A MOLECULAR KNIFE TO DICE DEPRESSION

GARA VERÓNICA MOLINA MENDOZA SOFÍA NAVARRO GARCÍA

INTRODUCCIÓN Un tema preocupante en la actualidad es la cantidad de estrés sufrido por las personas, así como la cantidad de problemas derivados del mismo. El estrés y distintas adversidades de la vida cotidiana son capaces de alterar el equilibrio psíquico de nuestras mentes pero, incluso bajo las mismas circunstancias, hay personas que acaban sufriendo depresión y otras, más resilientes, son capaces de mediar con estas circunstancias. Tras más de 40 décadas de investigación las bases moleculares de este fenómeno son todavía casi desconocidas, pero algunos autores han intentado profundizar en ellas, como Dias et al. (2014) que han descrito la relación entre la resiliencia y la función de la β-catenina en el control genético de la enzima Dicer1, la cual es sumamente importante en la generación de microRNAs, que en última instancia, intervendrían en el control de expresión de algunas proteínas. En este resumen científico vamos a centrarnos en el papel de la β-catenina que, a nivel funcional, controla la plasticidad de la sinapsis neuronal y la regulación de moléculas implicadas en la depresión. A nivel molecular, esta proteína tiene varias funciones. Originalmente se describió como un componente del complejo de adhesión celular (plasticidad neuronal), pero actualmente se sabe que también lleva a cabo una función nuclear como transductor de señales, transmitiendo información de Wnts (molécula de señalización extracelular) al núcleo para regular la expresión de ciertos genes. Esta última función está involucrada en comportamientos de resiliencia. Hay distintos genes regulados por β-catenina, uno de los más importantes es Dicer1, que codifica para una enzima (del mismo nombre) esencial para la generación de varios pequeños RNAs reguladores, es decir, RNAs que controlan la producción de proteínas. Dias et al (2014) proponen un modelo donde estos pequeños RNA (miRNA en particular), dependientes de regulación por β-catenina, son la base de la resiliencia al estrés. Teniendo en cuenta que cada miRNA puede llegar a regular la producción de cientos de proteínas. En última instancia esta posible relación entre la β-catenina y los miRNA significaría que βcatenina podría controlar la sobreexpresión de proteínas anti-resiliencia. A pesar de esta afirmación Dicer1 es necesaria para la expresión de la mayoría de miRNA, de los cuales la β-catenina tiene un efecto sólido sólo en unos pocos. Esto deja ver que otras dianas de Dicer1 pueden estar involucradas en resiliencia, ya que es responsable en la producción de otros pequeños RNA, como RNAs de interferencia, los cuales intervienen en otros procesos. Incluso si los miRNA fueran los efectores más relevantes, discernir cuales son exactamente entre los más de 1000 existentes, es una tarea difícil. Pero teniendo estos conocimientos, ahora es necesario descubrir la importancia de la regulación de los pequeños RNAs en neuropsiquiatría, de forma que en un futuro, estimular la expresión de RNAs podría ser una estrategia viable para prever que el estrés altere nuestro equilibrio mental.

Figura 1. Interruptor de resiliencia. a, una neurona de un individuo con depresión. Como consecuencia la βcatenina permanece en el citoplasma en estas células, incapaz de entrar en el núcleo y por ello el gen Dicer1 permanece inactivo, lo que a su vez conduce a que se produzcan las proteínas “anti-resiliencia” a partir de un mRNA que de otra manera habría sido inhibido por miRNAs generados por la proteína Dicer1. b, una neurona de un individuo resiliente, la β-catenina entra al núcleo, donde activa la transcripción de Dicer1. La proteína Dicer1 es sintetizada y cuando se encuentra en altos niveles incrementa la producción de miRNA y de otros efectores de resiliencia. Estos miRNAs se unen a los mRNAs de proteínas “anti-resilencia” inhibiendo así la síntesis de estas.

RESULTADOS En este apartado vamos a tratar los experimentos que llevó a cabo Dias y su equipo (2014), para llegar a las distintas conclusiones que permiten afirmar el papel de la β-catenina en la depresión. Creemos preciso explicar los modelos de ratones que usaron, ya que este equipo trabajó con modelos de ratones, aunque también tuvieron acceso a cerebros de humanos que habían sufrido depresión cuando estaban vivos. En primer lugar vamos a explicar dos de los modelos de ratón preestablecidos de depresión que se utilizan: 1. Estrés crónico social por derrota (CSDS), donde ratones macho son expuestos a derrotas repetidas en distintos encuentros con ratones físicamente superiores, lo cual deja secuelas psicológicas que llevan a estos ratones a manifestar comportamiento depresivo, en este estudio se tiene en cuenta principalmente el comportamiento de aislamiento social. 2. Estrés acelerado por derrota (ASD), podemos considerarlo una variante del anterior, la única diferencia es que este toma sólo 4 días (en lugar de 10), pero sigue siendo válido debido a que coincide con la máxima expresión transgénica (que explicamos a continuación).

En segundo lugar tenemos que abordar la manera que tuvo el equipo de modular la expresión del gen de β--catenina, que fue en muchos casos mediante transgénesis, usando como vector el virus del herpes simplex (HSV) y teniendo dos tipos: 1. HSV-cre: tiene como efecto el knock-out del gen de β--catenina, de forma que permite generar ratones donde no se exprese en una región específica del cerebro (NAc, explicada en el siguiente apartado). 2. HSV-GFP: en principio no tendría que tener ningún efecto sobre la expresión de β-catenina, sirve de control ya que así ambos ratones han sufrido transgénesis y los efectos que se puedan observar en el otro ratón distintos a este no podrán ser relacionados a la transgénesis como tal. Y en tercer y último lugar, es conveniente resaltar que la región específica donde estos autores trabajaron fue el “nucleus accumbens” (NAc), que se sabe que está involucrado en la depresión, y por consiguiente, como demuestran los experimentos que vamos a relatar, en la resiliencia de la misma. Investigaciones más profundas revelaron que la acción de la β­catenina en el proceso de resiliencia tienen lugar en un único tipo de neurona en el NAc, espinosas medias de tipo D2, las cuales están inactivas en los ratones depresivos, pero activas en aquellos que muestran resiliencia. 1. β-catenina como mediadora de las respuestas de resiliencia y ansiolíticas 1.1. Sobreexpresión de β-catenina y sus efectos. Se sobrexpresó β-catenina en NAc, para poder comprobar que aumentaba nuclearmente, pero no afectaba a la expresión del complejo N-cadherina/β-catenina (implicado en adhesión). Esto permite cerciorarnos de que con nuestra transgénesis únicamente afectamos a la función transcripcional y no a la de sinapsis. Seguidamente sobrexpresaron β-catenina en NAc durante ASD, demostrándose que los animales control desarrollaban aislamiento social, mientras que aquellos que sobrexpresaban la β-catenina no presentaban este fenotipo (Fig. 2).

Fig. 2. Gráfico comparativo de la cepa HSV-GFP, usada como control, y HSV-β-catenina, que sobrexpresa la proteína. En ambos se ha estudiado el tiempo que permanecen los individuos deprimidos y no deprimidos en la zona de interacción social durante el ASD. En la cepa HSV-GFP, los individuos deprimidos aguantan menos que aquellos no afectados. En cambio, de la cepa HSV-β-catenina, los individuos deprimidos aguantan el mismo tiempo que aquellos no afectados puesto que la sobrexpresión de la β-catenina los hace resilientes.

1.2. Bloquear β-catenina y sus efectos. También probaron lo contrario, es decir, bloquear la señalización de la β-catenina del NAc utilizando dos métodos, tanto un knock-out como un mutante de β-catenina negativo. En ambos se observa comportamiento depresivo en ratones que han experimentado una dosis de estrés por debajo del umbral. Además se comprobó que la excisión de β-catenina no causó cambios en las interacciones sociales (normales, sin inducir estrés) o el control locomotor en animales, demostrando una asociación específica con estrés. Estos resultados establecieron un papel crítico de la señalización de la β-catenina en NAc en la resiliencia comportamental. 1.3.Actividad nuclear de β-catenina, estudiando tanto mRNA como TF. Por último, para explorar la actividad endógena de la β-catenina en la depresión, examinaron su actividad transcripcional en el NAc post-mortem de humanos depresivos (Fig.3). Para llevarlo a cabo se tuvo en cuenta Axin2, un indicador de la señalización activa de β-catenina, que se encontraba, como era de esperar, fuertemente suprimida. Lo que observaron, que da lugar a interesantes conclusiones, fueron unos niveles totales inalterados de mRNAs de Ncadherina y β-catenina, además de supresión de factores de transcripción (en concreto Tcf3 y Tcf4) que son unos de los muchos a través de los que actúa β-catenina. Juntos, estos datos demuestran la disminución de transcritos regulados por la b-catenina en el NAc de humanos depresivos. Esto hace suponer que es la función nuclear de la β-catenina lo que está alterado en la depresión. Teniendo en cuenta los anteriores hallazgos, investigaron los niveles de mRNA de Axin2 en el NAc de ratones 48 horas después de inducirles CSDS y no observaron diferencia entre animales resilientes y susceptibles. Sin embargo, los animales resilientes muestran incrementos de Tcf3 y Tcf4, indicando que la resiliencia podría asociarse con un incremento de la señalización de la β-catenina (Fig 4).

Fig 3. Gráfico que representa la proporción normalizada de mRNA correspondiente a cada proteína que se encontró en humanos control y en humanos deprimidos en un estudio post-mortem del NAc. Observamos que β-catenina y las proteínas relacionadas con su ruta de actuación (Axin2, Tcf 3 y Tcf4) se han encontrado en menor cantidad en animales deprimidos debido a que en la depresión se altera la función de la β-catenina.

Fig 4. Gráfico que representa la proporción normalizada de mRNA correspondiente a cada proteína que se encontró en animales control, susceptibles y resilientes. Los ratones susceptibles muestran niveles transcripcionales de los diversos componentes muy parecidos a los del control. En cambio, en ratones resilientes, se observan niveles superiores de Tcf3 y Tcf4 con respecto al control.

2. Mapeo genético, unión de la proteína β-catenina al DNA y sus consecuencias Los investigadores llevaron a cabo mapeo genético de β-catenina en NAc después de inducir CSDS, utilizando las técnicas de inmunoprecipitación cuantitativa de cromatina (qChIP) y PCR cuantitativa (qPCR), comparando tanto ratones susceptibles y controles como resilientes de sufrir estrés, y comparando el número de picos. El enriquecimiento de β-catenina en animales resilientes ocurrió únicamente en sitios activos transcripcionalmente, como pudieron observar por la unión basal de dos marcas transcripcionales H3K4me3 y H4K16ac (ambas son modificaciones en las histonas, la primera es una metilación en la histona 3 y la segunda es una acetilación en la histona 4), pero no se observaron cambios globales en estos marcadores después del CSDS, lo cual nos lleva a sugerir que la β-catenina activa directamente factores de transcripción que se unen al DNA, es decir, que la cromatina ha sido “abierta” por otros factores o proteínas. Además observaron los picos de uniones de la β-catenina en los genomas de tres tipos de ratones (Fig. 5). En individuos resilientes, en comparación con el control, se redistribuye la proteína aumentando su unión tanto a promotores como a secuencias génicas, mientras que en los susceptibles sucede lo opuesto, se redistribuye desde promotores y secuencias génicas a desiertos génicos. Estos resultados también apoyan la teoría de que la resiliencia está asociada a un enriquecimiento de β-catenina unida al genoma.

Fig 5. Gráfico circular que representa en qué zonas del genoma está unida β-catenina.

3. Regulación de DICER1 y miRNAs por la β-catenina 3.1β-catenina y su implicación en la expresión de Dicer1 Un gen validado por inmunoprecipitación cuantitativa de cromatina (qChIP) y PCR cuantitativa (qPCR) fue Dicer1, el cual, como ya hemos visto, es esencial para la biogénesis de miRNA. Se puede observar (Fig 6) las diferencias al enriquecer con β-catenina entre los tres tipos de ratones, siendo muy importante la diferencia entre control y resiliente, ya que vemos que en el ratón resiliente hay una gran cantidad de β-catenina unida al DNA, además tanto antes del TSS (sitio de comienzo de la transcripción), como después. Mientras que el control, tiene dos picos mucho más reducidos muy cerca del TSS (una justo ante sy otro justo detrás), así como el susceptible tiene también un pico de tamaño pequeño alejado del TSS. No podemos saber

qué significa cada uno de estos picos, ya que no tenemos un extenso conocimiento de Dicer1, pero sí podemos afirmar es que hay un vínculo importante entre la unión de β-catenina a DNA y un aumento de la transcripción de Dicer1 (Fig 7). Juntas ambas nos indican que Dicer1 representa una diana fuerte de β-catenina en NAc, ya que el control es el menor de los tres (cuando no hay estrés), y la susceptible y la resiliente son ambas mayores que ella, cuando ya ha habido estrés, y dentro de las dos, la resiliente es la más alta, ya que es donde se produce una mejor respuesta “anti-estrés”.

Fig 6. Gráfico que muestra el enriquecimiento de β-catenina en ChIP-seq para Dicer1 alrededor de TSS.

Fig 7. Validación de ChIP-seq para Dicer1. Podemos apreciar como en ratones resilientes hay mayor expresión de Dicer1 con respecto a los demás mientras que los niveles de transcripción, varían muy poco unos de otros.

3.2. Reducción de Dicer1 y sus efectos. Una vez corroboraron la relación entre β-catenina y Dicer1, pasaron a estudiar los posibles efectos que este último podía tener en el comportamiento. Para ello, redujeron su expresión mediante un knock-out y expusieron a esos ratones a derrotas, pero por debajo del umbral a partir del cual esperaríamos comportamientos depresivos. Los animales control exhibieron interacción social normal, a diferencia de los animales knock-out que mostraron aislamiento social (Fig 8), lo cual imita los efectos de bloquear directamente la señalización de β-catenina. Para corroborar esto, hicieron otro experimento muy similar, también con un ratón control y otro knock-out en Dicer1, y además inyectaron a todos ambos grupos HSV-β-catenina, para asegurarse de que los posibles comportamientos distintos estaban generados si o si por la ausencia de Dicer1 y no por una posible falta de β-catenina que no tuviesen controlada. Después les hicieron experimentar ASD y se observó aislamiento social en los knock-out (como era de esperar). Este experimento se realizó similar a los otros, calificando si había aislamiento social o no en función del tiempo que interaccionan con otros ratones cuando son expuestos a ello.

Fig 8. Gráfico comparativo del efecto que tiene el knock-down de Dicer1 sobre el comportamiento en una derrota por debajo del umbral teniendo a HSVGFP como control.

Fig 9. Gráfico que representa el tiempo de interacción social con HSV-β-catenina antes y después del ASD.

3.3. miRNA y otros pequeños RNA relacionados con la resiliencia En cuanto a los miRNA, en última instancia están regulados por factores represivos bajo el control de β-catenina, por ello mediante la deleción de β-catenina fueron capaces de identificar los miRNA (66 en concreto) que disminuyeron su expresión en NAc, también identificaron en el caso de los susceptible, muchos de los cuales coinciden con el control. Lo cual nos ayuda a corroborar la hipótesis de que las respuestas de miRNA pro-resilientes no se dan cuando la β-catenina está ausente, lo que aumenta la susceptibilidad al estrés. También analizaron los miRNA que aumentaban su expresión en ratones resilientes. Los miRNA que coinciden entre dos de los 3 grupos, es decir, que se incrementan en los resilientes o que disminuyen en control y susceptibles, son los que en teoría deberían ser más importantes biológicamente regulados por β-catenina (y estrés), ya que se observan en ambas respuestas. Por último, cabe mencionar un hallazgo importante y es que el equipo también encontró piRNA, que originalmente se pensaba que únicamente se encontraban en la línea germinal y recientemente se identificaron en el cerebro. Aproximadamente 20 parecían estar regulados por CSDS. CONCLUSIÓN La β-catenina activa una ruta en neuronas D2 del NAc que desembocan en la resiliencia comportamental, mientras los déficits en esta misma contribuyen en patologías relacionadas con la depresión. Se sabe que las neuronas D2 median comportamientos motivados por una recompensa, permitiendo un incremento de la flexibilidad comportamental, lo que en los individuos resilientes permite superar el aislamiento social que observamos en los ratones susceptibles. Esto tiene un paralelismo en humanos: los individuos resilientes tienen una mejor respuesta y recuperación al estrés . La aproximación mediante ChIP-seq de la β-catenina proporciona un recurso valioso para encontrar posibles dianas moleculares que permiten la resiliencia. Una de estas dianas es Dicer1, que establece una nueva conexión entre la señalización de la β-catenina y los miRNAs

en el cerebro. Estos miRNAs llevan a cabo un proceso de feedback sobre la β-catenina. El pequeño número de miRNAs observados se debe al papel específico de la β-catenina y a la complejidad que envuelve algunos pasos reguladores de Dicer1 y que conllevan a la susceptibilidad al estrés. Los miRNAs son cruciales en la regulación génica posttranscripcional en el desarrollo neuronal, plasticidad y aumento del número de trastornos cerebrales. Finalmente, la identificación de los miRNAs específicos asociados a resiliencia ofrecen una plantilla para estudios futuros que induzcan resiliencia en sujetos susceptibles, ya que a pesar de que actualmente disponemos de medicamentos antidepresivos, estos son efectivos sólo en dos tercios de la población con depresión. Una mejor comprensión de las rutas moleculares activas en individuos resilientes podría informarnos de estrategias de tratamiento alternativo.

BIBLIOGRAFÍA Dias, C. et al. “β-catenin mediates stress resilience through Dicer1/microRNA regulation”, Nature 516, 51–55 (2014) Schratt, G. “A molecular knife to dice depression”, Nature 516, 45-46 (2014).