c

A

p

...

I T

u

L

o

6

ACIDOS NUCLEICOS Y . SUS COMPONENTES

acidos nucleicos desempeiian varias funciones en los orde bajo peso molecular de los acidos nucleicos son i"'nplliiU):lellijeYutifu~os~ las reacciones metab6licas. Cuando forman complejos ac:t~:1O~. nucleicos de alto peso molecular proporcionan estruc\Ia~IPU.J""\,J'''. ' Sin embargo, la funci6n unica y primordial como dep6sitos y transmisores de la informaci6n que las celulas funcionen de acuerdo con pakd!at'~:nueVliS celulas que funcionen en forma similar ~IliCl~jliJe'V1l/JfI.u~~~, a los planes codificados en el acido nucleico. 'Jiit;\i ...Ah' ~r.~jia.Jtr.aj~.~w~..tFti.:.~~~! en una molecula de acido nucleico en una r(ti"'tt.uq~.a."plP.lltGl_..Jlt~_*_~. Cuatro unidades distintas constituyen cada bb~:im.l&ruIjJijJ.J":ijij~qoJ..t~""'ldll~iJ~ informaci6n. Cada una de las unidades molecula de acido nucleico es lineal ·!O!rrblBlsemejan las letras de una pagina imde computadora. Dada la mainterpretarse, de la misma manera La celula interpreta la inforcomo secuencias de amide secuencias definidas ~ ·~.n11~il~ntes

molecula de proteflas caracterfsticas simb6lica. C6mo de la parte covalentes de

231

232

Acidos nucleicos y sus componentes

ala funcion de los acidos nucleicos . La formacion de estos enlaces es especialmente importante en la transferencia de la informacion genetica durante los procesos de sfntesis de protefnas y acidos nucleicos.

6.1

COMPONENTES Y ORGANIZACION DE lOS ACiDOS NUClEICOS La unidad monomerica de una molecula de acido nuclei co es un residuo de nucleotido. El nucleotido, a su vez, tiene tres componentes facilmente reconocibles: Un azucar. Una base purfnica 0 pirimidfnica. Una fraccion esterificada de acido fosforico. El azucar es ribosa 0 desoxirribosa y divide a los acidos nucleicos en dos grupos principales. El acido ribonucleico (RNA) tiene como azucar a la D-ribosa en la configuracion de furanosa, mientras que el acido desoxirribonucleico (DNA), como su nombre 10 indica tiene el azucar D-2-desoxirribosa, tambien en la configuracion de furanosa.

{3-D-Ribofuranosa

{3-D-2-Desoxirribofuranosa

Los nombres sistematicos de las bases purfnicas y pirimidfnicas derivan de los compuestos precursores, purina y pirimidina. La adenina (6"aminopurina) y la guanina (2-amino-6-oxopurina) son las dos bases purfnicas comunes tanto del DNA como del RNA.

o

NH2

~;YNJH H~.,J-N N

H

Adenina (6-aminopurina)

HN:J=N\ H2N

I A

FH

N

N

H

Guanina (2-amino-6-oxopurina)

Las bases pirimidfnicas comunes del RNA son la citosina (2-oxo-4-aminopirimidina) y el uracilo (2,4-bis-oxopirimidina), mientras que el DNA tiene citosina y timina como pirimidinas predominantes. Muchas otras bases purfnicas y pirimidfnicas se presentan en moleculas especfficas de acido nucleico. La mayorfa de ellas son raras. Una pirimidina no tan rara es la 5-metilcitosina que constituye el 7% de las bases del DNA de algunas plantas y hasta e13% de las bases en otros DNA eucarioticos. La N-6-metiladenina se encuentra en cantidades menores en los DNA eucarioticos, en tanto que en algunos DNA procarioticos estan presentes la 5-meti1citosina

Componentes y organizaci6n de los 6cidos nucleicos

233

y la N-6-metiladenina. Asimismo, se conocen otras bases organicas menos comu-

nes, algunas de las cuales se estudian aquf. Una base purfnica 0 pirimidfnica unida a la D-ribofuranosa forma un ribonucleosido. EI enlace N-tJ-glicosfdico une el carbo no 1 de la ribosa con el nitrogeno 9 de una base purfnica 0 el nitrogeno 1 de una base pirimidfnica. Para distinguir los sistemas de numeracion de las bases y de los azucares, los atomos de carbono del azucar se indican con apostrofos: C-l', C-2', hasta C-5'. Puede considerarse que el enlace glicosfdico se ha formado por eliminacion de una molecula de agua derivada del hidroxilo hemiacetalico del azucar y el proton unido al atomo de N de la base. Los desoxinucleosidos tienen estructuras similares. Ambos tipos de nucleosidos tienen la configuracion tJ, la cual se caracteriza por tener la base y el C-5' del azucar en el mismo lado del anillo furanosido del D-azUcar.

~: I N~O H

I

H

N

N~O

H

Citosina

Pirimidina

C/ 0

Uracilo

Timina

(0 NJlN-::

HN-CH3

H

N·6-Metiladenina

OH

OH

OH

H

Guanosina

Desoxirribosi l·5-metilcitid fna

(9-{3-D·Ri bofuranosil guanina)

(1-{3-D-2-Desoxi rribofu ran osil5-metilcitosina

234

Acidos nucleicos y sus componentes

Por acuerdo, la l-/3-D-ribofuranosiltimina se denomina ribotimidina.

Ribotimidina

Desoxirribotimidina

En la tabla 6.1 se dan los nombres de algunas bases purfnicas y pirimidfnicas y sus ribonucleosidos y desoxirribonucleosidos correspondientes. Observese que el sufijo -osina no se utiliza consistentemente en esta nomenclatura aceptada y que la ribotimidina y la desoxiuridina son , raras . Un nucle6tido es un nucleosido fosfato, un nucleosido esterificado con acido fosforico. Uno 0 mas de los tres hidroxilos, 2' , 3' 0 5 ' pueden estar esterificados. Sin embargo, los nucleotidos mas comunes son los nucleosido-5' -fosfatos. En la tabla 6.2 se dan las abreviaturas comunes para los nucleosido-5' -fosfatos y los desoxinucleosido-5' -fosfatos. Los nombres alternativos para el AMP son acido adenflico 0 adenilato; los nombres alternativos para el dCMP son acido desoxicitidflico y desoxicitidilato y asf sucesivamente. Los adenosfn-2' -monofosfatos y adenosfn-3' -monofosfatos se conocen a veces como 2' -adenilato y 3' -adenilato. Sin embargo, en el caso de estos y otros nucleotidos, las abreviaturas de la tabla 6.2 se reservan para los nucleosido-5' -fosfatos. Otra designacion para e15' -adenilato es pA, mientras que el 3' -adenilato tiene la abreviatura Ap. La desoxiadenosina-5' -fosfato se abrevia como pdA. TABLA 6.1 Nombres de nucle6sidos Desoxirribo-

Base Adenina

Ribonucleosido

Srmbolo

Adenosina

A

nucleosido 2' -desoxirribosiladenina 0

Guanir.a

Guanosina

G

desoxiadenosina 2' -desoxirribosilguanina

C

desoxiguanosina 2' -desoxirribosi1citosina

U

desoxicitidina 2' -desoxirribosiluracilo

0

Citosina

Citidina

0

Uracilo

Uridina

0

Timina

Ribotimidina

rT

Srmbolo dA

dG

dC

dU

desoxiuridina 2' -desoxirribosiltimina 0

desoxitimidina

dT

Nucleosido difosfato y nucleosido trifosfato; nucleotidos dclicos

235

TABLA 6.2 Abreviaturas para los nucleosido-5' -fosfatos Base

Ribonucle6tido

Desoxirribonucle6t1do

AMP GMP CMP UMP rTMP

dAMP dGMP dCMP dUMP dTMP

Adenina Guanina Citosina Uracilo Timina

o i - O-p - O I I

0 - CH2

OH

OH

H

Timidina-5' -fosfato (dTMP)

OH

Uridina-3 ' -fosfato

0-

I

0-

O--p-O I

I I

o I

-O-p--O

0-CH2

CH2

0OH

I ! o

O-p-O-

Adenosina-2,5' -bi-fosfato

6.2

OH

OH

Guanosina-5' -fosfato (GMP)

NUCLEOSIDO DIFOSFATO Y NUCLEOSIDO TRI FOSFATO; N UCLEOTI DOS cicLiCOS Como se indico anteriormente, la nomenclatura "bi-fosfato" se refiere a un nucle6sido que tiene dos de sus grupos hidroxilo individualmente fosforilados. EI grupo hidroxilo 5' de los nucleosidos puede esterificarse tambien para formar anhfdridos fosforicos: pirofosfato y trifosfato. Estos originan, respectivamente, nucle6sido difosfatos (no hi-fosfatos) y nucleosido trifosfatos.

236

Acidos nucleicos y sus componentes

HO -

o 0 i i P-O -P -O I I 0-

0-

o i - 0- p I 0-

Pi raloslato

o-

0

0

0-

0-

ii p-o - P- OH I I

Trifoslato

El adenosin trifosfato (A TP) funciona como la moneda energetica de la celula y es con mucho el compuesto mas importante a este respecto, como se sefiala en el capitulo 9. Los fosfatos del ATP se designan como a, {3 y ,,/, como se indica.

a

o 0 i i -O-p-O-P-O I I I 0-

000

iii -o-p-o-p-o-p-o I I I I

0 - CH 2

OH

0-

0-

0- CH 2

OH

OH

Adenos(n difosfato

OH

Adenos(n trifosfato

La hidr61isis de cualquiera de los enlaces de anhidrido fosf6rico es terrnodinamicamente una reacci6n muy favorecida a un pH neutro, liberando casi mas de dos veces la energia de la reacci6n de hidr61isis de un ester de acido fosf6rico comun, como es la hidr6lisis del AMP en adenosina y fosfato inorganico. Las dos reacciones de hidr6lisis de anhidrido fosf6rico son: ATp4 ATp4-

+ H20 ~ ADp3- + HPO~ - + W + H20 ~ AMp2- + HP20 ~- + H+

En el cuerpo humano, casi 2 kg de ATP se hidrolizan por dia en estas dos reacciones, y una cantidad similar es sintetizada. La mayor parte de la hidr61isis del ATP se acopla a otras reacciones para utilizar la energia que se alrnacen6 en esta molecula energetica. El resultado es que la hidr6lisis del ATP se utiliza para' 'impulsar" otras reacciones bioquimicas que de otra manera sedan termodinamicamente desfavorables. Se desconoce aun la contribuci6n relativa de todos los factores a la energia de hidr61isis favorable del ATP. Sin embargo, la alta densidad de carga negativa del ATP respecto a sus productos de hidr61isis y la estabilizaci6n de los productos por resonancia son factores importantes en este punto (v ease tambien el capitulo 9). No obstante, el ATP es una molecula estable en soluci6n acuosa a un pH neutro y en ausencia de enzimas que 10 utilicen como sustrato. Esta es una caracteristica importante en su funci6n como moneda energetica. Los trifosfatos de todos los nuc1e6sidos y desoxinuc1e6sidos comunes tambien son importantes: son, respectivamente, los precursores para la sintesis de RNA y DNA. Se han estudiado ampliamente dos clases de fosfodiesteres cfc1icos de nucle6sidos. Los fosfodiesteres 3 ':5 -cfclicos de adenosina y guanosina son intermediarios importantes en la acci6n de algunas hormonas. Los fosfodiesteres 2 ':3 I cfc1icos de nucle6sidos son intermediarios en la hidr6lisis del RNA (vease la secci6n 6.4). I

Estructura covalente del RNA y el DNA

237

ICH, o I oC=O) y amino (-NH-). Estas form as predominan sobre las formas enol (~ C-OH) e imino (=N-), que se muestran aqui para la timid ina (estructuras a la derecha y a la izquierda) y para la guanosina (estructura de la derecha).

Tim idina

o I'j

..)<

p "~'I/

": r~ Jl ).... .' '--y/

N

H G, C Y T + C. En la pnictica, en general no es posible resolver los fragmentos de cinco residuos 0 menos, por 10 que deben determinarse mediante otros metodos. En el siguiente esquema de este recuadro se muestra la apariencia del gel bajo la suposicion de que se determinaron incluso los fragmentos mas pequeiios. En dicho esquema se observa tambien una " escalera completa", que representa los productos de las reacciones en todos los residuos de desoxirribonucle6tido, aunque dicha representacion rara vez es necesaria. La lectura de la secuencia a partir de dicho esquema es pdNGATATAAACGCTGGTCCATGGTTTAA. EI estudiante debe escribir la f6rmula de las estructuras de los oligodesoxirribonucleotidos que se esperan obtener en algunas de las zonas especfficas del gel.

A>G

G

C

T+ C

EI metodo de F. Sanger, Hamado a veces "determinacion de la secuencia con didesoxirribonucleotidos" , da un patron de zonas similar pero mas simple despues de Hevar a cabo la electroforesis de los productos de reaccion, pero los fragmentos de DNA de esas zonas se obtienen de una manera totalmente distinta. Son sintetizados enzimaticamente in vitro mediante la transcripci6n de un molde de DNA de una sola cadena, cuyo origen esta mas alia del alcance de este texto. En primer termino, el DNA de una soIa banda es hibridizado con un oligodesoxirribonucle6tido sintetico especffico (recuadro 6.F) que es complementario del DNA de una sola cadena, en el sentido de que las dos cadenas del DNA B son complementarias. EI oligodesoxirribonucle6tido sintetico, Hamado iniciador 0 "primer", se diseiia para hibridizarse (seccion 6.6) con una region del DNA de una sola cadena que es parte del extrema 3' de la porcion de la cadena polinucleotida de interes. Por 10 comun, el DNA de una sola cadena tiene de cientos a miles de nucle6tidos de longitud. Aquf solo se muestra una pequeiia porcion de dicha molecula de DNA hibridizada con un iniciador.

250

Acidos nucleicos y sus componentes

3 '--HO--TGACCGG CAGCAAAATG--5' CGATATAA ACGCTGGTCCATGGTTTAACGT CG TG AC TGGCCGTC GTTTTACACTIGAAA .. . 3'

~'

Como se menciona en el capftulo 19, cuando dicho complejo se incuba con una DNA polimerasa dependiente de DNA y con desoxirribonucle6tido trifosfatos (secci6n 6.2), los residuos de desoxinucle6tido se afiaden al extrema 3' del iniciador secuencialmente y bajo el control del molde de DNA de una sola cadena . EI resultado sera la sfntesis de una copia comp1ementllria 0 "transcripcion".

5' .

GCTATATTTGCGACCAGGTACCAAATTGCAGCACTGACCGGCAGCAAAATG--5' CGATATAAACGCTGGTCCATGGTTT AACGTCGTGACTGGCCGTCGTTTT AC A CTIGAAA . . . 3'

Si a dicha reacci6n se afiade un desoxirribonucle6sido trifosfato con un residuo de azucar modificado, como la didesoxiguanosina trifosfato, la cadena terminara en el punto donde un residuo de didesoxiguanilato sustituya a un residuo de desoxiguanilato debido a que el primero carece de un grupo 3 ' -hidroxilo para participar en el siguiente enlace fosfodiester.

0-

I I o I - O-p---O I o I -O - P---O I

-O-p---O

O--CHy O

H

H

Didesoxiguanosina trifosfato

De esta forma, algunas de las transcripciones seran terminadas prematuramente, pero s610 en los sitios de inserci6n de los residuos de desoxiguanilato, es decir, los sitios de los residuos de desoxicitidilato en el molde de DNA de una sola cadena. Al balancear la proporci6n de la didesoxiguanosina trifosfato con la desoxiguanosina trifosfato existentes en la mezcla de reacci6n, el investigador puede controlar la longitud promedio de las copias terminadas prematuramente. Esto corresponde a ajustar las condiciones de rompimiento qufmico en la reacci6n de Maxam y Gilbert para lograr el nivel apropiado de reacci6n parcial. En el procedimiento de determinaci6n de la secuencia de didesoxirribonucle6tidos de Sanger, cuatro reacciones de transcripci6n separadas se inician simultaneamente, cada una con el didesoxinucle6sido trifosfato derivado de desoxiadenosina, desoxicitidina, desoxiguanosina y desoxitimidina. Todas las mezclas de reacci6n tienen tambien las cuatro desoxinucle6sido trifosfatos, uno de ell os marcado con fosfato radiactivo para permitir que las copias puedan detectarse mediante autorradiografia posterior a la electroforesis. Los productos son analizados e interpretados como en el metoda de Maxam y Gilbert, excepto que es la secuencia de la transcripci6n 10 que se determina. Tanto el metodo de Sanger y Maxam como ei de Gilbert continuan aplicandose ampliamente, ya que cada uno de ellos tiene sus ventajas. El metodo de Sanger requiere generalmente menos esfuerzo, mientras que el metoda de Maxam y Gilbert es menos sensible a los efectos de secuencias especfficas, como las que son ricas en residuos de desoxiguanilato y desoxicitidilato .

Doble helice de los 6cidos nucleicos

6.5

251

DOBLE HELICE DE LOS ACiDOS NUCLEICOS Por el ano de 1950, E. Chargaff habfa analizado la proporcion de bases del DNA de varias fuentes animales y bacterianas. Aunque dichas proporciones en diferentes moleculas de DNA variaban ampliamente, eran evidentes algunas regularidades. La mas importante de estas fue la equivalencia molar entre el desoxiadenilato y el desoxitimidilato y entre el desoxicitidilato y el desoxiguanilato. La proporcion de bases podfa expresarse simplemente como el porcentaje de Gc. Es decir, un DNA con un contenido del 40% de GC tiene desoxiadenilato, desoxicitidilato, desoxiguanilato y desoxitimidilato en la proporcion de 30:20:20:30 para satisfacer la regIa de equivalencia molar de Chargaff. Otra indicacion de la estructura regular del DNA provino de experimentos de difraccion de rayos X, notablemente de los estudios realizados por R. Franklin y M. Wilkins. Cuando los rayos X pasan a traves de grupos ordenados de moleculas de DNA y posteriormente son interceptados por una pelfcula fotografica, los rayos X difractados producen un patron regular. Aunque el patron no es una imagen de la molecula de DNA, muestra que esta tiene una estructura definida e indica si un determinado modelo de la conformacion de la cadena de polinucleotidos del DNA es posiblemente valido 0 definitivamente inadecuado. La sencillez y algunas otras caracterfsticas del patron de difraccion de rayos X de las fibras de DNA revelaron a las personas que trabajan con cristalograffa de rayos X que la estructura del DNA se puede representar mediante un modelo simple que es helicoidal. A principios de la decada de 1950, los conceptos de la composicion regular de bases y el plegamiento regular de la cadena polinucleotida parecfan oponerse a las supuestas funciones biologicas del DNA. Asimismo, se habfa descubierto que el DNA era un componente importante de esperma del salmon. O. T. Avery, C.M. Mac Leod y M. McCarty habfan modificado geneticamente (transformado) bacterias, de modo que estas elaboraban una cubierta de polisacaridos que originalmente eran incapaces de producir. Avery y sus colaboradores demostraron en la decada de 1940 que el "principio de transformacion" era el DNA de otras cepas de bacterias que normalmente producen la cubierta de polisacaridos. A. Hershey y M. Chase habfan encontrado que un bacteri6fago (virus bacteriano) inyectaba su DNA, pero no su capside de protefnas, en la bacteria hospedante para iniciar una infeccion. De esta manera, la inerte molecula de DNA parecfa ser importante para los procesos geneticos de animales, bacterias y virus. A algunos les parecfa razonable que el DNA era la molecula de la cual esmn formados los genes. (,Como podfa(n) formarse el(los) genes(s) de la cubierta de polisacaridos y los genes que dirigen la produccion de nuevas partfculas del bacteriofago a partir de una molecula que de los resultados de la cristalograffa de rayos X y de otros estudios ffsicos y qufmicos, era tan similar sin importar su fuente biologica? J. Watson y F. Crick conciliaron las propiedades de estructura uniforme y funcion genetica diversa cuando concibieron su ahora bien conocido modelo de la estructura del DNA, el modelo mas importante de una molecula biologica jamas construido. La figura 6.3 constituye dos representaciones de este modelo. Dos cadenas de polinuc1eotidos se entretejen para formar la bien conocida doble helice, en la que los residuos de fosfato y desoxirribosa, mas polares e hidrofflicos (afines al agua), se encuentran en el exterior de la molecula. Los pares de bases menos polares forman el interior de la molecula cilfndrica. En este modelo, los pares de bases son aproximadamente perpendiculares al eje mayor de la molecula y estan apilados para dar la apariencia de una escalera en espiral. Las bases de un par de

252

Acidos nucleicos y sus componentes

Ranura menor

mayor

(b)

FIGURA 6.3 Dos representaciones de 10 conformaci6n B del DNA de doble cadena . En 0) se ilustran el curso y las polaridades opuestas de las dos cadenas; los residuos alternantes de azucar (desoxirribosa) y fosfato se indican como S-P~S-P-S . . . Asimismo, se representan los pares de bases G :C y AT que forman el nucleo de 10 molecula. b) Modelo de esferas del DNA B, en el que se indica el curso de las dos cadenos de polinucle6tidos. (Cortesfa del Dr. John E. Johnson.)

bases estin en un mismo plano. De esta forma, un par de bases tiene casi el mismo grosor de una base, es decir, 0.34 nm. Una vuelta de la h6lice tiene 10 pares de bases, de modo que la longitud de paso (longitud de una vuelta completa) de la helice tiene 3.4 nm. N6tese que las dos cadenas de una Mlice estan orientadas en forma antiparalela y no paralela. Es decir, la direcci6n 5' - 3' de las dos cadenas es opuesta. Los pares de bases son el micleo tanto conceptual como estructural del modelo. Si se ignoran por un momento las restricciones esfericas impuestas por la cadena de polinucle6tidos, existen decenas de formas en las que las bases del acido nucleico pueden yuxtaponerse 0 apilarse en pares. Como se indica en la figura 6.4, las caracteristicas importantes del apareamiento particular de las bases propuesto por Watson y Crick son las siguientes:

Doble helice de los 6cidos nucleicos

253

T:A

C:G

A: T

G:C

FIGURA 6.4 Los cuatro posibles pares de bases del modelo de Watson y Crick, mostrando las dos probables orientaciones de un par de bases G:C y de un par AT dentro de una doble helice.

1. Los ,itomos C-l' de los residuos de desoxirribosa estan separados por la misrna distancia en los pares de bases A:T y C:G. 2. El lingulo formado entre una Ifnea que une los dos atomos C-l' de un par de bases y un enlace N-glicosfdico es igual en los cuatro residuos de nucle6tido. 3. Los puentes de hidrogeno rectos y firmes determinan el apareamiento especffico entre residuos dA y dT y entre residuos dC y dG. Los pares de bases propuestos cumplieron al mismo tiempo los requisitos geneticos y estructurales de la molecula del DNA, incluyendo las reglas de Chargaff. Las di-

254

Acidos nucleicos y sus componentes

mensiones similares de los dos tipos de pares de bases dispuestos en dos orientaciones permiten una estructura regular, pero no imponen ninguna restriccion sobre la secuencia de residuos de nucleotidos de una cadena. De este modo, cualquier gene puede estar codificado en una hebra sufientemente grande de DNA y las posiciones de los residuos de desoxirribosa y fosfato senin iguales. Sin embargo, de acuerdo con la estructura antiparalela y el apareamiento de bases del modelo de Watson y Crick, la secuencia de nucleotidos de una cadena determina la secuencia de nucleotidos de la otra cadena del DNA. Esto es ilustrado por la siguiente estructura, escrita en una notacion taquignifica, en la cual la cadena que posee la orientacion 5' a 3' esta en primer termino:

5' 3'

pdGATCCGCG . dCT AGGCGCp.

3' 5'

La estructura descrita en la figura 6.3 reune las caracterfsticas esenciales del DNA comun, es decir, un DNA can los cuatro residuos de nucleotidos bien representados. Se designa como la "helice (3 de Watson y Crick" para diferenciarla de estructuras del DNA can composicion de bases poco comun a del DNA de ambientes con escasez de agua. La correcto de la estructura (3 fue indicado no solo par el hecho de estar de acuerdo can las reglas de Chargaff y los requisitos geneticos para el funcionamiento del DNA, sino tambien deb ida a que predijo acertadamente el patron de dispersion de rayos X del DNA, cuando menos en una primera aproximacion. Asimismo, desde el punta de vista de la estereoqufmica resulto satisfactoria, 10 cual significa que podfa construirse un modelo molecular de esferas (figura 6.3b) a partir de atomos de tamafio adecuado, y el modelo era consistente can las estructuras conocidas de los mononucleotidos. Desde la pUblicacion de la estructura (3 en 1953, se han introducido modificaciones para hacer que esta estructura este mas de acuerdo can los datos mas precisos de la difraccion de rayos X. El DNA disuelto en soluciones salinas acuosas amortiguadas se comporta como si fuera una helice (3 de Watson y Crick, salvo que parece tener 10.5 (y no 10) pares de bases par vuelta de la dab Ie helice. El diametro de la molecula, de aproximadamente 2 nm, y la longitud de cada par de bases, de casi 0.34 nm, son como se habfa predicho. Estas dimensiones hacen esperar can anticipacion una de las propiedades mas sorprendentes del DNA, la extraordinaria relacion longitud/diametro. Por ejempIa, el genoma de la bacteria Escherichia coli es una molecula sencilla de DNA circular de aproximadamente 4.3 millones de pares de bases (4300 pares de kilobases a 4300 kb). Los cromosomas de los organismos superiores tambien parecen estar formados de moleculas unicas de DNA. Habiendo 0 .34 nm par cada par de bases, la longitud del canto rna del DNA de E. coli es de casi 1.5 mm, 10 que origina una relacion entre longitud y diametro de 730 000. Dado que la molecula de DNA es muy larga, la mfnima alteracion de la solucion puede producir regiones locales que fluyen en diferentes direcciones. Esto produce una tension sabre la larga molecula de DNA ala cual puede romper. Dichas fuerzas "cortantes" rompen normal mente las moleculas de DNA del tamafio del DNA de E. coli en miles de piezas, y son estas y no las moleculas intactas los materiales que se estudian can mas frecuencia en el laboratorio. Notese que aunque la doble helice lineal del DNA esta formada par dos moleculas lineales, covalentes y entretejidas, la norma considera a las dos moleculas como la "molecula de DNA". Obviamente, las dos unidades covalentes de esta molecula "no covalente" se mantienen unidas entre sf por puentes de hidrogeno. La

Doble helice de los 6cidos nucfeicos

(a)

(b)

255

FIGURA 6.5 Configuracion superhelicoida l del DNA circu lar ce rrad o cova lentemente. a) 'Representacio n de un DNA circular imaginario de solo 500 pares de bases. Si se supone que ha y 10 pares de bases por cada vuelta de la helice, el DNA circu lar tendr6 50 vue ltas. b) Forma superhelicoida l esperada para un DNA circular de 500 pares de bases que tiene solo 44 vueltas en la d oble helice en lugar de 50. '

estructura tambi6n es establHzada por las fuerzas que se establecen entre las bases colocadas una sobre otra para formar la "escalera en espiral" en el interior de la molecula. Las fuerzas de repulsion electrostatica que se generan entre los grupos fosfodiester cargados negativamente (v ease el recuadro 6 .A) y el movimiento termico desestabilizan la estructura. La molecula de DNA no es estatica sino que presenta una separacion aleatoria, dinamica y localizada de las bases organicas y un rapido restablecimiento de los pares de bases unidos por puentes de hidrogeno. EI aumento de temperatura aumenta el movimiento termico y cambia el equilibrio a favor de la separacion de las bases; a una temperatura bastante alta, los dos filamentos de un fragmento de DNA lineal se desenrollan y se separan. Este proceso se denomina "fusion". Los valores extremos de pH tambien desnaturalizan ("funden") el DNA. La desnaturalizacion del DNA es un proceso reversible que se describe en la seccion 6.6. Algunos tipos de DNA de doble cadena son circulares . EI DNA sera circular si una de las cadenas (0 ambas) es realmente una cadena circular de residuos de nuc1eotidos unidos por enlaces fosfodiester. Si ambas cadenas son circulares , se entretejen y no pueden separarse mientras esten intactas. En la figura 6.5 se muestra esquematicamente como las dos cadenas circulares covalentes pueden ser inseparables aun cuando no esten unidas covalentemente entre sf. EI modelo de Watson y Crick predice (y la forma lineal de un DNA de doble cadena define) el numero de vueltas que el DNA {3 debe tener en su forma mfnima de energfa. EI numero de vueltas es de casi una por cada 10 pares de bases. Una consecuencia importante del DNA circular "cerrado covalentemente" es la posibilidad de que el numero real de vueltas de la doble helice, impuesta por las dos cadenas circulares covalentes, sea distinto del numero de vueltas en el DNA lineal correspondiente. La correspondencia exacta entre el numero de vueltas de la helice y el numero de vueltas anticipado por el modelo de Watson y Crick para el DNA (3 dara una molecula circular sin superenrollamientos. En contraste, la forma superenrollada de una molecula de DNA de doble cadena, circular y cerrada covalentemente existe cuando el numero real de vueltas de la hetice es mayor 0 menor que el numero de vueltas que habrfan si la molecula fuera lineal. La diferencia que existe entre 1) el numero real de vueltas en las cadenas del DNA y 2) el numero de vueltas que asumirfa la forma de DNA {3 de baja energfa si no estuviera restringido por el cfrculo co valente da como resultado el superenrollamiento del DNA. EI proceso espontaneo del superenrollamiento permite que el DNA tenga el numero adecuado de vueltas que ha impedido la estructura covalente del DNA circular covalentemente cerrado .

256

Acidos nucleicos y sus componentes

El fenomeno del superenrollamiento puede demostrarse facilmente con una cuerda. Ponga la cuerda sobre una mesa y una sus extremos con cinta adhesiva a fin de formar un cfrculo covalente. La configuracion de la cuerda corresponde entonces a la figura 6.5a. Ahora, remueva la cinta adhesiva. Sostenga un extremo de la cuerda y haga que el otro extrema de una, dos, tres, etc. rotaciones completas. Sostenga la cuerda en esta forma tensa y vuelva a unir sus extremos con cinta adhesiva. Notese que la cuerda asume una configuracion similar a la mostrada en la figura 6.5b. Las endonucleasas de restriccion estan entre los medios mas titiles para analizar el DNA de doble cadena. La informacion relativa a estas enzimas muy importantes se da en los recuadros 6.D y 6.E, donde se describe el origen y las propiedades de dichas enzimas, asf como algunas de sus aplicaciones en el estudio y manipulacion de las secuencias del DNA.

RECUADRO 6.D

ENDONUCLEASAS DE RESTRICCI6N Y USOS

Las endonucleasas de restricci6n son enzimas hidrolizantes del DNA que son altamente especfficas con respecto a la secuencia de nucle6tidos en la cual cortan al DNA. Son esenciales para la construcci6n in vitro de las secuencias quimericas del DNA, las cuales son secuencias de DNA que derivan de dos 0 mas fuentes y se combinan en una sola molecula. EI resultado es la recombinaci6n in vitro, la parte mas importante de la tecnologia del DNA recombinante (vease el capitulo 22). Las endonucleasas de restricci6n se descubrieron cuando se observ6 la manera sorprendente de c6mo variaba la infectividad de ciertos bacteri6fagos (virus que infectan a bacterias) al ser transferidos de una bacteria hospedante a otra. Por ejemplo, despues del crecimiento sobre la cepa C de E. coli pudo recuperarse una preparaci6n del bacteri6fago 'A de DNA. Dicho bacteri6fago fue de 1 000 a 10 000 veces mas infeccioso a la cepa C de E. coli que ala cepa K de la misma bacteria. El bacteri6fago derivado de la cepa K de E. coli result6 bastante infeccioso para las cepas C 0 K, pero revertia a una forma poco infecciosa para la cepa K una vez que se replicaba en la cepa C. De esta manera, el bacteri6fago 'A puede ser restringido en cuanto a infectividad eficiente de la cepa K 0 bien modificado con respecto a replicaci6n en la misma cepa a fin de presentar una gran infectividad sobre dicho hospedante. Por otra parte, se han descubierto muchos otros sistemas de modificaci6n y restricci6n . En varios sistemas, la base de los procesos de restricci6n y modificaci6n se ha atribuido a un par de enzimas: 1) una endonucleasa de restricci6n que puede destruir el DNA extrafio cuando entra a la celula bacteriana y 2) una enzima modificadora del DNA que modifica covalentemente al DNA de la celula que forma la endonucleasa de restricci6n, por ejemplo, mediante metilaci6n de bases. Esta modificaci6n impide que la endonucleasa de restricci6n corte el DNA de la celula. En el ejemplo del bacteri6fago 'A, la cepa K hospedante posee un sistema de modificaci6n y restricci6n. Las pocas moleculas de DNA del bacteri6fago que escapan a la restricci6n se modifican y su progenie adquiere esta caracteristica, de modo que son capaces de replicarse en la cepa K de E. coli. La demostraci6n en un organismo de una endonucleasa que es especffica para un DNA extrafio se toma como prueba clara de un sistema de restricci6n y modificaci6n . La investigaci6n de las endonucleasas de restricci6n ilustra un importante principio de la investigaci6n: la dificultad que implica determinar si dicha investigaci6n es 0 no de valor practico 0 incluso fundamental. Alguna vez se pens6 que la restricci6n de los bacteri6fagos carecfa de interes practico y que era poco rundamental, pero el estudio del fen6menD de restricci6n llev6 al descubrimiento de una de las herramientas mas importantes de la bioquimica moderna, las endonucleasas de restricci6n, y su aplicaci6n a nuevos procesos industriales. Se reconocen dos clases generales, 0 tipos, de endonucleasas de restricci6n. Las del tipo II son utiles para preparar recombinantes in vitro (capitulo 22) debido a que catalizan el rompimiento de una moJecuJa de DNA dentro de una secuencia de nucle6tidos especffica. En la tabla que se muestra mas adelante se dan

Doble helice de los 6cidos nucleicos

257

ejemplos de endonucIeasas de restricci6n y se indica c6mo se nombran de acuerdo con el genero y especie del organismo que se utiliza como fuente y el orden de su descubrimiento. Por ejemplo, "EcoRI" es la primera endonucIeasa de restricci6n que pudo identificarse a partir de la cepa R de E. coli; HaeIII es la tercera endonucIeasa de restricci6n que se descubri6 en Haemophilus aegyptius. Para todos los ejemplos de la tabla excepto MnII, se indica el sitio de ruptura en una sola cadena. De esta manera, para EcoRI, los nuevos extremos creados por rompimiento son los siguientes: GAATTC

5'-

cn AAr~

3'-

')' 'J

5'·

G-OH

-5'

3'-

CTTAAp

pAATTCC

+ HO - G

·3' -5'

Esta reacci6n muestra los grupos 5' -fosforilo y 3' -OH que son caracteristicos de los nuevos extremos y la simetrfa del sitio de rompimiento. La ruptura en GI AATTC, por ejemplo, muestra el enlace fosfodiester que es roto. N6tese que la ruptura escalonada producida por las endonucIeasas de restricci6n como EcoRl y PstI da "extremos pegajosos", los cuales tienen un potencial debil para formar hfbridos moleculares mediante el apareamiento de bases . Esta propiedad ayuda a unir los fragmentos de DNA cuando se forman recombinantes in vitro. Sin embargo , pueden unirse incIuso "extremos romos" como los producidos por la acci6n de SmaI 0 HaeIIl (capitulo 22). La mayo ria de las endonucIeasas de restricci6n reconocen sitios simetricos, es decir, sitios que son iguales despues de una rotaci6n de 180 0 , como en el ejemplo de EcoRl. Otras, como la Acel, tienen algunos sitios que son simetricos y otros que no 10 son. Hinfl es un ejemplo de una enzima que reconoce casi, pero no perfectamente los sitios simetricos. En contraste, el sitio donde rompe MnII es asimetrico y carece de requerimiento alguno para las identidades de los pares de bases presentes en las siete posiciones a la izquierda del sitio de rompimiento, indicadas por N' . Las endonucIeasas de restricci6n son por 10 general especfficas del DNA de doble cadena; algunas que reconocen secuencias ricas en las bases GC, como HaeIII, cortan tambien moleculas de DNA de una sola cadena. Los experimentos indican que el rompimiento de los DNA de una sola cadena se debe a asociaciones estables 0 transitorias de regiones de diferentes partes de la cadena de polinucIe6tidos en una conformaci6n de doble filamento.

Algunas endonucIeasas de restricci6n tipo II Designacion

Fuente

Acel

Acinetobacter calcoaceticus

HaeIII

Haemophilus aeqptius Escherichia coli (cepa R) Haemophilus injluenzae (cepa Rf)

EcoRI Hinfl

MnII Pstl SmaI

Moraxella nonliquifaciens Providencia stuarti Seratia marsescens

Sitio(s) de ruptura

GT/AGAC GT/ATAC GT/CGAC GT/CTAC GGICC G/AATTC G/A ATC G/AGTC G/ATTC G/ATTC 5' -CCTCNNNNNNN/NNNN 3' -GGAGNNNNNNN/NNNN CTGCA/G CCCIGGG

258

Acidos nucleicos y sus componentes

La propiedad que distingue a las nucIeasas de restricci6n de otras desoxirribonucleasas es su capacidad para romper s610 en secuencias especfficas de los pares de bases y no al azar. EI mimero de sitios de cualquier molecula de DNA que son atacados por una endonucleasa de restricci6n depende, en promedio, del mlmero de bases reconocidas por dicha enzima. EcoRl, PstI y SmaI tienen sitios formados por seis pares de bases. Por ejemplo, si un DNA tuviera una composici6n de bases del 50% de GC, la probabilidad de tener un determinado residuo de desoxinucle6tido en un sitio dado es de 0.25. Cualquier secuencia de dinucle6tidos dada tiene una probabilidad de 0.25 X 0.25 = 0.0625 . La probabilidad de cualquier secuencia de seis bases es, entonces, (114)6 = 114096. Para enzimas como HaeIII y MnII, que reconocen una secuencia de cuatro residuos de nucle6tido, y HinfI, que reconoce una secuencia de cinco residuos pero no impone limitaci6n alguna sobre el residuo central, la probabilidad de localizar la secuencia reconocida es de 1/256. EI sitio de AccI tiene seis residuos, pero permite la ubicaci6n de cualquiera de dos residuos de nucIe6tido en cualquiera de las dos posiciones centrales en ese sitio, 10 que da una probabilidad de 1/1024. La secuencia de nucIe6tidos del DNA no es, por supuesto, aleatoria, de modo que las probabilidades caIculadas son s610 una gufa aproximada del numero de sitios esperados. Es decir, en una secuencia de alrededor de 4 000 residuos, se esperarfa en promedio un sitio EcoRl, pero algunas secuencias de 4 000 residuos tienen varios sitios EcoRI y otras carecen de ellos. En el recuadro 6.E se describe el uso de las endonucIeasas de restricci6n en el mapeo de las secuencias de nucIe6tidos.

RECUADRO 6.E MAPEO DE LAS SECUENCIAS DEL DNA CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Las endonucIeasas de restricci6n son valiosas no s610 para preparar fragmentos de DNA que se van a ensamblar para formar nuevas secuencias, sino tambien para otros procesos como la obtenci6n de fragmentos utilizados para el analisis de las secuencias de nucIe6tidos (recuadro 6.C) y la comparaci6n de segmentos de DNA muy largos para encontrar similitudes que sean aparentes a partir del ordenamiento de los sitios de la endonucIeasa de restricci6n. El "mapeo de restricci6n" es la asignaci6n de los sitios de restricci6n de diferentes enzimas a 10 largo de la cadena polinucIe6tida. El mapeo de restricci6n puede hacerse sin necesidad de determinar la secuencia de nucIe6tidos del DNA debido a que los sitios de los cortes de restricci6n pueden deducirse a partir de los tamanos aparentes de los fragmentos de DNA de doble cadena, los cuales se determinan mediante electroforesis en gel de agarosa , u ocasionalmente, en gel de poliacrilamida (recuadro 6.B). EI plasmido pBR322 es un cfrculo de DNA covalente de doble cadena de 4362 pares de bases. Si este plasmido se trata con las endonucIeasas de restricci6n AccI, EcoRI y PstI (v ease el recuadro 6.D) individualmente 0 en pares, los fragmentos lineales observados despues de la electroforesis en gel de agarosa tienen los tamanos indicados en numero de pares de bases (pb). AccI EcoRl Pstl AccI + EcoRl AccI + PstI EcoRl + PstI

1595 pb y 2767 pb 4362 pb 4362 pb 651 pb 1595 pb y 2116 pb 1366 pb 140/ pb y 1595 pb 750 pb y 3612 pb

A partir de los resultados de la digesti6n del plasmido pBR322 con AccI + EcoRl, es evidente que el unico sitio de EcoRl esta en el mas grande de los dos fragmentos de DNA obtenidos con AccI debido a que el fragmento mas pequeno de 1595 pb resiste la digesti6n con EcoRl. Asimismo, el unico sitio de Pstl esta en el fragmento mas grande de Accl. Los sitios de EcoRl y Pst! estan separados por 750 pb de acuerdo con los resultados de la doble digesti6n . De esta manera, el mapa del fragmento mas grande obtellido con AccI debe ser:

Doble he lice de los 6cidos nucleicos

Acel

EcoRI

Pstl

259

Acel

Este mapa, combinado con el fragmento restante de 1595 pb obtenido con AccI, dani dos mapas de endonudeasa de restricci6n circulares del phismido pBR322. Por acuerdo, se ha elegido uno de los mapas para ser la base de un sistema de numeraci6n de residuos de nuc1e6tido. En el esquema que se muestra al final de este recuadro puede observarse un mapa de endonuc1easa de restricci6n mas completo del pllismido pBR322. Con frecuencia, una endonuc1easa de restricci6n, llamese X, tendra varios sitios dentro de un fragmento que se obtiene con una segunda endonuc1easa de restricci6n, Y, como se muestra en el mapa del plasmido pBR322 mediante los cuatro sitios TaqI dentro del fragmento A de la Acc!. La localizaci6n inequivoca de los diferentes sitios de la endonuc1easa de restricci6n X requerira por 10 general procedimientos mas complicados que los que aquf se mencionan, como las digestiones parciaies con la endonuc1easa de restricci6n X para dar fragmentos que tengan todavfa uno 0 mas sitios de X. Por ejemplo, la digesti6n parcial

260

Acidos nucleicos y sus componentes

del plasmido pBR322 con TaqI podrfa dar fragmentos que correspondan a D-EI ya E 1-E2 , y asf sucesivamente. El mapa de dicho plasmido ilustra tambien c6mo pueden coincidir los sitios de restricci6n de dos enzimas. La secuencia de nucle6tidos que comienza en la base 649, CGTCGACC, tiene un sitio para AccI [GT(A /C)(G/T)AC ], para SalI[GTCGAC] y para TaqI[TCGA]. En contraste, la secuencia en el segundo sitio de AccI, empezando en la base 2244, es TGT AT ACT . Esta secuencia no posee un sitio para Sail 0 Taql.

EI DNA de doble filamento no es la unica forma de acido nuc1eico de doble cadena. EI RNA de doble cadena se encuentra en pocos virus y en pequefias cantidades en algunos hongos y plantas. Debido a las restricciones estericas impuestas por el grupo 2' -hidroxilo, el RNA de doble filamento es forzado a adoptar una conformacion denominada forma A. En esta conformacion, los pares de bases estan inclinados respecto al eje de la helice, y algunos otros cambios distinguen tambien a esta doble helice de la del DNA (3 . Los hfbridos de DNA y RNA formados artificialmente y que poseen una cadena de cada tipo de polinuc1eotido, asumen tambien la conformacion iX, de la misma manera que el DNA de doble cadena en soluciones de alcohol y agua.

6.6

DESNATURALIZACION Y RENATURALIZACION DE ACiDOS NUClEICOS La fusion de una molecula de DNA aumenta su absorcion de luz ultravioleta. La explicacion de esta observacion es que las interacciones electronicas entre las bases apiladas reduce su capacidad para absorber la luz de longitud de onda de aproximadamente 260 nm . Una proporcion de bases mucho menor se encuentra en la configuracion apilada en las cadenas sencillas " fundidas" que en la doble helice y la absorbancia se aproxima al valor mas alto (mas "hipercromico"), que es caracterfstico de los mononuc1eotidos individuales. En la figura 6.6a se indica como la absorbancia aumenta al aumentar la temperatura, dando curvas sigmoidales. Debido a que los pares de bases G:C son mas estables que los pares de bases A:T, la temperatura en el punto medio de la transicion, T,1l , es mayor para los DNA con mayor contenido porcentual de pares de bases Gc. En NaCl 0.15 My citrato de sodio 0.015 M, a un pH de 7, la relacion que existe entre el contenido de GC y Tm esta dada por la expresion: %GC = 2.44(Tm -69 .3) En soluciones de menor concentracion de sales, las cargas negativas de los grupos fosfodiester se repelen mas eficazmente, por 10 que el Tm disminuye para cualquier DNA. Las "curvas de fusion" para varios DNA en una solucion de menor fuerza ionica se muestran en la figura 6.6b. Como se indico en la seccion anterior, los pares de bases del RNA de doble cadena se encuentran inclinados a un angulo de 70° respecto al eje mayor de la molecula, en lugar de los aproximadamente 90° de la Mlice del DNA (3. Dicha inclinaci6n origina una molecula mas compacta. Por esta razon, el RNA de doble cadena es mas estable que el DNA de doble cadena y po see un mayor valor de T,1l para el mismo contenido porcentual de GC.

Desnoturolizoci6n y renoturolizoci6n de 6cidos nucleicos

261

1.4

Q' LO

'"'" ·u '"c .D '"0

'ci3"

1.3

Cf)

.D

'" 0 ..:'"

'" c .D '"0

til 1.2

~

·u

~

Cf)

.D

:!- 1.1

1.0 220

260 Longitud de onda (nm)

(a)

300

65°

75°

Temperatura

(b)

FIGURA 6.6 C urvas de fusion del DNA detectadas mediante cambios en la absorcion de luz ultravioleta. a) Espectros del DNA de doble cadena y el correspondiente DNA "fund ido" de una sola cadena. b) Experimento en el que se calentaron a varias temperaturas tres muestras de DNA en soluciones separadas de cloru ro de sodio 0.0 15M amortiguado y se midio la absorbancia a 260 nm . Los va lores del Tm son, respectivamente, 64, 69 y 76°C para los tres tipos de DNA.

Uno de los aspectos mas importantes del modelo de Watson y Crick son sus implicaciones geneticas. EI apareamiento de dos cadenas, facilitado por sus secuencias complementarias, indica que una cadena aislada podrfa dirigir la sfntesis de una nueva cadena que, despues de la sfntesis, serfa complementaria de la primera. De hecho, las moleculas de acido nuc1eico son duplicadas y transcritas en nuevas moleculas de acido nuc1eico bajo la direcci6n de una cadena que sirve como molde o plantilla, segun las reg las del apareamiento de bases Watson y Crick que se describen en el capftulo 19. A veces, la nueva cadena permanece asociada con el molde en una doble helice, como en la duplicaci6n del DNA de doble filamento. En otros casos, como en la sfntesis del RNA bajo la direcci6n de un molde de DNA de doble cadena, la cadena que se esta sintetizando permanece aparentemente asociada con su molde s610 por un momenta y en la regi6n en la cualla cadena esta creciendo. Los filamentos de DNA 0 de RNA, 0 de RNA y DNA, que son complementarios, formaran espontaneamente una doble helice en soluci6n en condiciones propicias. Esta capacidad que tienen dos moleculas de reconocerse sin la intervenci6n de un agente extemo, como una enzima, ha dotado a los bioqufmicos de una herramienta analftica de suma importancia. Con 10 anterior, es po sible discemir relaciones entre moleculas de acido nuc1eico muy grandes y complejas, relaciones que no podrfan establecerse mediante otros analisis. La hibridaci6n molecular, que se establece entre dos cadenas sencillas de acido nuc1eico para formar una molecula de doble helice, es una reacci6n muy especffica que requiere como reactivos cadenas exactamente complementarias 0, cuando me-

262

Acidos nucleicos y sus componentes

nos, casi exactamente complementarias . La velocidad y el grado de la reacci6n depende de la concentraci6n de los dos tipos de cadenas sencillas reaccionantes y de la duraci6n de la reacci6n. EI amilisis detallado de estas variables de la reaccion indica que la etapa mas lenta de la reacci6n, la etapa limitante de la velocidad, esta asociada con el encuentro adecuado de las dos cadenas, de modo que las porciones complementarias esten alineadas. La formaci6n del resto de la helice es un proceso muy rapido . En general, la temperatura y la concentraci6n de sales y otras condiciones del disolvente se ajustan de modo que la temperatura de la reacci6n de hibridaci6n molecular es de casi 25°C por debajo de la temperatura a la cual la helice se fundirfa (desnaturalizarfa) para formar cadenas sencillas. A esta temperatura, las reacciones entre cadenas sencillas dan helices perfectamente apareadas y helices no tan perfectamente apareadas. Las helices perfectamente apareadas son mas estables y, debido a que las cadenas sencillas y las helices esmn en equilibrio, las helices mas perfectas finalmente son las que predominan. A temperaturas mas bajas, las helices imperfectas son mas estables y evitan la formaci6n eficaz de helices perfectas. A temperaturas cercanas al punto de fusi6n, el grado de avance de la reacci6n es menor, de aquf el arreglo de emplear una temperatura 25°C por debajo del valor de la temperatura de fusi6n. Uno de los resultados mas importantes derivados de los experimentos de hibridaci6n molecular es que algunas secuencias nucleotfdicas, especialmente en el DNA de eucariotes, se repiten cientos, miles e incluso millones de veces en el genoma del organismo. Otras secuencias aparecen s610 una vez en el genoma. Considerese un DNA que tenga alguna secuencia de tamaiio desconocido repetida un mlmero desconocido de veces. Una reacci6n de hibridaci6n molecular puede definir una cantidad lIamada complejidad, N. N es el mlmero de residuos de nucle6tido existentes en una repetici6n de la secuencia repetitiva en una cadena. La complejidad N puede ilustrarse con tipos de DNA que poseen secuencias repetitivas muy limitadas (0 que carecen de elIas). EI DNA de E. coli tiene casi 4.3 X 10 6 pares de bases en su genoma que, si fueran secuencias unicas, corresponderfan a una complejidad de 4.3 X 10 6 . EI DNA del bacteriOfago T7 tiene alrededor de 73000 pares de bases y su N es de 73000. Un microgramo de cualquier DNA tendrfa aproximadamente 3 x 10 -9 moles de residuos de nucle6tido. Sin embargo, el numero de moles de DNA depende del tamaiio de la molecula. Un microgramo de DNA del bacteriOfago T7 corresponde a 3.9 x 10 - 14 moles, mientras que 1 J.tg del DNA de E. coli tiene s610 3.4 X 10 - 16 moles . Si se combinan 0.5 J.tg de cada DNA, existen 3 X 10 - 9 moles de residuos de nucle6tido en el valor de 1 J.tg resultante. Los DNA del bacteri6fago T7 y de E. coli no comparten amplias secuencias de nucle6tido. Si la mezcla de DNA se disuelve en soluci6n salina amortiguada y se funde y se incuba despues en condiciones de hibridaci6n, las cadenas complementarias del DNA del bacteriOfago T7 se hibridizaran entre sf, y otro tanto haran las del DNA de E. coli. Sin embargo, las cadenas de DNA del bacteriOfago T7, a causa de su concentraci6n molar mucho mayor, se "encontraran" entre sf con mayor rapidez y se hibridizaran mas rapidamente que las cadenas de DNA de E. coli . En general, el aumento de concentraci6n de un DNA aumentara la velocidad a la cual se hibridice, de modo que el tiempo requerido para que la mitad del DNA de un tipo se hibridice disminuira en proporci6n al incremento en la concentraci6n total de DNA. Una cantidad util es el producto de la concentraci6n inicial del DNA fundido, Co> en moles de residuos de nucle6tido por litro, multiplicado por el tiempo requerido para que la rnitad del DNA se hibridice, el t1l2. Esta cantidad, Cot1/2, sera casi 115 veces mas

Desnaturalizaci6n y renatura/izacion de acidos nucleicos

263

FIGURA 6.7 Hibridaci6n del DNA de un eucariote mostrando 10 amplia voriaci6n en el producto de 10 concen traci6n por el tiempo de hibridaci6 n requerido pora representor todas las clases de DNA que est6n presentes. EI va lor de Co t l/2 para el DNA de una sola copia en el ejemplo es menor de 10 3 M-s .

grande para el DNA de E. coli que para el DNA del bacteri6fago T7 . El calculo es 3.9 X 10 - 14 moles dividido entre 3.4 X 10 - 16 moles = 115 . La conclusi6n importante es que N es proporcional al valor de Cot1/2, valor al cualla formaci6n de la helice para un determinado DNA en una mezcla de reacci6n es semicompleta. Los experimentos de hibridaci6n molecular del DNA casi siempre se llevan a cabo utilizando fragmentos en lugar de moleculas intactas. El DNA analizado en la figura 6.7 consistfa en fragmentos de casi 400 pares de bases. Si se tratan diferentes muestras de DNA para dar fragmentos del mismo tamaiio, la relaci6n entre N y Cotl/2 para los DNA sera igual, y los valores de N corresponderan al mimero de residuos de nucle6tido en los DNA originales intactos. El valor de Cot1/2 para E. coli es de aproximadamente 4 Ms. En el recuadro 6.F se describen algunas aplicaciones del proceso de hibridaci6n molecular del DNA.

RECUADRO 6.F

HIBRIDACION MOLECULAR SOBRE UN SOPORTE SOLIDO

Mediante el uso de endonucleasas de restricci6n (recuadro 6.D) y la electroforesis en gel (recuadro 6.B) pueden resolverse porciones especfficas de moleculas de DNA muy grandes e incluso conocerse el orden de los fragmentos obtenidos con dichas enzimas dentro de la gran molecula de DNA (recuadro 6.E). Por supuesto, los fragmentos de DNA individuales, pueden aislarse y determinarse su secuencia de nucle6tidos (recuadro 6.C) . Con frecuencia, el amilisis de dichos fragmentos de DNA podrfa efectuarse con mayor rapidez si se pudiera determinar facilmente las relaciones existentes entre la secuencia de nucle6tidos de los fragmentos de DNA individuales y la de otros acid os nucleicos. Por ejemplo, si existiese un RNA mensajero particular, la identificaci6n de que fragmentos de DNA derivados de la digesti6n por una endonucleasa de restricci6n contenfan la misma secuencia de nucle6tidos llevada al aislamiento del gene correspondiente. Lo anterior podrfa hacerse cortando las zonas de DNA correspondientes (zona por zona) existentes en un gel e hibridizando cada una con el RNA en soluci6n (vease la secci6n 6.6). Sin embargo, E. Southern ha introducido un metodo mas directo, menos laborioso y en general mas sensible que posee tambien una mayor resoluci6n. Su metoda suele conocerse como "manchado de Southern" . Una vez que los fragmentos de DNA han sido resueltos mediante electroforesis, por 10 general en gel de agarosa, el gel se sumerge en soluci6n alcalina para desnaturalizar los fragmentos de DNA, es decir,

264

Acidos nucleicos y sus componentes

para separar sus cadenas in situ. Despues de la nip ida neutralizaci6n, el gel se deposita sobre un rimero de hojas de papel fIltro empapadas en soluci6n amortiguadora. EI papel hecho de nitrocelulosa 0 algun otro material que se une al DNA se coloca sobre el gel , y sobre esta lamina se coloca una pita de hojas de papel filtro secas tal como se muestra a continuaci6n: Lamina de nitrocelulosa

La acci6n capilar arrastra la soluci6n amortiguadora a traves del gel y el papel que se une al DNA hasta el papel filtro. Los fragmentos de DNA se unen y no pasan hasta la pita de papel filtro de mas arriba. El resultado es esencialmente una "impresi6n por contacto" del gel en el papel que se une al DNA. El horneado a 80°C fija permanentemente el DNA al nitrato de celulosa (nitrocelulosa) u otro soporte. La lamina de nitrocelulosa que Ileva adheridos fragmentos de DNA se coloca en una bolsa de plastico del tipo usado para congelar alimentos. Enseguida, se afiade DNA 0 RNA radiactivos a la bolsa en una soluci6n que sea apropiada para que ocurra una reacci6n de hibridaci6n. Por ultimo, la bolsa se sella e incuba para permitir la hibridaci6n.

Aplicar a la lamina de nitrocelulosa, hibridizar con el DNA 0 el RNA radiactivos

Enjuagar la lamina de nitrocelulosa, obtener el autorradiograma

La hibridaci6n molecular s610 ocurre en aquellas porciones de las moleculas de DNA que muestran homologfa suficiente (en cuanto a secuencia de nucle6tidos) con un DNA 0 RNA radiactivo, el cual se conoce como "sonda" 0 "prueba" debido a su capacidad para localizar secuencias especfficas en la masa de secuencias del DNA no relacionadas que estan presentes en la lamina de nitrocelulosa. Todo este procedimiento constituye el experimento del " manchado de Southern" que se esquematiza en la figura anterior. Cuando el acido nucleico que es transferido a la lamina de uni6n es RNA en lugar de DNA, la tecnica se conoce como "manchado Northern". Esta tecnologfa se ha extendido hasta las protefnas, que de manera similar pueden "imprimirse por contacto" en una lamina de nitrocelulosa. En este caso, la detecci6n es por uni6n de moleculas de anticuerpo, y la tecnica, en la jerga dellaboratorio , se conoce como " manchado Western".

Closes de 6cidos nucleicos

265

N6tese que en el caso del DNA circular covalentemente cerrado la fusi6n es posible. Sin embargo, debido a que las dos cadenas estan entretejidas, la hibridaci6n o la renaturalizaci6n son casi un proceso unimolecular. El resultado es que dicho DNA se renaturaliza demasiado rapido comparativamente con los DNA lineales mostrados en la figura 6.7. Las moleculas hfbridas de DNA-RNA pueden obtenerse tambien mediante incubaci6n en condiciones de renaturalizaci6n. Estos hfbridos son menos estables que los hfbridos de DNA-DNA 0 de RNA-RNA , excepto cuando se utilizan ciertos disolventes para obtener hfbridos de DNA-DNA menos estables que los hfbridos de DNA-RNA.

6.7

CLASES DE ACIDOS NUCLEICOS La funci6n de los acidos nuc1eicos es un tema importante de la parte III de este texto. Como pr610go de dicho tema, se sedalan aquf los tipos principales de acidos nuc1eicos. Todos los organismos hasta ahora caracterizados poseen alguna c1ase de acido nuc1eico como material genetico. En todas las celulas, el material genetico es el DNA, mientras que un determinado virus puede po seer cualquiera de los cuatro tipos de acido nuc1eico como material gen6mico: DNA 0 RNA de una sola cadena o de doble cadena. Los acidos nuc1eicos virales se estudian en el capitulo 22. EI DNA se encuentra en s610 un llIimero limitado de formas en celulas tanto procari6ticas (bacterias, algas verdeazules) como eucari6ticas (hongos, plantas, animales). La complejidad del cromosoma de E. coli, determinada mediante analisis de hibridaci6n molecular (secci6n 6.6), y su tamado fisico, determinado mediante microscopia electr6nica y otras tecnicas, son consistentes. Es decir, parece que el cromosoma procari6tico es una sola molecula de DNA larga, circular y de doble cadena. La longitud del contorno de dicho DNA tiene mas de 1 mm, mientras que la dimensi6n mayor de la celula bacteriana es de casi 0.001 mm. Evidentemente, el cromosoma bacteriano debe estar bastante plegado en la celula. El DNA esta superenrollado (vease la secci6n 6.5) y forma un complejo con protefnas y RNA, los cuales al parecer contribuyen a darle una conformaci6n compacta al DNA contenido en la celula bacteriana. En organismos eucari6ticos, la herencia de los caracteres geneticos esta ligada, heredandose en general ciertos caracteres juntos. Estos grupos de ligamiento corresponden a los cromosomas, correlacionando una entidad ffsica que puede verse inc1uso con el microscopio de luz, el cromosoma en metafase, con las propiedades geneticas del organismo. Cuando menos algunos cromosomas de eucariotes contienen una sola molecula de DNA muy larga. En la secci6n 6.10 se estudiara el tamado y plegamiento del DNA en los cromosomas de las celulas eucari6ticas. Las bacterias pueden adquirir elementos de DNA extracromos6micos llamados pbismidos. Los plasmidos son cfrculos de doble cadena con un tamado de casi 4 a mas de 200 kb (v ease tambien el recuadro 6.E). Estas estructuras se duplican independientemente del cromosoma bacteriano. Esta existencia semiaut6noma es posible debido a que el plasmido codifica parte de la informaci6n genetic a necesaria para su duplicaci6n y, por 10 general, la celula bacteriana continua manteniendo al plasmido debido a que este contribuye con alguna funci6n que Ie da a la bacteria una ventaja selectiva. El ejemplo c1asico de dicha adaptaci6n es la resistencia a un antibi6tico. Las "cepas bacterianas de hospital" que tienen la capacidad de duplicarse aun en presencia de varios antibi6ticos han adquirido de uno a varios plasmidos de resistencia a estos farmacos. En general, los plasmidos controlan el numero de

266

Acidos nucleicos y sus componentes

copias del phismido que existen por celula, que puede ser de solo 1 a 3 0 30, 0 mas. De modo usual, los phismidos de mayor tamano existen en un menor numero de copias. Otros ejemplos de funciones codificadas por estas estructuras son: 1) formacion del pilus F 0 tubo de conjugacion, una estructura que facilita la transferencia de plasrnidos de una celula bacteriana a otra; 2) produccion de toxinas que inhiben o destruyen bacterias emparentadas pero que carecen de plasmidos; y 3) capacidad para metabolizar ciertos compuestos necesarios para la nutricion de la celula bacteriana. Como se senala en el capitulo 22, los phismidos son elementos importantes de la tecnologia del DNA recombinante. Algunos de los organelos de los eucariotes, las mitocondrias y los c1oroplastos, asi como algunos otros organelos menos comunes, llevan una existencia semiautonorna debido a que tienen su propio DNA. El DNA mitocondrial de las plantas, por ejemplo, presenta un panorama complejo. A partir del numero y movilidad de las zonas producidas por electroforesis de fragmentos de DNA obtenidos mediante endonuc1easas de restriccion (recuadro 6.D), de 200 000 a 2 500000 pares de bases de DNA constituyen todas las secuencias de nuc1eotido existentes en las mitocondrias de varias especies vegetales. Sin embargo, el DNA mitocondrial de una deterrninada especie no es de tamano uniforme y puede ser una mezc1a de formas circulares y lineales. Si en el caso del DNA mitocondrial del maiz se asigna un valor de 1.0 al numero de secuencias del DNA identificadas como unicas mediante el analisis de fragmentos obtenidos con endonuc1easas de restriccion, las moleculas existentes de DNA mitocondrial son cfrculos de aproximadamentA 0.4,0.8, 1.0, 1.4, 1.6 y 2.0 veces este tamano. Las mitocondrias de las celulas vegetales suelen tener tambien moleculas pequenas de DNA tipo plasmido e inc1uso moleculas de RNA de doble cadena. Una celula tipica puede contener diez veces mas RNA que DNA. Tres c1ases representan la mayor parte del RNA que puede encontrarse en las celulas de procariotes 0 eucariotes: 1) RNA ribosomal, rRNA, que es el mas abundante; 2) RNA de transferencia, tRNA; y 3) RNA mensajero, abreviado mRNA. Todas las formas anteriores de RNA son sintetizadas por enzimas que copian sus secuencias de nuc1eotidos de un molde de DNA en un proceso llamado transcripcion (capitulo 19); asimismo, todas estas formas participan en la sintesis de proteinas (capitulo 20), pero en diferentes maneras: el rRNA en los ribosomas (seccion 6.10), las partlculas en las cuales se lleva a cabo la sintesis de proteinas; el mRNA (capitulo 19) como el intermediario que transfiere la informacion genetica del DNA al ribosoma, donde es interpretada como secuencias de aminoacidos; el tRNA (seccion 6.8) como parte del sistema de interpretacion, llevando aminoacidos al sitio de la sintesis de proteinas y especificando que aminoacido va a incorporarse de acuerdo con la informacion del mRNA. Otros RNA existen en menores cantidades y, entre otras funciones, participan en la sintesis del DNA y en la ruptura y union de las secuencias del RNA.

6.8

PLEGAMIENTO DE ACiDOS NUCLEICOS DE UNA SOLA CADENA La estructura bihelicoidal regular de la mayoria de las moleculas de DNA contrasta con la estructura de la mayoria de las moleculas de RNA. Sin embargo, las moleculas de RNA que se han estudiado con detalle parecen presentar una estructura definida. Solo un metoda puede dar un panorama detallado y completo de la distribucion

267

Plegamiento de 6cidos nucleicos de uno solo cadena

tridimensional de los ,ltomos en una molecula de acido nucleico: la cristalograffa de rayos X. La espectroscopia de resonancia magnetica nuclear da informaci6n menos completa pero no obstante detallada de la conformaci6n de los acidos nucleicos. Sin embargo, ambas tecnicas suelen utilizarse muy poco en el caso de moleculas de mas de 100 residuos de nucle6tido. Al igual que las proteinas, puede considerarse que los acidos nucleicos tienen varios niveles de estructura. La estructura primaria es, en efecto, la secuencia de los residuos de nucle6tido. Se considera que la estructura secundaria son las helices

r-----------------------------------. -----------------3

t 5'

I

I

A

pG - - C

..

C

G

G --

C70

G

U

I Brazo aa

As-- U

U

Brazo 0

-I

A

Brazo T

I I

U -- A G65 A CAe

D

I

IIII A

t"

Nucle6tido constante

O --

Purina 0 pirimidina constantes

C C A

G

A

'I'

@

IIII Asa V

G Brazo ac

u A

I I I I

I I

Gm 5' - - - - - - 1•• 3' Anticod6n

3' ......1 - - - - - - - - - - - - 5 ' Cod6n de RNAm

I

I

___ J

FIGURA 6.8 Secuencia de nucleotidos del tRNA de fenilalanina de levadura, representada en la configuracion de hoja de trebol. Los drculos grises son constantes en todos los tRNA y los drculos claros indican las posiciones que son ocupadas constantemente ya sea por purinas 0 pirimidinas. Abreviaturas: A, adenosina; T, timidina; G, guanosina; C, citidina; U, uridina; D, dihidrouridina; 1/1, seudouridina; Y, un nucleosido de purina; m, metil; y m2, dimetil. Las Irneas indican puentes de hidrogeno. En esta estructura est6n definidos cuatro brazos y un asa_

268

Acidos nucleicos y sus componentes

regulares que pueden formarse por apareamiento de bases entre porciones cercanas o distantes de la cadena polinucleotida. La estructura terciaria esta representada por el apilamiento de bases y las interacciones entre los pares de estas que unen porciones distantes de la cadena polinucleotida y no originan estructuras helicoidales regulares. Las helices regulares tienen pares de bases que son principalmente del tipo de Watson y Crick, aunque ocurre el apareamiento de bases G:U que, al parecer, tiene una energfa apenas ligeramente menor que la del par A:U. Las interacciones terciarias suelen resultar de los tipos mas raros de apareamiento de bases. Se conocen las estructuras tridimensionales completas de solo unas cuantas moleculas de tRNA. En la figura 6.8 aparece la secuencia de nucleotidos del tRNA de fenilalanina de la levadura, dispuesta de tal modo que da un patron de apareamiento de bases amplio y que es consistente con la mayorfa de las secuencias de los tRNA conocidos. Es decir, en la figura 6.8 se muestra la estructura secundaria del tRNA de fenilalanina de la levadura. Notese el par de bases G: U del tallo helicoidal que une la region 3' con la region 5' de la estructura. Como se sefiala en la seccion 6.1, los RNA de transferencia tienen residuos de nucleotidos raros aparte de los cuatro residuos estandar. Notese el contraste que existe entre las figuras 6.8 y la 6.9, esta indica la estructura tridimensional del mismo tRNA derivado de cristalografia de rayos X. Existe el mismo apareamiento de bases, pero la conformacion de la molecula y las interacciones terciarias no pueden esperarse a partir de la estructura secundaria.

r------·-------------------·------ ·· -···---·---.·--l

I I

54

64

.-5'

~~~

I ,

1

I

I

Anticodon

_ _______ ._.____.__________._._______...J FIGURA 6.9 Modelo esquemotico del tRNA de fenilalanina de levadura derivado de un mapa de densidad electr6nica del tRNA cristalino . Vease 10 figura 6.8 para las definiciones de brazos y asas de 10 estructura secundaria. (Fuente : cortesla de S. N. Kim) .

Plegamiento de 6cidos nucleicos de una sola cadena

269

FIGURA 6 . 10 Modelo de 10 estructura secundaria del RNA ribosomal 16S de E. coli . EI plegamiento propuesto para este RNA de 1542 residuos de nucleotido se deriva de varios datos qufmicos y biologicos. (Fuente: H. F. Noller y C. R. Woese, Science 2 12 :403 (1 981 ), con autorizacion) .

270

Acidos nucleicos y sus componentes

Se sabe muy poco de las estructuras tridimensionales de las moleculas de acido nucleico mas grandes. Los metodos que se han utilizado para estudiar macromoleculas de RNA incluyen: 1) mediciones de la ruptura del RNA mediante (0 por reaccion con) nucleasas y reactivos qufmicos que son sensibles a la estructura secundaria de la molecula, 2) reaccion con agentes de union transversal entrecruzantes y 3) observaciones de relaciones filogeneticas. Estos metodos presentan incluso el potencial de dar informacion limitada sobre las interacciones terciarias. AI hacer comparaciones filogeneticas, se seleccionan ejemplos del mismo tipo funcional de RNA de varios organismos distintos. Si las moleculas tienen secuencias muy similares, entonces las pocas diferencias existentes entre ellas pueden dar claves sobre el patron de plegamiento del RNA. Por ejemplo, al comparar dos moleculas de RNA, un residuo A de una posicion particular en una molecula puede ser sustituido por un residuo C en la otra. Asimismo, si en una segunda posicion de la secuencia un residuo U es sustituido por un residuo G, puede esperarse que las posiciones primera y segunda de cada una de las moleculas esten asociadas por un apareamiento de bases de Watson y Crick. En la figura 6.10 se muestra un modelo de la estructura secundaria del RNA ribosomal de E coli.

6.9

MUTAGENESIS La mutagenesis es la induccion de un mutante, 10 cual significa que se trata de un organismo 0 de una molecula de acido nucleico de caracter genetico alterado. Los mutantes se originan de alteraciones en las secuencias de nucleotidos. Los mutantes se inducen de muchas formas. En ellaboratorio, se han inducido con mas frecuencia mediante radiacion 0 tratando qufmicamente al organismo 0 su acido nucIeico, o bien aplicando agentes mutagenos al organismo 0 a un sistema en el cual el acido nucleico se esta duplicando. Mas recientemente, los avances en la sfntesis de oligonucleotidos (recuadro 6.G) permiten controlar con precision la mutagenesis mediante la sfntesis programada de secuencias alteradas . Un ejemplo de reactivo mutageno es el bisulfito. EI bisulfito reacciona especfficamente con los residuos de citidilato del RNA y los convierte en residuos de uridilato a traves ie la siguiente secuencia de reacciones:

· C NH

HSO:3 \.

"::N

I

~

N I R

•

0

Dos ejemplos de mutagenos in vivo son el 5-bromouracilo y la 2-aminopurina. El bromouracilo, gracias a su equilibrio tautomerico alterado comparado con el de

Mutagenesis

RECUADRO 6.G

271

SiNTESIS QUiMICA DE OLiGODESOXIRRIBONUCLEOTIDOS

La combinaci6n de las refinadas metodologfas de la qufmica organica y del DNA recombinante da al bioqufmico la oportunidad de producir polinucle6tidos de casi cualquier secuencia de nucle6tidos deseada, para crear acid os nucleicos que no pueden obtenerse de fuentes naturales. Con frecuencia, el aspecto qufmico de esta combinaci6n toma la forma de un sintetizador automatizado de 0ligodesoxirribonucle6tidos, el cual saca ventaja de la tecnologfa del soporte s61ido similar a la que se utiliza en la sfntesis de oligopeptidos (recuadro 3.D). Los residuos de nucle6tido qufmicamente modificados se aiiaden secuencialmente a la cadena de polinucle6tidos, la cual esta unida por su extrema 3' a un soporte s6lido de esferas polimericas o cristalinas. Gracias al soporte s6lido, la purificaci6n de los intermediarios de polinucle6tido entre las etapas del proceso de sfntesis es simpiemente cuesti6n de lavar las esferas de resina. Los sintetizadores disponibles en el mercado permiten obtener 0ligodesoxirribonucle6tidos de 50 6 incluso 100 residuos en cantidades micromolares. Por otra parte, se han creado varios sistemas para sintetizar enlaces fosfodiester entre los residuos de desoxinucle6sido. Uno de los procedimientos que se utiliza mas ampliamente, la qufmica de la fosforamidita, no requiere esteres de fosfato como material de inicio para la sfntesis. EI atomo de f6sforo en un ester de fosfato esta en el estado de oxidaci6n +5, mientras que un ester de fosfito esta en el estado de oxidaci6n + 3. Ambos se muestran a continuaci6n en el estado total mente protonado.

o i

o i R-O-P-OH I

R-O-P-OH

Ester de fosfato

Ester de fosfito

OH

Una fos foramidita es una amida de fosfito. A continuaci6n se muestra la estructura de un derivado de fosforamidita de desoxicitidina, el cual se utiliza en la sfntesis de 0ligodesoxirribonucle6tidos.

Los grupos reactivos de los derivados de fosforamidita de desoxinucle6sido deben bloquearse qufmicamente para evitar qlle ocurran reacciones secundarias indeseables durante el acoplamiento que origina la

272

Acidos nucleicos y sus componentes

formaci6n de nuevos enlaces fosfodiester en el polinucleotido. La base citosina del derivado de fosforamidita de desoxicitidina es bioqueada por un grupo benzoilo, mientras que ei grupo hidroxilo 5' de este y otros reactivos de fosforamidita de desoxinucleosido son bioqueados con un grupo de dimetoxi-tritilo en un enlace de eter que es especiaimente labil en acido. La serie de reacciones al terminG de este recuadro muestra las primeras etapas en la sfntesis de un oligodesoxirribonucleotido. EI residuo de nucleosido que esta mas proximo al extrema 3' del producto final entra a la reacci6n acoplado mediante su grupo hidroxilo 3' al soporte s6lido. La base de este nucleosido, asf como las bases de los residuos de nucle6tido que se aiiaden subsecuentemente, excepto la timina, requieren bloqueos apropiados. El grupo hidroxilo 5' del desoxinucle6sido tiene la capacidad de desplazar al grupo bi-isopropil amido protonado de la fosforamidita en la reacci6n de acoplamiento . En la segunda etapa, se forma un enlace fosfotriester estable mediante oxidacion con yodo del aromo de fosforo de su estado + 3 al estado + 5. Los acidos suaves eliminan el grupo de dimetoxitritilo, pero no el grupo metoxi del fosfotriester 0 los grupos bloqueadores de las bases. De esta manera, el producto unido al soporte de la serie de reacciones posee en esta etapa un grupo hidroxilo 5' libre, con 10 cual esta listo para reaccionar con la fosforamidita de desoxinucleosido del residuo que corresponde a la base B,,_2' La continuacion de estos ciclos hace que la cadena de polinucle6tidos crezca en la direcci6n 3' - 5' . AI termino de la serie de reacciones, los grupos metilo de los fosfatos y los bloqueadores de las bases de desoxirribonucleosido se eliminan mediante incubaci6n en un disolvente organico alcalino, mientras que el polinucleotido es removido de la resina tratandolo con hidr6xido de amonio. Despues de purificar el producto, el grupo 5' -dimetoxitritilo se elimina para dar el oligodesoxirribonucleotido.

OCH] H

!- 0 ---

I

I

.

I

;-) ----- l'-l '-- C. H,

I

DMTr-O~

H C3 7

'

-0-1

+ HO

\ Bn

So porte s61ido

DMTr-O

DMT' -

Soporte s61ido

Nuc/eoproteinas

273

la timina, puede formar pares de bases con residuos A 0 G. La 2-aminopurina puede formar pares de bases con la citosina 0 timina/uracilo.

o B r 0 N/ H

lN~O I

H Bromouracilo

2·Aminopurina

La mayorfa de las mutaciones son desventajosas para un organismo y su descendencia. La mutagenesis tambien esm asociada con la carcinogenesis. Por 10 tanto, los mutagenos, aun cuando sean herramientas utiles en bioqufmica y genetica, deben manejarse con cuidado y conservarse adecuadamente.

6.10

NUClEOPROTEiNAS Cuando las celulas se rompen , la mayor parte del DNA y el RNA existentes en ellas se liberan como complejos de protefna, en lugar de acidos nuc!eicos libres. Estos complejos de nucleoproteina 0 nucleoproteinas, aunque son estables a los tratamientos para romper las celulas, general mente carecen de uniones covalentes entre el acido nuc!eico y la protefna. Los bioqufmicos Haman tambien a estos complejos ribonucleoproteinas y desoxirribonucleoproteinas. Verbigracia: la cromatina, la desoxirribonuc!eoprotefna que representa la mayor parte de la mas a de los cromosomas eucarioticos, y los ribosomas, las partfculas de ribonuc1eoproteina en las cuales se forman los enlaces peptfdicos durante la biosfntesis de protefnas. Las partfculas virales tambien son nuc1eoprotefnas 0 las contienen . Algunas particulas virales son las nuc!eoprotefnas mas estables que se conocen, debido quiza a su necesidad de sobrevivir en ambientes extracelulares. A causa de la complejidad de las nucleoprotefnas, el estudio de dichas partfculas no solo requiere las tecnicas de la bioqufmica de protefnas y acidos nucleicos, sino tambien otras tecnicas. A continuaci6n se describiran, como ejemplo de como pueden estudiarse las nucleoprotefnas, algunos de los experimentos que han permitido definir parcialmente la estructura de la cromatina.

6.10.1

CROMATINA Los anal isis ffsicos muy elaborados han revelado que, cuando menos, algunos cromosomas eucari6ticos tienen una sola molecula de DNA con un peso molecular de

274

Acidos nucleicos y sus componentes

mas de 1010. De esta forma, en el caso de un organismo multicromosomico, varias moleculas de DNA con longitudes de mas de 10 7 !Lm deben concentrarse en el nucleo de casi lO!Lm de diametro. EI DNA no solo debe concentrarse; debe compactarse en tal forma que pueda duplicarse y servir de molde para la sfntesis del RNA (capftulo 19) sin exceder los lfmites del nucleo. La cromatina, que puede definirse funcionalmente como la desoxirribonucleoprotefna que se libera cuando el nucleo se rompe, consta de casi dos terceras partes de protefna y una tercera parte de DNA, con cantidades mas pequeiias de RNA y otros compuestos. La porcion protefnica de la cromatina consta de un 50% de histonas, que son protefnas basicas que se unen con firmeza al DNA y neutralizan casi una quinta parte de la carga ionica de los grupos fosfodiester del DNA. Las histonas se dividen en cinco grupos: HI, H2A, H2B, H3 y H4. Comparada con las demas histonas, con peso molecular de 11 000 a 14 500, la HI es mas grande, con un peso molecular de 21 000. La HI posee tambien una relacion mucho mayor entre residuos de lis ina y arginina 10 cual es caracteristico de otras histonas. La HI varia de una especie a otra y de tejido a tejido, mientras que la H3 y la H4 son bastante constantes en todos los tejidos de plantas y animales e incluso en las levaduras. Las histonas H2A y H2B muestran un grado de conservacion intermedio. Las protefnas "no histonicas" restantes tienen muchos mas miembros y se presentan a una concentracion mucho menor que las protefnas histonicas. Entre las protefnas no histonicas hay probabies reguladores y catalizadores de la expresion genetica, mientras que las protefnas histonicas actuan quiza fundamentalmente para controlar el plegamiento de la doble helice del DNA. EI tratamiento de cromatina purificada con bajas concentraciones de una nucleasa como la nucleasa de Micrococcus tiene un efecto notable sobre la estructura del DNA de doble cadena aislado de la cromatina parcial mente digerida. La electroforesis en gel de agarosa de cromatina tratada con nucleasa produce una "escalera" de zonas que a primera vista asemeja las escaleras que se obtienen en los experimentos para determinar las secuencias del DNA (recuadro 6.C). Sin embargo, los "peldaiios" de esta escalera esmn separados no por diferencias de un residuo de nucleotido, sino por incrementos de casi 200 pares de bases. Como se muestra en la figura 6.11, se observan zonas que corresponden a 200,400,600, 800 (y asf sucesivamente) pares de bases. Diferentes nucleasas dan el mismo resultado, 10 cual indica que es la conformacion y disponibilidad del DNA y no la especificidad de la nucleasa el factor que determina el patron de degradacion de la cromatina. Los tratamientos graduales y cada vez mas vigorosos de la cromatina con nucleasas causan cambios en el patron del DNA aislado de la cromatina tratada. La mayor parte del DNA es llevado a la zona de 200 pares de bases y, despues de tratamientos mas fuertes con nucleasa, incluso hacia las zonas que migran mas rapidamente. La cromatina que tiene su DNA degradado para formar la escalera de 200 pares de bases tambien posee una composicion qufmica simple. Por cada 200 pares de bases del DNA, la cromatina tratada tiene una molecula de histona HI y dos moleculas cada una de las histonas H2A, H2B, H3 Y H4. Esto corresponde a la composicion de la partfcula de cromatina que es la fuente del fragmento de DNA de 200 pares de bases, el nucleosoma. El tratamiento adicional de los nucleosomas con nucleasa remueve entre 30 y 35 pares de bases del DNA, pero no altera la composicion de las protefnas histonicas. Se considera que el DNA removido forma parte de un "eslabonador", un segmento de la cadena de DNA que no esm unido firmemente a las protefnas histonicas y al parecer une los segmentos de casi 165 pares de bases que esttin protegidos por la

-

Nuc/eoproteinas

275

FIGU RA 6.11 An61isis de la escision del DNA de doble cadena de la cromatina mediante tratamiento moderado con nucleasa. La cromatina tratada se expuso a un sistema bifOsico de fenol y agua para separar las proternas antes de realizar la electroforesis del DNA en un gel de agarosa.

histona. La desoxinucleoproteina residual, con una molecula de HI y dos moleculas cada una de las otras cuatro proteinas histonicas, se conoce como cromatosoma. Un tratamiento aun mas vigoroso del cromatosoma con nucleasa reduce el contenido de DNA hasta casi 147 pares de bases y libera la histona HI. El resultado es el mideo del nudeosoma. Las fibras de cromatina, los cromatosomas y los nucleos de nucleosoma han sido objeto de much as clases de analisis, incluyendo las extracciones diferenciales para determinar que enlaces intermoleculares resisten que disolventes, la union quimica entrecruzada de proteinas para determinar que proteinas estan proximas entre si en la estructura de la desoxinucleoproteina, y la difraccion de neutrones y de rayos X para conocer las posiciones relativas del DNA y las moleculas de proteina e incluso para delinear las cadenas del DNA y las proteinas. Esta gran diversidad de informacion ha revelado el esquema general de la estructura de la cromatina y sus productos de degradacion con nucleasa. Los nucleos de nucleosoma tienen una estructura sorprendente. El DNA no esta encerrado en la estructura del nucleosoma, sino que existe como dos vueltas de una helice. Esto es , en realidad, una superhelice, una helice "izquierda" de DNA B helicoidal de quiralidad "derecha"'formada en torno a un centro de proteina, como se indica en la figura 6.12. El resultado es una estructura en forma de disco. La rigidez inherente de una helice de DNA B requeriria 1500 mas pares de bases de DNA para formar un circulo sin que se deforme excesivamente la estructura del DNA B. Por 10 tanto, no es sorprendente que las vueltas de 100 pares de bases del nucleosorna esten deformadas. Tienen "defectos" en la estructura del DNA B, irnpuestos quiza por la interaccion del DNA y las histonas. El nucleo del nucleosoma es un tetramero de dos histonas H3 y dos H4. Los dimeros H2A-H2B se localizan en las "caras" de los discos. En el siguiente nivel de complejidad, el cromatosoma, la histona HI parece "sellar" las dos vueltas de la superhelice de DNA. La cromatina misma tiene otro nivel de estructura helicoidal, una helice de nucleosomas. En esta ultima helice, cuya estructura no se conoce muy bien, el eje mayor de los cilindros de la proteina HI (figura 6.12) probablemente es perpendicular a1 eje de la nueva

276

Acidos nucleicos y sus componentes

FIGU RA 6.12 Disposicion del DNA y la proterna en un nucleosoma, la unidad repetitiva de la cromatina. Dos vueltas de la superhelice de DNA, representadas en la ilustracion como un tubo retorcido, rodean a un nucleo de proterna, como se describe en el texto . La proterna H1 en forma de ci!indro se muestra a la derecha.

Mlice. Asimismo, niveles de plegamiento de orden min mayor contribuyen a la capacidad del mic1eo para contener la estructura bastante larga del DNA cromos6mico.

6.10.2

RIBOSOMAS El ribosoma es el mas abundante de los organelos subcelulares. Existe en la mayoria de las celulas de cualquier organismo celular. Debido a su abundancia y purificaci6n relativamente sencilla, los ribosomas, en particular los de los microorganismos y el hfgado de rata, se han estudiado desde la decada de 1950. Los ribosomas se obtienen rompiendo celulas de E. coli en soluci6n amortiguada de MgC1 2 5 mM Y centrifugando el extracto a alta velocidad, empleando para ella tecnicas simi lares a las descritas en el recuadro 4.B. Aproximadamente el 50% del peso seco de la porci6n soluble de las celulas bacterianas son ribosomas, la mayorfa de los cuales son de un tipo de partfcula denominada ribosoma 70S. Dado que esta partfcula se afsla mediante centrifugaci6n, no es sorprendente saber que recibe este nombre por la velocidad a la cual se sedimenta en un campo centrffugo, 70 unidades Svedberg (vease el recuadro 4.B). EI ribosoma 70S es la estructura de la celula bacteriana en la cual se forman los enlaces peptfdicos durante la sfntesis de protefnas (capftulo 20). Aunque es muchas veces mas complejo que una molecula de protefna 0 de tRNA, el ribosoma posee no obstante una estructura regular que se ha analizado con exito mediante metodos ffsicos, qufmicos y geneticos. Esta compuesto casi en su totalidad de RNA y protefna, con pequeiias cantidades de poliaminas como la espermidina, H2N-(CH2h-NH-(CH2)4-NH2, y iones metalicos como el magnesio. Uno de los primeros indicios que llev6 al descubrimiento de esta estructura fue la exposici6n del ribosoma 70S a una soluci6n amortiguada de MgCI2 0.5 mM, una concentraci6n del ion metalico bivalente que es una decima parte de la que suele

Nuc/eoproteinas

277

utilizarse para aislar dicho ribosoma. El ribosoma 70S se disoci6 en las subunidades ribosomales 50S y 30S. Ribosoma 70S ~ Subunidad ribosomal 50S

+ Subunidad ribosomal 30S

Es decir, la concentraci6n reducida del ion magnesio desplaz6 el equilibrio de la reaccion a la derecha. Por supuesto, debido a su funcion en la sfntesis de protefnas, los ribosomas estin presentes en casi todas las celulas de los eucariotes. Una de las pocas excepciones es el eritrocito maduro de los mamfferos, el cual pierde su complemento de ribosomas y su nueleo durante su desarrollo. Los ribosomas de los eucariotes son un poco mas .grandes que los de los procariotes y reciben el nombre de ribosomas 80S. Los ribosomas 80S se disocian tambien al menos parcialmente cuando disminuye la concentracion del ion magnesio, en los ribosomas 60S y 4OS. En la tabla 6.3 se comparan algunas de las propiedades de los ribosomas de las celulas procari6ticas y eucari6ticas. La mayorfa de los ribosomas procari6ticos tienen propiedades muy similares; se observa mas variacion entre los ribosomas eucarioticos. Dos organelos importantes de los eucariotes, las mitocondrias y los eloroplastos, tienen ribosomas. Sin embargo, los ribosomas de estos organelos se asemejan a los ribosomas de las bacterias en mayor grado que a los ribosomas citoplasmicos de los eucariotes, 10 que refleja quiza un origen procariotico evolutivo de las mitocondrias y los eloroplastos. Los ribosomas de las bacterias son los que mejor se han estudiado. Aunque los ribosomas citoplasmicos de los organismos eucarioticos son mas grandes y mas complejos que los de las bacterias, e ineluyen en ellos un tipo adicional de RNA, el RNA 5.8S, ambos tipos de ribosomas poseen una organizacion similar en cuanto

TABLA 6.3

Ribosomas y sus componentes

Procariotes 70s

Fuente Peso de la partfcula Fracci6n de RNA en la masa Subunidad grande Tipo de RNA

Protefnas Numero Intervalo de peso molecular Subunidad pequeiia Tipo de RNA Protefnas Numero Intervalo de peso molecular

Nota: m

=

2.7 X 10 6 -57%

50S 23S

Eucariotes (citop/asma) 80s 4.3 X 10 6 -59% 60S

26S-28S

(2904 nt, E. coli) 5S (120 rn)

( - 5100 rn, hfgado de rata) 5S(118 nt) 5.8S (150 rn)

32 5381-24599

-50 12 000-42 000

30S 16S

40S 18S

(1542 nt, E. coli)

(1789 nt, levadura)

21 8369-26 613 para S2 hasta S21; Sl, 61 159

-30 11 000 - 42 000

residuos de nucle6tido; las prote(nas de lao subunidad 30S de los ribosomas de E . coli se designan can SI a 511.

278

Acidos nucleicos y sus componentes

a RNA y protefnas. Se han hecho muchas analogfas de estructura y funci6n entre las protefnas de cada tipo de ribosoma. Aquf s610 se estudiani brevemente la subunidad 30S del ribosoma de E. coli. Los metodos de estudio de la estructura de la nucleoprotefna que se han aplicado a la cromatina, en particular el entrecruzamiento qufmico (de protefna a protefna y de protefna a RNA) tambien se han aplicado a los ribosomas. Ademas, el conocimiento que se tiene de los ribosomas ha sido aumentado por: 1) el estudio de mutantes con protefnas ribosomales alteradas 0 incluso faltantes, 2) las observaciones, al microscopio electr6nico, de los sitios en la superficie de los ribosomas a los cuales se unen anticuerpos contra protefnas ribosomales especfficas y 3) la capacidad para ensamblar subunidades ribosomales provenientes de protefnas ribosomales y RNA ribosomal purificados. A diferencia de la estructura del nucleosoma, el acido nucleico y la protefna del ribosoma parecen unirse a 10 largo de toda la partfcula, con el RNA, en promedio, ligeramente mas al centro que las protefnas. La subunidad ribosomal 30S de E. coli es una partfcula ligeramente alargada con dimensiones de aproximadamente 11 X 11 X 23 nm. Como se indica en la figura 6.13, esta partfcula tiene una constriccion 0 cuello. Muchas de las funciones importantes de la subunidad 30S que se ha demostrado son necesarias para la sfntesis de protefnas (capftulo 20) se han asociado con protefnas localizadas en una region de dicha constriccion, a la izquierda del esquema de la figura 6.13. Se conocen las posiciones de muchas de las 21 protefnas de esta subunidad y algunas se indican en la figura antes mencionada. La protefna SI es notable no s610 por su gran tamano (tabla 6.3), sino tambien porque esm unida menos firmemente a la partfcula 30S que las otras protefnas y puede disociarse y reasociarse con la partfcula.

6.10.3 VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO Las partfculas virales, la forma extracelular infecciosa del virus (v ease el capftulo 22), se denominan viriones. Los viriones del virus del mosaico del tabaco (VMT), el primer virus de plantas que se estudi6 con gran detalle, poseen una estructura

FIGURA 6.13 Disposicion de algunas de las prote!nas de la subunidad ribosomal 305 de la bacteria E. coli. En su mayor dimension, la part!cula tiene casi 23 nm. Se indica la localizacion de algunas de las 21 prote!nas de la subunidad 305 51, 53 y as! sucesivamente, as! como los extremos 3' y 5' del RNA ribosomal 165. (Fuente: adaptada de H. G. Wittmann, Annual Reviews of Biochemistry, Vol. 52 (1982), pp. 35-65).

Nuc/eoproteinas

279

mucho mas regular que los ribosomas. El peso de la partfcula es de casi 40 X 10 6 y consta de un 95 % de protefna y 5 % de RNA. El RNA de este virus es una sola moh!cula de casi 6 400 residuos de nucle6tido. La protefna, Hamada protefna de la capside del VMT, es de un tipo, con un peso molecular de 17 500. Los viriones del VMT son cilindros rfgidos de estructura helicoidal de aproximadamente 300 nm de longitud y 18 nm de diametro, con una cavidad central 0 poro a todo 10 largo del cilindro. Este presenta una estructura uniforme en toda su longitud. El aspecto de un segmento del VMT se muestra en la figura 6.14, la cual representa aproximadamente el 20% de la longitud total del virus. La estructura del VMT se conoce con detaHe gracias a los estudios de difracci6n de rayos X de los cilindros y de la protefna aislada de la capside de dicho virus. En promedio existen tres residuos de nucle6tido del RNA asociados con cada subunidad de protefna. La estructura helicoidal del RNA aparece entre las subunidades de protefna dispuestas helicoidalmente, como puede observarse a la izquierda de la figura 6.14. H. Fraenkel-Conrat y colaboradores descubrieron en la decada de 1950 c6mo aislar la protefna de la capside y el RNA del VMT. Mezclaron estos componentes en soluci6n amortiguadora de fosfato a pH neutro, y encontraron que las partfculas infecciosas se formaban espontaneamente al cabo de algunas horas. Esta fue la primera demostraci6n de dicha reacci6n bio16gica de ensamblaje espontaneo. Las partfculas formadas mostraron las propiedades de autenticos viriones del VMT de las plantas, como se demostr6 mediante varias pruebas. Mucho despues, las condiciones de reacci6n se modificaron para lograr el ensamblaje al cabo de unos minutos. La reacci6n de ensamblaje se ha estudiado con bastante detalle. La protefna que reacciona inicialmente con el RNA del VMT no es la protefna dispersa de la capside, sino probablemente agregados helicoidales de casi 30 a 40 moleculas. Contrariamente a 10 que se esperaba inicialmente, el agregado de protefnas no se une ni al extrema 3' ni al extremo 5' del RNA del VMT, sino a una secuencia especffica que se encuentra a aproximadamente 15 % de la distancia entre el extremo 3' Y el extremo 5', cerca del residuo 5 500. 5' ... GA\.

G G GAAGA GACG AGGG--CCCAU GAACUUA--CA A CUGU UCCC GGUA--CUUGAGU GU G A U A A UGCU 3' ... AG I\,

/,

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A

UAG

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I

residua 5500

La figura 6.15 es un esquema del complejo inicial entre el RNA Y el agregado de protefnas de la caps ide del VMT. Una consecuencia interesante de estos mecanismos de iniciaci6n es que el extremo 5' del RNA debe pasar a traves del poro central del cilindro del VMT conforme se van uniendo mas protefnas de la capside. El complejo de RNA y protefnas de la figura 6.15b y c es helicoidal, y la conformaci6n helicoidal del RNA se muestra en el esquema, abajo del diagrama del complejo de iniciaci6n. N6tese que la porci6n del RNA que esta conectada al extremo 5' pasa a traves del poro central del complejo de ribonucleoprotefna. De esta manera, el RNA pasa gradualmente a traves del poro, de modo que el extremo denominado 5' de esta molecula se mueve hacia arriba en el esquema de la figura 6.15. Finalmente, el extremo del cilindro del virus que protege al extremo 5' del RNA sera

280

Acidos nucleicos y sus componentes

FIGURA 6.14 Estructura de las partfcu las del virus del mosaico del tabaco. Se representa 10 helice "derecha" de RNA y protefna, en 10 que coda molecula de protefna de 10 c6pside tiene el aspecto de un zueco y el RNA tiene 10 forma de un collar de cuentas, una cuenta por coda residuo de nucle6tido. (Fuente: modificado de P.J.G. Butler, Journal of General Virology, Vol. 65 (1984), pp . 253-279 con autorizaci6n).

+ Proteina

agregada de la capside del VMT

3'

5' 3'

5' 3'

(a)

5'

5'

(b)

(c)

FIGURA 6.15 Primeras etapas del mecanisme de ensamble del virus del mosaico del tabaco. Parte de la molecula de RNA de este virus se muestra en a), que corresponde a una regi6n que tiene cosi 1100 residuos de nucle6tido a partir del extremo 3' . Esta regi6n reocciono con el ogregodo de protefnos de 10 c6pside del VMT para iniciar el ensamble de 10 partfcu la viral, como se indica en b). Conforme avanza el ensamble, un mayor numero de protefnas se anade al complejo en ellado distante al observad~r en b), dando el resultado observado en c).

Actividades cataliticas y de otro tipo del RNA

281

el extremo mas distante al observador en (c), una vez que el RNA ha pasado totalmente a traves del poro. El sistema del VMT ilustra varios principios. Al utilizar muchas copias de un solo tipo de protefna de la capside, el virus produce una estructura grande y estable y protege al RNA existente en el diffcil ambiente extracelular mediante la participaci6n de un solo gene, el gene de la protefna de la capside. Esta protefna no s610 es capaz de proteger al RNA, sino de reconocer tambien una secuencia particular de residuos de nucle6tido en este acido para iniciar el proceso de ensamblaje, el cual es facilitado por un cambio complejo en la conformaci6n de la protefna. El RNA controla tambien la reacci6n de ensamblaje, puesto que debe plegarse de tal forma que s610 exista un origen de ensamblaje. Dos orfgenes no serfan compatibles con el movimiento del RNA del VMT a traves del poro central de la ribonucleoprotefna. La reacci6n es esponillnea y no requiere gasto alguno de energfa 0 facilitaci6n por una enzima, 10 cual demuestra que el RNA y la protefna de la capside libres estan a un nivel de energfa mayor que el cilindro del VMT ensamblado y pueden facilitar sus propias reacciones de ensamblaje.

6.11

ACTIVIDADES CATALiTICAS Y DE OTRO TIPO DEL RNA Como ya se mencion6 en el capftulo 4, la gran mayorfa de los catalizadores bio16gicos son protefnas. Las moleculas del RNA ribosomal no s610 contribuyen a la estructura, sino tambien al funcionamiento de los ribosomas durante la sfntesis de protefnas, como se describe en el capftulo 20, y otras moleculas de RNA presentan reactividades qufmicas especfficas asociadas a protefnas. S610 algunas moleculas de RNA muestrandichas reactividades en ausencia de protefnas. La enzima ribonucleasa P de las bacterias cataliza la ruptura de una molecula de RNA que posee las secuencias de nucle6tidos de una 0 mas moleculas de tRNA, asf como tambien otras secuencias. Los productos son RNA de transferencia y fragmentos de RNA que contienen las secuencias adicionales. La ribonucleasa Pesta formada por una cadena polipeptfdica de peso molecular de 17 000 Yuna molecula de RNA de 400 residuos de nucle6tido. Ambas moleculas son necesarias para la actividad de la ribonucleasa P en condiciones fisio16gicas. Sin embargo, si la concentraci6n del ion magnesio aumenta a mas de 100 mM, valor que es varias veces la concentraci6n fisio16gica, la porci6n de RNA, el RNA de la RNasa P, cataliza la reacci6n de la ribonucleasa P utilizando moleculas precursoras autenticas de tRNA como sustratos. Es decir, se rompe un enlace fosfodiester, y es este mismo enlace el que es atacado por la ribonucleasa P completa. Se desconoce el mecanismo de esta reacci6n. Sin embargo, es evidente que no se requiere protefna alguna para la reacci6n que ocurre a alta concentraci6n de magnesio y que el RNA de la RNasa P actua como un verdadero catalizador, convirtiendo muchos moles de sustrato en producto sin que experimente modificaci6n alguna. La reacci6n presenta dependencia hiperb6lica (en cuanto a su cinetica) respecto de la concentraci6n de sustrato y un pH 6ptimo. De esta forma, es razonable suponer que la cadena polipeptfdica de peso molecular de 17 000 de la ribonucleasa P nativa funciona principalmente para estabilizar una conformaci6n activa del RNA de la RNasa P, en vez de catalizar la reacci6n que es caracterfstica de la enzima. Asimismo, se ha estudiado ampliamente una reacci6n de "autoempalme" del RNA. El RNA ribosoma126S del protozoario Tetrahymena se forma como precursor que tiene una secuencia de 413 nucle6tidos insertos en 10 que serfa el rRNA

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270

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FIGURA 6.16 Secuencia de nudeotidos y probable estructura secundaria del viroide del tuberculo fusiforme de 10 papa. Con fines de daridad se representa el asa de RNA de 359 residuos en tres Irneas. Las Irneas verticales muestran el apareamiento de bases y 10 numeracion de los residuos se indica a intervalos de 30.

"0

o

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C1>

'" it '"

Problemas de repaso

283

26S maduro. Este precursor reacciona con la guanosina y origina que la " secuencia intermedia" de 413 residuos (vease la secci6n 19.17) sea eliminada; despues los extremos del RNA 26S se unen para producir rRNA 26S intacto. No se requiere protefna alguna para que se efectue esta reacci6n espontinea in vitro. Es indudable que los RNA facilitan mucho menos reacciones bioqufrnicas que las protefnas catalfticas, las enzimas. Sin embargo, es posible especular que esto pudo no haber sido el caso en todas las etapas de la evoluci6n de la vida en la Tierra. Si tuviera que seleccionarse un tipo de molecula como la molecula primordial de la vida de entre las macromoleculas biol6gicas que se conocen hoy en dfa, dicha molecula serfa el RNA. El RNA es la unica macromolecula que puede ser tanto catalftica como portadora de informaci6n (vease el capftulo 19). Los viroides son los agentes infecciosos mas pequefios que se han caracterizado. Son cfrculos de RNA covalente, por 10 general de 400 6 menos residuos de nucle6tido, no cubiertos por protefnas de la capside. Infectan a plantas, se duplican en las celulas que han infectado yproducen copias de sf rnismos mediante un mecanismo que no implica al DNA, sino al proceso de transcripci6n de cadenas complementarias de RNA (vease la secci6n 19.1). En la figura 6.16 se muestra la secuencia de nucle6tidos y la estructura secundaria probable del primer viroide que se estudi6 ampliamente, el viroide del tuberculo fusiforme de la papa (VTFP). Este viroide tiene la capacidad de infectar papa, tomate y algunas otras plantas, asf como de duplicarse y causar enfermedad. Sin embargo, se desconoce aun el mecanismo por el cual este agente infeccioso con una estructura de s610 359 residuos de nucle6tido lleva a cabo todos estos procesos.

BI BLiOGRAFiA 1. R.L.P. Adams, R. H. Burdon, A.M. Campbell, D.P.Leader, and R.M. S. Smellie , The Biochemistry of the Nucleic Acids, 9th ed. London: Chapman and Hall, 1981. 2. V.A. Bloomfield, D.M. Crothers, and 1. Tinoco, Physical Chemistry of Nucleic Acids. New York: Harper and Row, 1974. 3. R. W. Old and S. B. Primrose, Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering. Los Angeles, Calif.: University of California Press, 1981 .

PROBLEMAS DE REPASO 1. Esquematizar las estructuras de las siguientes moleculas: a) 5-hidroximetilcitosina b) 5-0-metilguanosina

c) N-l-metiladenosina l,Que porci6n de azucar, si ese es el caso, tienen cada uno de estos compuestos? 2. Determinar la carga i6nica a un pH de 8 de los siguientes compuestos: a) Adenosina b) AMP

c) ADP d) Adenosfn-2' :3'-fosfato cfclico e) pdApdC

284

Acidos nucleicos y sus componentes

3. i,CuaJ es mas resistente a la degradacion a un pH de 11, el DNA 0 el RNA? i,Cual de los dos es mas resistente a la degradacion a un pH de 3? 4. Comparar los pares de bases A:T y C:G del DNA de doble cadena con respecto a: a) Grosor en direccion perpendicular al plano de las bases b) Estabilidad de los pares de bases a un pH de 12.5

c) Numero de puentes de hidrogeno d) Distancia entre los aromos C-l'

5. Se ha determinado que una muestra de DNA de doble cadena contiene 19% de timidilato como residuos de nucleotido. i,Cual debe ser el porcentaje de pares de bases G:C de este DNA? i,Como cambia la temperatura de fusion de un DNA de doble cadena con la composicion de bases? 6. Determinar la formula (secuencia de nucleotidos) de un oligodesoxirribonucleotido que deba formar un complejo de bases perfectamente apareadas con CpCtfipUtfipUpCpc. 7. l.Cuales son las dos fuerzas 0 enlaces que contribuyen considerablemente a la estabilidad de las estructuras especfficamente plegadas del DNA y el RNA? 8. Comparar las moleculas de RNA y DNA de doble cadena en cuanto a las siguientes propiedades: a) Estructura de las unidades monomericas b) Disposicion de los pares de bases respecto al eje de la Mlice

c) Temperatura de fusion

9. i,Que tipos de moleculas de RNA constituyen la mayor parte del RNA de una celula tfpica? 10. i,Que informacion ha contribuido a entender el plegamiento de las moleculas de RNA de "una sola cadena"? 11. Mencionar tres estructuras de nucleoprotefna. i,Que tipos de fuerzas y enlaces es probable que estabilicen dichas estructuras?