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Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)
Génie des procédés et de l'environnement Amanda Alejandra OLIVA HERNANDEZ jeudi 15 novembre 2012
Etude des capacités métaoliques de levures fructophiles isolées du Mezcal : comparaison cinétique et moléculaire (Evaluación cinética y molecular de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal tamaulipeco) Patricia TAILLANDIER Diana RESENDEZ PEREZ
Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS Amparo M. QUEROL SIMON Alberto MENDOZA HERRERA Claudia Patricia LARALDE CORONA Mécanique, Energétique, Génie civil et Procédés (MEGeP) chimique - LGC Laboratoire de génie Patricia TAILLANDIER Diana RESENDEZ PEREZ Anne Christine GSCHAEDLER MATHIS Amparo M. QUEROL SIMON
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE NUEVO LEÓN FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFÍLICAS AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO
Por AMANDA ALEJANDRA OLIVA HERNANDEZ
Como requisito parcial para obtener el Grado de DOCTOR EN CIENCIAS
Noviembre, 2012
1
EVALUACION CINETICA Y MOLECULAR DE LEVADURAS FRUCTOFÍLICAS AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO
Comité de Tesis
Dra. Diana Reséndez Pérez Director interno de la tesis
Dra. Patricia Taillandier Director externo de la tesis
Dra. Claudia Patricia Larralde Corona Secretario
Dra. Cristina Rodríguez Padilla Vocal
Dr. Jorge A. Verduzco Martínez Vocal
Dr. Pablo Zapata Benavides Vocal
2
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología Genómica del Instituto Politécnico Nacional bajo la asesoría de la Dra. Claudia Patricia Larralde Corona, y en el Laboratorio de Ingeniería Química del Institut National Polytechnique de Toulouse (Toulouse, Francia) bajo la dirección de la Dra. Patricia Taillandier, y con el apoyo económico
del
proyecto
CONACyT-Básica
2006-57576
“Análisis
metagenómico y de levaduras de alta actividad fructofílica durante la fermentación del mezcal tamaulipeco”, y de los proyectos institucionales SIP2008-0597 y SIP2009-0613 (Instituto Politécnico Nacional) “Caracterización cinética y molecular de la capacidad fructofílica de levaduras aisladas del mezcal tamaulipeco” de Febrero 2008 a Enero del 2010. A.A. Oliva Hernández agradece el apoyo de la beca nacional (CONACyT) así como el apoyo especial CONACyT PCP-2006, proyecto 04/06 “Levaduras fructofílicas aisladas de mezcal: comparación cinética y molecular de los procesos de elaboración del mezcal y del vino” de Enero del 2007 a Diciembre del 2010, en colaboración CBG-IPN y el INP-Toulouse (Toulouse, Francia).
3
AGRADECIMIENTOS
Gracias Dios por poner en mi camino todas las cosas bellas que ahora tengo. Gracias a mi familia querida por respaldarme, soportarme con amor y ser un firme apoyo en cada una de las decisiones y acciones que emprendo. Gracias mama, Amanda Leticia por darme tu mano cada vez que lo necesito, con ese incansable amor, estar siempre cerca y cuidar de mi tesoro más preciado, mis hijos, Arturo, Emiliano y Airam. Gracias a mi esposo Arturo, a mis hermanos Enrique, Lety y Cynthia por su cariño y apoyo. Profe Manuel de Jesús Hernández Monreal te quiero entrañablemente y le doy gracias a Dios por quien eres y porque te tengo, con tú gran cariño, ejemplo y apoyo incondicional has hecho crecer a los que te rodean. Y en lo personal has sembrado ideales, retos y acciones a seguir, siempre en el afán de que con un esfuerzo positivo y bien intencionado puedo lograrlo. Gracias a los Doctores Patricia Larralde, Diana Resendez, Patricia Taillandier, José Narváez por su trabajo y poner alma de artista en esta noble tarea al dirigir con fuerza misionera y mano delicada el trabajo que implica el quehacer científico, por contagiarme de ese espíritu de curiosidad y compromiso en aras de una idea. Gracias Doctor Felipe Ramón Portugal por tu apoyo y sobre todo tu amistad.
4
TABLA DE CONTENIDO
Sección
Página
AGRADECIMIENTOS .................................................................................................................... 3 LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... 8 LISTA DE FIGURAS ....................................................................................................................... 9 LISTA DE SIMBOLOS .................................................................................................................. 13 RESUMEN ...................................................................................................................................... 16 RÉSUMÉ ......................................................................................................................................... 18 1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 20 2
JUSTIFICACION.................................................................................................................... 22
3
HIPOTESIS ............................................................................................................................. 22
4
OBJETIVOS............................................................................................................................ 22 4.1. Objetivo general ............................................................................................................... 22 4.2. Objetivos particulares ...................................................................................................... 22
5
ANTECEDENTES .................................................................................................................. 23 5.1. Mezcal .............................................................................................................................. 23 5.2. La planta de Agave en Tamaulipas .................................................................................. 25 5.2.1. Tamaulipas región mezcalera, situación geográfica ................................................. 25 5.3. El proceso de elaboración del mezcal.............................................................................. 26 5.3.1. Selección de la planta ................................................................................................ 26 5.3.2. Cocción de las cabezas de agave ............................................................................... 27 5.3.3. Molienda.................................................................................................................... 29 5.3.4. Fermentación ............................................................................................................. 29 5.3.5. Destilación ................................................................................................................. 30 5.3.6. Envasado ................................................................................................................... 32
5 5.4. Microbiología del proceso de fermentación .................................................................... 32 5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae ..................................................................... 34 5.4.2. La fermentación alcohólica por S. cerevisiae.......................................................... 35 5.4.3. Tolerancia al estrés ambiental de S. cerevisiae y la producción de etanol .............. 37 5.5. Transporte de hexosas a través de la membrana celular en S. cerevisiae....................... 38 5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa .................... 39 5.5.2. El represor transcripcional RGT1 ............................................................................. 40 5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1 .............................................................................. 41 5.6. La regulación de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa ..................................... 43 6
MÉTODOS.............................................................................................................................. 48 6.1. Aislamiento de levaduras ................................................................................................. 48 6.1.1. Diseño del estudio y tamaño de la muestra ............................................................... 48 6.1.2. Tratamiento de la muestra ......................................................................................... 48 6.1.3. Clasificación microscópica ....................................................................................... 50 6.2. Identificación molecular .................................................................................................. 50 6.2.1. Extracción de DNA ................................................................................................... 50 6.2.2. Amplificación de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR ............... 52 6.2.3. Digestión enzimática del segmento ribosomal ITS’s ................................................ 52 6.2.4. Amplificación de los genes HXT1 y HXT3 .............................................................. 53 6.2.5. Identificación molecular por secuenciación .............................................................. 54 6.2.6. Construcción de dendogramas .................................................................................. 55 6.3. Fermentaciones ................................................................................................................ 55 6.3.1. Medios de cultivo ...................................................................................................... 55 6.3.2. Cuantificación de la biomasa. ................................................................................... 56 6.3.2.1. Espectrometría .................................................................................................... 56 6.3.2.2. Peso seco .......................................................................................................... 577 6.3.2.3. Cuenta celular ..................................................................................................... 57 6.3.3. Análisis de azúcares .................................................................................................. 57 6.3.3.1. Determinación de glucosa por un método enzimático ....................................... 57 6.3.3.2. Determinación de azucares totales por el método DNS ................................... 588 6.3.3.3. Cromatografía liquida de alta presión (HPLC) .................................................. 58 6.4. Cuantificación del estrés por etanol .............................................................................. 599 6.4.1. Parámetros cinéticos .................................................................................................. 59
6 6.5. Análisis estadístico ........................................................................................................... 60 7
RESULTADOS ....................................................................................................................... 61 7.1. Identificación molecular de las levaduras ....................................................................... 61 7.1.1. Análisis de restricción del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA) ........... 62 7.1.2. Amplificación del segmento ribosomal 26S ............................................................. 63 7.1.3. Identificación molecular por los segmentos ribosomales ITS’s y 26S ..................... 63 7.2. Caracterización de la productividad de las levaduras .................................................. 688 7.2.1. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa (M1) ..................................................................................................................................... 68 7.2.2. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa (M2) ................................................................................................................................... 722 7.3. Caracterización cinética de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica ............................................................................................................................. 755 7.4. Caracterización de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica en medio M3 .......................................................................................................................... 855 7.5. Caracterización de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ............................................................................................................ 91 7.6. Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ........................................ 91
8
DISCUSIÓN............................................................................................................................ 95 8.1 Identificación molecular de las levaduras ........................................................................ 95 8.2 Caracterización de la productividad de las levaduras ..................................................... 95 8.3 Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos ........................................ 99
9
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................................................... 103
10 APÉNDICES ......................................................................................................................... 104 Apéndice 1. Microfotografías de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas de mosto de mezcal. ............................................................................................................... 104 Apéndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal. ...................... 106 Apéndice 3. Secuencias ITS’s de las levaduras aisladas de mostos de mezcal .................... 110 Apéndice 4. Comparación de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 115
7 Apéndice 5. Comparación de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras seleccionadas por su fructofilia. ........................................................................................... 116 11
LITERATURA CITADA ...................................................................................................... 117
12 RESUMEN BIOGRÁFICO .................................................................................................. 135 PRODUCTIVIDAD ............................................................................................................... 135
8
LISTA DE TABLAS
Tabla
Página
I. Especificaciones físicas y químicas para la producción de mezcal
25
II. Composición de medios de cultivo
566
III. Parámetros cinéticos
59
IV. Aislados de levaduras con morfología redonda
61
V. Clasificación e identificación molecular de las levaduras aisladas de mostos de mezcal
64
VI. Parámetros cinéticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en glucosa (M1).
71
VII. Parámetros cinéticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en fructosa (M2)
74
VIII. Evaluación cinética al final de la fermentación de los aislados de S. cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1)
86
IX. Predicción de de la posición de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para los aislados de mostos de mezcal
94
9
LISTA DE FIGURAS
Figura
Página
Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Piñas de agave
27
Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno natural recubierto de piedra. (B) Piñas cocidas
28
Figura 3. Molino o “trapiche” metálico adaptado en forma transversal, accionado por tracción animal
29
Figura 4. Tinajas de fermentación de mostos de agave
30
Figura 5. Serpentín usado en destilación de mezcal
31
Figura 6. HXT1 Inducción de la transcripción solo por alta concentración (Ozcan et al., 1995)
44
Figura 7. HXT3 Inducción de la trascripción por glucosa independiente de la concentración de azúcar (Ozcan et al., 1995)
45
Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalería “El Palmar”. A) Piñas en cocción. B) Trapiche. C) y D) Mostos en fermentación
49
Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold™ 10 X. ADN de aislados de mostos de mezcal; en la tabla IV se especifica la identificación de las muestras...18 ADN de cepa control FECHA (Fermichamp)
51
Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT1 de aislados de mostos de mezcal
53
Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT3 de aislados de mostos
de
mezcal.
1=Oligonucleótidos
diseñados
por.
10
2=Oligonucleótidos diseñados por el Laboratorio de Biotecnología Industrial
544
Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con SyberGold™ 10 X. Amplificación de los segmentos ITS’s aislados con morfología celular redonda. Agua (C-) control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega, Estados Unidos)
622
Figura 13. ARDRA’s de aislados de mostos de mezcal. Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos)
622
Figura 14. Amplificación de genes ribosomales 26S. Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos) de las levaduras de morfología redonda aisladas de mostos de mezcal
633
Figura 15. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica de la región ribosomal 26S. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4
666
Figura 16. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica de la región ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4
677
Figura 17. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9)
699
Figura 18. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9)
70
11 Figura 19. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
733
Figura 20. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por S. cerevisiae en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
733
Figura 21. Cinética de fermentación a 30°C de 3D4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 9:1). Medio B) M2 (fructosa:glucosa 1:9)
766
Figura 22. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y2 Cinética. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
77
Figura 23. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y3. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
79
Figura 24. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
80
Figura 25. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y5. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) Figura 26. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y8.
82
A) Medio M1
(fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
83
Figura 27. Cinética de fermentación a 30°C de Fermichamp® (FECHA). A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1)
84
Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 100:100)
87
Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C) 3Y8 y D) Fermichamp® (FECHA) durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 1:1)
88
Figura 30. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1) Figura 31. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp®
89
12 (FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1)
90
Figura 32. Pérdida de viabilidad en células de levaduras Saccharomyces aisladas de mostos de mezcal a 30°C en 25% v/v de etanol. La viabilidad al 100% la representa el valor de 2 x 106 cfu/mL
91
Figura 33. Predicción de la conformación de los segmentos transmembranales de las proteínas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la secuencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae S288c y la posición de los polimorfismos de aislados de mostos de mezcal y la Fermichamp®
93
Figura 34. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. A) 3D2; B) 3D3; C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6
104
Figura 35. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3; H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8
105
Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen HXT1 de aislados de mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido
115
Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen hxt3 de Aislados de Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido
116
13
LISTA DE SIMBOLOS
C
Grados centígrados
l
Microlitro
M
Micromolar
A260
Absorbancia a 260 nm
A280
Absorbancia a 280 nm
ADN
Ácido desoxiribonucléico
ACP
Análisis de Componentes Principales
ADNg
Ácido desoxiribonucléico genómico
Als, A
Alanina
AMOVA
Análisis de Varianza Molecular
Arg, R
Arginina
ARN
Ácido ribonucléico
ARNasas
Ácido ribonucleasas
ARNm
Ácido ribonucléico mensajero
Asn, N
Asparragina
Pro, P
Prolina
Asp, D
Aspártico
C/N
Relación carbono-nitrógeno
CFU
Unidades formadoras de colonia
Cis, C
Cisiteina
CO2
Dióxido de carbono
CV
Coeficiente de variación
dNTPs
Desoxirribonucleósidos trifosfatados
DO550
Densidad óptica a 550 nm
EDTA
Ácido etilendiaminotetracético
G
Gramo
Gln, Q
Glutamina
14 Glu, E
Glutámico
Gly, G
Glicina
h
Hora
His, H
Histidina
HXT
Genes transportadores de hexosas
Ile, I
Isoleucina
kb
Kilobase
L
Litro
LB
Luria Bertani
Leu, L
Leucina
Lys, K
Lisina
M
Molar
M
Marcador de peso molecular.
Mb
Megapares de bases
Met, M
Metionina
mg
Miligramos
min
Minuto
ml
Mililitro
mM
Milimolar
ng μL-1
nanogramos por microlitro
nm
Nanómetros
ORF
Marco de lectura abierta
pb
Pares de bases
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
PDA
Agar papa dextrosa
pH
Potencial de hidrógeno
Phe, F
Fenilalanina
rARN
Ácido ribonucleico ribosomal
rpm
Revoluciones por minuto
s
Segundos
Ser, S
Serina
Thr, T
Treonina
Taq
ADN polimerasa de Thermus aquaticus.
TGY
Medio de cultivo de Triptona-Glucosa-Extracto de levadura
15 Trp, W
Triptófano
Tyr, Y
Tirosina
TM
Región transmembranal
U
Unidades
U μL-1
unidades por microlitro
UPGMA
Unweighted paired gropuing method with arithmethic average
UV
Ultravioleta
V
voltios
v/v
Volumen a volumen
Val, V
Valina
X
Veces de la concentración
g
Microgramo
l
Microlitro
16
RESUMEN Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados productores de mezcal más importantes, este producto mexicano puede contribuir a la economía del campo tamaulipeco provocando una derrama económica importante comparado con otros destilados de agave ya que además es una bebida que conserva la tradición de fabricación en empresas pequeñas con tradición, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades. A diferencia de la micoflora que interviene en el proceso de producción de otras bebidas alcohólicas, la micoflora responsable de la fermentación alcohólica del mezcal no ha sido completamente identificada ni caracterizada metabólicamente, es de gran interés industrial conocer si las levaduras nativas involucradas en la fermentación de mostos de agave poseen, en primer lugar, una fuerte naturaleza fructofílica (inducida por a la composición natural del mosto), y en segundo lugar, caracterizar a nivel cinético y molecular el tipo de transportadores involucrados en el consumo de la fructosa en estas cepa, ya que los estudios de la utilización de hexosas por Saccharomyces cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la glucosa, y no se ha observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la fructosa. En este trabajo la población a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente aislados) obtenidos de la mezcalería “El Palmar” del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos (Tamaulipas, México). La toma de muestra se efectuó en el horno de cocimiento; el trapiche (molino) y en las diversas etapas de los mostos en fermentación. Como control se utilizó la cepa Fermichamp ® (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructofílica. Se identificaron molecularmente por la secuencia ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 y 26S cinco grupos de microorganismos, 10 aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces bailii, tres de Torulaspora delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia mexicana. Se evaluaron cepas identificadas como S. cerevisiae en tres medios diferentes M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (glucosa:fructosa 1:1). Las cepas destacadas en el consumo de azucares en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp®; en M2 los mejores fueron 3Y2, 3Y4 y 3Y8; en M3 fueron 3Y3, 3Y5 y 3Y8. Además se evaluó la
17 resistencia a etanol encontrándose que la cepa con que presento mayor porcentaje de viabilidad fue la cepa 3Y8. El análisis de las secuencias de los trasportadores de hexosas de Hxt1 demostró que los segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de mezcal y Fermichamp® con la secuencia de la clona S228c. El análisis de Hxt3 mostro que en TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. TM7 de Hxt1, los aminoácidos Q275, G279 y D280 están conservados para todas las cepas, sin embargo en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T. En Hxt1 se encontraron entre la región TM9, en el rizo externo y en la TM10 cambios de aminoácidos en la posición 418420 y 431, en Hxt3 se localizaron los polimorfismos en la posición 418 y 419 solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las sustituciones Y402L y C401S; otro cambio ocurrió solo en la cepa 3D3 que presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. En Hxt1 del segmento TM10 está presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición F380. Por otra parte en la cepa 3D3 se encontraron los polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En el transportador Hxt1 está presente el polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3. Se considera que los polimorfismos que se presenten en estos segmentos transmembranales pudieran modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azucar, evidenciando su importancia en la formación de la cadena. Por lo que se pudiera conisderar que estas modificaciones distorsionarian la conformacion de la estructural exofacial provocando alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteina, propiciando una diferente afinidad con las moleculas de hexosas, provocando cambios
en
la funcionalidad del transportador. Los resultados
obtenidos en este estudio sugieren la necesidad de realizar un análisis integral para determinar las capacidades fructofílicas y de producción de etanol en una cepa de S. cerevisiae; ya que los cambios observados en la tasas de consumo de azucares y producción de etanol para estas cepas no están relacionados solo con la expresión y/o actividad de estos genes.
18
RÉSUMÉ L’état de Tamaulipas au Mexique a pour objectif de devenir l'un des plus grands producteurs de mezcal. En effet ce produit mexicain peut contribuer à l'économie rurale et prendre un essor économique important par rapport à d'autres distillats d'agave. C’est aussi une boisson qui maintient la tradition de fabrication dans les petites entreprises conformément à la culture et l'histoire en faisant appel aux racines des communautés. Contrairement à la mycoflore impliquée dans le processus de production des autres boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est tout d’abord d'un grand intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts agave ont une forte nature fructophilique (induite par la composition naturelle du moût). Par ailleurs les caractérisations cinétique et niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans la consommation de fructose dans cette flore seraient pertinentes étant donné que des études sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae ont porté presque exclusivement sur le glucose, et qu’il n'a pas été observé que ces transporteurs discriminaient le glucose et le fructose. Dans ce travail la population étudiée était de 17 isolats sur 103 levures initialement isolés d’une mezcalerie, la "El Palmar" Lozoya M. Emilio, situé à San Carlos (Tamaulipas, Mexique). L'échantillonnage a eu lieu dans la cuisson au four, au moulin et à différents stades de moûts en fermentation. Comme souche de contrôle la Fermichamp ® (DSM) a été utilisée. Il s’agit d’une souche industrielle de vin à capacité fructophilique. Cinq groupes de microorganismes ont été identifiés par la séquence-ribosomiques ITS1 et ITS2 5,8 S-26S : 10 Saccharomyces cerevisiae, 1 Zygosaccharomyces bailii, 3 Torulaspora delbrueckii, 2 Kluyveromyces marxianus et 1 Pichia mexicana. Les souches identifiées comme S. cerevisiae ont été évaluées dans trois milieux différents : M1 (glucose: fructose 9:1), M2 (glucose: fructose 1:9) et M3 (glucose: fructose 1:1). Les souches prédominantes pour la consommation de sucres dans M1 étaient 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8. Dans M2 la meilleure était FECHA suivie de 3D5, 3Y8, 3D3, 3Y2 et 3Y4; dans M3 c’était 3Y3, 3Y5 et 3Y8. En outre la
19 résistance à l'éthanol a été évaluée et nous avons constaté que la souche témoin Fermichamp ®, conservait la meilleure suivie de 3Y5 et 3Y8. L'analyse des séquences des transporteurs d'hexoses de Hxt1 ont montré que les segments transmembranaires TM3, TM5 et TM6 sont conservés dans les isolats du mezcal et dans Fermichamp ® par rapport à la séquence du S228c cloné. L’analyse Hxt3 montre que dans le segment transmebranaire TM5, les souches de mezcal présentent un polymorphisme dans S207L (changement d'un acide aminé non polaire à une autre polaire) par rapport à la souche S228c. Pour le segment TM7 de Hxt1, les acides aminés Q275, G279 et D280 sont conservés pour toutes les souches, mais dans Fermichamp ®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 et 3Y8 on rencontre le polymorphisme K278T. Dans Hxt1 entre TM9, région de la boucle extérieure, et TM10 des changements d'acides aminés à la position 418 à 420 et 431 ont été trouvés. Dans Hxt3 les polymorphismes étaient situés à la position 418 et 419 seulement pour Fermichamp ; les isolats du mezcal présentent les substitutions Y402L et C401S, un autre changement a eu lieu seulement dans la souche 3D3 qui présentent les polymorphismes Y405A, A406F, S407L dans la région 9 transmembranaire. Dans Hxt1 dans le segment TM10 le polymorphisme L377F est présent, à proximité de la position 3Y8 F380. En outre, pour cette souche on trouve aussi le polymorphismes dans les F406, G408A, G411A dans Hxt1. Sur le trnasporteur Hxt1 le polymorphisme L439M est présent dans le TM12. On considère que les polymorphismes survenant dans les segments transmembranaires peuvent modifier la taille des pores et la forme de signalisation de la protéine par du sucre, démontrant son importance dans la formation de la chaîne. Comme ces changements pourraient modifier la conformation structurelle exofaciale, provoquant entre des altérations des sites allostériques de la protéine, ils peuvent conduire à une modification de l’affinité pour les hexoses différents et donc à des changements dans la fonctionnalité du tranporteur. Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin de déterminer les capacités à la fructophilie et à la production d'éthanol des souches de S. cerevisiae. Les changements observés dans les taux de consommation de sucre et de production d'éthanol pour ces souches ne seraient pas liés uniquement à l'expression et / ou l'activité de ces gènes.
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1. INTRODUCCIÓN
La fuente principal de carbono en el mosto de agave está compuesta principalmente de azúcares fermentables (glucosa y fructosa) aproximadamente en una relación de 1 molécula de glucosa por 7 moléculas de fructosa, a priori podemos pensar que las levaduras predominantes durante el proceso de elaboración del mezcal tendrán una tendencia fructofílica (fuerte capacidad de asimilación de la fructosa). La especie de Agave que se utilice en el proceso va a determinar el tipo y contenido de azúcares, con lo cual se observan variaciones en el rendimiento del producto, que generalmente son más bajas que el estimado teórico, debido a deficiencias en la etapa de cocción, extracción de azúcares, de la fermentación y de la destilación, dado el poco control que se tiene en cada etapa por lo artesanal del proceso. El mosto de agave contiene además una baja concentración de nitrógeno asimilable para la levadura. Las levaduras son el factor más importante durante el proceso de fermentación, pues además de etanol, producen alcoholes superiores, enzimas extracelulares, precursores de aromas y compuestos de alto peso molecular que constituyen o participan en el aroma característico de los productos refinados. Dentro de la amplia gama de carbohidratos presentes en la naturaleza, y que son utilizables en el metabolismo, las hexosas ocupan un lugar predominante de importancia, y entre ellas, la glucosa es la más importante. Para que las hexosas puedan ser utilizadas deber ser en primer lugar traslocadas a través de la membrana celular, para lo cual se ha observado que existe todo una serie de proteínas transportadoras, de afinidad variable y modulable, y las cuales son reguladas tanto a nivel transcripcional como post-traduccional. Los estudios de la utilización de hexosas por S. cerevisiae se han concentrado casi exclusivamente en la glucosa, y no se ha observado que los transportadores discriminen entre la glucosa y la fructosa. El que una levadura posea una naturaleza fructofílica, es decir, que consuma a mayor velocidad la fructosa que la glucosa a altas concentraciones, le confiere una mayor capacidad de utilizar
21 una fuente de carbono que la mayoría de los microorganismos no utilizan como primera opción. Hasta la fecha no se conoce en detalle la micoflora que interviene en el proceso de conversión del mosto del Agave en mezcal tamaulipeco, así como tampoco se ha caracterizado cinéticamente el transporte y aprovechamiento de azúcares, que son la materia prima fundamental del proceso de obtención de mezcal. A nivel científico el conocimiento de las levaduras nativas del mezcal, así como las características de transporte de azúcares (y otras actividades bioquímicas en este sistema de fermentación) sería de gran importancia, y en particular, en lo que se refiere a la utilización de la fructosa, que es el azúcar principal de los mostos, y sus posibles consecuencias a nivel de la caracterización y mejoramiento de la producción del mezcal.
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JUSTIFICACION
El conocimiento de las características de transporte de azúcares en las levaduras nativas del mezcal tamaulipeco, y en particular, en lo que se refiere a la utilización de la fructosa, tendría un impacto positivo en el conocimiento básico y mejoramiento de la producción del mezcal. 3
HIPOTESIS
Dada la alta concentración de fructosa presente en los mostos de mezcal se pueden aislar levaduras nativas que expresan transportadores con una alta afinidad hacia este azúcar. 4
OBJETIVOS
4.1. Objetivo general Caracterizar a nivel cinético y molecular el consumo de la fructosa en cepas productivas de alcohol aisladas de mostos de mezcal tamaulipeco. 4.2. Objetivos particulares Aislar y caracterizar cinéticamente las levaduras con una alta actividad fructofílica. Caracterizar la productividad de etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas bajo diferentes relaciones fructosa:glucosa. Caracterizar la tolerancia al etanol de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas. Caracterizar genéticamente los genes HXT1 y HXT3 del sistema de transportadores de azúcares de las levaduras Saccharomyces cerevisiae fructofílicas seleccionadas de la micoflora nativa del mezcal.
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5
ANTECEDENTES
5.1. Mezcal La palabra mezcal tiene su origen en vocablos de la lengua náhuatl, algunos sostienen que deriva de “mexcalli” (“metl” o “meztl”, maguey, y de “ixcalli”, cocer), la traducción sería entonces “maguey cocido” (Gómez, 2004; Colunga et al., 2007). La planta del maguey desde tiempo prehispánico era utilizada por los indígenas en todo Mesoamérica obteniendo de él aguamiel y pulque (Parsons et al., 1990); pero no fue sino hasta la llegada de los españoles en el siglo XVIII, quienes controlaron su producción, que se introdujo por a las costas de Colima y Jalisco el proceso de destilación proveniente originalmente de los filipinos (Parsons et al., 2000; Colunga et al., 2007; Zizumbo et al., 2008). Ciertamente la fabricación del vino mezcal tuvo un comienzo modesto, su consumo fue a lo largo de los siglos XVI y XVII estrictamente local, sin embargo, para fines del siglo XVIII y como consecuencia de su vinculación a los centros mineros, experimentó un fuerte impulso ya que este emergente mercado vino a sumarse al tradicional mercado rural y al recién conquistado mercado urbano, articulándose así una fuerte comercialización del producto. En Tamaulipas, existen registros de que los indígenas Janambres, en el invierno consumían “mezcal de agave haciendo en barbacoa la piña del quiote del maguey y la lechuguilla”, fueron de verdad los indios más temidos antes de y durante la conquista. (Mirafuentes, 1993). Durante la colonia, el auge mezcalero de la región llegó a su punto máximo gracias a las actividades mineras en la sierra de San Carlos, pero pasada la corta bonanza minera en la Sierra de Tamaulipa Nueva y empobrecidos sus habitantes por la grave dislocación económica que generó en todo el Noreste la guerra de Independencia, las minas fueron abandonadas y sus habitantes obligados a buscar otro medio de subsistencia (Delay, 2007). El nombre mezcal se utiliza como genérico para bebidas destiladas a partir de diversas especies de maguey, fabricadas a partir de variados procesos tradicionales, con una denominación de origen que emplea el nombre mezcal para agrupar, sin reconocer sus diferencias, a variadas especies, bebidas, regiones y procesos de siete estados que son los únicos que ahora pueden usar el nombre en la comercialización de sus productos.
24 Actualmente de acuerdo a la NORMA Oficial Mexicana NOM-070-SCFI-1994 Bebidas Alcohólicas-Mezcal Especificaciones, (Tabla I) el mezcal “es la bebida alcohólica obtenida por destilación de mostos preparados con los azúcares extraídos del tallo y base de las hojas de los agaves mencionados, sometidos previamente a fermentación alcohólica con levaduras, permitiéndose adicionar hasta un 20% de otros azúcares en la preparación de dichos mostos, siempre y cuando no se eliminen los componentes que le dan las características a este producto.” (Bebidas Alcohólicas-Mezcal Especificaciones). A petición de los productores de maguey, el Instituto de la Propiedad Industrial gestionó ante la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual, la denominación de Origen para el Mezcal, misma que obtuvo su registro en 1994 para los estados de Oaxaca, Guerrero, San Luís Potosí, Durango y Zacatecas; en 2001 para el municipio de San Felipe, Guanajuato, y en 2003 se incorporaron 11 municipios de Tamaulipas entre los que se encuentran Bustamante, Tula, Miquihuana de Canales, Palmillas, así como de los de San Carlos Arteaga, San Nicolás de Degollado y Burgos, existiendo en estos últimos el mayor número de fábricas de elaboración de la bebida alcohólica denominada “Mezcal” ( Norma Oficial Mexicana 2006). En Tamaulipas el mezcal se elabora de manera artesanal en pequeñas fábricas en donde los campesinos elaboran la bebida para su propio consumo, las fiestas comunitarias y familiares y para ayudar su economía familiar mediante la venta. Actualmente el gobierno de Tamaulipas impulsa la agroindustria del mezcal en el proceso de fortalecimiento en acciones dirigidas a la modernización y terminación de las fábricas de mezcal existentes, la certificación de las mismas, promoción y comercialización del mezcal para así lograr el posicionamiento nacional e internacional (COMERCAM; Gaceta parlamentaria, 2008). Considerando la ubicación geográfica, la infraestructura de las vías de comunicación, la cercanía con el mercado más grande del mundo y gran consumidor del tequila y mezcal, como lo es Estados Unidos, Tamaulipas tiene las expectativas de figurar como uno de los estados productores de mezcal más importantes y este producto mexicano puede tener una derrama económica muy importante, ya que aunque incipiente, posee amplias perspectivas con impacto social y económico para las entidades rurales comparado con otros destilados de agave, este es una bebida que conserva la tradición de fabricación en empresas pequeñas con tradición, cultura e historia fomentando el arraigo de las comunidades.
25 Tabla I. Especificaciones físicas y químicas para la producción de mezcal Especificaciones Mínimo
Máximo
Porcentaje de alcohol en el volumen a 20° C.
36.0
55.0
Extracto seco g/l
0.2
10.0
Miligramos por 100 centímetros cúbicos referidos a alcohol anhídrido Acidez total (como ácido acético)
170.0
Alcoholes superiores mg/100 ml
100.0
400.0
Metanol mg/100 ml
100.0
300.0
Se pueden utilizar los aditivos permitidos y en la dosis que establezcan las disposiciones legales correspondientes. NOM-070-SCFI-1994. 5.2. La planta de Agave en Tamaulipas En el estado de Tamaulipas la denominación de origen enlista para producción de mezcal a Agave esperrima jacobi Amarilidáceas (“maguey de cerro, bruto o cenizo”), A. angustifolia Haw (“maguey espadín”), A. weberi cela, Amarilidáceas (“maguey de mezcal”), A. potatorum, Amarilidáceas (maguey de mezcal) A. salmiana Otto Ex Salm SSP Cassispina (Trel) Gentry (“maguey verde” o “mezcalero”); en la literatura menciona también se menciona a A. americana L subsp. Protamericana Gentry (“mezcal” o “maguey cenizo”), A lophiana, A univittata Haw., y Agave funkiana K. Koch Bouché (Ambas conocidas como “lechuguilla” o “amole”); Agave montium-santicaroli (Jarcia) (NOM-070-SCFI-1994; CONABIO 2002; García, 2003; García-Mendoza et al., 2007). En Tamaulipas se encuentran establecidas 1600 hectáreas con agaves, sin embargo se tienen plantas silvestres distribuidas en los 22 mil kilómetros cuadrados de los municipios protegidos, específicamente en la región de San Carlos conformada por los municipios de San Carlos, San Nicolás parte de Cruillas y Burgos (Jaques et al., 2003). 5.2.1. Tamaulipas región mezcalera, situación geográfica El Estado de Tamaulipas se ubica al noreste de la República Mexicana, geográficamente se ubica entre los paralelos 22° 12’ 31’’ y 27° 40’ 52’’ de latitud norte, y los meridianos 97° 08’
26 38’’ y 100° 08’ 51’’ de longitud oeste. Específicamente la Sierra de San Carlos en donde se encuentra delimitada la actividad mezcalera, es una unidad orográfica asilada dentro de la planicie costera del Golfo Norte de México sobre la cota de los 400 metros sobre el nivel del mar (msnm); se localiza en la porción centro-oeste del estado de Tamaulipas, entre los 24° 07’ y los 24° 45’de latitud norte y los 99° 05’y los 98° 42’de longitud oeste. En esta región se presentan climas que van de los templados subhúmedo a semicálidos secos con lluvias en verano y largos periodos de sequía, siendo la precipitación mayor parte de la sierra son del tipo rendzina, estos presentan una capa superficial rica en materia orgánica que descansa sobre roca caliza y ocupan un 76 % del área, suelos profundos del grupo Chernozem, ocupan un 10 % de la superficie; también están presentes suelos como los vertisoles y litosoles en menor proporción. En cuanto a su orografía la parte norte de la sierra pertenece a las subcuencas del rio Conchos y de los arroyos Chorreras y Camacho, pertenecientes a la cuenca del Rio San Fernando y el sur de la sierra a las subcuencas de los ríos Pilón, San Carlos y el arroyo La Zanja, pertenecientes a la cuenca del Rio Soto la Marina; no existen corrientes perennes dentro de la sierra (Treviño et al., 2002). 5.3. El proceso de elaboración del mezcal 5.3.1. Selección de la planta El agave tarda entre 8 y 10 años en madurar y es cuando se cortan o “jiman” las pencas y las raíces hasta dejar el centro del maguey al descubierto, a esta forma de maguey se le conoce comúnmente como piña, dependiendo del tipo de Agave y la forma de corte, cada una llega a pesar cien o más kilos (Figura 1). Es necesario observar ciertas características tales como coloración verde-amarillenta en la base de las pencas y parda en la base del Agave, así como la presencia de pencas secas en esta zona. Desde el punto de vista bioquímico, el estado de madurez apropiado lo marca un alto contenido de azúcares que puedan ser aprovechados por los microorganismos para la generación de alcohol (Jaques et al., 2004; Ramales et al., 2002; Salvatierra, 2003).
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A
B
B Figura 1. (A). Planta silvestre de Agave spp. (B) Piñas de agave 5.3.2. Cocción de las cabezas de agave En Tamaulipas el proceso de elaboración de mezcal es rustico, en la cocción de las piñas de agave se usan pozos cónicos de piedra y tierra construidos para trabajar 800 kg aproximadamente (Gómez et al., 2004). El proceso inicia haciendo una oquedad en el suelo, en donde se coloca leña y se recubre con piedras refractarias al calor, se hacen llegar al rojo vivo (800 a 1000 °C aproximadamente), después se colocan las piñas, se cubren con costales y tierra (Figura 2). Es importante cuidar la temperatura y el tiempo de tapado ya que repercuten en el sabor de mezcal, quemado en caso de estar muy caliente el horno o ahumado en caso de un mal tapado. La temperatura óptima del horno se define en base a la experiencia del procesador, apoyada en el tiempo de combustión de la leña. El horneado tiene una
28 duración aproximada de tres días, esto es cuando la piña cambia del color blanco a color caramelo.
B A
B
Figura 2. Pozos de cocimiento tradicionales: (A) Horno natural recubierto de piedra. (B) Piñas cocidas. Con este proceso se logra la hidrólisis de los fructanos, principal producto fotosintético en la planta de Agave, estos son polímeros solubles de fructosa con generalmente una glucosa por molécula. Esta reportado que existe más de una estructura en la familia Agavácea (Sims et al., 2001), en el Agave tequilana y el Agave americana la principal fuente de almacenamiento de carbohidratos es la inulina (Sánchez et al., 1953). La molécula de inulina es un fructano con un enlace tipo ß (2 1) compuesta por más de 30 unidades de D-fructosa unidas por enlaces glucosídicos; su hidrólisis produce además de fructosa (100 a 140 g/L dependiendo de la especie) 5 a 6 % de moléculas de glucosa; la inulina se hidroliza por los ácidos y por la
29 enzima, es soluble en agua, levógira, no da color con el yodo y no tiene poder reductor. (Babor and Aznárez, 1977; Gómez et al., 2004; Aguilar et al., 2007). 5.3.3. Molienda En la siguiente fase los pedazos de cabezas se desmenuzan y pasan a la molienda, usando un molino o “trapiche” vertical metálico accionados por tracción animal o mecánico (Figura 3). El mosto obtenido se coloca en tinas de fermentación, a través de canaletas ubicadas generalmente al ras del suelo.
Figura 3. Molino o “trapiche” metálico adaptado en forma transversal, accionado por tracción animal. 5.3.4. Fermentación En la fermentación del mosto se usa como inóculo residuos de fermentaciones anteriores, se lleva a cabo en tinajas de madera o metálicas (Figura 4) donde fermenta en forma natural y a la intemperie durante cinco a nueve días (dependiendo de la temperatura ambiente, la cual oscila entre los 25°C y 42°C). Los procesadores dan por terminado el proceso cuando cesa la generación de espuma. En la fermentación natural del mosto de agave participan e interaccionan secuencialmente un complejo grupo de microorganismos. En lo que se refiere a las levaduras, el origen de estos microorganismos puede ser la superficie de los agaves o el ambiente de las tinajas de fermentación, hasta las moscas que rondan la molienda sin ningún
30 tipo de inoculación externa; esta situación causa que las fermentaciones no sean producto de una sola especie o cepa de levadura, sino de una biodiversidad de especies y cepas diferentes a lo largo del proceso. Se tiene la certeza de que en la etapa final invariablemente dominan las levaduras resistentes a altas concentraciones de alcohol comúnmente Saccharomyces cerevisiae. Es indudable que la calidad del mezcal está directamente relacionada con la microflora típica nativa del proceso fermentativo.
A
B Figura 4. Tinajas de fermentación de mostos de agave 5.3.5. Destilación Al terminar el proceso de fermentación los mostos cocidos se pasan hacia los alambiques de destilación (Figura 5). Aquí la mezcla se calienta en el alambique evaporándose y condensándose lentamente a través de un serpentín que deposita su contenido en un recipiente; el producto de la fermentación es destilado en tres partes, la cabeza y la intermedia
31 son generalmente redestiladas, obteniéndose así un producto con mayor porcentaje de alcohol (aproximadamente 55 % en volumen) y una tercera parte llamada “cola” es desechada. Empíricamente para conocer el grado alcohólico los productores usan un carrizo y una jícara donde vierten el mezcal, cuando se forman burbujas se entiende que el mezcal es de calidad. Este proceso ha sido muy poco estudiado, considerando que es el último paso que define la calidad de la bebida. La Norma NOM-070-SCFI-1994 para el mezcal establece los límites máximos y mínimos de concentración permitidos en la bebida (Tabla I), pero en estudios anteriores se observó que existe una gran variedad de componentes volátiles en el mezcal, sin embargo, solamente algunos de ellos están bajo regulación oficial. Como es esperado, el etanol es el componente de mayor abundancia en el mezcal, ya que este compuesto es el resultado de la biotransformación de la azúcar por los microorganismos durante la fermentación (Salmon, 2005; Suarez et al., 2006; Arrizon et al., 2006).
Figura 5. Serpentín usado en destilación de mezcal Análisis realizados en mezcal por micro extracción de fase solida- cromatografía de gasesespectrometría de masas (SPME-GC-MS) mostraron la presencia de alcoholes como metanol, el cual es producido durante la fermentación alcohólica a por la biodegradación de la pectina y la lignina de la pared de las células vegetales; asimismo se encontraron etanol, metanol, npropanol, 2-butanol, 2-metilpropanol y mezcla de 2/3 metil-1-butanol, producidos por el catabolismo de los amino ácidos (Lachenmeier et al., 2006; De León-Rodríguez et al 2006). Del mismo modo fueron identificado nueve clases de terpenos (α-phellandrene, α -terpineno, p-cimeno, limoneno, α -trans-ocimene, linalool, 4-terpineol, geraniol, and trans-nerolidol) se
32 ha reportado que estos terpenos son liberados por las β-glucosidasas por las levaduras durante el proceso de la fermentación. Asimismo ha sido detectado furfural y 5-metilfurfuraldehído, al igual que la presencia de ésteres en su mayoría de etilo, los cuales son los responsables del aroma afrutado en bebidas alcohólicas, como el caso de hexanoato de etilo y octanoato de etilo (olor a manzana). Igualmente se observó la presencia de alcoholes aromáticos importantes como el feniletanol, que confiere un aroma floral (Escalante et al., 2006; Lachenmeier, 2006, Molina et al., 2007) otro compuesto que también se encuentra en los mezcales son el acido acético, acetato de etilo y etil-2-hidroxipropanato (León et al., 2006, Vera et al., 2009). La presencia de componentes minoritarios juega un papel muy importante en la bebida ya que le confiere propiedades organolépticas específicas que varían notablemente con la edad de maduración. Cabe mencionar que la concentración de metanol en conjunto con los alcoholes superiores es un indicativo de que la bebida no se encuentre diluida o adulterada (Lachenmeier, 2006). 5.3.6. Envasado De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana sobre bebidas alcohólicas, los mezcales se clasifican en tres tipos basados en el tiempo de maduración después de la destilación. Los mezcales jóvenes son embotellados justo después de la destilación, los reposados permanecen de 2 a 6 meses en barricas para su estabilización, mientras que los añejos son sujetos a un proceso de maduración de por lo menos 1 año. Durante este tiempo el mezcal adquiere color ámbar y sabor característico. 5.4. Microbiología del proceso de fermentación Bioquímicamente en la fermentación los azúcares son transformados a etanol y otros compuestos como alcoholes con tres o más átomos de carbono y ésteres. En general las propiedades organolépticas de una bebida alcohólica son determinadas por la composición de una mezcla de alcoholes, ésteres, y otros compuestos como terpenos provenientes de la planta. Es decir, la variedad de compuestos organolépticos generados en la fermentación, depende del tipo de microorganismo, de la materia prima y de las condiciones de fermentación (Berry et al., 1987; Lachenmeier et al., 2006).
33 A diferencia del mezcal, la dinámica de la flora responsable del proceso fermentativo del mosto en bebidas como el tequila (Arrizon et al., 2002, 2007), pulque (Estrada et al., 2001), y vinos de mesa ha sido objeto de numerosos estudios (Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). En tequila la identificación de levaduras nativas se encontró que en el agave fresco la microbiota estaba dominada por Clavispora lusitaniae y especies endémicas como Merschnikowia agavaveae, en Drosophila spp encontradas alrededor o dentro de la destilería se identificó Hanseniaspora spp., Pichia kluyveri y Candida krusei., en melazas Schizosaccharomyces pombe, en agave cocido y mostos una considerable diversidad de especies incluida Saccharomyces cerevisiae, en mostos fermentados se encontró baja la heterogeneidad de especies, encontrando al inicio de la fermentación a Torulaspora delbrueckii, Kluyveromyces marxianus y Hanseniaspora spp, progresivamente en el tiempo se encontró a S. cerevisiae, Zygosaccharomyces bailii, Candida milleri y Brettanomyces spp., concluyendo que la principal fuente de inóculo para el proceso de fermentación son los tanques de fermentación (Arrizon et al., 2002). En pulque, han sido aisladas las levaduras Candida lusitaneae, Kluyveromyces marxianus var. Bulgaricus, Saccharomyces cerevisiae (capensis), C. valida, S. cerevisiae (chevalieri) y K. marxianus (lactis) (Estrada et al., 2001). En la fermentación espontánea del mezcal se han encontrado microorganismos como Candida spp., C. magnolia, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, H. vinae, K. marxianus, P. membranifaciens, T. delbrueckii, Candida parapsilosis, Clavispora lusitaniae, Debaryomyces hansenii, Pichia caribbica, P. guilliermondii, y S. cerevisiae (Jaques et al., 2005; Oliva, 2007; Cáceres et al., 2008). En vino blanco, elaborados a partir de la variedad de uva “Rovello bianco” se encontraron levaduras nativas del genero de S. cerevisiae, Hanseniaspora uvarum, Metschnikowia spp., Candida, Pichia, Torulaspora y especies de Cryptococcus flavescens (Francesca et al., 2009). En otro estudio, se aislaron levaduras nativas de una fermentación alcohólica se encontraron microorganismos del genero S. cerevisiae, Hanseniaspora guilliermondii, H. uvarum, Issatchenkia orientalis, Pichia anómala y Kluyveromyces thermotolerans (Clavijo et al., 2011). En vinos espumosos, se han realizado estudios sobre la influencia de cepas de Saccharomyces cerevisiae en la formación de compuestos volátiles en la fermentación (Pretorius, 2001; Abdel et al., 1999). Para optimizar la producción de vino y otras bebidas
34 fermentadas se han manipulado genéticamente cepas de Saccharomyces cerevisiae, se sabe que esta levadura interviene en la fermentación y calidad; de tal forma que se han introducido o eliminado características genéticas con la finalidad de que la cepa intervenga en el proceso de fermentación afectando de manera deseable la producción del vino (influyendo en los cambios de acidez volátil, sabores y olores agradables), no obstante este tipo de levaduras están prohibidas en Europa y en Australia, sin embargo, en Canadá o Estados Unidos están totalmente permitidas (Querol et al., 1990; Pérez et al., 1999; Pretorius, 2001). 5.4.1. La levadura Saccharomyces cerevisiae Las levaduras del género Saccharomyces pertenecen al phylum Ascomycota, clase Hemiascomycetes, orden Saccharomycetales y familia Saccharomycetaceae. El género de Saccharomyces está compuesto por las especies S. cerevisiae, S. arboricola, S. bayanus, S. cariocanus, S. kudriavzevii, S. mikatae, S. paradoxus y un hibrido S. pastorianus (Naumov et al., 2000, 2003; Kurtzman et al., 2003; Wang et al., 2008, Scanell et al., 2011).
Particularmente la especie Saccharomyces cerevisiae constituye el microorganismo eucariota más estudiado por su importancia en la elaboración de alimentos, como en la panificación y bebidas como vinos (Barnett, 2000). La palabra Saccharomyces proviene del latín saccharum (azúcar) y mykes (hongo), mientras que cerevisiae de cerevisia (cerveza) y es un hongo levaduriforme que presenta células alargadas globosas, elipsoidales con gemación o blastoconidios multilaterales, con ascos con hasta cuatro ascosporas esféricas o elipsoides y de pared lisa en su interior. Las colonias crecidas en PDA (Agar papa dextrosa) son cremosas y blandas (Barnett, 2000). El crecimiento vegetativo es la forma principal de reproducción de S. cerevisiae, este tipo de reproducción asexual se lleva a cabo por gemación y envuelve la división mitótica de núcleos haploides. La reproducción sexual es una alternativa de cuando faltan nutrientes, la levadura es inducida a esporular y finalmente a propagarse por la segregación de cuatro esporas haploides (Saba et al., 1997). La levadura S. cerevisiae posee un genoma pequeño, esto simplifica de manera importante el análisis genético y molecular del mismo (Dujon, 1996). A diferencia de los genomas de organismos multicelulares, el genoma de la levadura es muy compacto, dado que el 72% de la secuencia corresponde a secuencias codificantes. El tamaño promedio de los genes de
35 levadura es de 1.45 kb, o 483 codones, y solamente el 3.8% de los ORFs contienen intrones. Aproximadamente el 30% de los genes se han caracterizado experimentalmente; y del 70% restante, cuya función no se conoce, aproximadamente la mitad contiene al menos un motivo de algún tipo de proteínas ya caracterizadas, o corresponden a genes que codifican para proteínas estructuralmente relacionadas con productos génicos ya caracterizados en levadura o en otros organismos (Pandey y Mann, 2000). En S. cerevisiae el ARN ribosomal se encuentra codificado por 120 copias repetidas y arregladas en tándem en el cromosoma, en tanto que existen 262 genes que codifican para ARNs de transferencia, 80 de los cuales poseen intrones. Los cromosomas contienen elementos movibles, retrotransposones, que varían en número y posición en las diferentes cepas de S. cerevisiae, aún cuando la mayoría de las cepas de laboratorio poseen aproximadamente 30 elementos (Pandey y Mann, 2000). En el ADN ribosomal tanto en S. cerevisiae, como en las demás especies de levaduras y hongos, hay cuatro genes, el gen 5S, 5.8S, 18S y 26S, estos se encuentran agrupados en repeticiones a lo largo del cromosoma XII y son regiones altamente conservadas en todas las especies de levaduras. Los genes 18S y el 26S se encuentran separados uno de otro por espacios transcritos internos (ITS) y espacios íntergénicos (IGS). Las secuencias de ITS e IGS pueden ser fácilmente amplificadas por PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) usando oligonucleótidos homólogos a estas. En S. cerevisiae al igual que en otras especies de levaduras, estas secuencias han sido ya obtenidas, de manera tal que estos estudios son en gran medida útiles para identificación, hacer análisis de filogenia y diversidad genética entre las especies de levaduras (Montrocher et al., 1998; Esteve et al., 1999; Hauser et al., 2001; Naumova et al., 2003). La digestión de los segmentos ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 con enzimas de restricción, es una importante herramienta en la diferenciación de especies de levaduras S. cerevisiae a otros géneros presentes en una fermentación espontanea, no obstante la comparación entre un perfil y otro obtenido de la misma especie requiere de análisis bioquímicos y moleculares más puntuales para diferenciarlas entre sí (Hierro et al., 2005; Nisiotou et al., 2007). 5.4.2.
La fermentación alcohólica por S. cerevisiae.
En la fermentación alcohólica espontanea tradicional, participa un complejo grupo de microorganismos nativos o autóctonos que interaccionan entre sí a lo largo del proceso, la levadura S. cerevisiae tiene un rol central dentro de este proceso; generalmente se obtiene una
36 bebida alcohólica con características particulares de los insumos usados, la mano de obra que lo procesa, las condiciones climáticas y geográficas de la región; atribuyéndole una gran variabilidad organoléptica y química entre una fermentación y otra. La levadura Saccharomyces sp. ha sido seleccionada por su habilidad de fermentar rápida y eficientemente los mostos de uva los cuales contienen altas concentraciones de azúcar, por su resistencia a alta concentraciones de etanol y al dióxido de sulfuro y la capacidad de supervivencia a elevadas temperaturas durante las fermentaciones produciendo así fermentaciones controladas mejorando la calidad y composición química del vino (Puig et al., 2000; Querol et al., 2001; Serra et al., 2006). Las levaduras presentan la tendencia a utilizar iones de amonio como única fuente de nitrógeno por lo que el amoniaco y sales amónicas, parecen ser las fuentes más adecuadas de nitrógeno por su fácil disponibilidad y bajo precio (Prescott et al., 1962). El (NH4)2SO4 es la fuente más favorable ya que provee un beneficio nutricional adicional, como una fuente de azufre (Pinal et al., 1997; Taillander et al., 2006). Sánchez et al., (1953) recomendaron el uso de sulfato de amonio como una fuente de nitrógeno, en la fermentación del agave para la producción de tequila para favorecer la producción de alcohol. En otro estudio se observo el efecto de la concentración del ion amonio en la producción de alcohol, y encontraron que la producción de etanol fue alta cuando el sulfato de amonio estuvo presente a concentraciones equivalentes de 750 a 1000 mg N/L (Terán et al., 2002). En agaves o magueyes el contenido de nitrógeno es bajo, con promedio de 0.02% a 0.03%, en el caso del A. tequilana Weber variedad azul (Sánchez, et al., 1953), y mayor de 0.37% en el caso del A. angustifolia Haw (Sánchez, 1985), por lo cual, los niveles de nitrógeno pueden ser críticos durante la fermentación. La falta de nutrientes para la levadura especialmente, la deficiencia en nitrógeno, provoca fermentaciones lentas (Casey et al., 1984). Uno de los factores de mayor impacto en una fermentación espontanea es la alta variabilidad en las poblaciones de S. cerevisiae (Martínez et al., 1989; Esteve et al., 2001; Suarez et al., 2006), los resultados genéticos sugieren que las diferentes cepas derivan unas de otras por mutación, como lo son los rearreglos cromosomales adquiridos por las numerosas divisiones mitóticas; todo esto tiene lugar debido al proceso gradual de adaptación a las condiciones de vinificación (Naumov et al., 1996; Polsinelli et al., 1996; Puig et al., 2000; Fleet et al., 2003).
37
Desde 1930 han sido utilizados los cultivos líquidos de levadura vínica (Instituto Laclaire, Francia), mientras que las levaduras vínicas secas no se originaron hasta mediados de los años cincuenta utilizándose como inoculo en fermentaciones dirigidas (Rainieri
et al., 1998;
Querol et al., 2001). 5.4.3.
Tolerancia al estrés ambiental de S. cerevisiae y la producción de etanol
Las habilidades de las células de levadura para detectar y responder a las condiciones ambientales de estrés son importantes ya que estas afectan directamente la viabilidad de la célula, los mecanismos de respuesta al estrés responden a moléculas sensoras y señales en las rutas de transducción las cuales determinan cambios en los niveles de mRNA para cerca de 900 genes (Bauer y Pretorius, 2000; Estruch, 2000; Gasch et al., 2000; Hohmann y Mager, 2003). Como un factor de estrés para la sobrevivencia y el crecimiento de las levaduras, pueden considerarse el estrés osmótico debido a las altas concentraciones de azúcar al inicio de una fermentación (glucosa y fructosa en los mostos de uva varía entre 125 y 250 g/L) (Carrasco et al., 2001), un pH bajo (3.5 a 3), de acuerdo al progreso de la fermentación la acumulación en las concentraciones de alcohol y acetaldehídos, la temperatura alta o baja ya que la tasa de crecimiento en las levaduras decrece rápidamente dañando la membrana celular y desnaturalizando ciertas enzimas (Beloch, 2008; Cardona et al., 2007; Salvado et al., 2008), así como la limitación de nutrientes, y el estrés oxidativo debido al metabolismo respiratorio. En una fermentación vinícola, el mosto es preparado con uvas maduras, consecuentemente con una alta concentración de azúcar. Estas concentraciones de azúcar producen vinos con altos niveles de etanol, algunas veces por encima del 15% (v/v) (De Barros et al., 2003). En las fermentaciones espontaneas las levaduras que participan presentan un patrón progresivo de crecimiento hasta el estado estacionario cuando los niveles de etanol son de 3-4% (Fleet el al., 1993), pero los estados finales de una fermentación natural invariablemente son dominados por especies de levaduras alcohol tolerantes como la S. cerevisiae (Campbell, 2003; Zuzuarregui et al., 2004).
38 5.5.
Transporte de hexosas a través de la membrana celular en S. cerevisiae
La plasticidad en la expresión de un gen es determinante en la adaptabilidad; una de las manifestaciones fundamentales de esta capacidad es la habilidad de las células a usar diferentes fuentes de carbono. Esto es consecuencia de un complejo grupo de sensores y rutas de señalización que lideran la expresión de transportadores y enzimas metabólicas. En la naturaleza S. cerevisiae tiene la capacidad de adaptarse un amplio rango de fuentes fermentables y no fermentables de carbono (L-azucares, etanol, acetato, glicerol, etc.). La glucosa es la fuente de energía más utilizada en las células; en respuesta a esta fuente de carbono existe una matriz compleja en las rutas de las señales de transducción coordinadas con diversas respuestas metabólicas, como por ejemplo la glucólisis, la disminución de la actividad respiratoria, el incremento de la biogénesis de los ribosomas, además de la regulación en el crecimiento y desarrollo. El primer paso en el catabolismo exógeno de la fuente de carbono es usualmente el transporte de la molécula a través de la membrana celular; los genes HXT (transportadores de hexosas) son los encargados de la expresión de las proteínas que facilitan la difusión de glucosa, fructosa y otros azucares a través de la membrana (Yin et al., 2003; Flick et al., 2003). Las proteínas HXT pertenecen a la súper familia de facilitadores MFS, se ha encontrado que para S. cerevisiae existen 17 familias potenciales, estas proteínas son capaces de transportar pequeñas cantidades de solutos a través gradientes quimiostáticos, asimismo de equilibrar los sustratos a través de la membrana en ambas direcciones (Nelissen et al., 1997; Saier et al., 2000; Bannam et al., 2004). La secuencia y los análisis bioquímicas de diversas MFS sugieren que están compuestos de 12 segmentos transmembranales (TMs) de estructura tipo α-hélice, seis hélices están localizadas fuera de la membrana citoplasmática y 6 hélices dentro, formando un canal que facilita el transporte bidireccional del sustrato (Hirai et al., 2002). Las proteínas HXT son similares en su secuencia amino terminal y trabajan independientemente, facilitando los mecanismos de difusión y exhibiendo diferentes afinidades por los diferentes sustratos (glucosa, fructosa, manosa y/o galactosa). La modulación de la afinidad de los transportadores de hexosas HXT por una u otra fuente de carbono y a interacción entre ellos puede contribuir a la habilidad de adaptación a las diferentes concentraciones del azúcar por las células de
39 levadura (Saloheimo et al., 2007). En S. cerevisiae la expresión de los genes HXT se regula a través del balance de dos rutas opuestas, represión e inducción las cuales son reguladas o inhibidas respectivamente por glucosa. Existen 18 genes que codifican para proteínas transportadoras de hexosas HXT1 a HXT17, GAL2 (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Ferrer et al., 2004). En S. cerevisiae hay dos sistemas de transporte, uno constitutivo que es un sistema de baja afinidad (Km 15 a 20 mM) y uno represivo de glucosa que es un sistema de alta afinidad (Km 1 a 2 mM). En investigaciones realizadas encontraron que una cepa mutada en los genes HXT1 al HXT7 no fue apta para crecer en glucosa, fructosa ni manosa y no presento flujo glucolítico. Con estos estudios determinaron que HXT2, HXT6 y HXT7 son genes que expresan proteínas transportadoras de hexosas de alta afinidad la presencia de cualquiera de estos genes es suficiente para que la cepa mutante crezca en una baja concentración de glucosa (0.1%). Los genes HXT1, HXT3 y HXT4 son genes que codifican para transportadores de baja afinidad, y su presencia es suficiente para que la cepa mutante crezca en altas concentraciones de glucosa (más del 1%). Los genes HXT8 al HXT17 codifican para proteínas que son incapaces de transportar glucosa (Ozcan et al., 1999; Rolland et al., 2001; Yin et al., 2003). 5.5.1. Regulación transcripcional en S. cerevisiae: señalización por glucosa La regulación de la concentración de hexosas en las células de levadura, es mediante la expresión de los genes HXT vía señalización desde receptores de baja y alta afinidad de glucosa (Ozcan et al., 1999, 2002; Flick et al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006). El gen SNF3 codifica una proteína situada en la membrana citoplasmática (Snf3p) que censa bajas concentraciones de sustrato, en cuanto a hexosas se refiere, esta activa la inducción de un grupo de transportadores de hexosas de alta afinidad, la deficiencia de la proteína lleva a una pérdida de los transportadores. Snf3p es requerida para la inducción de los genes HXT2, HXT3 Y HXT4 (Flick et al., 2003; Ozcan et al., 1999). El gen RGT2 codifica Rgt2p (proteína censora de altas concentraciones de glucosa) está situado en la membrana citoplasmática, este requerido para la expresión máxima de la inducción del gene HXT1 (Ozcan, 1996, 1999). El alto grado de similitud entre Snf3 y Rgt2 sugiere que ambas proteínas censan glucosa de una forma similar y pueden actuar sobre las mismas proteínas o similares para transmitir la señal de glucosa. Tanto Rgt2p como Snf3p, tienen un 70% de homología entre ellos y un 30%
40 con otros miembros de la familia HXT. Como se menciono anteriormente, no transportan glucosa pero sirven como sensores extracelulares de glucosa, fructosa y manosa generando una señal intracelular de inducción que no requiere del transporte o metabolismo de la glucosa para la expresión de HXT (Dietvorst et al., 2009). Ambas proteínas, están constituidas por dos diferentes dominios: 12 dominios transportadores transmembranales y un dominio C-terminal la cual se predice esta en el citoplasma; Snf3 tiene dos secuencias de 25 aminoácidos y Rgt2p solo una, aparentemente esta terminación es la responsable en la generación de la señal de la expresión de los genes HXT. Se ha sugerido que el cambio conformacional inducido por la unión de la glucosa al dominio transmembranal, afecta el dominio C-terminal y la forma en cómo interacciona con otros componentes se sugiere que probablemente sirve como un dominio de señalización que interactúa con los componentes cercanos en la ruta de la señal de transducción (Ozcan et al., 1996, 1999; Lafuente et al., 2000). 5.5.2. El represor transcripcional RGT1 El controlador final en la ruta de traducción en la señal de glucosa es RGT1, ruta la cual inicia con el sensado en la superficie de la membrana y termina en el núcleo, regulando la expresión de los transportadores de glucosa. RGT1 pertenece a la familia GAL4 de factores de transcripción, es requerido para la represión transcripcional de HXT1-HXT4 en ausencia de glucosa; este gen codifica para un represor transcripcional, Rgt1p, una proteína que contiene un grupo Zn2Cys6 responsable de la unión al ADN, la cual reconoce varios sitios de unión a los promotores de los genes HXT ya que un solo sitio de unión no es suficiente para una represión significativa (Ozcan et al., 1999; Kim et al., 2003; Flick et al., 2003). La función de Rgt1p es regulada por una interacción intramolecular entre la región-N terminal y la región media de RGT1, se sugiere que esto inhibe la unión al DNA con el dominio de RGT1 (Dombek et al., 2004). RGT1 sirve también como activador transcripcional y es requerido para la completa expresión del gen HXT1 cuando los niveles de glucosa son altos, aunque la forma en cómo se convierte de represor transcripcional a un activador no es clara aun. Lo cierto es que el nivel de glucosa determina el estado de fosforilación de Rgt1p; esta hipofosforilado en ausencia de glucosa e hiperfosforilado cuando los niveles de glucosa son altos (Lafuente et al., 2000; Kim et al., 2006).
41 En ausencia de glucosa Rgt1p, en conjunto con Mth1, un regulador negativo en la señalización de glucosa y Std1p una proteína involucrada en el control de la regulación de glucosa, se une a los promotores de los genes HXT y a los correpresores transcripcionales Ssn6 y Tup1, esto estabiliza el dominio represivo en la cromatina e inhibe directamente a la RNA polimerasa reprimiendo la expresión de los genes HXT (Lafuente et al., 2000; Flick et al., 2003; Ramakirshnan et al., 2006). En presencia de glucosa, cuando la señal es generada por Snf3 y Rgt2, es transmitida a Rgt1 a través de Grr1, inhibiendo la represión transcripcional de Rgt1, aunado a la degradación inducida por glucosa de Mth1 y Std1, permitiendo que los genes HXT se expresen (Kim et al 2003, 2006; Ramakirshnan et al., 2006). En la activación por glucosa la PKA (cAMP-proteinquinasa) cataliza la fosforilación de Rgt1 inhibiéndolo, permitiendo la expresión de los genes HXT. La PKA está involucrada en diversos procesos celulares, entre los que se encuentra el crecimiento celular, resistencia al estrés y en el metabolismo en general. Diversos estudios han demostrado que las células de levaduras deficientes en PKA no son capaces de expresar los genes HXT1 y HXT3 en presencia de glucosa (Lafuente et al., 2000; Polish et al., 2005; Kim et al., 2006; Belinchon et al., 2006). 5.5.3. Las proteínas Grr1, Hxk2 y Reg1 La represión en la expresión de los genes HXT en presencia de glucosa requiere de la proteína Grr1p, una proteína que se expresa constitutivamente a muy bajos niveles y pertenece al complejo SCF (Skp1/cullin/F-box) cada una de las cuales poseen diferentes componentes F-box. La naturaleza de la proteína F-box determina la especificidad de la interacción con el complejo de enzimas de ubiquitinación (Ubcs) y su blanco. Grr1 se une a los sustratos en la proteólisis mediante ubiquitinación, esta incluye un motivo carboxilo terminal capaz de interaccionar proteína-proteína, unido así Rgt1 con Grr1 se elimina la interacción con el correpresor dando lugar a una activación transcripcional (Hsiung et al., 2001; Flick et al., 1991, 2003; Vallier et al., 1994). En ausencia de glucosa, Rgt1 está presente en la forma no-ubiquinada y actúa como represor al unirse a Ssn6 y Tup1, proteínas que forman un complejo correpresor que reprime la transcripción de algunos genes interaccionando directamente con las histonas H3 y H4 (Watson et al., 2000; Davie et al., 2003; Zhang et al., 2004; Fagerstrom-Billai et al., 2007).
42 La levadura S. cerevisiae es capaz de detectar los niveles extracelulares de glucosa y generar señales intracelulares que resultan en respuestas adecuadas a las variaciones en la composición del medio; la mayoría de estas respuestas involucran alteraciones en la expresión de los genes, una parte de estas alteraciones ocurren por los niveles de trascripción del mARN, por la represión o activación en la trascripción de diversos genes implicados en la codificación de enzimas en el metabolismo de carbono; entre estas se encuentra una isoenzima hexoquinasa 2 (Hxk2). Cuando las células de la levadura están creciendo en un medio fermentable compuesto por glucosa, fructuosa o manosa como fuente de carbono, el gen HXK2 codifica la enzima Hxk2p, la cual cataliza la fosforilación de glucosa en el carbón 6 en el citosol. Se encontró que la interrupción del gen HXK2 tuvo un profundo efecto en las transcripciones de genes relacionados con el ciclo TCA (Ciclo de los ácidos tricarboxílicos o de Krebs), al igual que en la tasa de respiración, y en la síntesis de ATP. Al realizar la cinética de producción de etanol con la mutante hxk2-delta presentó una menor producción que la cepa que no tenía interrumpido el gen HXK2. Hxt2p juega un rol específico durante la señalización de glucosa ya que es requerida para la represión de algunos genes por glucosa, es específicamente requerida para una fuerte inducción de HXT1 por altas concentraciones de glucosa y para HXT4 en bajas concentraciones (Belinchon et al., 2006; Westergaard et al., 2007). Hxk2 depende de la cantidad de Mig1 presente en el núcleo, Moreno et al. (2005) analizaron la interacción tanto in vivo como in vitro de Hxk2-Mig1; encontraron que el complejo es necesario para la translocación de Mig1 al núcleo. Dilucidaron que el mayor funcionamiento de Mig1 en inhibir la función de la proteinkinasa Snf1 cuando la bloquea por fosforilación. Mig1 en un factor involucrado en la represión transcripcional de glucosa, que tiene una secuencia especifica de unión al ADN y es regulado por SNF1 (serinproteína/treonin quinasa) y GLC7 fosfatasa (Nehlin et al., 1990; Verma et al., 2005). De la Cera et al. (2002) demostraron que HXK2 Y MED8 están asociados fisiológicamente ya que ambas proteínas Hxk2p y Med8p se encuentras interaccionando juntas en las uniones con los segmentos de DNA que contienen los sitios MED8, concluyeron que Hk2p opera a través del sitio MED8 por interacción con Med8p, en la traducción en la ruta de señalización de glucosa en Saccharomyces cerevisiae. MED8 es una subunidad mediadora del complejo de la ARN polimerasa II cuando actúa como represor previene que la polimerasa se una al promotor, cuando actúa como activador se une a la polimerasa e incrementa la afinidad con el promotor o simula la transición de cerrado a abierto complejo promotor-polimerasa (en la burbuja de trascripción en la cual la doble hélice de ADN se une para facilitar el inicio de la trascripción) (Kornberg et al., 2005; Westergaard et al., 2007). Otra proteína que participa en el proceso
43 inhibidor de los genes represivos es Reg1p, una proteína magnesio dependiente serin-treonina fosfatasa (AMD fosfatasa) contiene una subunidad catalítica de 38 kDa y una subunidad moduladora de 23KDa, tiene actividad fosfatasa. Reg1p interacciona fuertemente con Glc7p, una proteinfosfatasa tipo-1 que participa en diferentes procesos que incluyen represión de glucosa, crecimiento celular y acumulación de glicógeno. Reg1 interacciona a través de Glc7p con el dominio kinasa de Snf1p resultando la desfosforilación e inactivación de Snf1p y de algunos genes involucrados en la represión de glucosa. Esta interacción juega un rol importante en el transporte de Fbp1p (fructosa 1-6 bifosfatasa) como intermediario de importación y degradación de las vesículas a las vacuolas durante la inducción de glucosa (Tung et al., 1992; Cui et al., 2004; Kenneth et al., 2004). 5.6. La regulación de los genes HXT1 y HXT3 por glucosa/fructosa La forma en la que los genes HXT son regulados transcripcionalmente, esto es por proteínas que se unen a secuencias reguladoras de ADN, en respuesta a glucosa es consistente con su función de alta o baja afinidad. (Ozcan et al., 1999; Reifenberger et al., 1997.). Estos genes exhiben diferentes tipos de regulación por glucosa: El gen HXT1, localizado en el cromosoma VIII, (Figura 6) se expresa en concentraciones mayores al 1% de glucosa o fructosa; la expresión máxima de este gen es durante la fase lag y la fase tempranaexponencial de crecimiento de la levadura (Ozcan et al., 1995; Greatrix et al., 2006). La pérdida del gen HXT1 resulta en la disminución del transporte de glucosa y manosa pero no de fructosa, sugiere que esta proteína puede ser específica para las aldohexosas. Se sabe que Hxt1p funciona como transportador de baja afinidad para xilosa, cerca de 10 veces más que para glucosa (Lewis et al., 1991; Saloheimo et al., 2007). La secuencia de HXT1 es de 1,707 nucleótidos, posee un marco de lectura abierto que codifica para 569 aminoácidos y una proteína de 64,044 Da. La proteína Hxt1 es altamente hidrofóbica (de acuerdo al análisis de hidrofobicidad de Kyte-Doolittle) contiene dos grupos de seis dominios hidrofóbicos separados por un giro de 68 aminoácidos hidrofóbicos, una región con 59 aminoácidos hidrofilicos N-terminal y 58 aminoácidos del dominio C-terminal (Lewis et al., 1991), esta proteína es la única que tiene 200 sitios de glucosilación, cuatro sitios hipotéticos de glucosilación están situados en la región N-terminal Asn2,14,36,42 y uno más en TM5 Asn277. Esta proteína no contiene motivos PEST (sitios potenciales proteolíticos de unión, Szkutnickaet al., 1989; Lewis et al., 1991). Como se muestra en la figura 6, Rgt1 es represor de la expresión de HXT1 en ausencia de glucosa. En presencia de glucosa Rgt1 es
44 hiperfosforilado y disociado del complejo represor formado por las proteínas Ssn6p y Tup1p, esto requiere de la presencia de la proteína Grr1p (Ozcan et al., 1999; Flick et al., 2003; Ferrer et al., 2004). Igualmente en presencia de glucosa por un mecanismo aun desconocido la proteína Hxk2 interacciona con la proteína Reg1p produciendo una fuerte inducción del gen HXT1 (Ozcan et al., 1999; Belinchon et al., 2006; Westergaard et al., 2007). HXT3 es un gen que induce un transportador de glucosa de baja afinidad Hxt3p inducido por bajas o altas concentraciones de glucosa. La presencia de glucosa por si sola induce la expresión de HXT3 cerca de 10 veces con un valor de Km de 28.65 a 6.8 mM. Está reportado que la expresión de HXT3 es máxima cuando las células están en fase estacionaria (Ozcan et al., 1995, 1999; Maier et al., 2002). HXT3 codifica por una proteína de 567 aminoácidos con una masa molecular de 62 KDa; tiene cuatro secuencias TATA (-111, -177, -265 y -280); el análisis de hidrofobicidad de la proteína predice que contiene 12 dominios transmembranales; una región hidrofílica entre TM6 y TM7 de 68 aminoácidos (Ko et al,. 1993).
Figura 6. HXT1 Inducción de la transcripción solo por alta concentración (Ozcan et al., 1995).
45 Como se muestra en la Figura 7, Rgt1 inhibe la expresión de los genes HXT en ausencia de glucosa. La proteína Grr1p es requerida para la inhibición de la función de Rgt1. La señal de glucosa intracelular generada por Snf3 (alta concentración de glucosa) y Rgt2 (baja concentración de glucosa) es responsable de la inhibición de Rgt1 por Grr1, además de la inducción y la expresión de HXT3 (Ozcan et al., 1995, 1999). Ko et al. (1993) encontraron que al restaurar los genes HXT1 y HXT3 en células mutadas fueron capaces de crecer en condiciones extracelulares bajas en potasio (7mM). En una fermentación alcohólica por S. cerevisiae la glucosa tiene una tasa mayor de consumo que la fructosa, como en la mayoría de las levaduras industriales usadas en vinicultura, quedando una alta discrepancia entre el consumo de las cantidades de las dos azucares, por lo que la habilidad de la levadura para fermentar la fructosa es de importancia crítica para mantener la fermentación hasta el final del proceso (Bertheles et al., 2004; Guillaume et al., 2007).
Figura 7. HXT3 Inducción de la trascripción por glucosa independiente de la concentración de azúcar (Ozcan et al., 1995).
46 Luyten et al. (2002) encontraron que Hxtp1 y Hxtp3 tienen un rol predominante en las condiciones enológicas debido a los altos contenidos de glucosa y fructosa, Hxt1p tiene una función importante durante el inicio de la fermentación, mientras que ha sido evidenciado que Hxt3 es el único transportador que asegura el perfil normal de fermentación, a demás se expresa durante todas las fases y presuntivamente responsable de la capacidad de algunas levaduras de consumir fructosa. Estudios en la levadura Fermichamp, caracterizada como fructofílica ya que la diferencia entre el consumo de glucosa y fructosa es mucho más pequeño, revelaron que en el gen HXT3 existen 38 mutaciones en la región codificante, 10 de los cuales son resultado de sustituciones, encontrando que estas se encuentran en la región transmembranal nueve y diez (TM9 y TM10) (Guillaume et al., 2007). El flujo metabólico en la fermentación de la fructosa es muy similar al de la glucosa como lo hemos mencionado anteriormente y el transporte del azúcar a través de la membrana es el primer factor en la diferencia de fermentación entre las dos azucares; la segunda causa de discrepancia son los pasos de fosforilación ya que la glucosa después del transporte es fosforilada por tres enzimas, la glucoquinasa, la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2 mientras que la fructosa solo es fosforilada por la hexoquinasa 1 y la hexoquinasa 2; otro factor importante en el transporte son las propiedades fisicoquímicas de los azucares, la glucosa es transportada en forma de piranosa y la fructosa en forma de furanosa (Colville et al., 1993; Bertheles et al., 2004). En conclusión, la habilidad de degradar el azúcar a etanol y dióxido de carbono (CO2) de la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada por los humanos desde hace miles de años en la fermentación de bebidas alcohólicas. A diferencia de la micoflora que interviene en el proceso de producción de vino, las levaduras responsables de la fermentación alcohólica del mezcal no han sido completamente identificadas ni caracterizadas metabólicamente, ya que el proceso es más bien artesanal; sin embargo, se sabe que la especie S. cerevisiae, al igual que en el proceso de vinificación, es la más productiva. A nivel científico y genético la complejidad del sistema de transporte de azúcares no ha sido estudiado durante la obtención de mezcal, por lo tanto tampoco sus consecuencias a nivel del proceso de elaboración, mejoramiento y optimización de los procesos de producción, para realizar la búsqueda de cepas de levaduras con capacidades metabólicas interesantes desde el punto de vista de utilización y aprovechamiento de residuos agroindustriales.
47 El presente trabajo propone analizar en detalle el proceso de fermentación y obtención del mezcal, poniendo énfasis, en primer lugar, en la caracterización de los perfiles metabólicos de las levaduras responsables de la producción de alcohol y metabolitos que le confieren sus características organolépticas singulares a éste producto; y en segundo lugar, se analizaría desde el punto de vista molecular la expresión y regulación de los transportadores de hexosas involucrados en la asimilación de la fructosa, que se sabe es el azúcar principal de los mostos de agave, y cuya utilización completa determina una mayor productividad del proceso. La importancia de este trabajo es, en primer lugar, la información científica que se generaría en cuanto al conocimiento microbiológico (metabólico y molecular) de la producción de mezcal, el cual es casi inexistente. En segundo lugar, la industria mezcalera tamaulipeca se beneficiaría, en el corto plazo, con la caracterización precisa del componente biológico presente en sus procesos, lo cual les permitiría tener un mayor control e implementar esquemas de optimización y seguimiento de sus procesos. A mediano y largo plazo podrían contar con un inóculo preciso y único que les garantice la calidad de su producto, además de la posible aplicación de cepas específicas en la utilización del agave y otros subproductos agrícolas con una alta concentración de fructosa.
48
6
MÉTODOS
6.1. Aislamiento de levaduras 6.1.1. Diseño del estudio y tamaño de la muestra La población a estudiar fueron 17 aislamientos (de 103 originalmente aislados) obtenidos de la mezcalería “El Palmar” del Sr. Emilio Lozoya, situada en San Carlos (Tamaulipas, México), que se ubica a una altitud 609 m y con coordenadas N 24˚ 43.241’ y W 98˚ 52.934’. La toma de muestra se efectuó en el horno de cocimiento, directamente de la pared del equipo y agave cocido; el trapiche (molino) al área de molienda, mostos y bagazo de agave; y en las diversas etapas de los mostos en fermentación (Figura 8). Como control se utilizó la cepa Fermichamp ® (DSM) una cepa de vino industrial con capacidad fructofílica. 6.1.2. Tratamiento de la muestra En cada punto (Figura 8) las muestras fueron homogeneizadas; en el caso de la muestra de consistencia solida se suspendieron 10 g en 10 mL de solución salina al 0.9%, en las muestras liquidas se analizaron 15 mL. En ambos casos se realizaron diluciones seriadas con el mismo diluyente y fueron sembradas en medio AN (Agar nutritivo, DIFCO, Francia), YEPD (Extracto de levadura 5 g/L; peptona 3 g/L; glucosa 20 g/L; agar 20 g/L con antibiótico (Kanamicina de SIGMA, Alemania). Los aislados obtenidos fueron cultivaron en medio YEPD y conservadas en glicerol al 86% manteniéndose a -70 °C.
49
Figura 8. Puntos muestreados en la mezcalería “El Palmar”. A) Piñas en cocción. B) Trapiche. C) y D) Mostos en fermentación.
50 6.1.3. Clasificación microscópica Se realizaron frotis en fresco de los aislados de mostos de mezcal con el fin de observar la morfología celular. La observación se realizo primero con el objetivo 40X y posteriormente se tomaron imágenes de las células con campo claro con el objetivo ocular 100X, en un microscopio BX-51 (Olympus, Japón), y se adquirieron con una cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. Las células fueron clasificadas y agrupadas por su morfología redonda u ovalada. 6.2. Identificación molecular 6.2.1. Extracción de DNA Se utilizó el protocolo modificado de extracción de ADN propuesto por Raeder y Broda (1985). Se recolectaron 50-80 mg de células de levadura en un tubo Eppendorf® estéril de 1.5 mL, se sumergieron en nitrógeno liquido por 20 min y se maceraron con pistilos plásticos por 5 min. Fueron agregados 500 µL de buffer de extracción (200 mM Tris HCL pH 8.5; 250 mM NaCl 25 mM EDTA, 0.5 % SDS) se homogeneizó la muestra e incubó por 5 min a temperatura ambiente. Para la separación de las fases acuosa, interfase y orgánica se le añadió 500 µL de fenol-cloroformo (50:50 v/v a 4 °C) y se mezcló en el vortex a máxima velocidad por 5 min. La muestra se centrifugó a 13000 rpm por 30 min y la fase acuosa se transfirió a un tubo Eppendorf® limpio, donde se adicionaron 400 mL de cloroformo (4 °C), se mezcló minuto en vortex y se centrifugó durante 5 min. Se recuperó el sobrenadante en un tubo Eppendorf® estéril y se trató con 8µL de RNAasa (PROMEGA, Estados Unidos) se incubó por 30 minutos a 37 °C en un block caliente. Posteriormente se le adicionaron 500 mL de isopropanol frío (-20 ºC). Para ayudar a la precipitación de los ácidos nucleicos la muestra se colocó a -20 ºC durante 1 h. Los ácidos nucleicos se recuperaron centrifugando a 10,000 rpm durante 10 min y se colocaron en un tubo Eppendorf®, realizando un lavados con etanol 70 %. La pastilla se suspendió en 50 μL de agua mili-Q estéril. El DNA obtenido se visualizó en un gel de agarosa al 1.0 %, teñido con SyberGold™ 10 X (Figura 9). Este se conservó a -20 °C, para su uso en las amplificaciones de PCR.
51
1 2
3 4
5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Figura 9. Gel agarosa al 1.5 %, tenido con SyberGold™ 10 X. ADN de aislados de mostos de mezcal; en la tabla IV se especifica la identificación de las muestras. 18 ADN de cepa control FECHA (Fermichamp®). La cantidad de ADN obtenida se determinó por su absorbancia a 260 nm en un espectrómetro GBC (Cintra 10e.), y aplicando la fórmula siguiente: [ADN] = 50 * A260nm * FD [μg/ml] Donde el factor de dilución se calculó como: FD = (Vol. Agua miliQ) + (Vol.de la muestra) / Vol. de la muestra La calidad del ADN se cuantificó mediante el valor de la relación de absorbancia a 260 y 280 nm de acuerdo a la siguiente fórmula: Calidad de ADN= A260 / A280 Donde un valor entre 1.8 y 2 indica que la solución está libre de proteína, por lo que se tiene una buena calidad de ADN. El ADN se visualizó en un gel de agarosa por 1 h. El ADN obtenido fue suspendido en 100 μl de TE 1X. y fue conservado a 4 °C, para su empleo en las amplificaciones por PCR.
52 6.2.2. Amplificación de los genes ribosomales ITS1-5.8S-ITS2 y 26S por PCR En la reacción de PCR para la amplificación de los segmentos ITS’s se utilizaron los oligonucleótidos
reportados
por
White
et
al.
(1990),
ITS1
(5´
TCCGTAGGTGAACCTGCGG) e ITS4 (5´ TCCTCCGCTTATTGATATGC); esta se realizó en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X), 1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μL de dNTPs (10 mM), 0.5 μL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/μL) y completando el volumen a 25 μL con agua MiliQ estéril. El programa en el termociclador incluyó un ciclo inicial de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos con temperaturas de desnaturalización (94 ºC/ 30 seg), alineación (59 ºC / 30 seg) y alargamiento (72 ºC/ 30 seg). Finalmente se dio un paso de extensión final de 7 min a 72 ºC. El producto amplificado fue procesado mediante electroforesis en gel. El segmento ribosomal 26S se amplificó con los oligonucleótidos NL1(5´ GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG) y NL4 (5´ GGTCCGTGTTTCAAGACGG); esta se realizó en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1 µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X), 1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μl de dNTPs (10 mM), 0.5 µL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/µL) y completando el volumen a 25 µL con agua MiliQ estéril. El programa en el termociclador incluyó un ciclo inicial de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos con temperaturas de desnaturalización (94 ºC/ 30 seg), alineación (63 ºC/ 30 seg) y alargamient0 (72 ºC/ 30 seg). Finalmente se dio un paso de extensión final a 7 min a 72 ºC. El producto amplificado fue procesado mediante electroforesis en gel. 6.2.3. Digestión enzimática del segmento ribosomal ITS’s Los segmentos ITS’s amplificados fueron sometidos a un proceso de restricción con las enzimas EcoRI (Promega). A 10 μL de la reacción de PCR le agregó 12 u de enzima, a lo cual se le adicionó el buffer 10 x correspondiente a la enzima en una concentración final de 1 x; la mezcla de reacción fue ajustada a 20 µL con agua MiliQ estéril. Se centrifugó 15 segundos y se mezcló suavemente. Finalmente se incubó por 6 horas a 37 ºC. El producto de la digestión se visualizó en un gel de agarosa al 2.5 %. El gel fue fotografiado y los patrones de restricción comparados entre si. Los productos amplificados fueron procesados mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 1 X, en regulador Trisborato-EDTA 1% (para un litro, 108 g trizma-base, 55 g ácido bórico, 40 mL EDTA 0.5 M
53 pH 8) a 100 V por 45 min. Los geles se documentaron en fotografías bajo luz UV a 320 nm con un digitalizador de imágenes Gel Doc (Kodak, Estados Unidos). 6.2.4. Amplificación de los genes HXT1 y HXT3 En la amplificación del gen HXT1 (Figura 10) se usaron oligonucleótidos reportados por Ramakrishnan et al. (2006), HXT1F (5´ GTGAAAGTCAAGTGCAACCC) y HXT1R (5´ CGGTCAACGGTGTACGAG) además los oligonucleótidos diseñados en nuestro laboratorio JAHXT1F
(5´
ATGAGAGCCGCTGGTACTGCATCT)
y
JAHXT1R
(5´
CTATTTCCTGCTAAACAAACTCTTG).
Figura 10. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT1 de aislados de mostos de mezcal. Para la obtención del gen HXT3 (Figura 11) se utilizaron los oligonucleótidos HXT3F (5´ GATTTCCAAGCTGAGGCCG)
y
HXT3R
(5´
ACATGGCCGGCTTACCAGTG)
(Ramakrishnan et al., 2006); además de un par de oligonucleótidos diseñados en este trabajo, FHXT3J
(5´-ATTTCTGAAGTCGCTCCTAAGG)
ACATAACAGCAGACCATACC).
y
RHXT3J
(5´
-
54
Figura 11. Gel de agarosa al 1 %, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos). Amplificación del gen HXT3 de aislados de mostos de mezcal. 1=Oligonucleótidos diseñados por. 2=Oligonucleótidos diseñados por el Laboratorio de Biotecnología Industrial. La reacción de amplificación para los cuatro pares de oligonucleótidos se realizó en un volumen final de 25 µL, utilizándose 1µL de ADNg (50 ng), 2.5 µL de Buffer (10 X), 1.5 µL de cloruro de magnesio (50m µL), 1 µL de cada uno de los oligonucleótidos (10 µM), 0.5 μl de dNTPs (10 mM), 0.5 μL de la enzima Taq DNA polimerasa (5 U/μL) y completando el volumen a 25 μL con agua MiliQ estéril. El programa que se utilizó consistió de 1 ciclo de 5 min a 94 ºC y 35 ciclos de 30 seg a 94 ºC, 30 seg a 63 ºC y 30 seg a 72 ºC. Finalmente se dio un paso de extensión final a 7 min a 72 ºC. Los productos de la amplificación fueron visualizados en gel de agarosa al 1 %. La reacción de PCR obtenida fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and PCR for Clean-up System (PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación se realizo con el kit Sequence BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Estados Unidos). La reacción de PCR de secuenciación fue purificada con el kit Big Dye® XTerminatorTM Purification (Applied Biosystems, Estados Unidos). 6.2.5. Identificación molecular por secuenciación La reacción de PCR obtenida en la amplificación de los genes ITS’s, 26S, HXT1 y HXT3 fue purificada por columnas con el kit Wizard SV Gel and PCR for Clean-up System (PROMEGA, Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del fabricante. La secuenciación se
55 realizó con el kit Sequence BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing (Applied Biosystems, Estados Unidos). La reacción de PCR de secuenciación fue purificada con el kit Big Dye® XTerminatorTM Purification (Applied Biosystems, Estados Unidos). Se utilizo el equipo secuenciador ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems, Estados Unidos). Las secuencias obtenidas fueron analizadas con el programa BioEdit Sequence Aligment Editor (Hall, 1999) y comparadas en la base de datos depositadas en el NCBI usando el BLAST (Basic local alignment search tool). 6.2.6. Construcción de dendogramas En el análisis filogenético de las secuencias 26S e ITS’s obtenidas se utilizó el método de agrupamiento promedio de “Neighbor-Joining” con un “Bootstrap” de 1000 repeticiones y para las distancias de evolución se utilizó el modelo “Nucleotide Maximum Composite Likelihood” máxima similitud, con el objeto de ver las relaciones entre aislamientos. 6.3. Fermentaciones 6.3.1. Medios de cultivo Con el fin de disminuir la fase de adaptación del microorganismo al medio en el inicio de la fermentación, las levaduras se activaron en un pre-cultivo (Taillander et al., 2006). Esta etapa se realizó en matraz erlenmeyer de 250 mL, conteniendo 100 mL de medio (Tabla II), el pH se ajustó a 5 con una solución de ácido ortofosfórico el medio fue esterilizado en autoclave a 120 °C durante 20 minutos. El microorganismo se incubó a 250 rpm a 30 °C por 12 horas. Se cuantificó el número de células con el fin de determinar el volumen necesario para iniciar la cinética a 3x106 células por mililitro.
56 Tabla II. Composición de medios de cultivo
Reactivo
Precultivo Medio 1 Medio 2 Medio 3 (g/L)
Extracto de levadura
1.0
1.0
1.0
1.0
KH2PO4
5.0
5.0
5.0
5.0
MgSO4(H2O)7
0.4
0.4
0.4
0.4
(NH4)2S04
2.0
2.0
2.0
2.0
Glucosa
20.0
90.0
10.0
100.0
Fructosa
0.0
10.0
90.0
100.0
Los aislados fueron evaluadas en los medios uno y dos con la composición indicada en las Tabla II (Taillander et al 2006). Los aislados con mejores características en consumo de azúcar y producción de etanol fueron evaluados en el medio 3 (Tabla II). En todos los casos ajustando el pH a 5. Las condiciones de la cinética de crecimiento se llevo a cabo en matraz Erlenmeyer® de 500mL conteniendo 300 mL de medio a 30 °C y 125 rpm. La cinética de fermentación se realizó en matraces de 1 L con 500 mL de medio de cultivo y un inóculo inicial de 3 X106 células /mL, a una temperatura de 30°C. 6.3.2. Cuantificación de la biomasa.
6.3.2.1. Espectrometría La densidad óptica (DO) fue evaluada a 600 nm en un espectrofotómetro modelo Hitachi* U-2000TM equipo monocromático Seya-Namioka®. Las medidas se realizaron en cubetas de 2 mm de trayecto óptico; se efectuaran diluciones a partir de DO> 0.8 con el fin de mantener la tendencia lineal.
57 6.3.2.2. Peso seco La concentración celular en g/L fue determinada por el método de peso seco, esta técnica permite la estimación de la biomasa total. Consistió en tomar un volumen conocido de la muestra para centrifugarlo a 13000 rpm, por 10 minutos a 10 °C. El paquete celular fue lavado dos veces con agua desionizada para eliminar restos del medio de cultivo, posteriormente se llevó peso constante utilizando un analizador de humedad (modelo HA60; Precisa, Zurich, Suiza). Este método se llevó en paralelo con el de espectrometría, con el fin de obtener la correlación entre DO600nm y concentración en biomasa (peso seco).
6.3.2.3. Cuenta celular Este método consiste en la determinación de la concentración celular utilizando un hematocímetro (cámara de Neubauer o d Thoma) visualizando en el objetivo 40X de un microscópico (BH-2 Olympus, Japón). 6.3.3. Análisis de azúcares
6.3.3.1. Determinación de glucosa por un método enzimático El método utilizado por el instrumento YSI (YSI Life sciences, Estados Unidos) consiste en la determinación de glucosa por medio de la enzima glucosa-oxidasa inmovilizada entre dos membranas, una de policarbonato y otra de celulosa acetato. El sustrato es oxidado al entrar en contacto con la enzima produciendo peróxido de hidrógeno, el cual pasa a través de la membrana de celulosa acetato hacia el electrodo de platino. El resultado es la cuantificación de la concentración en el sustrato de acuerdo a la siguiente reacción: D-glucosa+O2
glucosa oxidasa
D-glucono-δ-lactona+H2O2.
58 6.3.3.2. Determinación de azucares totales por el método DNS El método DNS (ácido 3,5-dinitrosalicílico) se realizó comparando los resultados con una curva patrón de glucosa, con el objeto de obtener la curva correspondiente para determinar los equivalentes de azucares reductores. La solución DNS fue compuesta por 8 g de sodio; 5 g de ácido dinitrosalicílico; 150 g de tartrato de sodio y potasio; completando a 500 mL de agua y evitando su exposición a la luz; el reactivo puede ser utilizado después de 15 horas de su preparación. El análisis se efectuó en un tubo de ensayo conteniendo 1 mL de reactivo DNS y 1 mL de la muestra a analizar, previamente diluida a la concentración de la gama patrón (A partir de una gama de soluciones patrón de glucosa y fructosa equivalente a 0-2 g/L), fue incubada a 100 °C durante 10 minutos; enfriada por 10 minutos en hielo y determinó DO570nm, se diluyó convenientemente con agua destilada, mientras que si fue demasiado pequeña, se repitió el ensayo pero con una mayor cantidad de solución de glucosa (por ejemplo 0.2 a 0.3 mL). El método ácido 3,5-dinitrosalicílico se basa en la reducción del DNS (de color amarillo) por el azúcar reductor al ácido 3-amino-5-nitrosalicílico (de color rojo), cuya presencia puede detectarse por lectura de absorbancia en la zona de 540-570 nm (Montreuil et al., 1986).
6.3.3.3. Cromatografía liquida de alta presión (HPLC) La cromatografía liquida de alta presión es una técnica analítica, utilizada para separar e identificar compuestos mediante intercambio iónico, basada en la atracción electrostática entre los iones en solución y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. El equipo utiliza una columna de intercambio iónico Aminex HPX-87 C de 30 cm de longitud precedida de una precolumna con un gradiente de interacción GC 801. Las sustancias resultantes del metabolismo de la levadura en el proceso de fermentación en glucosa y fructosa, como glicerol, ácido acético, ácido cítrico, ácido succínico y etanol fueron evaluadas por HPLC. Para llevar a cabo el análisis por HPLC se utilizó una fase móvil preparada con agua miliQ y acido sulfúrico (H2SO4 0.005 M). Las muestras a analizar se centrifugaron a 13000 rpm a 10°C y fueron filtradas. La curva de calibración para los análisis fue obtenida utilizando la ecuación lineal de la recta obtenida con el área contra la concentración del compuesto a analizar, y para todos ellos el cuadrado de coeficiente de correlación de Person (r2) no fue ser mayor a 0.98.
59 6.4. Cuantificación del estrés por etanol Se inocularon 50 mL de medio rico en fructosa (Medio 2) con células precultivadas con a una DO660nm=1 (aproximadamente a las 12 horas), se incubaron por 24 horas a 125 rpm y 30 °C. De las células cultivadas bajo estas condiciones, 25 mL fueron centrifugados a 3000 rpm (Allegra 6G Centrifugue Beckman Coulter, Japón) por 10 min., se recolectaron y suspendieron en 25 mL del medio líquido YM (25% Etanol v/v; y en g/L: extracto de malta 3; extracto de levadura 3; peptona 5; glucosa 10 y agar 20). Se tomó 1 mL de muestra a los 0.5, 1.5, 3 y 5 min, cada mililitro se diluyo en 9 mL de solución Ringer (cada 100 mL contiene NaCl 0.85g, KCl2 0.04g, CaCl2 2H2O 0.034 g) las diluciones seriadas de cada muestra se sembraron por duplicado en YM agar e incubaron por 72 horas a 28 °C. (Pina et al., 2003). Para el control se tomaron 25 mL de células, estas fueron centrifugadas, recolectadas y suspendidas en 25 mL del medio líquido YM sin etanol, 1 mL de muestra se diluyo en 9 mL de solución Ringer, se hicieron diluciones seriadas y se sembraron por duplicado en YM agar e incubaron por 72 horas a 28 °C. Se usó el conteo de UFC (Unidades Formadoras de Colonias) como índice de viabilidad. 6.4.1. Parámetros cinéticos Los valores experimentales obtenidos fueron evaluados en general para cada tratamiento analizándose los parámetros indicados en la tabla III. Tabla III. Parámetros cinéticos Parámetro
Unidades
Velocidades Velocidades de producción de biomasa
(g/L/h): rx
dX/dt
Velocidades de consumo de substrato
(g/L/h): rs
dS/dt
Rendimientos Rendimientos de producción de biomasa por sustrato consumido Yx/s (g/g) Rendimiento de sustrato
Yp/s (g/g)
60 6.5. Análisis estadístico Los datos cinéticos obtenidos de los tratamientos fueron evaluados estadísticamente por ANOVA.
61
7
RESULTADOS
De 103 aislamientos iniciales, y basado en su imagen microscópica y macroscópica se seleccionaron 17 cepas (Tabla IV) con morfología celular presuntiva de S. cerevisiae. Tabla IV. Aislados de levaduras con morfología redonda Aislado AN2, 1Y1, 1Y9, AN1, 1Y14, AN5
Observaciones Aislamiento realizado a los dos días de inicio de la fermentación. Los mostos presentaron una concentración de 13.2° Brix.
3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, El aislamiento se realizó al sexto día de 3Y1, 3Y2, 3Y3, 3Y4,3Y5, inicio de la fermentación. Los mostos 3Y8
presentaron una concentración de 10° Brix.
7.1. Identificación molecular de las levaduras Los aislados se concentraron en cuatro grupos diferentes de acuerdo al patrón de amplificación de los segmentos ITS’s, A) integrado por 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8 y 1AN5 con 750 pares de bases (pb) aproximadamente; B) grupo compuesto por 3Y1, 1AN2, y 1AN1 con 700 pb aproximadamente; el C) formado por 1Y1, 1Y9 con 650 pb y D) constituido por 1Y14 con cerca de 600 pb (Fig. 12).
62
Figura 12. Gel de agarosa al 1.5% tenido con SyberGold™ 10 X. Amplificación de los segmentos ITS’s aislados con morfología celular redonda. Agua (C) control negativo y M: marcador de 100 pb (Promega, Estados Unidos). 7.1.1. Análisis de restricción del segmento ribosomal ITS1-5.8S-ITS2 (ARDRA) Los productos de amplificación ITS’s de todos los aislados fueron sometidos a un proceso de restricción con la enzima EcoRI; se encontró que los aislados se agruparon en cinco ARDRA’s diferentes (Fig. 13), constituidos por I) 3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8 y FECHA; perfil II) 3Y1; el III) 1AN2, 1AN1, 1AN5; el IV) 1Y1 Y 1Y9; el V) 1Y14.
Figura 13. ARDRA’s de aislados de mostos de mezcal. Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos).
63 7.1.2. Amplificación del segmento ribosomal 26S La amplificación del segmento 26S (Figura 14) fue para todos de 750 pb aproximadamente.
Figura 14. Amplificación de genes ribosomales 26S. Gel de agarosa al 2.5%, teñido con SyberGold™ 10 X, marcador 100 pb (Promega, Estados Unidos) de las levaduras de morfología redonda aisladas de mostos de mezcal. 7.1.3. Identificación molecular por los segmentos ribosomales ITS’s y 26S En el análisis de la secuencia se identificaron cinco grupos de microorganismos, 10 aislados de Saccharomyces cerevisiae, uno Zygosaccharomyces bailii, tres de Torulaspora delbrueckii, dos de Kluyveromyces marxianus y uno de Pichia mexicana (Tabla V); de los aislados 3D6 y AN1 solo se obtuvo la secuencia del segmento 26S.
64 Tabla V. Clasificación e identificación molecular de las levaduras aisladas de mostos de mezcal Identidad
Especie
Accesión*1
3D2
Saccharomyces cerevisiae
JQ824871
100
EF457564.1
99
3D3
Saccharomyces cerevisiae
JQ824873
100
AB212257.1
89
3D4
Saccharomyces cerevisiae
AB279746
100
AB279746.1
96
3D5
Saccharomyces cerevisiae
AF321540
100
AF321540.1
87
3D6
Saccharomyces cerevisiae
JQ824876
100
----------------
3Y2
Saccharomyces cerevisiae
JQ824877
100
EF151450.1
98
3Y3
Saccharomyces cerevisiae
JQ824872
100
EF457565.1
98
3Y4
Saccharomyces cerevisiae
JQ824875
100
AM900396.1
98
3Y5
Saccharomyces cerevisiae
JQ824869
100
EU145764.1
97
3Y8
Saccharomyces cerevisiae
JQ824874
100
FJ231432.1
99
3Y1
Zygosaccharomyces bailii
FM201320.1
99
X84640.1
93
1AN1
Torulaspora delbrueckii
FJ468458.1
97
----------------
1AN5
Torulaspora delbrueckii
GQ179981.1
99
FN401197.1
100
1AN2
Torulaspora delbrueckii
GQ179981.1
98
AB469378.1
99
1Y1
Kluyveromyces marxianus
FJ896140.1
99
FN401197.1
99
GQ121696.1
97
AY046214.1
98
EF042032.1
99
EM199966.1
98
1Y9 1Y14
*3,1Torulaspora delbrueckii *3,2Kluyveromyces marxianus Pichia mexicana
*1. 26S. *2. ITS1-5.8S-ITS2. *3.1 por 26S y *3.2 por ITS1-5.8S-ITS2.
(%)
Accesión *2
Identidad
Aislado
(%)
65 Al realizar la comparación por secuencia en el gen 26S el dendrograma (Fig. 15) agrupó genotipos iguales, es decir organismos del mismo género y especie destacando la similitud alcanzada para la unión de 99% para los cinco grupos formados, A) S. cerevisiae,
B) T.
delbrueckii, C) Z. bailii, D) K. marxianus, F) y G) P. mexicana. El análisis de comparación por secuencia del segmento ITS1-5-8S-ITS2 (Fig. 16) el dendrograma agrupó A) con una similitud de unión de 81% a los aislados identificados como S. cerevisiae; B) con 84% de similitud a los aislados identificados como Z. bailii; C) con un 88% unió a 1AN2 con T. delbrueckii; D) en un clado separó al aislado 1Y9 y lo colocó en medio de los grupos “C y E”; E) 91% de similitud agrupó a los aislados identificados como T. delbrueckii (AN5) y K. marxianus (1Y1); y F) con 97% de similitud a P. mexicana (1Y14). Cabe mencionar que en el dendrograma se expresan las diferencias entre clases o grupos con un intervalo de cero a uno, por lo que para la interpretación de los resultados se calculó el complemento (la similitud) y se expresó en porcentaje, es decir, se analizó la homología molecular detectada entre y dentro de genotipos.
66
3D2 3Y4 3Y8 3Y3 3D5
99
92
93
72
99
50
99 99
74
99
66
3D4 3D3 3D6 3Y5 3Y2 S. cerevisiae (GU080049) S. cerevisiae (FJ972215) S. cerevisiae EF192587) S. cerevisiae (HM191656) S. cerevisiae (HM191650) S. cerevisiae (FN393977) 1AN2 1AN1 1AN5 T. delbrueckii (FN393992) T. delbrueckii (GU373796) T. delbrueckii (FR691642) T. delbrueckii (GQ121628) 3Y1 Z. bailii (GU080052) Z. bailii (AJ966343) Z. bailii (FM201320) Z. bailii (AJ966522) 1Y1 1Y9 K. marxianus (GU565207) K. marxianus (FJ896140) K. marxianus (EU439450) K. marxianus (EU669470) P. mexicana (EF042031) 1Y14 P. mexicana (DQ409143) P. mexicana (FM180550) Pichia sp (AM911003)
Figura 15. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica de la región ribosomal 26S. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4.
67 3D3 S. cerevisiae (FN393995) S. cerevisiae (GQ376091) S. cerevisiae (AB279744) S. cerevisiae (FM199962) S. cerevisiae (EU145764)
81
51
74 96 55
84
69 88
3D5 3D4 3Y2 3Y3 3D2 3Y4 3Y5 3Y8 Z. baili (X84732) Z. bailii (FJ914883) Z. bailii (AY796194) 3Y1 Z. bailii (DQ872858) Z. bailii (X84640.1) Z. bailii (AY046191) T. delbrueckii (AB469378) 1AN2 1Y9 T. delbrueckii (DQ249191)
54
1AN5 K. marxianus (EU019227)
91
54 77
97
1Y1 T. delbrueckii (FM173070) K. marxianus (AB480229) K. marxianus (EF568057) T. delbrueckii (AY939806) T. delbrueckii (AB480229) P. mexicana (FM199966) P. mexicana (EF568069) P. mexicana (FM199966) P. mexicana (AB054110) 1Y14
Figura 16. Árbol filogenético que agrupa a las levaduras comparando la secuencia nucleotídica de la región ribosomal ITS1-5.8S-ITS2. Este árbol está basado en el método “Neighbor-Joining”, un bootstrap de 1000. La distancia evolutiva fue realizada usando el Método “Maximum Composite Likelihood” usando número de bases de sustitución por sitio para el tamaño de los clados. El grupo de salida fue P. mexicana. El análisis filogenético se llevo a cabo en MEGA4.
68 7.2. Caracterización de la productividad de las levaduras En la primera evaluación se seleccionaron y caracterizaron 11 microorganismos de acuerdo a la imagen micro, macroscópica y perfiles de ARDRA, este análisis se dividió en dos grupos, 1) aislados no Saccharomyces y 2) aislados Saccharomyces cerevisiae. Se evaluaron los aislados identificados como S. cerevisiae cinéticamente evaluando crecimiento y consumo de azucares reductores en dos medios sintéticos, uno rico en glucosa M1 (glucosa:fructosa 9:1) y el otro rico en fructosa M2 (glucosa:fructosa 1:9). Posteriormente se evaluaron solo al inicio y al final de la fermentación las características productivas de todos los aislados identificados como S. cerevisiae con el fin de seleccionar los microorganismos S. cerevisiae con una alta actividad fructofílica. 7.2.1. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en glucosa (M1) Los microorganismos identificados como S. cerevisiae (Fig. 17) fueron caracterizados en el medio M1 (fructosa:glucosa 1:9), se encontró que los aislamientos 3Y2, 3Y4 y 3Y8 presentaron mayor crecimiento a las 72 horas, 3D6 y 3D3 fueron las que menor crecimiento tuvieron. En el consumo de azúcares reductores (Fig. 18)
se observaron tres
patrones de
comportamiento, los aislamientos 3Y4 y 3Y8 a las 72 horas fueron los que menos azúcar residual dejaron (5 g/L de azúcar residual en el medio aproximadamente), seguidos por FECHA, 3Y2 y 3Y6
(23 -29 g/L de azúcar residual aproximadamente) y
3Y5, 3D4 y 3D2 (58-059 g/L
aproximadamente). Al final de la fermentación (120 horas) en M1 (Tabla VI), los que mayor rendimiento presentaron en cuanto a consumo de sustrato fueron Fermichamp®, 3Y2, 3Y8 y 3Y4; las cepas que terminaron la fermentación 3Y8, 3Y4 y Fermichamp® ya que dejaron una concentración menor a 2 g/L de azúcar residual, el resto de las cepas si fermentaron la glucosa pero dejaron una alta residualidad (menor del 50%) en el medio. En cuanto a los parámetros cinéticos (Tabla VI), 3Y4, 3Y8 y FECHA tuvieron la mayor velocidad de consumo de sustrato en M1; los que mayor velocidad en la producción de biomasa fueron 3Y4 y 3D2, pero 3D3, 3D6 y 3D5 fueron las que más biomasa produjeron al final de la fermentación (2.9 a 3.71 g/L). En cuanto a etanol 3D4, 3Y3 y 3Y5 presentaron mayor
69 rendimiento pero 3Y3, 3Y4 y Fermichamp® fueron las que más g/L produjeron. La mayor producción de acido acético la tuvieron 3Y8 y 3D2; 3D4 y 3D6 mayor concentración de glicerol; 3D4 y Fermichamp® mayor concentración de acido láctico.
DO600 nm
6
4
2
0 0
24
48
72
Tiempo (h) 3D2
3D3
3D6
3Y2
3Y4
3Y8
FCHA
Figura 17. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal en medio M1 (fructosa:glucosa 1:9).
70
Porcentaje (%) de azúcar residual
100
80
60
40
20
0 0
12
24
36
48
60
72
Tiempo (h) 3D2
3D4
3D6
3Y2
3Y3
3Y4
3Y5
3Y8
FCHA
Figura 18. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por levaduras S. cerevisiae aisladas
de
mostos
de
mezcal
en
medio
M1
(fructosa:glucosa
1:9).
71
Tabla VI. Parámetros cinéticos de los aislamientos de S. cerevisiae en medio rico en glucosa (M1) a las 120 horas Velocidad de Velocidad de Aislado
consumo de producción de
YEtanol/azúcar
Biomasa
Azúcar residual
Acido acético
Etanol
Glicerol
Acido láctico
azúcares
biomasa
g/L*h
g/L*h
g/g
3D2
0.67+0.00
0.09+0.00
0.40+0.00
2.78+0.45
19.70+1.60 31.72+0.10
0.83+0.00 5.34+0.24
0.75+0.10
3D3
0.76+0.00
0.01+0.00
0.40+0.00
3.71+0.09
9.10+1.40
36.42+0.90
0.47+0.03 4.86+0.25
0.59+0.01
3D4
0.57+0.00
0.03+0.00
0.48+0.00
2.88+0.29
31.36+1.40 36.89+2.20
0.73+0.15 7.61+2.08
1.39+0.36
3D5
0.64+0.00
0.00+0.00
0.42+0.00
3.30+0.00
22.91+1.20 32.20+1.60
0.46+0.01 4.27+1.22
0.57+0.01
3D6
0.75+0.00
0.02+0.00
0.40+0.00
3.34+0.01
10.00+1.60 35.56+1.30
0.62+0.02 5.82+0.40
0.47+0.06
3Y2
0.70+0.00
0.01+0.00
0.36+0.00
2.89+0.16
15.83+1.20 35.38+0.00
0.70+0.32 4.07+0.48
0.67+0.52
3Y3
0.57+0.01
0.03+0.01
0.46+0.01
2.63+0.03
31.36+3.10 39.86+0.20
0.82+0.01 4.03+1010 0.79+0.18
3Y4
0.82+0.00
0.04+0.00
0.44+0.00
2.80+0.00
1.52+1.40
43.90+5.20
0.74+0.03 3.59+0.32
0.00+0.00
3Y5
0.43+0.01
0.03+0.01
0.45+0.01
2.90+0.03
45.95+1.90 34.64+3.20
0.47+0.00 1.70+0.53
0.76+0.00
3Y8
0.82+0.00
0.03+0.00
0.32+0.00
2.10+0.10
1.41+1.20
31.83+1.90
1.26+0.64 3.50+0.12
0.52+0.06
FECHA 0.81+0.00
0.01+0.00
0.42+0.00
2.89+0.04
1.68+1.20
42.31+0.00
0.46+0.00 3.85+0.00
1.33+0.09
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®
g/L
72 7.2.2. Caracterización del rendimiento de las levaduras en medio rico en fructosa (M2) Los microorganismos identificados como S. cerevisiae fueron caracterizados en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1) De los aislados evaluados los que tuvieron mayor crecimiento fueron 3Y2, 3Y4 y 3Y8 (Fig. 19) y los que tuvieron menor crecimiento en este medio fueron 3D2 y Fecha. En el consumo del
sustrato a las 72 horas (Fig. 20) se observaron tres tipos de
comportamiento, los aislamientos 3Y8, 3Y4 a las 72 horas fueron los que menos azúcar residual dejaron (5g/L aproximadamente), seguidas por FECHA, 3D6 y 3Y2 (50 g/L aproximadamente) y las que mayor residualidad dejaron fueron 3Y5, 3D4 y 3D2 (más de 60 g/L). En M2 (Tabla VII) los aislados con mayor velocidad de consumo de sustrato 3Y8, 3D5 y 3D3; pero las que dejaron menor concentración de azúcar fueron 3D3, 3Y4 y 3Y8 (menos de 2 g/L aproximadamente). El aislado que mayor velocidad en la producción de biomasa tuvo fue 3Y5 y las que más biomasa produjeron al final de la fermentación fueron 3D3, 3D5 y 3Y4 (3.06 a 3.78 g/L). Los aislados que rendimiento en producción de etanol fueron 3Y3, 3Y5 y FECHA y además fueron los que produjeron la mayor concentración (38.72 a 42.84 g/L). La mayor producción de acido acético la tuvieron 3D3; 3D5 y 3D6 (5.66 a6.50 g/L); mayor concentración de glicerol; 3Y5 y 3Y8 (4.21- 4.37g/L) la mayor concentración de acido láctico.3Y5 y FECHA (1.02-1.32 g/L).
73
6
DO600 nm
4
2
0 0
24 3D2
Tiempo (h)
3D3
3D6
3Y2
48
72 3Y4
3Y8
FCHA
Figura 19. Cinéticas de crecimiento por densidad óptica de levaduras S. cerevisiae en el medio
Porcentaje (%) de azúcar residual
M2 (fructosa:glucosa 9:1).
100
80
60
40
20
0 0
12
24
36
48
60
72
Tiempo (h) 3D2
3D4
3D6
3Y2
3Y3
3Y4
3Y5
3Y8
FCHA
Figura 20. Cinéticas de porcentaje (%) de consumo de azúcar por S. cerevisiae en el medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
74
Tabla VII. Parámetros cinéticos de los aislados de S. cerevisiae en medio rico en fructosa (M2) a las 120 h Velocidad de Velocidad de Aislado
consumo de producción de
YEtanol/azúcar
Biomasa
Azúcar residual
Acido acético
Etanol
Glicerol
Acido láctico
azúcares
biomasa
g/L*h
g/L*h
g/g
3D2
0.80+0.01
0.02+0.01
0.2+0.01
2.94+0.14
5.05+2.80
22.47+0.10 3.74+0.01 0.75+0.27
0.75+0.27
3D3
0.82+0.03
0.02+0.00
0.34+0.02
3.78+0.05
1.17+1.80
33.80+0.10 6.14+0.80 0.58+0.08
0.57+0.07
3D4
0.56+0.06
0.01+0.01
0.33+0.02
2.68+0.02
32.01+1.70 31.74+1.30 3.69+0.00 0.98+0.00
0.98+0.00
3D5
0.83+0.00
0.01+0.00
0.34+0.01
3.06+0.31
52.17+1.50 33.38+1.40 5.66+1.05 0.52+0.06
0.52+0.06
3D6
0.74+0.01
0.02+0.00
0.38+0.01
3.34+0.19
11.05+1.50 33.60+0.40 6.50+0.91 0.73+0.11
0.73+0.11
3Y2
0.68+0.03
0.03+0.00
0.29+0.00
2.66+0.19 18.26+1.20
3Y3
0.57+0.00
0.03+0.00
0.41+0.01
3Y4
0.82+0.00
0.03+0.00
3Y5
0.44+0.04
3Y8 FECHA
g/L
28.58+5.20 0.64+0.03 3.13+0.38
0.00+0.00
2.68+0.02
32.01+1.40 39.28+0.10 0.58+0.44 2.96+0.55
0.00+0.00
0.34+0.00
3.30+0.10
1.71+2.10
32.71+0.90 0.70+0.01 3.38+0.06
0.38+0.01
0.04+0.00
0.49+0.02
2.73+0.03
36.43+1.70 33.65+0.50 1.00+0.02 4.37+0.03
1.02+0.16
0.83+0.00
0.01+0.00
0.39+0.15
2.25+0.15
1.00+0.81
38.72+4.41 0.77+0.03 4.21+0.12
0.77+0.00
0.68+0.02
0.01+0.00
0.43+0.00
2.35+0.13 18.92+1.30
42.87+4.30 0.54+0.01 3.31+0.12
1.32+0.06
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®
75 7.3. Caracterización cinética de los aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica Fueron evaluadas las características cinéticas de producción de etanol, glicerol biomasa y consumo de azucares residuales de 3D4, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5 y 3Y8 identificados molecularmente como S. cerevisiae usando como control la cepa Fermichamp®. La levadura 3D4 (Figura 21 A y B) tuvo crecimiento similar en M1 y M2 (2.26-2.88 g/L) al final de la fermentación. En cuanto al comportamiento en la cinética de fermentación se observó tanto en M1 como en M2 de las 72 a las 100 horas una fase estacionario en el consumo del azúcar de mayor concentración, al igual se observa como la producción de etanol se encuentra en fase log hasta las 72 horas en ambos medios. Al final de la fermentación en ambos medios tuvieron un producción similar de glicerol (2.30 g/L aproximadamente) La levadura 3Y2 (Fig. 22 A y B) se observo tanto en M1 como en M2 una fase de crecimiento hasta las 48 horas, la levadura tuvo poca diferencia en la producción de biomasa al final de la fermentación en ambos medios (2.14- 2.70 g/L). En relación a la producción de etanol, glicerol y consumo de azucares reductores tanto en glucosa como en fructosa aproximadamente a 36 horas inicia la etapa estacionaria. En M1 tanto el etanol como el glicerol tienen una fase log de producción hasta las 36 horas aproximadamente; en M2 el etanol sigue produciéndose hasta el final de la fermentación, la producción máxima de glicerol se da hacia las 60 horas.
76
A
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24
48
72
96
Etanol, Glicerol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
120
Tiempo (h) 50
B
80
40
60
30
40
20
20
10
0
Etanol, Glicerol , Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
0 0
24
48
72
96
120
Tiempo (h) FRUCTOSA
GLUCOSA
ETANOL
GLICEROL
PESO SECO
Figura 21. Cinética de fermentación a 30°C de 3D4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 9:1). Medio B) M2 (fructosa:glucosa 1:9).
A
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24
48 72 Tiempo (h)
96
B
100
Glucosa, Fructosa (g/L)
120
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0
0
24 FRUCTOSA
48
Tiempo (h)
GLUCOSA
72
ETANOL
96 GLICEROL
Etanol, Glicero, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
Etanol, Glicerol, Peso seco (g//L)
77
120 PESO SECO
Figura 22. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y2 Cinética. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
78 La cepa 3Y3 presento un patrón de crecimiento similar en los dos medios (Fig. 23 A y B), la etapa estacionaria inició aproximadamente a las 32 horas exhibiendo en esta etapa el crecimiento máximo para la cepa en los dos medios, al final de la fermentación en ambos medios esta cepa tuvo una producción final de biomasa de 2.44 g/L aproximadamente; en la cinética de fermentación la cepa dejo una alta concentración del azúcar con mayor concentración, en M1 (glucosa) y M2 (fructosa) al final de la fermentación (mayor a 48g/L aproximadamente), en cuanto el azúcar de menor concentración en M1 (fructosa) a las 72 h fue totalmente consumida y en M2 (glucosa) hasta las 120 h fue consumida en su totalidad; 3Y3 tuvo una producción similar en M1 y M2 (2.5 g/L aproximadamente); en cuanto a la producción de etanol, produjo una concentración mayor en M1 (40 g/L aproximadamente) que en M2 (28 g/L aproximadamente) El crecimiento en M1 de 3Y4 (Fig. 24 A y B) la fase estacionaria apareció a las 48 horas, después de este periodo, aproximadamente a las 72 horas, se observo una nueva fase log de crecimiento, esto se ve reflejado en el comportamiento del microorganismo (Figura 24 A y B) ya que en la cinética de fermentación a las 48 horas consumió la mayor parte, de igual forma se observa que después de las 72 horas se presenta una nueva fase de producción de etanol. En M2 se observa marcadamente una etapa diauxica en el crecimiento del microorganismo hacia las 48 horas, la cual coincide con las últimas etapas de fermentación del sustrato predominante del sustrato (Figura 24 C) y el cambio a la fermentación del sustrato presente en menor cantidad; en cuanto a la producción de etanol se observa una producción exponencial de este hasta las 36 horas, observándose que se reactiva la producción después de las 60 horas,
79 50
A
80
40
60
30
40
20
20
10
0
Etanol, Glicerol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
0 0
24
48
72
96
120
Tiempo (h) 50
B
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24 GLUCOSA
48 FRUCTOSA
Tiempo (h) ETANOL
72
96 GLICEROL
Etanol, Glicerol , Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
120 PESO SECO
Figura 23. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y3. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
80 50
A
80
40
60
30
40
20
20
10
0
Etanol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
0 0
24
48
72
96
120
Tiempo (h) 50
B
80
40
60
30
40
20
20
10
0
Etanol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
0 0
24
GLUCOSA
48 72 Tiempo (h) FRUCTOSA
ETANOL
96
120
PESO SECO
Figura 24. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y4. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
81 En M1 la cepa 3Y5 presentó crecimiento (Figura 25 A) y consumo de azúcar exponencial, hasta las 36 horas (Figura 25 B) este microorganismo tuvo un paro en la fermentación a las 72 horas y dejo una alta residualidad del azúcar en el medio, la máxima producción de etanol se dio hacia las 96 horas. En M2 (Figura 25 D) a las 24 horas se observo un punto diauxico, aquí se observo el máximo crecimiento del microorganismos y un paro en la fermentación del azúcar; en cuanto a la producción de etanol a las 72 horas se observo una nueva etapa de producción. Para el aislamiento 3Y8 (Fig. 26A) tanto en M1 como en M2 el microorganismo presentó un crecimiento exponencial hasta las 12 horas, manteniéndose en fase estacionaria hasta el final de la fermentación; a las 72 horas el microorganismo termino la fermentación de glucosa y fructosa dejando una residualidad menor de 5 g/L de ambos (Figura 26 A y B). En ambos medios la producción de etanol fue exponencial hasta las 60 horas. Este microorganismo tuvo comportamiento similar en ambos medios. En la cepa control Fermichamp (Fig. 27 A) presento crecimiento exponencial en ambos medios; el consumo de glucosa (Figura 27 B) se dio de forma exponencial, a las 72 horas consumió el 78 % de la glucosa y al final de la fermentación el 99%; en M1 (Figura 27 C) el consumo de la fructosa se dio de forma exponencial con dos cambios diauxicos, uno a las 4 horas y otro a las 24 horas aproximadamente, al final de la fermentación se consumió el 83% de esta azúcar. El etanol se produjo de forma exponencial aproximadamente hasta las 72 horas en ambos medios encontrándose mayor producción en glucosa (41.4 g/L) que en fructosa (22.01 g/L)
82 50
A
80
40
60
30
40
20
20
10
0
Etanol, Glicerol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
0 0
24
48
72
96
120
Tiempo (h) 50
B
Etanol, Glicerol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24
48
72
96
120
Tiempo (h) GLUCOSA
FRUCTOSA
ETANOL
GLICEROL
PESO SECO
Figura 25. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y5. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
83
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24
48
Tiempo (h)
72
96
100
Glucosa, Fructosa (g/L)
Etanol, Peso seco (g//L)
50
A
120
B
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
Etanol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
0 0
24
48
72
96
120
Tiempo (h) GLUCOSA
FRUCTOSA
ETANOL
PESO SECO
Figura 26. Cinética de fermentación a 30°C de 3Y8. A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
84
A
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24
48
72
96
Etanol, Glicerol . Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
120
Tiempo (h)
\
B
50
80
40
60
30
40
20
20
10
0
0 0
24 GLUCOSA
48 FRUCTOSA
Tiempo (h)
72
ETANOL
96 GLICEROL
120
Etanol, Glicerol, Peso seco (g//L)
Glucosa, Fructosa (g/L)
100
PESO SECO
Figura 27. Cinética de fermentación a 30°C de Fermichamp® (FECHA). A) Medio M1 (fructosa:glucosa 1:9). B) Medio M2 (fructosa:glucosa 9:1).
85 7.4. Caracterización de aislados de S cerevisiae con una alta actividad fructofílica en medio M3 Los aislados de S. cerevisiae con una alta actividad fructofílica fueron evaluadas en M3 (Tabla VIII). Las levaduras 3Y3, 3Y5 y 3Y8 consumieron la glucosa al final de la fermentación y no presentaron diferencia significativa entre ellas. La cepa control Fermichamp consumió la totalidad de la fructosa presente en el medio, mientras que los aislamientos 3Y8 y 3Y5 tuvieron un consumo mayor al 86.5% sin diferencia significativa. En cuanto a la producción de etanol no se presento diferencia significativa entre las mejores 3Y5 y 3Y8. En el medio M3 (Fig. 28) en general más del 50% de la glucosa es consumido a las 72 h por las cepas 3Y5 (Figura 28 B) consume la mayoría de la glucosa a las 150 h, dejando en el medio menos de 6 g/L; 3Y3, y 3Y8 a las 200 h; la cepa testigo deja alta concentración (30 g/L) al final de la fermentación. En cuanto a fructosa las cepas a las 92 h consumen más del 50% de la fructosa, 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejan una alta concentración de fructosa en el medio al final de la fermentación, solo Fermichamp® termina la fermentación a las 150 h dejando menos de 1 g/L de esta azúcar residual.
El proceso inicia con la misma concentración de ambas azucares
observándose que las cuatro cepas en estudio consumen más rápido la glucosa que la fructosa, dando lugar a una diferencia entre el consumo de estos azucares (Discrepancia GF) en el curso completo de la fermentación. Al inicio de la fermentación se observa una mayor discrepancia, cuando la glucosa empieza a ser limitante en el medio esta se reduce notablemente, observándose que cuando la fermentación cesa las cepas aisladas del proceso de mezcal
dejan una alta
concentración de fructosa en el medio, a excepción de la 3Y8 que hacia las 100 horas la relación G/F tiene un valor de uno, ya que el microorganismo consume de igual forma la glucosa y la fructosa. El etanol solo se midió al final de la fermentación, 3Y5 y 3Y8 fueron las cepas que mayor concentración de este produjeron.
86
Tabla VIII. Evaluación cinética al final (12 días) de la fermentación de los aislados de S. cerevisiae en medio M3 (glucosa:fructosa 1:1)
Cepa
Glucosa
Fructosa
residual
residual
Azúcar residual
Etanol
g/L
YEtanol/azúcar g/g
Velocidad de consumo Glucosa
Fructosa
g/L*h
g/L*h
3Y3
0.52+0.34A
15.41+2.10C
15.92+5.62B
68.63+1.05B
0.38+0.01
0.32+0.02
0.31+0.02
3Y5
0.22+0.13A
13.25+3.10B,C
13.47+4.13A,B
78.16+2.59A
0.43+0.01
0.29+0.00
0.32+0.02
3Y8
0.86+0.75A
9.29+4.38B
10.15+2.62A
76.25+4.60A,B
0.42+0.01
0.30+0.00
0.34+0.00
FECHA
31.88+3.73B
0.00+0.00A
31.65+7.67C
61.62+4.56C
0.35+0.00
0.21+0.01
0.36+0.00
FECHA: Cepa de referencia Fermichamp®. A, B, C agrupados por ANOVA con Prueba de Diferencia Mínima Significativa
87
Porcentaje (%) de azúcar
A 100 80 60 40 20 0
0
50
100 150 Tiempo (horas)
200
B
100
Porcentaje (%) de azúcar
250
80 60 40 20 0 0
50
100
150
200
250
Tiempo (h) FRUCTOSA
GLUCOSA
Figura 28. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 100:100).
88
Porcentage (%) de azúcar
C 100 80
60 40 20 0 0
50
100
150
200
250
Tiempo (h)
D
Porcentaje (%) de azúcar
100 80
60 40 20 0 0
50
100
150
Tiempo (h)
FRUCTOSA
200
250
GLUCOSA
Figura 29. Consumo porcentual de glucosa y fructosa de cepas S. cerevisiae C) 3Y8 y D) Fermichamp® (FECHA) durante la fermentación en M3 (fructosa:glucosa 1:1).
Porcentaje (%) Azucar l
89
A
100
80 60 40 20 0 0
50
100
150
200
250
Tiempo (h)
B
Porcentaje (%) Azucar
100 80 60 40 20 0 0
50
100
Tiempo (h) M1 M2
150
200
250
M3
Figura 30. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y3 y B) 3Y5 en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).
90
A Porcentaje (%) Azucar
100 80 60 40 20 0 0
50
100
150
200
250
Porcentaje (%) Azucar
Tiempo (h)
B
100 80 60 40 20 0 0
50
100 150 Tiempo (h) M1
M2
200
250
M3
Figura 31. Comparación del consumo porcentual de azúcar residual durante la fermentación de cepas S. cerevisiae A) 3Y8 y B) Fermichamp® (FECHA) en M1 (fructosa:glucosa 1:9), M2 (fructosa:glucosa 9:1) y M3 (fructosa:glucosa 1:1).
91 7.5. Caracterización de la tolerancia al etanol de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos De acuerdo a este protocolo, la cepa con mayor resistencia al etanol a los tres minutos fue 3Y8 (5.4 x 105 cfu/ml), seguida por Fermichamp® (1.5 x105 cfu/ml) y 3Y5 (8.1 x 104 cfu/ml); mientras que la 3Y3 (0% a 3 min) resultó ser el aislado más sensible (Figura 30). A los cinco minutos la cepa con mayor resistencia al etanol fue la 3Y8 (2.1 x 105 cfu/ml).
Viabilidad (UFC/ml)
1.E+06
1.E+04
1.E+02
1.E+00 0
1
2
3
4
5
Tiempo (min) 3Y3
3Y5
3Y8
FECHA
Figura 32. Pérdida de viabilidad en células de levaduras Saccharomyces aisladas de mostos de mezcal a 30°C en 25% v/v de etanol. 7.6. Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos Las secuencias de los genes que codifican para la proteínas de los transportadores Hxt1p y Hxt3p de los aislados identificados como S. cerevisiae fueron comparadas con secuencias de la clona S228c (publicadas en el Saccharomyces Genome Database) y la cepa de referencia Fermichamp® (obtenidas de Guillaume et al., 2007). Con la secuencia aminoacídica de S228c se predijo el modelo conformacional de los 12 dominios de los segmentos transmembranales (TM) para Hxt1p y hxt3p (Figura 33 A y B) además la posición de los polimorfismos encontrados en las cepas aisladas de mostos de mezcal (AMM).
92
El análisis de las secuencias (Tabla IX) de Hxt1p reveló que los segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de mezcal y Fermichamp®. En Hxt3 revelo que en TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c. Para TM7 de Hxt1p, los aminoácidos Q275, G279 y D280 están conservados en todas las cepas, pero en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T. En Hxt1 se encontraron entre la región TM9, en el lazo externo y en la TM10 cambios de aminoácidos en la posición 418-420 y 431, en Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la posición 418 y 419 solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurrió solo en la cepa 3D3 que presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. En Hxt1 del segmento TM10 está presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición F380. En la cepa 3D3 se encontraron los polimorfismos F406S; G408A; G411A en Hxt1. En se encontró que en Hxt1 está presente el polimorfismo L439M en el TM12, en la cepa 3D3. Probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos transmembranales pueden modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar, evidenciando su importancia en la formación de la cadena, es probable que estas modificaciones puedan distorsionar la conformación de la estructural exofacial ocasionando alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteína propiciando una diferente afinidad con las moléculas de hexosas, alterando de manera importante la funcionalidad del transportador.
93
A)
Figura 33. Predicción de la conformación de los segmentos transmembranales de las proteínas A) hxt1 y B) hxt3 basada en la secuencia de la cepa Saccharomyces cerevisiae S288c y la posición de los polimorfismos de aislados de mostos de mezcal y la Fermichamp®.
B)
94 Tabla IX. Predicción de de la posición de los polimorfismos en HXT1 y HXT3 para los aislados de mostos de mezcal Sustituciónes aminoacídicas V1A
Tansportador de hexosas HXT1 S. cerevisiae aislados AMMb
Sustituciónes aminoacídicas L211S
T4M
AMMb
I213V
F19I
3Y5
G241C
F19R
3Y8
M328I
T34I
3Y4 FECHAa
L392M
D34E F55N P223S S239G F255Y G258D R264T T265G M266K T278K
a
FECHA 3D6
AMMb, FECHAa 3D2 3Y4 3D2 3D2 3D2 FECHAa , 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8
FECHAa FECHAa FECHAa AMMb AMMb
Y402L Y405A A406F
3D3 3D3
S407L
3D3
G409R
3D5, 3Y2
V410A
3D2
V410L
3Y2 FECHAa
F300L G307S V308I V308L A334T V349G D358N
3Y2 3D3 3D3 3D2 3D3 3Y8 AMMb, FECHAa AMMb, FECHAa
G419N V432C I266L A555D M567L
A411G I430F Y433F M439L G471S L473P G487S D489E
FECHAa
C401S
E418Q
A408G
3D2, 3D6
I396V
3Y5
P360G V371C I372L E394Q F396G V400I S406F
AMMb FECHAa
Y393W
V294L
Q359N
Tansportador de hexosas HXT3 S. cerevisiae aislados
FECHAa 3D6, 3Y2, 3Y3, 3Y4, 3Y5, 3Y8 AMMb, FECHAa 3D3 AMMb
AMMb, FECHAa AMMb, FECHAa 3Y8 3Y8 3Y8 3Y8 3D3 3D3 3D3 3Y8 3Y8 3D3 3D4, FECHAa 3D3 3Y5, 3Y8 3D5
FECHAa (Fermichamp®) = datos tomados de Guillaume et al. (2007). AMMb =Aislados de mostos de mezcal (3D2, 3D3, 3D4, 3D5, 3D6, 3Y2, 3Y2, 3Y4, 3Y5, 3Y8
95
8
DISCUSIÓN
En Tamaulipas, el proceso de elaboración del mezcal es realizado de forma artesanal bajo condiciones no controladas, en la fermentación alcohólica generalmente se usan levaduras nativas, originando largos tiempos y una gran variabilidad en la calidad en la fermentación. 8.1 Identificación molecular de las levaduras La fermentación de los mostos de mezcal es realizada por un complejo grupo de microorganismos nativos que interaccionan entre sí (Cáceres et al., 2008), pero la levadura que finalmente predomina en el proceso y produce la mayor concentración de etanol es la Saccharomyces cerevisiae. En el proceso de fermentación espontanea de los mostos de mezcal tamaulipeco a los dos y seis días se encontraron 9 cepas de S. cerevisiae, 3 de T. delbrueckii, 1 de Z. bailii, 2 de K. marxianus y 1 de P. mexicana. El análisis de las secuencias de los segmentos ribosomales 28S e ITS revelaron la diversidad entre estas, la posición filogenética con el análisis de la secuencia 28S mostro un alto nivel de relación entre organismos de la misma especie (99%); a diferencia de el análisis con ITS que las asoció con un bajo nivel de relación a S. cerevisiae (81%), T. delbrueckii, Z. bailii y K. marxianus (64%) y separó a P. mexicana (97%), a demás no asoció a 1Y9 con K. marxianus, esto es debido a que la región ribosomal 5.8S-ITS exhibe una mayor diferencia interespecífica que los segmentos 26S ribosomales (Kurtzman et al., 1998, 1992) no obstante 26S permite la diferenciación de especies relativamente cercanas esto es resuelve diversidad interespecífica e intraespecífica.
8.2 Caracterización de la productividad de las levaduras El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y especies que taxonómicamente están muy cerca, pero que tienen propiedades muy diferentes en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas dado el complejo grupo de
96 microorganismos que participan en una fermentación alcohólica es necesario el uso un método de aislamiento rápido y confiable como rutina de laboratorio como lo es el ARDRA (Baere et al., 2002; Escalante et al., 2006; Pérez et al., 2007). En esta investigación el ARDRA evidenció un alta similitud en la huella genética de organismos del mismo género y especie, especialmente en lo que se refiere a S. cerevisiae, con excepción de los identificados como K. marxianus esto concuerda con el análisis de la secuencia 26S e ITS1-5.8S-ITS2. En cuanto a la evaluación de crecimiento por DO(600nm) y consumo de azúcar residual las cepas S. cerevisiae 3Y2, 3Y4 y 3Y8 (DO600=4.5 en promedio) fueron los que mejor se adaptaron al ambos medios (M1 y M2) y consumieron casi en la totalidad tanto la glucosa como la fructosa a demás presentaron mayor crecimiento que las levaduras analizadas por Arroyo y colaboradores 2009, en donde evaluaron la inhibición por efecto del sustrato, ellos encontraron que en 69.57% de fructosa (v/v) había una D.O600>1. En la industria es importante encontrar levaduras con una alta preferencia a la fructosa o tolerancia, ya que las altas concentraciones de esta azúcar incrementan el riesgo de la contaminación al final de la fermentación causando detrimento en la calidad, al evaluar los parámetros cinéticos de las levaduras aisladas de mostos de mezcal identificadas como S. cerevisiae estas tuvieron comportamientos diferentes. Las cepas destacadas en M1 fueron 3Y4, 3Y8 y Fermichamp® ya que al final de la fermentación la concentración en el medio fue menos de 2 g/L de azúcar residual; en M2 los mejores fueron 3D3, 3Y4, 3Y8 y al final de la fermentación la concentración fue menos de g/L de azúcar residual; en M3 las tres cepas en evaluación 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de 1 gr/L de glucosa residual; en cuanto a fructosa 3Y8 dejó una concentración menor a 10 g/L y sólo FCHA consumió en su totalidad esta azúcar. Estos resultados son comparables con los reportados por Díaz et al (2008) ellos analizaron S. cerevisiae aisladas de mostos para producción de tequila, encontraron de 8-11 g/L de azúcar residual en el medio al final de la fermentación en mostos de A. tequilana (a las 72 h y 95±5 g/L azúcares reductores), Cortes et al (2009) realizaron fermentaciones en mostos de agave (100g/L de azucares reductores) con S. cerevisiae y encontraron una residualidad de 6+1 g/L, Pinal et al (2009) analizaron levaduras S. cerevisiae aisladas de mostos de agave encontraron una concentración menor a los 5 g/L de azucares a las 72h de fermentación en mostos con 10° Brix; en otros estudios encontraron que una levadura aislada de mostos de vino en fermentaciones de mostos de
97 agave para producción de tequila (108 g/L de azúcares reductores inicial) dejó alrededor de 15 g/L (Pinal et al., 1997). Berovic et al (2007), en mostos de uva (109g/L de glucosa y 103 g/L de fructosa) encontraron al final de la fermentación 6.5 ± 0.23 de azúcar residual. Dumont et al (2009), analizaron cepas que dejaron menos de 5 g/L de ambos azucares reductores. Los aislamientos que mayor biomasa produjeron en M1 fueron 3D3, 3D6 y 3D5 (Tabla VI); en M2 los mejores fueron 3D3, 3D5, 3Y4 (Tabla VII). Las cepas evaluadas en el presente estudio produjeron una menor cantidad de biomasa que la reportada en estudios realizados por Díaz et al (2008), en donde encontraron de 4-5 g/L aproximadamente a las 12h. Para la producción de etanol los aislamientos más destacados en M1 fueron 3Y3, 3Y4 y Fermichamp® (Tabla VI); para M2 fueron 3Y3, 3Y5 y Fermichamp® (Tabla VII); en M3 fue 3Y5 y 3Y8 (Tabla VIII). Estos resultados concuerdan con los publicados por Díaz et al., 2008, ellos encontraron en mostos de agave con 12° Brix 39.9-43.5 g/L de etanol, en otros estudios realizados en fermentaciones de mostos de agave (10° Brix) encontraron 37 g/L al final de la fermentación (Pinal et al., 2009), en mostos de agave una concentración de etanol de 45+2 (Cortes et al., 2009), una S. cerevisiae aislada de mostos de vino en fermentaciones de mostos de agave para producción de tequila (108 g/L de azúcares reductores inicial) tuvo una producción de de 50 g/L de etanol (Pinal et al., 1997), en fermentaciones en mostos de A. tequilana Weber variedad azul (100g de azucares reductores) evaluaron 8 aislamientos de S. cerevisiae encontrando una producción de 35.85 a 46.16 g/L de etanol (Gutiérrez et al., 2009); en mostos de uva encontraron 84.7+2.18 de etanol (Berovic et al., 2007). Polsinell et al (1996), encontraron cepas que produjeron 97 g/L de etanol en mostos de uva; Dumont et al (2009), analizaron cepas que produjeron 120g/L etanol. En cuanto al acido acético en M1 la menor producción la tuvo FCHA, 3Y5, 3D5 y 3D3 con concentraciones inferiores a 0.5 g/L. M2 la menor producción la tuvo FCHA, 3Y3, 3Y2, 3Y4 y 3Y8 en concentraciones inferiores a 0.7 g/L. En fermentaciones de mostos de agave para producción de mezcal al final de la fermentación se han encontrado de .2 a .4 g/L de ácido acético (Vera et al., 2009). Es importante determinar la concentración final de ácido acético presente en una fermentación ya que en concentraciones de 1.2 a 4.8 g (20-80 mM) causa muerte en las células de S. cerevisiae en la etapa exponencial induciendo condensación de la cromatina a lo largo de la envoltura nuclear, exponiendo la fosfatidilserina sobre la superficie
98 citoplasmática de la membrana con posterior fragmentación de ADN (Loudovico et al., 2001), a demás de que tiene un severo impacto negativo en el sabor de los vinos. En la producción de acido láctico de menor producción en M1 fuero 3D6 (0.47+0.06 g/L) y 3Y4 (0.00+0.00 g/L) (Tabla VI); para M2 los aislamientos 3Y2 (0.00+0.00 g/L), 3Y3 (0.00+0.00 g/L), 3Y4 (0.38+0.01 g/L)
(Tabla VII). Díaz et al (2008) encontraron en
fermentaciones de mostos de Agave tequilana Weber una concentración de acido láctico de 0.0752 a 0.110 mg/L; la concentración usual producida por S. cerevisiae en fermentaciones de vinos es de 0.1 a 0.5 g/L (Vasserot et., al 2010), es importante conocerlo ya que altas concentraciones de acido láctico (más de 1 g/L) pueden modificar el metabolismo de la levadura, inhibir el crecimiento, el efecto más obvio es el alargamiento de la fase lag, (Vasserot et., al 2010); además de que puede provocar paro en la fermentación (Pampulha et al., 2000). La mayor concentración de glicerol en M1 la produjeron los aislamientos 3D4 (7.61+2.08 g/L) y 3D6 (5.82+0.40 g/L) (Tabla VI); en M2 fueron los aislamientos 3Y5 (4.37+0.03 g/L) y 3Y8 (4.21+0.12 g/L) (Tabla VII). Nuestros resultados son comparables a los obtenidos en fermentaciones de mostos de agave en los que se encontró una concentración de 4.3 a 4.7 g/L (Díaz et al., 2008), Cortes et al (2009) en mostos de agave encontraron 2.8 a 3.9; en mostos de uva se encontró una concentración de 6.8 (Berovic et al., 2007). Es importante conocer la concentración de glicerol en una fermentación ya que este compuesto le confiere calidad, en vinos no es deseable que exceda 6 g/L. Dado el carácter glucofílico de la levadura Saccharomyces cerevisiae y la importancia que este microorganismo tiene en la industria vinícola, es necesario contar con levaduras que fermenten en igual o similar proporción tanto la glucosa como la fructosa ya que generalmente dejan una alta
concentración de fructosa en el medio, causando una
discrepancia entre la cantidad de glucosa y fructosa consumidas durante la fermentación (GF) (Berthels et al., 2004; Guillaume et al., 2007). Investigaciones realizadas por Berthels et al. (2004) en mostos de la variedad de uva Colombard mostraron que las levaduras utilizadas fermentaron más rápido la glucosa, no obstante que al inicio del proceso estaban presentes cantidades similares de los dos azucares (110 g/L de cada una) la lenta utilización de la fructosa dejó una diferencia (GF) y que cuando la glucosa es limitante en el medio la relación GF decrece también, a los doce días estaba presente aproximadamente 5 g/L de glucosa, 30
99 g/L de fructosa y 85 g/L de etanol. En la evaluación de las levaduras en medio sintético tipo mostos de uva (M3) se observó que solo la cepa control Fermichamp® consumió totalmente a la fructosa aproximadamente en 180 horas, seguido por el aislamiento 3Y8; en cuanto a la glucosa los aislamientos 3Y3, 3Y5 y 3Y8 dejaron menos de 1 g/L de azúcar residual. En este estudio se observó que las cepas consumen más rápido la glucosa que la fructosa, coincidente con el carácter glucofílico de las cepas S. cerevisiae empleadas en procesos fermentativos vinícolas. Al caracterizar una levadura fermentativa, es importante analizar la resistencia al estrés por etanol ya que este perturba la homeostasis de las células impactando negativamente a diversas actividades celulares, por ejemplo el metabolismo de los trasportadores de hexosas puede ser bloqueado, causando desnutrición en las células y ocasionando por consecuencia un paro en la fermentación; o bien la reproducción celular puede verse afectada factor importante en las fermentaciones ya que se necesita que las cepas sean capaces de generar la biomasa requerida para completar eficientemente la fermentación (Nagodawithana et al., 1975; Thomas et al., 1978). En esta investigación se usaron niveles de etanol de 25% v/v debido a que causan estrés en la célula, generando inactivación cinética tan rápida que no puede interferir los factores debidos al régimen de cultivo, además de que es medible a través de un periodo corto de tiempo (Pina et al., 2004). Se encontró que la cepa con que presento mayor porcentaje de viabilidad fue la cepa control Fermichamp®, seguida por 3Y5 y 3Y8. Thomas et al (1978), analizaron organismos S cerevisiae encontrando cepas que toleraban concentraciones de etanol arriba del 20% a 30°C. Estrada et al (2001) reportaron cepas de S cerevisiae aisladas de mostos de agave con una resistencia a más del 10% v/v de etanol considerando un crecimiento positivo cuando se presentaba una DO (650nm) arriba del 0.020 unidades. 8.3 Caracterización genética de los genes transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 de los aislamientos Saccharomyces cerevisiae fructofílicos Los genes que codifican para los transportadores de hexosas HXT1 y HXT3 están presentes en mamíferos bacterias, plantas y levaduras, estos genes exhiben una estructura conservada en los Segmentos Transmembranales (TM) 1, 3, 5, 7, 8, regiones que se caracterizan por formar α-héliceses anfipáticas las cuales hipotéticamente interactúan, formando un poro acuosos a través del cual pasa la hexosa, se sugiere que el hidroxil y la amina del aminoácido forman cadenas de estas hélices uniéndose con la hexosa a través de
100 puentes de hidrógeno con los grupos hidroxilos del azúcar (Mueckler et al, 1999; Kasahara et al., 2007), estudios sugieren que la hexosa es transportada de acuerdo a su polaridad, debido a la unión estructural entre las fuerzas internas y externas entre el azúcar y el transportador, iniciando desde el exterior por el C-1 (Carbono 1) siguiendo con C-4 y el C-6 (Hashiramoto et al, 1992), probablemente los polimorfismos que se presenten en estos segmentos transmembranales pueden modificar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar. Las investigaciones han revelado en los FMS (súper familia de los principales facilitadores, por sus siglas en inglés) el TM5 de levaduras es importante para el reconocimiento y paso del substrato, específicamente en el transportador HXT2 se encontró que en esta región el aminoácido Leucina (L201) es esencial para una alta afinidad de transporte bajo condiciones limitadas de glucosa (Kasahar et al, 2003); igualmente se encontró que la Glutamina (Q) esta altamente conservada en otros transportadores para glucosa, fructosa, galactosa, xilosa y arabinosa (Glut1 Q161, en HXT1 Q149 y HXT3 Q206 ) evidenciando su importancia, estudios previos sugieren la participación de este aminoácido en la formación exofacial de la cadena, básicamente en el sitio de unión con el sustrato (Mueckler et al, 1994). En nuestro caso el análisis de las secuencias de Hxt1 reveló que los segmentos transmembranales TM3, TM5 y TM6 se encuentran conservados en los aislados de mezcal y Fermichamp® con la secuencia de la clona S228c. El análisis de Hxt3 reveló que en TM5, las cepas de mezcal presentan polimorfismo en S207L (cambio de un aminoácido no polar por otro polar) con respecto a la cepa S228c; Fermichamp® presenta el polimorfismo V209I; considerando su cercanía al aminoácido conservado Q206 y a las características del cambio de Leucina por Serina del transportador en las cepas aisladas de mezcal, como en Fermichamp®, es probable que estas modificaciones puedan distorsionar la conformación estructural exofacial ocasionando alteraciones entre los sitios alostéricos de la proteína propiciando una diferente afinidad con las moléculas de hexosas. El segmento TM7 tiene un alta homología en otros SMF y está situado en la parte superior de la membrana, probablemente este cumple el papel de reconocimiento del sustrato por parte de la célula, esto es en la interacción exofacial de la proteína con el azúcar, además de que participa en el doblamiento de la hélice; Hashiramoto (1992) mostró que en GUT1 el aminoácido Q282 (HXT1 Q275; HXT3 Q332) se encuentra en una región conservada, es posible que una modificación en esta zona, altere de manera importante la funcionalidad del
101 transportador; hipotéticamente este aminoácido forma puentes de hidrógeno con el C-1 de la glucosa (Liang et al., 1977; Mueckler et al., 2009), además de que puede participar en la unión de la estructura conformacional externa entre TM7 y TM12 propiciando el movimiento helicoidal ascendente cuando un sustrato es incorporado del exerior hacia el interior; en otros estudios se encontró que el aminoácido glicina (HXT1 G279 y HXT3 G336) esta altamente conservado en transportadores de mamíferos y hongos, y es crítico para el transporte de glucosa (Liang et al., 1997, 1998); Kasahara (2010) encontró que el segmento Hxt7 tiene una región hidrofílica y que posee el aminoácido D340 (HXT2 D331; HXT1 D280; HXT3 D337) en la parte central de la cadena, posoción que hipotéticamente afecta la estructura de unión al sustrato o el papel que tiene de unirse a otros residuos, estos ensayos sugieren que Asp340 interacciona con el C-1 de la D-glucosa (Mueckler et al, 1994; 2004). En este estudio el análisis, el segmento TM7 de Hxt1, los aminoácidos Q275 (GUT1 Q282; Hxt3 Q332), G279 y D280 (D340) están conservados para todas las cepas, pero en Fermichamp®, 3D6, 3Y2, 2Y3, 2Y4, 2Y5 y 3Y8 se encuentra adyacente el polimorfismo K278T, considerando que la Lisina (K) es un aminoácido positivo mas grande y puede estar sujeto a ubiquitinación/acetilación, se sugiere que hipotéticamente esta modificación cambia el plegamiento de la región TM7 pudiendo afectar el tamaño del poro y la forma de señalización de la proteína con el azúcar afectando en forma importante la funcionalidad del transportador. Guillaume et al (2007) encontraron 6 mutaciones situadas entre la región TM9, en el lazo externo y en la TM10 de Hxt3, esta región no ha sido identificada como crítica en el transporte del azúcar, no obstante las mutaciones presentes pueden tener un efecto en la proteína, ya que es se encuentran situadas exofacialmente; en Hxt1 se encontraron en la misma región cambios de aminoácidos en la posición 418-420 y 431, el análisis de cepas nativas y comerciales con caracteristicas vinícolas reportaron los mismos polimorfismos en la misma región, sugiriendo que estos cambios pueden afectar positivamente el desarrollo de la fermentación (Guillaume et al., 2007; Karpel et al; 2008). Para este trabajo, se encontró en el transportador Hxt1 de la cepa testigo y en los aislados de mezcal, los polimorfismos reportados por Karpel (2007) en la misma región (418-420 y 431) (TM9, el rizo medio y la TM10). En Hxt3 se encontraron los polimorfismos en la posición 418 y 419 reportados por Karpel (2007) pero solo para Fermichamp; los aislados de mezcal presentaron las sustituciones Y402L y C401S; otro cambio notable que ocurrió solo en la cepa 3D3 que presentó los polimorfismos Y405A, A406F, S407L dentro de la región transmembranal 9. Todos los cambios mencionados anteriormente pueden afectar considerablemente la conformación
102 estructural de ambas proteínas favoreciendo o disminuyendo el transporte de la hexosa en la fermentación. En ensayos realizados con levaduras mutantes (Kasahara et al, 1997; 1998; 2006; Dietvorst 2009), se encontró que en el gen Snf3 el aminoácido conservado Phe462 (Glut1 F379, Hxt1 F380, Hxt2 F431,Hxt3 F437) situado en la TM10, este aminoácido está relacionado como sitio de reconocimiento (o punto de unión) en la parte interna de la hélice para los azúcares fructosa, glucosa y manosa. En las cepas analizadas se encontró que en Hxt1 del segmento TM10 esta presente el polimorfismo L377F, para 3Y8 cerca de la posición F380, probablemente esto y otras características (no evaluadas), favorezca el transporte tanto de la glucosa como la fructosa a través de la membrana ya que es de las cepas que más consume estos azúcares. Existen reportes de que en la TM11 el Triptófano se encuentra conservado en Glu1 (W412) Hxt1 (W413), Hxt3 (W470), Muecler et al (2009) sugieren que este aminoácido aromático se une al sustrato interaccionando con el C-6 de la piranosa. En la cepa 3D3 los polimorfismos presentes en Hxt1 (F406S; G408A; G411A) encontrados en la TM11 se localizan cercanos al aminácido Triptófano (W413). Kasahara (2000), reportó que la posición 504 (Phe) en Gal2 en TM12 es crítica para el transporte de galactosa, y que este aminoácido aromático está conservado en un gran número de transportadores de azúcar o proteínas relacionadas, se reportó que este aminoácido fue remplazado en Hxt3 por (Phe945) y se obsevó una disminución en el transporte de glucosa, observándose por el crecimiento de la célula sobre la placa en medio YNB, sugiriendo que este sitio contribuye fuertemente a la discriminación del reconocimiento en el sustrato, aun que Liang (1997) realizó ensayos con inserción y deleción en TM12 del transportador Hxt3 encontrando que esta región no es crítica para el transporte de glucosa. En nuestro estudio se encontró que en Hxt1 esta presente el polimorfismo L439M en el segmento transmembranal 12, adyacente a la posición F438 (Gal2 F504) en la cepa 3D3, posiblemente estos cambios interfieren con el sitio de reconocimiento de la glucosa ya que 3D3 es de los aislados que dejó mas de 5 g/L de glucosa residual al final de la fermentación (dejando menos de 2 g/L de fructosa). Los polimorfismos encontrados en los genes de los transportadores Hxt1 Y Hxt3 de las cepas aisladas de mostos de mezcal podrían ser cambios naturales debido al proceso evolutivo incrementado por las condiciones específicas de estos mostos, con la posibilidad acumulativa de mutaciones neutrales o tal vez negativas y/o positivas pero es necesario realizar más investigación al respecto.
103
9
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
El contar con un método rápido de detección y aislamiento para levaduras Saccharomyces cerevisiae, además que sean candidatas a consumir eficientemente la fructosa es una herramienta predictiva muy útil en microbiología con fines de uso industrial. Debido a la fuente fructofílica de los mostos de agave el aislamiento de levaduras con características fructofílicas y de producción de etanol además de tolerancia a altas concentraciones de etanol, son susceptibles de ser usadas en otros modelos fermentativos, como lo son los mostos de uva ya que la composición de estos es aproximadamente 100 g/L de glucosa y 100g/L de fructosa, siendo esta ultima una azúcar residual de alta concentración al final de la fermentación. Por lo que es de gran relevancia la evaluación de la cepa 3Y3, 3Y5 3Y8 en mostos de agave, así como en mostos de uva con un fin productivo para mezcal y vinos de mesa ya que es necesario encontrar cepas de S. cerevisiae productivas y adaptadas a las diversas condiciones de fermentación por que la calidad de estas bebidas alcohólicas depende entre otras cosas al rápido establecimiento y la eficiencia de la levadura durante la fermentación. Los resultados obtenidos del análisis de las secuencias de los transportadores mostraron que las cepas con mayor consumo de azúcares reductores presentaron un mayor despliegue de polimorfismos relacionados con cambios en la región interna del poro y/o en las regiones regulatorias de acuerdo a la literatura. La cepa 3Y8 presentó el mayor número de cambios importantes en Hxt1, Para el HXT3 los polimorfismos analizados mostraron en todas las cepas menores cambios en relación a la Fermichamp y en lo particular para las cepas analizadas con más detalle (3Y3, 3Y5, 3Y8) se presentó el polimorfismo Val432Cys. Los resultados obtenidos en el análisis de los HXT1 y HXT3, sugieren la necesidad de realizar estudios de expresión y mutagénesis en sitio dirigida para determinar las capacidades fructofílicas de cepas de S. cerevisiae aisladas de mostos de mezcal.
104
10 APÉNDICES Apéndice 1. Microfotografías de las levaduras Saccharomyces cerevisiae aisladas de mosto de mezcal.
A
B
C
D
E Figura 34. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. A) 3D2; B) 3D3; C) 3D4; D) 3D5; E) 3D6.
105
F
G
H
I
J
K
Figura 35. Imágenes tomadas con campo claro, objetivo ocular 100X, en un microscopio BX51 (Olympus, Japón), adquiridas con cámara de video Hitachi KPD-50 adaptada al triocular del microscopio. F) 3Y2; G) 3Y3; H) 3Y4; I) 3Y5; J) 3Y6; K) 3Y8.
106 Apéndice 2. Secuencias 26S de las levaduras aislados de mostos de mezcal. >3D2 Saccharomyces cerevisiae CCGGGGTTGCCTTAGTACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACC >3D3 Saccharomyces cerevisiae GGGGCATGGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCC
>3D4 Saccharomyces cerevisiae AGGGAATCCCTTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT
107 CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAAACCGCGAACCA >3D5 Saccharomyces cerevisiae CGGGGAATGCCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTG GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG >3D6 Saccharomyces cerevisiae GGGGAAAAGCCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACACACGGGACCA
108 >3Y2 Saccharomyces cerevisiae CGGTATgCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCTAAGCTCAATTTGAAATCTGGTACC TTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTcTAT GTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTGC GGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAG TGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACA AGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGT GAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGC TCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTGGC AGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGGAA TACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAATG GTTATATGCCGCCCGTCTTGAAAAACCCGGAACCAAA >3Y3 Saccharomyces cerevisiae CAAAGGGAATGCTTATACGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAATTTGAAATCTG GTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTT GTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGG AGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCT CTAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACCACGGACCAAAA >3Y4 Saccharomyces cerevisiae CGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGT ACCTTCGGTGCCCSAgTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGtCT aTGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAGTG CGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAA GTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAAC AAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTAC GTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCT
109 GCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGTG GCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGGG AATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATAA TGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAA >3Y5 Saccharomyces cerevisiae ACAGGGGGATGCTTGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT CTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGA GTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCG AACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAG TACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCC TCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGG TGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTG GGAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCAT AATGGTTATATGCCGCCCGTCTTG >3Y8 Saccharomyces cerevisiae CgGGGGATGCCTTAGTACGGCGAGTGAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGG TACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGAGAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGT CTATgTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCCCGTGTGGCGAGGAG TGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCT AAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGA ACAAGTACAGTGATGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGT ACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCATTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCT CTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCAGCATCAGTTTTGGT GGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGG GAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTGGCATA ATGGTTATATGCCGCCCGTCTTGAACAAACGGACCAA
110 Apéndice 3. Secuencias ITS’s de las levaduras aisladas de mostos de mezcal >3D2 Saccharomyces cerevisiae ATATTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTACTGGCAA GAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGGGGGGTCTTGC TAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTT GTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTT TGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAA AGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAA ATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAA GAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCG AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAG CGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAA CTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTG CGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTA ATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGG CGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAA >3D3 Saccharomyces cerevisiae CAAATTTGATAATTTTGAAATGGATTTTTTTATTTTTGGGAATGGAGAGCGAGCTT TTACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTG CGCGGCCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTGGGCATACAAAACGGGGAGAGTT TTCGGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAGCACTAGGGGGT ATTTTCCTATCTTTTCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCAAGAGG TAACAAACACAAACAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTT TCGTAACAGGAATTTTGAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC TCGCATCGATGAAAAACACATCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTC CKGGAATCATCGAATCTTTGAACGCTAATTGTTCCCTTTGGTATTCCTGGGGGCTT GGGTGTTGGAGCGAAATTACCTACCCAAAGATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACT CTTTGTAATAAATTTTAACTAAACGGCCTTTTCATTGAAATTTTTTTTTCTAAAAAT TGGTTCCACGGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCTTTTTGGGTTTAACCA CCTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAATAAGAA AGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAAACGGGKAGGAAGAC CCCCCTGAACTTAAGCTTCACTAAGAGCGGGGGAAGATAAA
111
>3D4 Saccharomyces cerevisiae CAAAGATTATATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAACAAGAGAGCTTTT ACTGGGCAAGAAGACAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGCG CGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTC TGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTT TCAAATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG TAACKGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAAAATTCCG GGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCAKG CCTGTTTAAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCT TTGGAGTTAACTTGAAATKGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGA GGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAA CTGCGGCTAATCTTTTTTTATACCGGAGCGTTTTGGAACGTTTTCGAAAAAAAAA AAGCGTCCTAGGCGAACAATTGTTTTAAAGTTTGACCCTCAAATCAGGTAGGAGK ACCCCGCTGAACTAGCCTAAAAAGAGGGCGGGGGGAGAGAGTACAAAATTTTTA TATTTTTGTAAAATGGAATTTTTTTTTTTTTTTTGG >3D5 Saccharomyces cerevisiae CAAAATTTATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGCTAAGAACTGAAGACCTT TCTCTGGGTAAGAAGACAAAAAAGGGAGAGCCCAGCTGGGCCTGCGCTTAAGGG CGCGGCTTTGCTAGGTTTGCAAGTTTCTTGCTCGCTCTTCCAAACGGTGAAATATT TCTGAGCTTTTGTTATAGGACACTTAAAGCCGTTTCATTACATCACGCTGTGGAGT TTTCACAGCTTAGCAACTTTTTCTTGGGGCTTTCAAGCAAGCGGGGCCCAGAGGT ACCAAACACAAAAAATTTCATTTCTGCATTAATTTTTAGCCAAAAACAAGAATTT TCGTAACTGGAAATTTTAAAACATTAAAACCTTACAACAACGGATCACTTGTTTC TCGCATCGATTAACACCCCACCGAAATGCTAATCGTACTGTGAATTGCAAAATTC CGTGAATCATCGATTCTTTGAACACACATTGCGCCCCTKGGTATTCCGGGGGGCA GGCCGGTTTTAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATCCT CTTAGTAGTTAACTTGAAATTGCCGGCCTTTACCTTGGAGGTTTTTTTTCCAAAAA TAGTTTCCTCTGCTTGCTTGAGGCATAATGCAAGTACGGTCTTTTTAGGTTTAACC ACCAGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCCAAAAAAAAA
112 AAGCTTCTAGGCCAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAACCAGGGAGGAGTCC CCGCTGAACTTAACCATTCAAAAAAGCGGAGGAAAAAAAG >3Y2 Saccharomyces cerevisiae CAGTAATAGTTTTGAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTTTTAC TGGGCAAGAAAACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAKTGCGCG GTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTG TGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTC ATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACA AACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTA ACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCAT CGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGA ATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTKGGTATTCCAGGGGGCATGCCT GTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTG GAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGT TTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTG CGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTA >3Y3 Saccharomyces cerevisiae ATGATGATTCTTTTCGTTGGGCAAGAGCTGAGAGCTTTTACTGGGCAAGAAGAAG GCGATGGAGAGTCGGCCGGGCCTGCGCTTAAGGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAA GTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACA ATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTT CTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATT TATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATA TTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCG AAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTT CTCAAACATTCTGTTTGGTAGGGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCT GGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGT ATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATAC TGAGCGTATTGGAACGTTATCGAGAAGAAGAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTC TTAAAAGTTTGACCT
113 >3Y4 Saccharomyces cerevisiae CAAAGAAAATTAATAATTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAAAGCATGAG AGCTTTTACTGGGCAAGAAGACAAGAGATGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTT AAGTGGGCGGTCTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAG AGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGT GGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAG AGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGA ATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGG TTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGA ATTCCGGGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGG GGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGA TACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAA AGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTT ACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACCGAGCGTATTGGAACGTTATCGAAAAAA AAAGAGCGTCTAGGCGAACAAGGTTTTAAAAGTTTGCCTC >3Y5 Saccharomyces cerevisiae TATGATGATTTTTTTCGTTGGGCAAGAGCGGAGGTTACGGAAAAAAAAGAAGGG AGAGCAGCGGGCTGCGTTAAGTGGGGGCTGGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTG CTATTCCAAACGGTGAGAGATTTCTGTGCTTTTGTTATAGGAAAATTAAAACCGTT TCAATACAACACACTGTGGAGTTTTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTC GAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAACAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAAT TTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCGTAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACG TAATGTGAATTGCAGAATTCCKTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCC CCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCT GTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTTGGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATT GGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGGTTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTA CGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACTGCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGG AACGTTATCGATAAGAAAAAGAGCGTCTAGGCGAACAATGTTCTT >3Y8 Saccharomyces cerevisiae TAAATTTATAATTTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCAAGAGCATGAGAGCTT TTACTGGGCAAGAAGAAAGAGAGGGAGAGTCCAGCCGGGCCTGCGCTTAAGTGC
114 GCGGTTTTGCTAGGCTTGTAAGTTTCTTTCTTGCTATTCCAAACGGTGAGAGATTT CTGTGCTTTTGTTATAGGACAATTAAAACCGTTTCAATACAACACACTGTGGAGTT TTCATATCTTTGCAACTTTTTCTTTGGGCATTCGAGCAATCGGGGCCCAGAGGTAA CAAACACAAAGAATTTTATTTATTCATTAAATTTTTGTCAAAAACAAGAATTTTCG TAACTGGAAATTTTAAAATATTAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGC ATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGT GAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGC CTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCTCAAACATTCTGTTTGGTAGTGAGTGATACTCTTT GGAGTTAACTTGAAATTGCTGGCCTTTTCATTGGATGTTTTTTTTCCAAAGAGAGG TTTCTCTGCGTGCTTGAGGTATAATGCAAGTACGGTCGTTTTAGGTTTTACCAACT GCGGCTAATCTTTTTTATACTGAGCGTATTGGAACGTTATCGATAAGAAGAGAGC GTCTAGGCGAACAATGTTCTTAAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAGTACCCGC TGAACTTAAGCATATCAATAAACGGGGGAAAAGATCATTAAAGAAATTTAATAA TTTTGAAATGGATTTTTTTTGTTTTGGCMARGGCATGGAGAGCTTTT
115 Apéndice 4. Comparación de las secuencia de los genes HXT1 de las levaduras seleccionadas por su fructofilia.
Figura 36. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen HXT1 de aislados de mostos de mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido.
116 Apéndice 5. Comparación de las secuencia de los genes HXT3 de las levaduras seleccionadas por su fructofilia.
Figura 37. Alineamiento Clustal, secuencia de aminoácidos del gen hxt3 de Aislados de Mostos de Mezcal y Fermichamp en referencia a S288c. Indica residuo de aminoácido idéntico; color rojo indica cambio en el aminoácido
117
11 LITERATURA CITADA
Abdel FW, Fadil M, Nigam P, Banat IM. 1999. Isolation of thermotolerant ethanologenic yeasts and use of selected strains in industrial scale Fermentation in an Egyptian distillery. Biotechnology and Bioengineering 68:5. Aguilar-Uscanga B, Arrizon J, Ramírez J, Solís-Pacheco J. 2007. Effect of Agave tequilana Juice on cell wall polysaccharides of three Saccharomyces cerevisiae strains from different origins. Antonie van Leeuwenhoek 91:151-157. Arrizon J, Fiore C, Acosta G, Romano P, Gschaedler A. 2006. Fermentation behaviour and volatile compound production by agave and grape must yeasts in high sugar Agave tequilana and grape must fermentations. Antonie van Leeuwenhoek 89: 181-189. Arrizon J, Gschaedler A. 2002. Increasing fermentation efficiency at high sugar concentrations by supplementing an additional source of nitrogen during the exponential phase of the tequila fermentation process. Canadian Journal of Microbiology 48:965-970. Arrizon J, Gschaedler A. 2005. Effects of the addition of different nitrogen sources in the tequila fermentation process at high sugar concentration. Journal of Applied Microbiology 102:1123-1131. Arroyo-López F.N, Querol A, Barrio E. 2009. Application of a substrate inhibition model to estimate the effect of fructose concentration on the growth of diverse Saccharomyces cerevisiae strains. Journal Industrial Microbiology Biotechnology 36:663–669 Babor J, Aznárez J. 1977. Química general moderna: una introducción a la física y a la química descriptiva superior (inorgánica, orgánica y bioquímica). Séptima edición. Editorial Época. Argentina. Capitulo 50. Página 787. Baere T, Mendonca R, Caléis G. 2002. Evaluation of amplified rDNA restriction analysis (ARDRA) for the identification of cultured mycobacterium in a diagnostic laboratory. BMC Microbiology 2:4.
118 Bannam T.L, Johanesen P.A, Salvado Ch.L, Pidot S.J, Farrow K.A, Rood J.I. 2004. The Clostridium perfringens TetA(P) efflux protein contains a functional variant of the Motif A region found in major facilitator super family transport proteins. Microbiology 150:127-134. Barnett J.A, Payne R.W. 2000. Yeast: Characteristics and Identification. Third edition. Editorial Cambridge 17:18. Bauer F.F, Pretorius I.S. 2000. Yeast stress response and fermentation efficiency: how to survive the making of wine. A review. South African Journal of Enology and Viticulture 21:27-51. Belinchon M.M, Gancedo J.M. 2006. Different signalling pathways mediate glucose induction of SUC2, HXT1 and pyruvate decarboxylase in yeast. FEMS Yeast Research 7:40-47. Belloch C, Orlic S, Barrio E, Querol A. 2008. Fermentative stress adaptation of hybrids within the Saccharomyces sensu stricto complex. International Journal of Food Microbiology 122:1-2, 29 Pp. 188-195. Berovic M, Herga M. 2007. Heat shock on Saccharomyces cerevisiae inoculums increases glycerol production in wine fermentation. Biotechnoloy Letters 29:891–894 Berry D.R, Watson D.C. 1987. Production of organoleptic compounds. In: Yeast Biotechnology. Berry D.R, Russell I. and Stewart, G.G. (Eds). Yeast Biotechnology. Allen & Unwin. Pp. 345-364. Bryson K, McGuffin L.J, Marsden R.L, Ward J.J, Sodhi J.S. Jones D.T. 2005. Protein structure prediction servers at University College London. Nucl. Acids Res. 33(Web Server issue):W36-38. Cáceres-Farfán M, Lappe P, Larqué-Saavedra A, Magdub-Méndez A, Barahona-Pérez L. 2008.
Ethanol production from henequen (Agave fourcroydes Lem.) juice and
molasses by a mixture of two yeasts. Bioresource Technology. 99:18. Campbell. 2003. Microbiological aspects of brewing. In: Priest F.G. and Campbell I. Editors. Brewing microbiology (3rd edition), Kluyver Academic, Plenum Publishers, New York, USA, pp. 1-16.
119 Cardona F, Carrasco P, Pérez-Ortín J.E, Del Olmo M, Aranda A. 2007. A novel approach for the improvement of stress resistance in wine yeasts. International Journal of Food Microbiology 114:83-91. Carrasco P, Querol A, Del Olmo M. 2001. Analysis of the stress resistance of commercial wine yeast strains. Archives of Microbiology. 175:450-457. Casey G.P, Magnus C.A, Ingledew W.M. 1984. High gravity brewing: Effects of nutrition on yeast composition, fermentative ability, and alcohol production.
Applied
Environmental Microbiology. 48:3, 639-646. Cirillo V. P. (1968). Relationship between sugar structure and competition for the sugar transport system in baker’s yeast. Journal of Bacteriology 95:603-61 1. Clavijo A, Calderón L.I. 2011. Yeast assessment during alcoholic fermentation inoculated with a natural ‘‘pied de cuve’’ or a commercial yeast strain. World Journal Microbiology and Biotechnology. 27:1569-577. Coelho S.C.L, Augusto R.C, Souza O.E. 2006. Studies on the kinetic parameters for alcoholic fermentation by flocculent Saccharomyces cerevisiae strains and non-hydrogen sulfide-producing strains. World Journal of Microbiology & Biotechnology 22: 857– 863 Colunga-Garcia M. Zizumbo-Villarreal D. 2007. Tequila and other Agave spirits from westcentral México: current germplasm diversity, conservation and origin. Biodiversity and Conservation 16:1653-1667 Colville C.A, Seatter M.J, Jess T. J., Gould G. W, Thomas, H. M. (1993). Kinetic analysis of the liver-type (GLUT2) and brain-type (GLUTS) glucose transporters in Xenopus oocyte substrate specificities and effects of transport inhibitors. Biochemical Journal 290:701-706. COMERCAM. Consejo Mexicano Regulador de la Calidad del Mezcal [Internet]. Disponible en el sitio de red: http://www.comercam.org [Revisado el 2 de mayo de 2010]. CONABIO. 2002. Biodiversidad. Boletín bimestral de la Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad. Año 6; Num.44. CONABIO. Comisión Nacional para el Conocimiento y uso de la Biodiversidad. Sistema Integrado de Información Taxonómica (SIIT). Disponible en el sitio de red: http://siit.conabio.gob.mx/ [Revisado el 18 de enero de 2011].
120 Cortes H.C, Córdova L.J, Herrera L.E, Díaz M.D. 2009. Estudio de la aireación y la tasa de dilución en la fermentación en continuo de jugo de agave complementado con extracto de levadura. XIII Congreso Nacional DE Biotecnología y Bioingeniería. VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras. 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero. Cui D.Y, Randell B.C, Chiang H.L. 2004. The type 1 phosphatase Reg1p-Glc7p is required for the glucose induced degradation of fructose-1,6 bisphosphatase in the vacuole. The Journal of Biological Chemistry 279:11. Pp. 9713-9724. Davie J.K, Edmondson C.B, . 2003. Tup1-Ssn6 interacts with multiple class I histone deacetylases in vivo. Journal Biological Chemistry 278(50):50158-62. De Barros Lopes M.A, Eglinton J, Henschke P.A, Hoj P.B, Pretorius I.S. 2003. The connection between yeast and alcohol reduction in wine: managing the double-edged sword of bottled sunshine. Australian and New Zealand Wine Industry Journal 18:17–18, 20, 22. De la Cera T, Herrero P, Moreno-Herrero F, Chaves R.S, Moreno F. 2002. Mediator factor Med8p interacts with the hexokinase 2: implication in the glucose signalling pathway of Saccharomyces cerevisiae. Journal of Molecular Biology 319(3):703-14. De León-Rodríguez A, González - Hernández L, Barba de la Rosa A.P, Escalante Minakata P, López G.M. 2006. Characterization of volatile compounds of mezcal, an ethnic alcoholic beverage obtained from Agave salmiana. Journal Agricultural of Food Chemistry. 1337-1341. Delay B. 2007.2007. Independent Indians and the U.S.-Mexican War. The American Historical Review 112:1. Díaz-Montaño D.M, Marie-Line D, Estarrón-Espinosa M, Strehaiano P. 2008. Fermentative capability and aroma compound production by yeast strains isolated from Agave tequilana Weber juice. Enzyme and Microbial Technology. 42-7:608-616. Dietvorst J, Karhumaa K, Kielland-Brandt1 M, Brandt A. 2009 Amino acid residues involved in ligand preference of the Snf3 transporter-like sensor in Saccharomyces cerevisiae. Yeast 27:131–138.
121 Dombek M.K, Kacherovsky N, Young. 2004. The Reg1-interacting proteins, Bmh1, Bmh2, Ssb1, and Ssb2, have roles in maintaining glucose repression in Saccharomyces cerevisiae. The American Society for Biochemistry pp. 39165-39174. Dujon B. 1999. The yeast genome project: what did we learn? Unité de Génétique Moléculaire des Levures 7: 263-270. Dumont A, Raynal C, Raginel F, Ortiz-Julien A, Suarez C, Jose Heras J.M. 2009. Capacidad de las levaduras enológicas de consumir fructosa. Lallemand Enologie. Ciencia y Técnica. http://www.lallemandwine.com. Escalante M.P, Blaschek A.P, Barba L.S, De León R.A. 2008. Identification of yeast and bacteria involved in the mezcal fermentation of Agave salmiana. Letters in Applied Microbiology 46: 626–630. Escalante M.P, González H.L, Barba de la Rosa A.P, De León R. A. 2006. El mezcal, una mezcla natural de alcoholes y feromonas. Junio -Julio 2006. Alfa Editores Técnicos. Bebidas Mexicanas. http://www.alfa-editores.com. Esteve-Zarzoso B, Belloch C, Uruburu F, Querol A. 1999. Identification of yeasts by RFLP analysis of the 5.8S rRNA gene and the two ribosomal internal transcribed spacers. International Journal of Systematic Bacteriology. 49:29-337. Esteve-Zarzoso B, Peris-Torán M.J, García Maizquez E, Uruburu F, Querol A. 2001. Yeast population dynamics during the fermentation and biological aging of Sherry wines. Applied and Environmental Microbiology 67:2056-2061. Estrada G.A, Cruz G.A, Lappe P, Ulloa M, García G.M, Gómez R.L. 2001. Isolation and identification of killer yeasts from Agave sap (aguamiel) and pulque. Worlds Journal of Microbiology and Biotechnology 17:557-560. Estruch F. 2000. Stress-controlled transcription factors, stress-induced genes and stress tolerance in budding yeast. FEMS Microbiology Reviews. 24(4):469-86. Fagerstrom-Billai F, Durand-Dubief M, Ekwall K, Wright A.P. 2007. Individual subunits of the Ssn6-Tup11/12 corepressor are selectively required for repression of different target genes. Molecular and Cell Biology 27(3):1069-82. Ferrer M.A, Riera A, Jiménez Ch.J, Herrero P, Moreno F, Gómez F.A. 2004. A glucose response element from the Saccharomyces cerevisiae hexose transporter HXT1 gene
122 is sensitive to glucose in human fibroblasts. Journal of Molecular Biology. 338:657667. Fleet G.H, Heard G.M. 1993. Yeasts-growth during fermentation. In: G.H. Fleet, Editor, Wine microbiology and biotechnology, Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerlan. pp. 42–43. Fleet G.H. 2003. Yeast interactions and wine flavor. International Journal of Food Microbiology 86:11-22. Flick J.S, Johnston M. 1991. GRRI of Saccharomyces cerevisiae is required for glucosa repression and encodes a protein with leucine-rich repeats. Molecular and Cellular Biology. Pp. 5101-5112. Flick M.K, Spielewoy N, Kalashnikova I.T, Guaderrama M, Zhu Q, Chang H.C, Wittenberg C. 2003. Grr1-dependent Inactivation of Mth1 mediates glucose-induced dissociation of Rgt1 from HXT gene promoters. Molecular Biology of the Cell Vol. 14:32303241. Francesca N, Chiurazzi M, Romano R, Aponte M, Settanni L, Moschetti G. 2009. Indigenous yeast communities in the environment of ‘‘Rovello bianco’’ grape variety and their use in commercial white wine fermentation. World journal Microbiology and Biotechnology. 26:337-351. Gaceta Parlamentaria. 2008. año XI, número 2607, martes 7 de octubre. Disponible en el sitio de red: http://gaceta.diputados.gob.mx. [Consultado el 9 de septiembre del 2009]. García M.A. 2003. “Informe final del proyecto V029 ‘Sistemática y distribución actual de los Agave spp. mezcaleros”. México, Jardín Botánico del Instituto de Biología de la UNAM y CONABIO. García Mendoza A. 2007. Los agaves de México. Jardín Botánico, IB-UNAM, Ciencias 87:14-23. Gasch A.P, Spellman P.T, Kao C.M, Carmel-Harel O, Eisen M.B, Storz G, Botstein D, Brown P.O. 2000. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular Biology of Cell. 11:4241-4257. Gómez A.R, 2004. Optimización del proceso de extracción de la inulina de Agave americana y de su hidrólisis para la obtención de azucares fermentecibles. Tesis para obtener el
123 título de Químico Farmacéutico Biólogo. Universidad Autónoma de Tamaulipas. 1824. Gough S, Flynn O, Hack C.J, Marchant R, 1996. Fermentation of molasses using a thermotolerant yeast, Kluyveromyces marxianus IMB3; simplex optimization of media supplements. Applied Microbiology Biotechnology 46:187-190. Greatrix B.W, Van Vuuren H.J.J. 2006. Expression of the HXT13, HXT15 and HXT17 genes in Saccharomyces cerevisiae and stabilization of the HXT1 gene transcript by sugarinduced osmotic stress. Current Genetics 49:205-217. Guillaume C, Delobel P, Sablayrolles J.M, Blondin B. 2007. Molecular basis of fructose utilization by the wine yeast Saccharomyces cerevisiae: a mutated HXT3 allele enhances fructose fermentation. Applied Environmental Microbiology. 73(8):24322439. Gutiérrez L.M, Ramírez C.J, Pelayo O. C, Escalante G. Z, Corona G.R, Lezama G.L. 2009. Sobreexpresión de los genes ADH1 y HXT1 en levaduras de Saccharomyces cerevisiae para mejorar la eficiencia en la producción de tequila. XIII Congreso Nacional DE Biotecnología y Bioingeniería. VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras. 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero. Hashiramoto M, Kadowaki T, Clark A.E, Muraoka A, Momomura K, Sakura H, Tobe A, Akanuma Y, Yazaki Y, Holman G.D, and Kasuga M. 1992. Site-directed Mutagenesiso f GLUT1 in Helix 7 Residue 282 Results in Perturbation of Exofacial Ligand Binding 267:25:17502-17507. Hauser N, Fellenberg K, Gil R, Bastuck S, Hoheisel J. 2001. Whole genome analysis of a wine yeast strain. Comparative and Functional Genomics 2: 69-79. Hierro N, González A, Mas A, Guillamon J.M. 2005. Diversity and evolution of nonSaccharomyces yeast populations during wine fermentation: effect of grape ripeness and cold maceration. FEMS Yeast Research 6:1, pp. 102-111. Hirai T, Heymann J.A.W, Maloney P.C, Subramaniam S. 2002. Structural model for 12Helix transporters belonging to the major facilitator super family. Bacteriology. Pp. 1712–1718. 185:5.
Journal of
124 Hohmann, S. 2003. The osmotic stress response of Saccharomyces cerevisiae. Yeast stress responses. Hohmann and W. Mager. Berlin, Heidelberg Germany, Springer: 121200. Hsiung G.Y, Chang H.C, Pellequer J.L, Valle R. 2001. F-Box protein Grr1 interacts with phosphorylated targets via the cationic surface of its leucine-rich repeat. Molecular and Cellular Biology. P.p. 2506–2520. Jacques H.C, López H.A, Anaya G.C, Sifuentes R.A, Taillandier P, Ramón P.F. 2005. Identificación (ID) de levaduras aisladas de mostos de mezcal: ID morfológicabioquímica (M-B) vs molecular (Mol). Congreso Ibero-Americano de Ingeniería de Alimentos. CYTED-IPN-UA. Puerto Vallarta, Jalisco, México. 4 al 7 de Septiembre de 2005. Jacques Hernández, C.; 2003 Estudio de factibilidad ecosistémica y justificación socioeconómica para el cultivo de agave mezcalero en el Estado de Tamaulipas, Reporte de programa de estudio apoyado por la coordinación General de Posgrado e Investigación del Instituto Politécnico Nacional, México. Jacques-Hernández C, Herrera P.O, Ramírez De L.J.A. 2004. El maguey mezcalero y la agroindustria del mezcal en Tamaulipas. IV Simposium Internacional sobre Agavaceae y Nolinaceae, AMC-CICY-CONAGAVE-UNAM-Tequila Herradura, Mérida, Yuc., 3-5 de Marzo. Karpel J.E, Place W.R, Linda F. Bisson L.F. 2008. Analysis of the major hexose transporter genes in wine strains of Saccharomyces cerevisiae. American Journal of Enology and Viticulture. 59:3. Kasahara M, Shimoda E, Maeda M. 1996. Transmembrane segment 10 is important for substrate recognition in Gal2 and Hxt2 sugar transporters in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters 389: 174-178. Kasahara M, Maeda M. 1998. Contribution to Substrate Recognition of Two Aromatic Amino Acid Residues in Putative Transmembrane Segment 10 of the Yeast Sugar Transporters Gal2 and Hxt2. The Journal of Biological Chemistry. 273:44:29106– 29112.
125 Kasahara M, Shimoda E, Maeda M. 1996. Transmembrane segment 10 is important for substrate recognition in Gal2 and Hxt2 sugar transporters in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Letters 389:174-178. Kasahara T, Ishiguro M, Kasahara M. 2006. Eight Amino Acid Residues in Transmembrane Segments of Yeast Glucose Transporter Hxt2 Are Required for High Affinity Transport. The Journal of Biological Chemistry 281:27:18532–18538. Kasahara T, Kasahara M. 2000. Three Aromatic Amino Acid Residues Critical for Galactose Transport in Yeast Gal2 Transporter. The Journal of Biological Chemistry 275:6:4422-4428. Kasahara T, Kasahara M. 2003. Transmembrane segments 1, 5, 7 and 8 are required for highaffinity glucose transport by Saccharomyces cerevisiae Hxt2 transporter. The Journal of Biological Chemistry 372:247–252. Kasahara T, Kasahara M. 2010. Identification of a Key Residue Determining Substrate Affinity in the Yeast Glucose Transporter Hxt7 A TWO-DIMENSIONAL COMPREHENSIVE STUDY. The Journal of Biological Chemistry 285:34:26263– 26268 Kasahara T, Maeda M, Ishiguro M, Kasahara M. 2007. Identification by Comprehensive Chimeric Analysis of a Key Residue Responsible for High Affinity Glucose Transport by Yeast HXT2. The Journal of Biological Chemestry. 282:18:13146– 13150. Kenneth M.D, Kacherovsky N, Young E.T. 2004. The Reg1-interacting proteins, Bmh1, Bmh2, Ssb1, and Ssb2, have roles in maintaining glucose repression in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 279:37. Pp. 39165– 39174. Kim J.H, Johnston M. 2006. Two glucose-sensing pathways converge on Rgt1 to regulate expression of glucose transporter genes in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. No. 36. Pp. 26144–26149. Kim J.H, Polish J, Johnston M. 2003. Specificity and regulation of DNA binding by the yeast glucose transporter gene repressor Rgt1. Molecular and Cellular Biology. Pp. 5208– 5216.
126 Ko Ch.H, Liang H, Gaber F.R. 1993. Roles of multiple glucose transporters in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. Pp. 638-648. Kornberg R.D. 2005. Mediator and the mechanism of transcriptional activation. Review. TRENDS in Biochemical Sciences 30:5. Kurtzman C.P . 1992. DNA relatedness among phenotypically similar species of Pichia. Mycologia 84: 72–76 Kurtzman C.P and Robnett C.J. 1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences. Antonie van Leeuwenhoek 73:331-371. Kurtzman C.P. 2003. Phylogenetic circumscription of Saccharomyces, Kluyveromyces and other members of Saccharomycetaceae, and the proposal of the new genera Lachancea, Nakaseomyces, Naumovia, Vanderwaltozyma and Zygoyorulaspora. FEMS Yeast Research 4:233-245. Lachenmeier D.W, Sohnius E.M, Rainer, Lopez M.G. 2006. Quantification of Selected Volatile Constituents and Anions in Mexican Agave Spirits (Tequila, Mezcal, Sotol, Bacanora). Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54:3911-3915. Lafuente M.J, Gancedo C, Jauniaux J.C, Gancedo J.M. 2000. Mth1 receives the signal given by the glucose sensors Snf3 and Rgt2 in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Microbiology. 161-172. León-Rodríguez A, González-Hernández L, Barba A, Escalante M.P. 2006. Characterization of volatile compounds of mezcal, an ethnic alcoholic beverage obtained from Agave salmiana. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54: 1337-1341. Lewis DA, Bisson LF. 1991. The HXT1 gene product of Saccharomyces cerevisiae is a new member of the family of hexose transporters. Molecular and Cellular Biology. 11(7):3804-13. Liang H, Ko C.H, Herman T, Gaber R.F. 1998.Trinucleotide Insertions, Deletions, and Point Mutations in Glucose Transporters Confer K1 Uptake in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology 18:2:926-935. Ludovico p, Joao S.M, Silva TS, Leao C, Corte-Real M. 2001. Saccharomyces cerevisiae commits to a programmed cel death process in response to acetic acid. Microbioloogy 147:2409-2415.
127 Luyten K, Riou Ch, Blondin B. 2002. The hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae play different roles during enological fermentation. Yeast. 19:713–726. Luyten K, Riou Ch, Blondin B. 2002. The hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae play different roles during enological fermentation. Yeast 19:713–726. Maier A, Völker B, Boles E, Günter F.F. 2002. Characterization of glucose transport in Saccharomyces cerevisiae with plasma membrane vesicles (counter transport) and intact cells (initial uptake) with single Hxt1, Hxt2, Hxt3, Hxt4, Hxt6, Hxt7 or Gal2 transporters. FEMS Yeast Research. 2:539-550. Martinez J, Millan C, Ortega J.M. 1989. Growth of natural flora during the fermentation of inoculated musts from Pedro Ximenez grapes. S. Afr. J. Enol. Vitic. 10(2): 31-35. Mirafuentes Galván J.L. 1993. Movimientos de resistencia y rebeliones indígenas en el norte de México. 1680-1821. Guía documental 11. Universidad Nacional Autónoma de México. Serie bibliográfica - Instituto de Investigaciones Históricas. UNAM, México, 12:4-155. Molina-Guerrero A, Botello-Álvarez J.E, Estrada-Baltazar A, Navarrete-Bolaños J.L, Jiménez-Islas H,
Cárdenas-Manríquez M, Rico-Martínez R. 2007. Compuestos
volátiles en el mezcal. Revista Mexicana de Ingeniería Química 6: 1:41-50. Montrocher R. Verner M.C, Briolay J, Gautier C, Marmeisse R. 1998. Phylogenetic analysis of the Saccharomyces cerevisiae group based on polymorphisms of rDNA spacer sequences International. Journal of Systematic Bacteriology 48:295–303. Moreno F, Ahuatzi D, Riera A, Palomino C. A, Herrero P. 2005. Glucose sensing through the Hxk2-dependent signalling pathway. Biochemical Society Transactions 33:1. Mueckler M. Weng W, Kruse M. 1994. Glutamine 161 of Glutl Glucose Transporter Is Critical for Transport Activity and Exofacial Ligand Bindin. Journal of Biological Chemistry 269:32:20533-20538. Mueckler M., Makepeace C. 2009. Model of the Exofacial Substrate-Binding Site and Helical Folding of the Human Glut1 Glucose Transporter Based on Scanning Mutagenesis. Biochemistry 48:25:5934–5942. Nagodawithana T.W, Steinkraus K.H. 1975. Influence of the rate of ethanol production and accumulation on the viability of Saccharomyces cerevisiae in rapid fermentation. Applied and Environmental Microbiology pp. 158-162.
128 Naumov G.I, James S.A, Naumova E.S, Louis E.J, Roberts I.N. 2000. Three new species in the
Saccharomyces
sensu
stricto
complex:
Saccharomyces
cariocanus,
Saccharomyces kudriavzevii and Saccharomyces mikatae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50:1931-1942. Naumov G.I, Naumova E.S, Kondratieva V.I. 2006. The use of hybridization in breeding of eukaryotic microorganisms. ISSN 1022-7954, Russian Journal of Genetic 42:11. Pp. 1324-1328. Naumov G.I. 1996. Genetic identification of biological species in the Saccharomyces sensu stricto complex. Journal of Industrial Microbiology Biotechnology 17:295-302. Naumova E.S, Korshunova I.V, Jespersen L, Naumov G.I. 2003. Molecular genetic identification of Saccharomyces sensu stricto strains from African sorghum beer. FEMS Yeast Research 3:177-184. Nehlin J.O, Ronne H. 1990. Yeast MIG 1 repressor is related to the mammalian early growth response and Wilms' tumour finger proteins. The EMBO Journal 9:9. Pp. 2891 2898. Neliseen B, Wachter R.D, Gojeau A. 1997. Classification of all putative permeases and other membrane plurispanners of the major facilitator superfamily encoded by the complete genome of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiology Reviews 21:113-134. Nisiotou A.A, Nychas G.J. 2007. Yeast populations residing on healthy or botrytis-infected grapes from a vineyard in Attica, Greece. Applied and Environmental Microbiology 73:8 Pp. 2765-2768. Norma Oficial Mexicana 2006. NOM-006-SCFI-2005, “Bebidas
Alcohólicas-Tequila-
Especificaciones”. Disponible en: www.economia.gob.mx. Consultado el 15 de Septiembre 2009. Oliva A. 2007. Análisis de la diversidad genética de cepas de Saccharomyces cerevisiae aisladas de mostos de mezcal de la región de San Carlos, Tamaulipas. Tesis que para obtener el grado de maestría en Ciencia y Tecnología de Alimentos. Universidad Autónoma de Tamaulipas.
129 Ozcan S, Dover J, Rosenwald A.G., Wolfl S, Johnston M. 1996. Two glucose transporters in Saccharomyces cerevisiae are glucose sensors that generate a signal for induction of gene expression. Genetics 93:12428-12432. Ozcan S, Jhonston M.
1999. Function and regulation of yeast hexose transporters.
Microbiology and Molecular Biology Reviews. Pp. 554–569. Ozcan S, Johnston M. 1995. Three different regulatory mechanisms enable yeast hexose transporters (HXT) genes to be induced by different levels of glucose. Molecular and Cellular Biology. 15:1564-1572. Ozcan S. 2002. Two different signals regulate repression and induction of gene expression by glucose. The Journal of Biological Chemistry 277:49, 6. Pp. 46993–46997. Pampulha M.E, Loureiro-Dias M.C. 2000 Energetics of the effect of acetic acid on growth of Saccharomyces cerevisiae, FEMS Microbiology Letters 184:69–72. Pandey A, Mann M. 2000. Proteomics to study genes and genomes. Nature Publishing, London. Nature 405, 837-846. Parsons J.R, Darling J.A. 2000. Maguey (Agave spp.) utilization in Mesoamerican civilization: a case for pre-columbian pastoralism. Bolétin de la Sociedad Botánica de México. 66:81–91. Parsons J.R, Parsons M.H. 1990. Maguey utilization in Highland central Mexico. Museum of Antropology, University of Michigan. Ann Arbor. 82:388. Pérez B.D, Tapia-Tussell R, Quijano-Ramayo, A, Larqué Saavedra A, Lappe P. 2007. Molecular characterization of Kluyveromyces marxianus strains isolated from Agave fourcroydes Lem in Yucatán, México. Molecular Biotechnology 37:181–186. Pérez C.M, Briones P.A, Ubeda I.J, Martin A.P. 1999. Characteristics of wines fermented with different Saccharomyces cerevisieae strains isolated from the La Mancha region. Food Microbiology 16:563-573. Pina C, Gonçalves P, Prista C, Loureiro-Dias M.C. 2004. Ffz1, a new transporter specific for fructose from Zygosaccharomyces bailii. Microbiology 150:2429-2433. Pinal L.E, Cedeño M, Gutiérrez H, Alvarez-Jacobs J. 1997) Fermentation parameters influencing higher alcohol production in the tequila process. Biotechnology Letters 19:1. Pp. 45-47.
130 Pinal L.E, Cornejo M, Arellano E, Herrera E, Nunez L, Arrizon J, Gschaedler A. 2009. Effect of Agave tequilana age, cultivation field location and yeast strain on tequila fermentation process. Journal Industrial Microbiology Biotechnology 36:655–661 Polish J.A, Kim J.H, Johnston M. 2005. How the Rgt1 transcription factor of Saccharomyces cerevisiae is regulated by glucose. Genetics Society of America. 169: 583-594. Polsinelli M, Romano P, Suzzi G, Mortimer R. 1996. Multiple strains of Saccharomyces cerevisiae on a single grape vine. Letters in Applied Microbiology, 23:1 10-1 14. Prescott C, Dunn G. 1962. Las levaduras. En: Microbiología Industrial; ed. Aguilar- Madrid, España. Pp. 45-47. Pretorius S.I. 2001. Gene technology in winemaking: New approaches to an ancient Art. Institute for Wine Biotechnology, University of Stellenbosch. Agriculture Conspectus Scientificus, 66(1): 27-47. Puig S, Pérez-Ortín J.E. 2000. Stress response and expression patterns in wine fermentations of yeast genes induced at the diauxic shift. Yeast 16. Pp. 139-148. Querol A, Jiménez M, Huerta T. 1990. Microbiological and enological parameters during fermentation of musts from poor and normal grape-harvest in the region of Alicante (Spain). Journal of Food Science. 55: 1603-1606. Querol A. 2001. Modificación genética de levaduras vínicas. El vino en la alimentación y la salud: Memorias del IV Encuentros de Primavera de la Universidad de Cádiz en el Puerto de Santa María, España. Pp. 83-88. Raeder U, Broda P. 1985. Rapid Preparation of DNA from filamentous fungi. Letters in Applied Microbiology. 1: 17-20. Rainieri S, Zambonelli C, Kaneko Y. 2003. Saccharomyces sensu stricto: Systematics, genetic diversity and evolution. Journal of Bioscience and Bioengineering 96(I): 1-9. Rainieri S, Zambonelli C, Tini V, Castellari L, Giudici P. 1998. The enological traits of thermotolerant Saccharomyces strains. American Journal Enology and Viticulture. 49:319–324. Ramakrishnan V, Theodoris G, Bisson L. F. 2006. Loss of IRA2 suppresses the growth defect on low glucose caused by the snf3 mutation in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research 7: 67–77.
131 Ramales Osorio M.C, Barragán Ramírez M.L. 2002. La industria del mezcal y la economía oaxaqueña
en
Observatorio
de
la
Economía
Latinoamericana
http://www.eumed.net/cursecon/ecolat/mx/ (consultado: 3 de febrero de 2006). Reifenberger E, Boles E, Ciriacy M. 1997. Kinetic characterization of individual hexose transporters of Saccharomyces cerevisiae and their relation to the triggering mechanisms of glucose repression. European Journal of Biochemistry. 245: 324-333. Rolland F, Winderickx J, Thevelein J.M. 2001. Glucose sensing mechanisms in eukaryotic cells. Trends Biochemical Sciences 26: 310–317. Saba J.D, Nara F, Bielawska A, Garrett Hannun Y. 1997. The BST1 gene of Saccharomyces cerevisiae is the sphingosine-1-phosphate lyase. The Journal of Biological Chemestry 272(42): 26087- 26090 Saier H.M. 2000. Micro review families of transmembrane sugar transport proteins. Molecular Microbiology 35(4):699-710. Salmon J.M. 2006. Interactions between yeast, oxygen and polyphenols during alcoholic fermentations: Practical implications. Lebensmittel Wissenschaft Technologie Food Science and Technology. 39:959-965. Saloheimo A, Rauta J, Stasyk O.V, Sibirny A.A, Penttilä M, Ruohonen L. 2007. Xylose transport studies with xylose-utilizing Saccharomyces cerevisiae strains expressing heterologous and homologous permeases. Applied Microbiology Biotechnology. 74:1041-1052. Salvado Z, Chiva R, Rodriguez-Vargas S, Randez-Gil F, Mas A, Guliiamon J.M. 2008. Proteomic evolution of a wine yeast during the first hours of fermentation. FEMS Yeast Res 8:1137-1146. Salvatierra G.A. 2003. El mezcal y su importancia para el desarrollo económico del estado de Oaxaca. El sector exportador: retos y oportunidades en el mercado de la Unión Europea. Tesis de Licenciatura. Universidad de las Américas, Puebla Escuela de Ciencias Sociales Departamento de Relaciones Internacionales e Historia. Sánchez L.A. 1985. Plan de Desarrollo de la Agroindustria Mezcalera en el Estado de Oaxaca. ITO. Oaxaca, México. Pp. 97-123. Sánchez-Marroquin A, Hope P.H. 1953. Agave juice fermentation and chemical composition studies of some species, Journal of Agricultural and Food Chemistry 3:146-249.
132 Scannell D.R, Zill O.A, Rokas A, Payen C, Dunham M.J, Eisen M.B, Rine J, Johnston M, Hittinger C.T. 2011 The Awesome Power of Yeast Evolutionary Genetics: New Genome Sequences and Strain Resources for the Saccharomyces sensustricto Genus. Genes Genomes Genetics. 1:11-25. Serra A, Strehaiano P, Taillander P. 2006. Influence of temperature and pH on Saccharomyces bayanus var. uvarum growth; impact of wine yeast interspecific hybridization on these parameters. Food Microbiology 95-100. Sims I.M, Cairns A.J, Furneaux R.H. 2001. Structure of fructans from excised leaves of New Zealand flax. Phytochemistry 57:661-668. Suarez Valles B, Pando Bedriñana R, González García A, Querol Simón A. 2006. Molecular genetic study of natural strains of Saccharomyces isolated from Asturian cider fermentations. Journal of Applied Microbiology 1364-5072. Taillander P, Portugal F, Fuster A, Strehaiaho P. 2006. Effect of ammonium concentration on alcoholic fermentation kinetics by wine yeast for high sugar content. Food Microbiology 24: 95-100. Terán S.U, Santiago-Rivera L, Vera-Guzmán A, Bautista P.B, López-Pérez M.G, SantiagoGarcía P. 2002. Estudio comparativo de la fermentación natural e inducida del mosto de agave (Agave angustifolia Haw), en la elaboración tradicional del mezcal. Memorias del Segundo Foro de la Agroindustria del Mezcal. Oaxaca, Oaxaca. Thomas D.S, Hossack J.A, Rose A.H., 1978. Plasma-membrane lipid composition and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae. Archives of Microbiology. 117:239245. Torija M.J, Rozes N, Poblet M, Guillamon J.M, Mas A. 2003. Effects of fermentation temperature on the strain population of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology 80: 47–53. Treviño Garza E.J, Muñoz R.C.A, Barajas Chávez L. 2002. Evaluación del flujo hídrico superficial en
la Sierra de San Carlos, Tamaulipas. Ciencia UANL, octubre-
diciembre, vol. V, numero 004, Universidad Autónoma de Nuevo León, Monterrey, México. Pp.525-530.
133 Tung K.S, Norbeck L.I, Nolan S.L, Atkinson N.S, Hopper A.K. 1992. SRN1, a yeast gene involved in RNA processing, is identical to HEX2IREG1, a negative regulator in glucose repression. Molecular and Cellular Biology. Pp. 2673-2680. Vallier L.G, Coons D, Bissont L.F, Carbon M. 1994. Altered regulatory responses to glucose are associated with a glucose transport defect in grl mutants of Saccharomyces cerevisiae. Genetics 136:1279-1285. Vasserot Y, Morneta F, Jeandeta P. 2010. Acetic acid removal by Saccharomyces cerevisiae during fermentation in oenological conditions. Metabolic consequences. Food Chemistry. 119:1220-1223. Vera Guzmán A.M, Santiago García P.A, López G.M. 2009. Compuestos volátiles aromáticos generados durante la elaboración de mezcal de Agave angustifolia y Agave potatorum. Revista Fitotecnica Mexicana 32(4): 273-279. Verma M, Bhat P.J, Venkatesh K.V. 2005. Steady-state analysis of glucose repression reveals hierarchical expression of proteins under Mig1p control in Saccharomyces cerevisiae. Biochemical Journal 388: 843–849. Wang SA. Bai FY. 2008. Saccharomyces arboricolus sp. nov., a yeast species from tree bark. International Journal of Systematic Evolutionary Microbiology 58: 510–514. Watson A.D, Edmondson D.G, Bone J.R, Mukai Y, Yu Y, Du W, Stillman D.J, Roth S.Y. 2000. Ssn6-Tup1 interacts with class I histone deacetylases required for repression. Genes and Development 14(21): 2737-44. Westergaard S.L, Oliveira A.P, Bro C, Olsson L, Nielsen J. 2007. A systems biology approach to study glucose repression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biotechnology and Bioengineering. 1;96(1):134-145. White T.J, Bruns T, Lee S, Taylor J. 1990. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In PCR Protocols: a Guide to Methods and Applications, pp. 129-141. Edited by M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. S. Sninsky&T. J. White. Academic Press: New York. Yin Z, Wilson S, Hauser N, Tournu H, Hoheisel J.D, Brown A. 2003. Glucose triggers different global responses in yeast, depending on the strength of the signal, and transiently stabilizes ribosomal protein mRNAs. Molecular Microbiology. 48(3): 713–724.
134 Zhang Z, Reese JC. 2004. Redundant mechanisms are used by Ssn6-Tup1 in repressing chromosomal gene transcription in Saccharomyces cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry 279(38): 39240-39250. Zizumbo-Villarreal D, Colunga-García Marín P. 2008. Early coconut distillation and the origins of mezcal and tequila spirits in west-central Mexico. Genetics Resources and Crop Evolution 55(4): 493-510. Zuzuarregui A, Del Olmo M. 2004. Analyses of stress resistance under laboratory conditions constitute a suitable criterion for wine yeast selection. Antonie van Leeuwenhoek 85, 271–280.
135
12 RESUMEN BIOGRÁFICO
Amanda Alejandra Oliva Hernández Candidata para el Grado de Doctor en Ciencias Tesis:
EVALUACIÓN
CINÉTICA
Y
MOLECULAR
DE
LEVADURAS
FRUCTOFÍLICAS AISLADAS DE MEZCAL TAMAULIPECO Campo de Estudio: Biotecnología con acentuación en Microbiología Datos Personales: Nacida en Reynosa, Tamaulipas el 3 de Mayo de 1968, hija de Amanda Leticia Hernández Monreal y Gerardo Enrique Oliva Guzmán Educación: Egresada del Tecnológico de Estudios Superiores de Monterrey, grado obtenido Ingeniera Agrónoma en Producción en 1993. Egresada de la Universidad Autónoma de Tamaulipas, grado obtenido Maestra en Ciencia y Tecnología de Alimentos en 2007. Experiencia Profesional: Puesto de Profesor Asociado “C” de Tiempo Completo en el Instituto Politécnico Nacional, desde el 2003, asociada de investigación en el Laboratorio de Biotecnología Industrial (CBG-IPN).
PRODUCTIVIDAD Presentaciones orales en congresos nacionales e internacionales De la Torre F. J., Guido N., Oliva-Hernández A., Narváez-Zapata José A. y LarraldeCorona P. (2010) Monitoreo por técnicas moleculares (FISH y ARISA) de un cultivo mixto de levaduras durante la fermentación del mosto de agave. 7 Encuentro Nacional de Biotecnología del IPN. 11 al 13 de Octubre 2010. Mazatlán, Sinaloa.
136 De la Torre- González F, Tarqui-Callejas N., Oliva-Hernández A., Narváez-Zapata J., Larralde-Corona P. 2012. Determinación de la Tolerancia de Tres Especies de Levaduras Aisladas del Mezcal Tamaulipeco. VII Congreso Nacional y XXVIII Internacional de Ingeniería Bioquímica.. 28, 29 y 30 de Marzo. Ixtapa Zihuatanejo, Guerrero, México.
Artículos científicos indexados Amanda A. Oliva Hernández, Patricia Taillandier, Diana Reséndez Pérez, José A. Narváez Zapata, Claudia Patricia Larralde Corona. The effect of hexose ratios on metabolite production of Saccharomyces cerevisiae strains obtained from the spontaneous fermentation of mezcal. En prensa: Antonie van Leeuwenhoek Journal of Microbiology, DOI 10.1007/s10482-012-9865-1 Flores-Magallón R., Oliva-Hernández A.A., Narváez-Zapata J.A. (2011). Characterization of microbial traits involved with the elaboration of the Cotija cheese. Food Science and Biotechnology 20(4): 997-1003. Larralde-Corona C.P., Ramírez-Gonzalez S., Oliva-Hernández A., Pérez-Sánchez G. Narváez-Zapata J.A. (2011). Identification of differentially expressed genes in the citrus epiphytic-yeast Pichia guilliermondii during interaction with Penicillium digitatum. Biological Control 57: 208-214. Reyes-López, M. A., Salazar-Marroquín, E. L., Oliva-Hernández, A. A., Salinas-López, N., Narváez-Zapata, J. A. (2009) White-spot syndrome virus diagnostic in frozen shrimp stocks imported to Mexico. CyTA Journal of Food 7: 89-94.
Capítulos en libros institucionales Arratia-Mireles J. M., Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernández A. A., Narváez-Zapata J.A. (2009) Estudio de la diversidad de levaduras asociadas a los mostos de mezcal. En: Avances en el Estudio de la Biotecnología. Narváez Zapata J. A., VillegasHernández M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politécnico. 2009. ISBN: 978607-414-060-6. pp: 42-45. Oliva-Hernández A. A, Narváez-Zapata J.A., Resendez D., Taillander P., LarraldeCorona C.P. (2009) Evaluación de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal tamaulipeco. En: Avances en el Estudio de la Biotecnología. Narváez Zapata J. A., Villegas-Hernández M. C. & Mendoza Herrera A. Editorial Politécnico. 2009. ISBN: 978-607-414-060-6. pp: 191-194. Posters en congresos nacionales e internacionales
137
Larralde-Corona C.P., Oliva-Hernández A.A., Narváez-Zapata J.A., Resendez-Pérez D. y Taillander P. 2009. Caracterización productiva de levaduras fructofílicas aisladas del mezcal Tamaulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnología y Bioingeniería y el VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, México. Poster Arratia-Mireles M., Oliva-Hernández A., De la Torre-González F., Trujillo-Negreros E., Narváez-Zapata J.A. y Larrralde-Corona C.P. (2009). Diversidad genética y capacidad fermentativa de levaduras involucradas en la producción del mezcal tamulipeco. XIII Congreso nacional de Biotecnología y Bioingeniería y el VII Simposio Internacional de Producción de Alcoholes y Levaduras (SIPAL). Del 21 al 26 de Junio. Acapulco, Guerrero, México. Oliva Amanda, Narváez José, Resendez Diana, Strehaiano Pierre, Taillandier Patricia, Larralde Patricia. 2009. Mezcal fermentation: yeast diversity and their productive characterization on high fructose synthetic medium and Agave must. 27th International Specialised Symposium on Yeasts. Institut Pasteur. Paris, France. De la Torre-González F. J., Narváez-Zapata José A., Oliva-Hernández A. y LarraldeCorona C.P. 2010 Caracterización de la cinética de cultivos mixtos de levaduras aisladas del mezcal Tamaulipeco. XXXVII Congreso Nacional de Microbiología. 29 de junio al 2 de Julio. Morelia, Michoacán. México Oliva-Hernández A., Resendez D., Taillandier P., Narváez-Zapata J., Larralde-Corona C.P. 2011. Fructose utilization by yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. México Narváez-Zapata J., Segura-Cabrera A., Oliva-Hernández A., Larralde-Corona C.P. 2011. Predictive homoplasic sites in HXT1 and HXT3 transporters related to fructophilic profiles in yeasts isolated from agave must. 29th International Specialised Symposium on Yeasts. Guadalajara, Jalisco. México..
Estancias de investigación Estancia de Investigación de 3 meses en "Laboratoire de Génie Chimique UMR CNRS 5503" . INP-Toulouse, Francia. 2007. Estancia de Investigación de 3 meses en "Laboratoire de Génie Chimique UMR CNRS 5503". INP-Toulouse, Francia. 2009.
138
Résumé Au Mexique l’état de Tamaulipas est susceptible de devenir l'un des plus grands producteurs de mezcal. Contrairement à d’autres boissons alcoolisées, la mycoflore responsable de la fermentation alcoolique du mezcal n'a pas été pleinement identifiée ou caractérisée métaboliquement. Il est d'un grand intérêt industriel de savoir si les levures indigènes impliquées dans la fermentation de moûts d’agave ont une forte nature fructophilique qui serait induite par la composition naturelle riche en fructose du moût. De plus, la caractérisation cinétique des levures et au niveau moléculaire des transporteurs impliqués dans la consommation de fructose par cette flore est pertinente étant donné que des études sur l'utilisation des hexoses par Saccharomyces cerevisiae n’ont pas montré que les transporteurs de glucose et de fructose étaient différents. Dans ce travail, la population levurienne étudiée était de 17 isolats, à partir de 103 initialement isolés de la mezcaleria "El Palmar" Emilio Lozoya, situé à San Carlos (Tamaulipas, Mexique) au niveau de différentes étapes. Seules les levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae ont été retenues et étudiées. En particulier de polymorphismes des 2 gènes des transporteurs principaux de sucres associes au fructose consume HXT1 et HXT3, a été évalué en comparaison à une souche de référence. Les résultats obtenus dans cette étude suggèrent la nécessité d'une analyse approfondie afin de préciser les liens entre la fructophilie et l'expression et / ou la structure des gènes des transporteurs de sucres lors de la fermentation alcoolique. Mots clés: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, transporteurs d’hexoses HXT, fructophile, fermentation alcoolique
Abstract The Mexican state of Tamaulipas has the potential to become one of the main producers of mezcal. But contrary to what is known about other alcoholic beverages, the mycoflora involved in this alcoholic fermentation has not been completely identified nor characterised from the metabolic point of view. There is an increasing industrial interest on knowing if the native yeasts associated to agave must fermentations possess a fructophilic behaviour, favoured by the natural high fructose composition of the agave musts. Moreover, the kinetic characterisation of these yeasts and the molecular analysis carried out on the hexose transporters genes reported to be involved in the glucose and fructose consumption is pertinent, and several studies on Saccharomyces cerevisiae have demonstrated a differential preference for each hexose. In this study, a set of 17 yeast isolates were chosen from an original collection of 103 yeast isolated at the mezcalería El Palmar Emilio Lozoya, which is located at San Carlos (Tamaulipas, Mexico) from different stages of the fermentation. Only those belonging to S. cerevisiae specie were studied, mainly concerning the polymorphisms found on their two main hexose transporter genes associated to a preferential consumption of fructose, HXT1 and HXT3, and results compared to a control strain. The results obtained showed that there is no a direct link between the fructophilic phenotype and/or the structure of these genes and that more studies are needed to establish such relationships. Keywords: Mezcal, Saccharomyces cerevisiae, hexose transporters HXT, fructophilic, alcoholic fermentation