboxilo o una resina de amida de Rink para las amidas terminales de carboxilo. Cuando era apropiado, se sintetizaron los siguientes derivados de amino´ acidos. La homociste´ına se prepar´ o por hidr´ olisis en condiciones alcalinas de la lactona de L -homociste´ına. Los residuos de treoninol, en los que el grupo carboxilo del amino´ acido ha sido reducido a un alcohol primario, se introducen en los p´eptidos del invento cuando es apropiado, usando el procedimiento de Neugebauer y colaboradores (1990, Peptides: Proceedings of the 11th American Peptide Symposium, p´ aginas 1.020-21). Se prepararon Fmoc.Hcy(Trt) y Fmoc.Pen(Trt) a partir de los apropiados amino´ acidos por tritilaci´on con trifenil-metanol en TFA, seguida por derivatizaci´ on con Fmoc, como se ha descrito por Atherton y colaboradores (1989, Solid Phase Peptide Synthesis, IRL Press: Oxford). La Fmoc.homohomo -ciste´ına(Trt) se prepar´ o reduciendo el ´ester α-met´ılico de ´acido N,N-bis-Boc-glut´amico con borano-THF, seguido por mesilaci´on y reacci´on con mercapturo de tritilo, seguido por eliminaci´on de los grupos Boc con BF3 OEt en ´acido ac´etico, y luego por derivatizaci´ on con Fmoc como antes se ha descrito. El PhCH2 CHBrCOOH se prepar´ o tratando fenil -alanina (en una soluci´ on de agua y TFA/ saturada con NaBr) con nitrato de sodio, seguido por destilaci´ on para recuperar el producto puro. Cuando era apropiado, se introdujeron grupos 2-cloro -acetilo, 2-bromo-acetilo y 2-bromo-3-fenilpropionilo, o bien usando el apropiado 2-halo-´ acido como el u ´ ltimo residuo acoplado durante la SPPS, o tratando el p´eptido de amino´acido libre en el extremo terminal de N unido a la resina o bien con una mezcla de 2-halo-´acido/diisopropil -carbodiimida/N-hidroxi-succinimida/NMP o del anh´ıdrido de 2-halo´acido/diisopropil-etil-amina/NMP. Cuando era apropiado, los p´eptidos halo-acilados en posici´on 2, purificados por HPLC, fueron ciclizados agitando una soluci´ on de 0,1-1,0 mg/ml en un tamp´on de fosfato o bicarbonato o en hidr´ oxido de amonio diluido (de pH 8,0), que opcionalmente conten´ıa 0,5-1,0 mM de EDTA, o acetonitrilo o THF durante 1-48 h, seguido opcionalmente por acidificaci´ on con a´cido ac´etico, liofilizaci´on y purificaci´ on por HPLC. Cuando era apropiado, el [BAM] (N1 ,N4 -bis(2 -mercapto-2-metil-propil)-1,4,10-triaza-decano) se conjug´ o con el p´eptido activando primeramente el carboxilato de p´eptido con una mezcla de diisopropilcarbodiimida y N-hidroxi -succinimida o de HBTU y HOBt en DMF, NMP o cloruro de metileno, seguido por acoplamiento en presencia de diisopropil-etil-amina. Despu´es de haber acoplado, los conjugados fueron desprotegidos como antes se ha descrito.

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Cuando era apropiado, se prepararon aductos con BSME haciendo reaccionar p´eptidos que conten´ıan un u ´nico tiol (de 5 a 50 mg/ml en DMF tamponado a pH 7 con N-metil -morfolina o N-etil-morfolina, 12

ES 2 164 667 T3 o un tamp´ on de fosfato de sodio 50 mM, de pH 7-8, que opcionalmente conten´ıa EDTA 0,5 mM o DMF o THF o acetonitrilo) con 0,5 equivalentes molares de BMME (bis-maleimido-metil-´eter) previamente disuelto en acetonitrilo a la temperatura ambiente durante aproximadamente 1-18 horas. La soluci´ on se concentr´o y el producto se purific´ o por HPLC. 5

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Cuando era apropiado, los aductos con TSEA se prepararon haciendo reaccionar un p´eptido que conten´ıa un u ´ nico tiol (en concentraciones de 10 a 100 mg/ml en DMF tamponado a pH 7 con N-metilmorfolina o N-etil-morfolina, o de 5 a 50 mg/ml del p´eptido en fosfato de sodio 50 mM, de pH 7-8, que opcionalmente conten´ıa 0,5 mM de EDTA o DMF o THF o acetonitrilo) con 0,33 equivalentes molares de TMEA (tris-(2-maleimido-etil)amina) previamente disuelta en acetonitrilo o DMF, con o sin 1 equivalente molar de trietanol-amina, a la temperatura ambiente durante aproximadamente 1-18 h. Dichas mezclas de reacci´on que conten´ıan aductos se concentraron y luego los aductos se purificaron usando una HPLC. Cuando era apropiado, se prepararon aductos con BAT-BS (N-[2-(N’,N’-bis(2-succinimido-etil)aminoetil)]-N6, N9 -bis(2-metil-2-mercapto-propil)-6,9-diaza-nonanamida haciendo reaccionar un p´eptido que conten´ıa un u ´ nico tiol (en concentraciones de 2 a 50 mg/ml de p´eptido en DMF tamponada a pH 7 con N-metil-morfolina o N-etil-morfolina, o en fosfato de sodio 50 mM (de pH 7-8) que opcionalmente conten´ıa 0,5 mM de EDTA o DMF o THF o acetonitrilo) con 0, 5 equivalentes molares de BAT-BM (N-[2-(N’,N’bis(2 -maleimido-etil)amino-etil)]-N9-(t-butoxicarbonil) -N6 ,N9 -bis(2-metil-2-trifenilmetiltio-propil)-6,9 diaza-nonanamida) previamente disuelta en acetonitrilo o THF, a la temperatura ambiente durante aproximadamente 1-18 h. Luego la soluci´ on se evapor´o hasta sequedad y los conjugados con [BAT-BS]-p´ eptidos se desprotegieron por tratamiento con 10 ml de TFA y 0,2 ml de trietil-silano durante 1 h. La soluci´ on se concentr´ o, los aductos del producto se precipitaron con ´eter y luego se purificaron por HPLC. Los productos fijados a resinas se disociaron rutinariamente por uso de una soluci´ on de a´cido trifluoro -ac´etico o una mezcla de ´acido trifluoro-ac´etico y cloruro de metileno, u opcionalmente una soluci´ on de a´cido trifluoro-ac´etico, agua, ticanisol, etanoditiol y trietil -silano, preparada en unas relaciones de 100:5:5:2,5:2 durante 0,5 - 3 h a la temperatura ambiente. Los p´eptidos brutos se purificaron mediante cromatograf´ıa de l´ıquido a alta presi´on (HPLC) preparativa usando una columna de Waters Delta Pak C18 y una eluci´ on en gradiente usando a´cido trifluoro-ac´etico (TFA) al 0,1 % en agua modificada con acetonitrilo. El acetonitrilo se evapor´o a partir de las fracciones eluidas que luego fueron liofilizadas. La identidad de cada producto se confirm´ o por espectroscopia de masas con bombardeo con ´atomos r´ apidos (FABMS) o por espectroscopia de masas con proyecci´on el´ectrica (ESMS). Los siguientes compuestos an´alogos a somatostatina se sintetizaron como aqu´ı se proporciona, y los productos de dicha s´ıntesis se identificaron por FABMS (los valores de MH+ puestos entre par´entesis) CH2 CO.YWD KTCAcm GCAcm .amida CH2 CO.YWD KTC CH2 CO.YWD KTC.amida CH2 CO.YWD KTCT CH2 CO.YWD KTCT(CH2 OH) CH2 CO.YWD KTCTGGCM ob.amida CH2 CO.FFWD KTFC CH2 CO.FFWD KTFC.[BAM] CH2 CO.FFWD KTFC.amida CH2 CO.FWD KTHcy CH2 CO.FWD KTCD CH2 CO.FWD KT.Hcy.amida CH2 CO.FWD KT.Pen CH2 CO.FFWD KTFCCAcm GCAcm .amida CH2 CO.FFWD KTF.Hcy PhCH2 CHCO.YWD KTC CH2 CO.YWD KTHhe CH2 CO.YWD KT.Hhe.amida CH2 CO.FFWD KTF.Hhc CH2 CO.FYWD KTFC

13

(1246) (740) (740) (841) (828) (1178) (1018) (1322) (1017) (738) (724) (737) (752) (1422) (1032) (830) (769) (768) (1046) (1033)

ES 2 164 667 T3 Ejemplo 2 Un m´etodo general para marcar radiol´ ogicamente con Tc-99m 5

10

15

20

0,1 mg de un p´eptido preparado como en el Ejemplo 1 se disolvieron en 0,1 ml de agua o una mezcla 50/50 de etanol y agua o una soluci´ on salina tamponada con fosfato o un tamp´ on de fosfato de potasio 50 mM (pH = 5, 6 ´ o 7,4). El gluceptato de TC-99m se prepar´ o reconstituyendo un vial de Glucoscan (E.I. DuPont de Nemours, Inc.) con 1,0 ml de pertecnetato de sodio Tc-99m que conten´ıa hasta 200 mCi y se dej´o reposar durante 15 minutos a la temperatura ambiente. Se a˜ nadieron luego al p´eptido 25 µ1 de gluceptato de TC-99m y se dej´ o que la reacci´on se realizase a la temperatura ambiente o a 100◦C durante 15-30 min y luego se filtr´ o a trav´es de un filtro de 0,2 µm. La pureza del p´eptido marcado con Tc-99m se determin´o por HPLC usando las siguientes condiciones: una columna anal´ıtica Waters Delta Pak RP-18, 5 µ, de 4,6 mm x 220 mm, se carg´o con cada uno de los p´eptidos marcados radiol´ ogicamente, y los p´eptidos se eluyeron a un caudal de disolvente igual a 1 ml/min. La eluci´on en gradiente se realiz´o comenzando con 100 % del disolvente A (0,1 % de CF3 COOH/H2 O) y terminando con 100 % del disolvente B90 (0,1 % de CF3 COOH y 90 % de CH3 CN/H2 O) en el curso de 10-20 min. Los componentes radiactivos se detectaron usando un detector radiom´etrico en l´ınea, empalmado con un registrador integrador. El gluceptato de Tc-99m y el pertecnetato de sodio Tc-99m se eluyen entre 1 y 4 minutos en estas condiciones, mientras que los p´eptidos marcados con Tc-99m se eluyen despu´es de un per´ıodo de tiempo much´ısimo mayor, como se ilustra en la Tabla I siguiente. TABLA I

25

30

35

P´eptidos

FABMS MH+

Rendimiento radioqu´ımico

HPLC Rt (min)

P389 P428

1422 1322

99 %∗ 99 %∗∗

15,1-16,9 18,8

CH2 COFFWD KTFCCAcm GCAcm .amida = P389 CH2 COFFWD KTFC.[BAM] = P428 ∗ Mezcla 1:1 de etanol y agua, a 100◦C

40

∗∗ Mezcla 1:1 de etanol y agua, a temperatura ambiente Ejemplo 3

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50

55

60

aticas Inhibici´ on de la fijaci´ on de [125 I-Tyr11]somatostatina -14 a membranas de c´elulas tumorales pancre´ de rata AR42J La capacidad de diversos compuestos an´alogos a somatostatina, todav´ıa no enlazados a un resto que se fija a marcas radiol´ ogicas, como se define en el invento, para fijarse a receptores de somatostatina in vitro se demostr´o analizando la capacidad de dichos compuestos an´ alogos para inhibir la fijaci´on de un compuesto an´ alogo a somatostatina marcado radiol´ogicamente a membranas de c´elulas que contienen un receptor de somatostatina. La l´ınea de c´elulas tumorales pancre´ aticas de rata AR42J que expresa el receptor de somatostatina, se cultiv´ o en un medio esencial m´ınimo de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de bovino fetal (FBS) al 10 % y glutamina 8 mM en una atm´ osfera con 5 % de CO2 humidificada a 37◦C en matraces en T. Las c´elulas cosechadas se homogeneizaron en un tamp´on fr´ıo de Tris-HCl 50 mM (de pH 7,4) y luego el material homogeneizado se centrifug´o a 39.000 g durante 10 min a 4◦ C. Los sedimentos se lavaron una vez con un tamp´ on y luego se volvieron a suspender en una soluci´ on enfriada por hielo de Tris-HCl 10 mM (de pH 7,4). Partes al´ıcuotas de esta preparaci´ on de membranas de c´elulas on final de 0,5 nM y 750.000 cpm/ml, se incubaron con [125 I-Tyr11 ] -somatostatina-14 (a una concentraci´ con una actividad espec´ıfica de 2.000 Ci/ mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) y un p´eptido a una on de HEPES 50 mM (de pH 7, 4) que conten´ıa concentraci´on final de 10−11 M a 10−6 M en una soluci´ alb´ umina de suero bovino (BSA) al 1 %, MgCl2 5 mM, Trasylol (200.000 Unidades Internacionales), bacitracina (0,02 mg/ml) y fluoruro de fenil-metil-sulfonilo (0,02 mg/ml) durante 25 min a 30◦ C. Usando 14

ES 2 164 667 T3

5

un distribuidor m´ ultiple de filtraci´ on, esta mezcla se filtr´ o a trav´es de un filtro GC/F lavado con poli -(etilen-imina) (Whatman, Maidstone, Inglaterra), y el residuo que quedaba sobre el filtro se lav´ o tres veces con 5 ml de tamp´on HEPES fr´ıo. El filtro y una muestra de los materiales lavados en el filtro se recontaron luego en un contador de part´ıculas gamma. Para averiguar la fijaci´ on inespec´ıfica, el an´ alisis se realiz´ o en la presencia de somatostatina-14 sin marcar a 200 nM. El an´ alisis de los datos, inclusive representaciones gr´aficas seg´ un Hill de los datos proporcionaron unas constantes de inhibici´ on (v´ease Bylund & Yamamura, “Methods of receptor binding” (M´etodos de fijaci´ on a receptores), en Methods in Neurotransmitter Receptor Analysis, Yamamura y colaboradores, coordinadores de edici´ on, Raven Press: Nueva York, 1990).

10

Estos resultados se presentan en la siguiente Tabla. Los datos muestran que los restos de p´eptidos del presente invento tienen una alta afinidad de fijaci´ on a receptores de somatostatina. TABLA II 15

P´eptidos

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Ki (nM)

CH2 CO.FYWD KTFC CH2 CO.FFWD KTF.Hhc CH2 CO.FFWD KTFC.amida CH2 CO.FFWD KTFC.[BAM] CH2 CO.FFWD KTFC CH2 CO.FFWD KTFCCAcm GCAcm .amida CH2 CO.FFWD KTF.Hcy

0,16 0,41 0,45 1,9 4,0 7,5 9,8

Deber´a entenderse que la descripci´on que antes se resalta ciertas realizaciones espec´ıficas del invento y que el invento abarca todas las modificaciones o alternativas equivalentes a ellas, como que se encuentran dentro del alcance del invento como se expone en las reivindicaciones anejas.

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ES 2 164 667 T3 REIVINDICACIONES

5

1. Un reactivo para preparar un agente de representaci´ on escintigr´ afica en im´agenes para representar en im´agenes sitios situados dentro del cuerpo de un mam´ıfero, que comprende un p´eptido que se fija al receptor de somatostatina y un resto que se fija a marcas radiol´ ogicas enlazado covalentemente a ´este; en que dicho p´eptido tiene la f´ ormula: R1 (CR2 )-(C(R3 R4 ))m -CO-(X1 )n A1 A2 A3 A4 (X2 )q NH-CH-X3 | | S —————(CR7R8 )———————(Cr5R6 )p

,,

10

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25

30

en la que R1 y R2 son independientemente H, alquilo inferior o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido; R3 y R4 son cada uno independientemente H, alquilo inferior o alquilo sustituido, arilo o arilo sustituido, o en que cualquiera de los R3 ´o R4 es N (R10 )2 , en que cada R10 es independientemente H, alquilo inferior o una secuencia pept´ıdica de no m´ as que 10 amino´acidos, y m es un n´ umero entero comprendido entre 0 y 3; A1 es D- ´o L-Phe o D- ´o L-Tyr o Nal; A2 es D- ´o L-Trp; A3 es D- ´o L-Lys o Hly, Achxa, Amf, Aec, Apc, Aes o Aps; A4 es Thr, Ser, Val, Phe, Ile, Abu, Nle, Leu, Nva o Aib; X1 y X2 son cada uno independientemente un D- o´ L-amino´acido, y n y q son independientemente ya sea 0 ´o 1; X3 es H, -COOR9 , -CH2 OH, -CH2 COOR9 ´o -CON(R9 )2 , en que cada R9 es independientemente H, alquilo inferior lineal o c´ıclico, o un p´eptido que tiene una secuencia de amino´acidos con no m´ as de 10 residuos; R5 y R6 son cada uno independientemente H o alquilo inferior y p es uno cualquiera entre 0, 1 o´ 2; y R7 y R8 son independientemente H, alquilo inferior o alquilo inferior sustituido, o uno cualquiera de R7 ´o R8 es -COOH o un derivado de ´este;

35

40

y en que el resto que se fija a una marca radiol´ogica no est´a enlazado covalentemente a grupos funcionales que comprenden las cadenas laterales de amino´acidos de los amino´acidos A1 , A2 , A3 ´o A4 . 2. El reactivo de la reivindicaci´ on 1, en que el p´eptido que se fija a receptores de somatostatina ofano, A3 es lisina y A4 es treonina o comprende lo siguiente: A1 es fenilalanina o tirosina, A2 es tript´ valina. 3. El reactivo de las reivindicaciones 1 ´o 2, en el que el p´eptido que se fija al receptor de somatostatina se selecciona entre el grupo que consta de:

45

CH2 CO.YWD KTC CH2 CO.YWD KTC.amida

50

CH2 CO.YWD KT.Hhc CH2 CO.YWD KT.Hhc.amida CH2 CO.FWD KTCD

55

CH2 CO.FWD KT.Hcy CH2 CO.FWD KT.Hcy.amida

60

CH2 CO.FWD KT.Pen CH2 CO.FYWD KTFC

16

ES 2 164 667 T3 CH2 CO.FFWD KTFC CH2 CO.FFWD KTFC.amida 5

CH2 CO.FFWD KTF.Hcy CH2 .CO.FFWD KTF.Hhc PhCH2 CHCO.YWD KTC

10

4. El reactivo de las reivindicaciones 1 a 3, en que el resto que se fija a marcas radiol´ogicas tiene la f´ ormula: I. C(pgp)s -(aa)-C(pgp)s

15

en la que C(pgp)s es H o un grupo protector de tiol y (aa) es cualquier amino´ acido; II. A-CZ(B)-(C(R’R”))n -X

20

en la que A es H, HOOC, H2 NOC, (p´eptido)-NHOC, (p´eptido)-OOC o´ R””; B es H, SH o´ -NHR”’, -N (R”’)-(p´eptido) o´ R””; 25

X es H, SH ´o -NHR”’, -N (R”’)-(p´eptido) o´ R””; Z es H R””;

30

R’, R”, R”’ y R”” son independientemente H o alquilo inferior de cadena lineal o ramificada o c´ıclico; n es 0, 1 ´o 2; y

35

cuando B es -NHR”’ o´ -N(R”’)-(p´eptido), X ha de ser SH y n ha de ser 1 o´ 2; cuando X es -NHR”’ o´ -N(R”’)-(p´eptido), B ha d de ser 1 o´ 2;

40

cuando B es H o´ R””, A ha de ser HOOC, H2 NOC, (p´eptido)-NHOC, (p´eptido)-OOC, X ha de ser SH y n ha de ser 0 o´ 1; cuando A es H o´ R””, entonces cuando B es SH, X ha de ser -NHR”’ o´ -N(R”’)-(p´eptido) y cuando X es SH, B ha de ser -NHR”’ o´ -N(R”’)-(p´eptido);

45

cuando X es H ´o R””, A ha de ser HOOC, H2 NOC, (p´eptido)-NHOC, (p´eptido)-OOC y B ha de ser SH; cuando Z es metilo, X ha de ser metilo, A ha de ser HOOC, H2 NOC, (p´eptido)-NHOC, (p´eptido)OOC, B ha de ser SH y n ha de ser 0;

50

cuando B es SH y X es SH, n no ha de ser 0; y en que el resto de tiol est´ a en la forma reducida;

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17

ES 2 164 667 T3

5

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en que X = H o un grupo protector; (amino´ acido) cualquier amino´acido;



25

(CR2 )n

NH | (CR2 )m | S-(pgp)6

30

QQ

N-A-CO-p´eptido | (CR2 )p | S-(pgp)6

en que cada R es independientemente H, CH3 ´o C2 H5 ; cada (pgp)s es independientemente un grupo protector de tiol o H; m, n y p son independientemente 2 o´ 3;

35

A = alquilo inferior lineal o c´ıclico, arilo, heterociclilo, o combinaciones de estos radicales; o

 NH

(CR2 )n

40

| (CR2 )m | SH

45

QQ N-A-CH(V)NHR’ | (CR2 )p | SH

en que cada R es independientemente H, CH3 ´o C2 H5 ; 50

m, n y p son independientemente 2 o´ 3; A = alquilo inferior lineal o c´ıclico, arilo, heterociclilo, o combinaciones de estos radicales; V = H o -CO-p´eptido;

55

R’ = H o p´eptido; y en que cuando V = H, R’ = p´eptido y cuando R’ = H, V = -CO-p´eptido;

60

en que el resto que se fija a marcas radiol´ogicas es capaz de formar un complejo con tecnecio-99m. 5. El reactivo de la reivindicaci´ on 4, en el que o bien: 18

ES 2 164 667 T3 (a) la ciste´ına del resto que se fija a marcas radiol´ ogicas que tiene la f´ormula I tiene un grupo protector de la f´ ormula: -CH2 ,-NH-CO-R 5

en la que R es un alquilo inferior que tiene de 1 a 6 a´tomos de carbono, 2-, 3- o´ 4-piridilo, fenilo o fenilo sustituido con alquilo inferior, hidroxi, alcoxi inferior, carboxi o alcoxi inferior-carbonilo; o 10

15

20

ormula: (b) el resto que se fija a marcas radiol´ogicas C(pgp)s -(aa)-C(pgp)s tiene la f´ CH2 -S-CH2 NHCOCH3 | -HN-CH-CO-NH-CH2 -CO-NH-CH-CO| CH2 -S-CH2 NHCOCH3 6. El reactivo de las reivindicaciones 4 ´o 5, seleccionado entre el grupo que consta de reactivos que tienen las f´ ormulas: CH2 CO.YWD KTCTGGCM ob.amida CH2 CO.YWD KTCTCAcm GCAcm .amida

25

CH2 CO.FFWD KTFC.[BAM] CH2 CO.FFWD KTFCCAcm GCAcm .amida 30

7. Un reactivo para preparar un agente multim´erico para la representaci´on escintigr´ afica en im´agenes, que comprende: (a) una multiplicidad de reactivos como se han definido en las reivindicaciones 1 a 6; y

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45

(b) un resto enlazador polivalente que est´ a enlazado covalentemente a cada uno de los p´eptidos y a cada uno de los restos que se fijan a marcas radiol´ ogicas de cada reactivo, en que el agente de representaci´on escintigr´ afica en im´agenes tiene un peso molecular menor que aproximadamente 20.000 Dalton. 8. El reactivo de la reivindicaci´ on 7, en el que el resto de enlace polivalente es bis-succinimidil-metil´eter, ´acido 4-(2,2-dimetil-acetil)benzoico,N-(2-(N’,N’-bis(2 -succinimido-etil) amino-etil))-N6,N9 -bis-(2metil-2 -mercapto-propil)-6,9-diaza-nonanamida, tris(succinimidil-etil)amina o un derivado de estos compuestos. 9. El reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el reactivo est´ a marcado radiol´ ogicamente con tecnecio-99m, renio-186 o renio-188. 10. El reactivo de la reivindicaci´ on 9, en el que dicho reactivo es un complejo del reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con tecnecio-99m, renio-186 o renio-188.

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11. Un m´etodo para preparar el reactivo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en que el p´eptido que se fija al receptor de somatostatina se sintetiza qu´ımicamente in vitro, opcionalmente por una s´ıntesis de p´eptidos en fase s´olida. 12. Un m´etodo para marcar el reactivo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende hacer reaccionar el reactivo con tecnecio-99m, o renio-186 o renio-188, en la presencia de un agente reductor, opcionalmente un ion de ditionito, un ion estannoso o un ion ferroso. 13. Una composici´on farmac´eutica que comprende el reactivo de la reivindicaci´ on 9 o´ 10, en que el p´eptido es un veh´ıculo farmac´euticamente aceptable. 14. Un estuche para producir una preparaci´ on farmac´eutica radiol´ ogica, comprendiendo dicho estuche un vial cerrado herm´eticamente que contiene una cantidad predeterminada de un reactivo de una 19

ES 2 164 667 T3 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y una cantidad suficiente de un agente reductor para marcar con tecnecio-99m al reactivo o al agente para la representaci´on en im´agenes.

5

15. Uso de un reactivo marcado radiol´ ogicamente de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o del reactivo de las reivindicaciones 9 ´o 10, en la producci´ on de un medicamento para representar en im´ agenes un sitio situado en el cuerpo de un mam´ıfero.

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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposici´ on Transitoria del RD 2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicaci´ on del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a Espa˜ na y solicitadas antes del 7-10-1992, no producir´ an ning´ un efecto en Espa˜ na en la medida en que confieran protecci´ on a productos qu´ımicos y farmac´euticos como tales. Esta informaci´ on no prejuzga que la patente est´e o no inclu´ıda en la mencionada reserva.

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