RELACIÓN ENTRE LA TRISOMÍA 21, LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL GEN IFNAR1 EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA FRECUENCIA DE INFECCIONES SEVERAS EN NIÑOS DE 2 A 10 AÑOS CON SINDROME DE DOWN Y CONTROLES SANOS.

ANA MARÍA BOLÍVAR AGUILERA

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE BIOLOGIA BOGOTA D.C 2013

 

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RELACIÓN ENTRE LA TRISOMÍA 21, LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL GEN IFNAR1 EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA FRECUENCIA DE INFECCIONES SEVERAS EN NIÑOS DE 2 A 10 AÑOS CON SINDROME DE DOWN Y CONTROLES SANOS.

ANA MARÍA BOLÍVAR AGUILERA

___________________________ Decano Académico

_________________________ Director de Carrera

 

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RELACIÓN ENTRE LA TRISOMÍA 21, LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DEL GEN IFNAR1 EN LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA Y LA FRECUENCIA DE INFECCIONES SEVERAS EN NIÑOS DE 2 A 10 AÑOS CON SINDROME DE DOWN Y CONTROLES SANOS.

ANA MARÍA BOLÍVAR AGUILERA

___________________________

_________________________

Juan Carlos Prieto Rivera

Paola Ayala

Director de Trabajo de Grado

Jurado de Trabajo de Grado

 

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NOTA DE ADVERTENCIA

Artículo 23, Resolución No 13 de Julio de 1946

“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y por qué las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

 

5   1. RESUMEN

El Síndrome de Down (SD) o la trisomía del cromosoma 21 es la principal causa, a nivel genético, de discapacidad intelectual. La mayoría de los millones de pacientes con esta condición, que se distribuyen por el mundo, padecen una gran variedad de problemas de salud, incluyendo defectos cardiacos congénitos, desordenes hematopoyéticos, principios de la enfermedad del Alzheimer y suelen poseer un sistema inmune deficiente con alta incidencia a desarrollar infecciones. De acuerdo a estudios realizados sobre éste síndrome, se conoce la presencia de la Región Critica del Síndrome de Down, que se ubica entre 21q22.3 y 21q22.2, y se caracteriza por ser la región que al estar triplicada, incluso en trisomías parciales del cromosoma, permitirá el desarrollo del fenotipo característico de SD. La tendencia con la que se desarrollan dichas infecciones podría estar explicada por alteraciones a nivel inmunológico, que se derivan de la presencia de un tercer cromosoma 21. Con base en esto, el presente estudio se enfoca en la subunidad 1 del receptor para el interferón alfa (IFNAR1), cuyo gen se ubica en 21q22.1 sobre el cromosoma 21, es una proteína que se expresa en la superficie de aproximadamente todas las células del cuerpo y está involucrada en la respuesta inmune cumpliendo la función de activar la transcripción de varios genes que hacen parte de la inmunidad contra patógenos. Pero, a pesar de que este gen no se ubica en la Región Critica mencionada anteriormente, se ha considerado como un gen sensible a la dosis génica. Aunque se han realizado varios estudios con el fin de definir los genes involucrados y causantes de los rasgos fenotípicos característicos de SD (entre ellos la tendencia a desarrollar infecciones) los resultados no son satisfactorios y se presenta dificultad debido a la gran complejidad de procesos genéticos y la alta variabilidad que se da a nivel fenotípico entre los individuos de esta población. A pesar de todo el progreso alcanzado, incluso con modelos en ratones con Síndrome de Down, aún está presente la necesidad de un mejor entendimiento sobre el funcionamiento de las células y el desarrollo de la patología del Síndrome de Down. Con base en esto, el objetivo del presente proyecto fue comparar los niveles de transcripción del gen IFNAR1 entre niños de 2-10 años con Síndrome de Down y niños sanos a través de un estudio en el que se midieron los niveles de mRNA de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica por medio de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para compararlos entre sí, y luego

 

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correlacionarlos con los niveles de expresión proteica del mismo IFNAR1 y con la frecuencia de infecciones severas en la población a estudiar. Los resultados muestran que la presencia de un tercer cromosoma 21 genera una disminución del número de copias del gen IFNAR1 con respecto a los individuos euploides,. Además, se observa una tendencia a que con la disminución del número de copias se disminuye la expresión proteica de la molécula IFNAR1. Se encontró también que existe una correlación inversa entre el número de copias del gen IFNAR1 y la frecuencia de infecciones severas, lo cual consiste con los reportes de deficiencia en la respuesta inmune en individuos con SD.

2. INTRODUCCIÓN El Síndrome de Down (SD) es la anomalía más común en seres humanos. Las personas que lo padecen presentan características faciales típicas, deterioro cognitivo, malformaciones cardiacas congénitas, gastrointestinales y alteraciones

debidas al deterioro y mal funcionamiento del

sistema inmune. Esta última característica resulta en un alto nivel de riesgo a desarrollar infecciones virales y una baja tasa de respuesta a la acción de las vacunas. Se presenta desde el desarrollo temprano del sistema inmune de los individuos y tiende a incrementarse a medida que crecen (Lin et al. 2001), constituyendo aun la mayor causa de muerte en esta población (Philip et al. 1986) (Elsayed &Elsayes 2009). Aunque aún no hay un entendimiento claro de la causa de dicha susceptibilidad a infecciones, algunos estudios a nivel mundial revelan que existen diferencias entre características del sistema inmune de pacientes con Síndrome de Down cuando estos se comparan con controles sanos. Algunas de estas diferencias son la proporción de linfocitos CD8 + l, la cual se incrementa en pacientes con SD; la proporción de linfocitos CD4 +, que por el contrario, disminuye en individuos con SD (Lin et al. 2001). Además, se presenta una marcada reducción linfoide y anormalidades en el funcionamiento de los linfocitos T en SD (Philip et al. 1986), así como un incremento temprano de células apoptóticas, especialmente células T (Elsayed &Elsayes 2009). Sin embargo, otros estudios revelan que en SD hay un comportamiento normal del sistema inmune en comparación con controles sanos, generando un conflicto entre los datos que cada estudio revela.

 

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Según Ferreira et al. (2004), hay estudios que no demuestran ninguna diferencia del sistema inmune entre individuos con SD y controles sanos, en cuanto a la respuesta de anticuerpos a proteínas virales antígenas. También explica que la falta de acuerdo entre los diferentes resultados está dada por la edad de los sujetos que participan en cada uno de ellos, pues por ejemplo Bertotto et al (1987) encontraron que la respuesta proliferativa de los linfocitos es normal durante los primeros 10 años pero se reduce rápidamente e irreversiblemente después de ésta edad. A nivel molecular se asume que al haber una tercera copia del cromosoma 21, la dosis génica, de los genes que allí se ubican, se incrementa en un 50% más que la dosis normal. Aun así, esta hipótesis no se ha comprobado hasta el momento pues de igual manera los resultados de diferentes estudios se contradicen y se dificulta obtener una conclusión concreta y definitiva debido a que existen muchos factores que influyen en la vida media del mRNA dependiendo de cada gen (Kahlem et al. 2004). De este modo, se entiende que se requiere más información para ampliar el conocimiento sobre la inmunodeficiencia y la influencia de una tercera copia del cromosoma 21 sobre la dosis génica. Para esto, se eligió al gen IFNAR1, el cual puede cumplir un papel importante en el desarrollo de infecciones, pues codifica la expresión de la subunidad 1 del receptor alfa, proteína que se expresa en la superficie de aproximadamente todas las células del cuerpo y está involucrada en la respuesta inmune cumpliendo la función de unirse al interferón alfa mediante dominios proteicos que activan la cascada de señalización JAK-STAT para activar la transcripción de varios genes involucrados en el sistema inmune, cuando se detecta la presencia de algún patógeno (Stark, et al. 1998). Se evaluaron los niveles de mRNA en leucocitos de sangre periférica, en 10 niños de 2 a 10 años con Síndrome de Down y 10 controles sanos en el mismo rango de edad, mediante qPCR. Una vez se obtuvieron estos resultados se realizó un estudio de correlación con los niveles de expresión a nivel proteico de IFNAR1 en leucocitos y la frecuencia de infecciones severas de los mismos individuos. Lo anterior tuvo como finalidad aportar información clave para mejorar el entendimiento sobre la susceptibilidad de los niños con SD a desarrollar infecciones. Con el presente estudio se encontró una disminución en los niveles de mRNA del gen IFNAR1 cuando hay presencia de un tercer cromosoma 21. Por otro lado, se observó que puede haber una tendencia a que a mayor número de copias del gen se encuentra una mayor expresión de la proteína expresada en leucocitos de sangre periférica. Además existe una correlación en la que

 

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los niveles de transcritos del gen IFNAR1 es inversamente proporcional a la frecuencia de infecciones, lo cual soporta las deficiencias en el sistema inmune de los individuos con SD.

3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA El Síndrome de Down (SD) es la patología cromosómica más frecuente en niños recién nacidos. Afecta a más de 1 individuo de cada 700 recién nacidos en el mundo. Aunque la expectativa de vida de las personas con esta condición ha incrementado significativamente en los últimos años (con un promedio de vida mayor a 55 años), aún se mantiene una tasa alta de mortalidad por infecciones dada por la susceptibilidad a desarrollarlas. (Bloemers, et al. 2010; Bittles, et al. 2002). En los últimos 30-40 años han sido realizados una gran variedad de estudios enfocados en el sistema inmune de pacientes con SD, con el fin de clarificar los problemas clínicos y sus causas. Aun así los estudios enfatizados en la respuesta inmune innata, la cual juega un papel muy importante en el ataque a microorganismos, son muy escasos (Bloemers, et al. 2010). En el cromosoma 21 se encuentran los genes que codifican para las subunidades 1 y 2 de los receptores de los interferones alfa y beta, los cuales se unen a los interferones tipo I durante la respuesta inmune innata . Teniendo en cuenta que en individuos con SD se presenta una trisomía del cromosoma 21, se esperaría que la copia supernumeraria genere un incremento del 50% en todos los niveles de transcritos de los genes ubicados allí y por esto una mayor sensibilidad del ataque antiviral de los interferones (Bloemers, et al. 2010 ; Prandini, et al. 2007) . Aun así, mientras unos estudios a nivel de expresión proteica han demostrado que las células de individuos con SD son hipersensibles a los efectos anticelulares de los IFNs (Iwamoto, et al. 2009), otros estudios demuestran que hay una habilidad reducida para responder a agentes infecciosos en niños con esta condición. Estos resultados contradictorios pueden deberse a que los estudios realizados sobre este aspecto presentan inconvenientes en cuanto a la edad de los pacientes, el número reducido de la muestra y las técnicas utilizadas para separar las poblaciones celulares (Bloemers, et al. 2010). Sin embargo, la mayoría de estudios se enfocan en estudiar estos casos solo a nivel de expresión

 

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proteica, dejando atrás los estudios moleculares a nivel de transcripción de genes involucrados como IFNAR1 IFNAR2, IFNGR2, y IL10Rb, ubicados en el cromosoma 21, lo cual podría estar muy relacionado con estas características fenotípicas del sistema inmune de niños con SD. Según Prandini, et al. (2007), estudios recientes muestran que no siempre hay una correlación directa entre el desbalance genómico y los niveles de transcritos del segmento aneuploide, sugiriendo que existen mecanismos complejos de regulación de la transcripción, entre los que se encuentran elementos cis o trans regulando genes individuales y generando una variación de expresión génica que difiere en cada individuo con SD y genera, por lo tanto, diferencias en las características fenotípicas de cada uno de ellos. Con base en lo anterior, es posible decir que aunque se han realizado varios estudios para esclarecer el comportamiento del sistema inmune en niños con SD, aún falta evidencia definitiva y precisa que permita establecer si es el funcionamiento de este sistema, junto con la trisomía 21 la causa o la consecuencia del nivel de mortalidad en la población (Bloemers, et al. 2010). Por lo tanto, con el fin de aportar información clave para responder a dichas incógnitas, que aún existen con respecto a las deficiencias en la respuesta inmune de niños con SD, el proyecto tiene el propósito de establecer sí existen diferencias, para el año 2013, entre los niveles de transcritos de mRNA del gen IFNAR1 presentes en leucocitos en niños entre 2 y 10 años con SD y niños sanos; así como la relación de éstos con los niveles de expresión proteica del receptor 1 para el interferón alfa en leucocitos y la frecuencia de infecciones severas. Una vez se logre entender con más precisión el comportamiento del sistema inmune en niños con SD, se podrá contribuir a identificar marcadores de susceptibilidad asociados a la inmunodeficiencia o autoinmunidad que se presenta en estos niños y proceder a establecer tratamientos que contribuyan a aumentar su expectativa de vida aún más o mejorar su calidad de vida, superando las infecciones con más facilidad o incluso previniéndolas.

4. MARCO TEORICO El Síndrome de Down es la manifestación fenotípica de la presencia de una tercera copia del cromosoma 21 debido a un error en la división celular, más específicamente un error en la segregación de cromosomas homólogos durante la primera división meiótica conocida como

 

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evento de no disyunción, la cual se puede dar ya sea como un cromosoma libre extra, como parte de una fusión cromosómica robertsoniana o en raros casos, como una translocación recíproca (Hassold & Hunt 2001). Normalmente, todas las células del cuerpo son trisómicas aunque se han dado pocos casos de mosaicismo en el que el individuo presenta células diploides y células trisómicas suficientes para manifestar el fenotipo de esta condición (Epstein 2011 ; Tanaka, et al. 2012). Estadísticamente, el SD se presenta en 1 de cada 700 recién nacidos (Rachidi & Lopes 2008), representando el 8% de la población con anomalías congénitas en Europa (Bloemers, et al. 2010). En Colombia se reporta una incidencia de 15,8 por cada 1000 nacidos vivos (1/633) (Nazer 2011 ; Valencia, et al. 2008; Zarante, López & Fernández 2010). Estudios clínicos y citogenéticos de personas que padecen SD dan a comprender que dicho síndrome puede ser causado por una trisomía parcial o completa del cromosoma 21, dejando claro que no hay una sola región cromosomal responsable de todos los rasgos fenotípicos que se dan en estos pacientes. Sin embargo, estudios, de pacientes cuyos cariotipos muestran una trisomía parcial del cromosoma 21, han revelado que la región cromosomal de 5-10 Mb, ubicada en la parte distal del brazo largo, que va desde 21q22.2-21q22.3 está asociada con muchos de los rasgos fenotípicos de pacientes con SD. Esta región se conoce con el nombre de Región Critica de Síndrome de Down (siglas en ingles DSCR) y los genes que aquí se ubican, contribuyen en gran medida a la variabilidad de dichos rasgos fenotípicos (Vesa et. al 2005; Rachidi & Lopes 2008). Las personas con SD se caracterizan por una gran variedad de rasgos dimórficos y malformaciones congénitas, entre las que se encuentran malformaciones cardiacas y gastrointestinales, déficit cognitivo, rasgos faciales característicos. Además, se ha encontrado una fuerte asociación entre un sistema inmune aberrante, casos de leucemia y enfermedades autoinmunes como hipotiroidismo, enfermedad celiaca y diabetes mellitas de tipo I, con la presencia del tercer cromosoma 21; así como una alta frecuencia de infecciones, principalmente en el tracto respiratorio (la cual se considera como la causa más importante de la morbimortalidad de los niños), así como en el área de los oídos, garganta y nariz; deficiencia de la respuesta frente a antígenos vacunales, deficiencia en la cicatrización de heridas,

(Bloemers, et al. 2010;

Iwamoto, et al. 2009 ; Wiseman, et al. 2009; Kuster et al. 2009). Estas infecciones suelen ser consecuencia de la presencia de microorganismos, y para la defensa contra estos, la inmunidad innata juega un papel muy importante. Aun así, sobre este tema aún

 

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hay muy poca información científica precisa. A la fecha se sabe que hay una reducción en el número de linfocitos T, células NK, CD16+ y CD56+ en individuos con SD en comparación con controles sanos (Bloemers, et al. 2010; Kuster et al. 2009). Además, la migración quemotáctica de leucocitos polimorfonucleares y fagocitos mononucleares es reducida, así como la habilidad fagocítica y adhesividad de los neutrófilos en sangre periférica. También hay estudios que demuestran una producción menor de interferones por los linfocitos (Bloemers, et al. 2010). Como parte de la respuesta inmunológica a presencia de patógenos, está la actividad de los interferones, una gran familia de citoquinas cuya producción se activa como respuesta a la detección de patógenos por parte del sistema inmune innato y su función tiene efectos antivirales, antitumorales, antiproliferativas e innmunomodulatorias (Theofilopoulos A et al. 2005). Los interferones tipo I, producidos en respuesta al presencia de infecciones virales, promueven un estado virus-resistente en las células y ayudan al sistema inmune a detectar y eliminar los virus y las células infectadas. Todas estas actividades son mediadas por la interacción entre estos interferones y los complejos receptores de los mismos, también conocidos como Receptores de IFN-a. Estos últimos están presentes en aproximadamente todas las células del cuerpo (Krause et al. 2013 ; Tanaka, et al. 2012). Los interferones, de tipo I, alfa/beta pueden ser producidos por cualquier célula y actúan bajo una señalización que involucra cinco grandes pasos, como se observa en la Figura 1: Se inicia con la llegada del interferón a la célula infectada, lo cual genera la dimerización del receptor del interferón, este último se divide en dos subunidades proteicas, IFNAR1 e IFNAR2 (Stark, et al. 1998). Con la dimerización se activa una cascada de fosforilación de tirosina dentro de la célula que resulta en la dimerización de las proteínas STATs fosforiladas, lo cual permite el transporte de las mismas hacia el núcleo celular donde se unen a secuencias de DNA específicas, estimulando la transcripción de genes que codifican proteínas especializadas en el ataque al patógeno causante de la infección (Stark, et al. 1998 ; Negrotto, et al. 2011; Theofilopoulos et al. 2005). Los productos de estos genes suprimen la propagación de algunos patógenos y cooperan con la citoquinas en las células dendríticas para promover la presentación de antígenos (Qian, et al. 2011). También tienen funciones para inhibir crecimiento celular y controlar la apoptosis, muy importantes a la hora de combatir cáncer e infecciones (Stark, et al. 1998).

 

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Figura 1. . Cascada de señalización desencadenada por la unión del IFN alfa o beta con el receptor. Tomada de Stark, et al. 1998   El gen IFNAR1 se ubica en 21q22.1, está compuesto por 11 exones y cubre una región de 32,9 Kb sobre el cromosoma 21 (Thomas, et al. 2011). Al haber una tercera copia del cromosoma 21 se genera una sobredosis de la expresión de los genes presentes en este cromosoma y para explicar la patogénesis que se genera a partir de esto, se han planteado dos hipótesis (Rachidi and Lopes 2008). La primera, conocida como la Hipótesis del efecto de la dosis génica, sostiene que el fenotipo es resultado directo de los efectos acumulados del desbalance del gen individual localizado en oflathezona triplicada del reproduction cromosoma, es decir un grupo Reproduced with permission copyright owner. Further prohibited without que permission.

pequeño de genes es

directamente responsable de los rasgos patológicos particulares asociados a la trisomía 21 (Rachidi and Lopes 2008 ; Yahya-Graison, et al. 2007). La segunda hipótesis llamada Hipótesis de la Inestabilidad amplificada del desarrollo, establece que lo dosis desbalanceada de cientos de genes ubicados en el cromosoma 21, determina una alteración no especifica de la regulación y expresión genómica, alterando un desarrollo normal de la homeostasis y determinando la mayoría

 

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de los rasgos y manifestaciones del SD. Sin embargo, aún no se ha aceptado ninguna de estas hipótesis como única y verdadera (Rachidi and Lopes 2008 ; Yahya-Graison, et al. 2007). Aunque el gen IFNAR1 no se ubica dentro la Región Critica de Síndrome de Down (mencionada previamente), varios estudios de mapeo cromosómico, entre los que están los de Wiseman, et al. (2009), revelan que los genes del cromosoma 21 con trisomía, se dividen en genes sensibles a la dosis génica y genes insensibles a la dosis génica. Dependiendo de los genes sensibles a la dosis, el fenotipo puede ser alterado de diferentes maneras. En el caso de IFNAR1, este se considera junto con otros genes como un gen sensible a la dosis génica. Meguid, et al. (2004) y Burgio, et al. (1975), también proponen que este gen es sensible a la dosis luego de emplear 14 líneas celulares linfoblásticas y 17 líneas de fibroblastos de individuos con SD, sobre las que analizan la expresión de varios genes, entre estos el gen IFNAR1, mediante RT-PCR cuantitativa para al final obtener que este gen muestra una sobre-expresión constante en pacientes con SD, con respecto a controles sanos, así que se consideró como un gen que puede inducir algún fenotipo constante en SD. Por otro lado, Yahya-Graison, et al. (2007) logrò clasificar, en cuatro clases, los genes ubicados en el cromosoma 21, de acuerdo a su expresion en individuos con SD con respecto a controles. La clase I contiene 30 genes con una proporcion de expresion SD/controles de 1.5. Estos 30 genes podrian considerarse como responsables del fenotipo observado en SD ya sea de forma directa o indirecta. La clase II contiene 9 genes con una proporcion de expresion SD/controles mayor al 1.64, la clase III contiene 77 genes con una proporcion SD/controles menor a 1.4, los cuales se cree que son compensados en SD. La clase IV contiene 15 genes con una proporcion entre 1 y 1.5 y son altamente variables entre individuos. El gen IFNAR1, fue clasificado como un gen de clase I, lo cual indica al igual que el resto de estudios mencionados, que su expresion se ve afectada por la trisomia 21 y a su vez afecta el fenotipo de los individios con SD de algun modo (Yahya-Graison, et al. 2007). En Colombia, en el Instituto de Genética Humana de la Facultad de Medicina de la Universidad Pontificia Universidad Javeriana de Bogotá, se llevó a cabo el proyecto “Respuesta inmune en niños con Síndrome de Down” en el que hasta el momento se ha evaluado la expresión proteica de las moléculas CD18, ICOSL, IFNAR1 e IFNGR2 en pacientes con SD y controles sanos pareados por edad, utilizando citometría de flujo multiparamétrica. Los hallazgos más relevantes, encontrados por Martínez (2012) fueron la disminución de basófilos y de LTCD4+ en los individuos con SD, lo cual lo asocian con el desarrollo de enfermedades autoinmunes. Además,

 

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en SD se encontró disminución en el número de monocitos IFNAR1+ e IFNGR2+ cuando la edad de los pacientes era de 10-16 años lo cual lo asocian con la incidencia de infecciones y enfermedades autoinmunes de los pacientes. De acuerdo con estos resultados, en este proyecto plantean la necesidad de la búsqueda de correlaciones claras entre variables de laboratorio (entre las que podrían estar incluidas variables enfocadas en la parte molecular) y variables clínicas. De esta manera el presente trabajo será desarrollado bajo el marco de “Respuesta inmune en niños con Síndrome de Down”, buscando correlaciones entre los niveles de transcritos del gen IFNAR1, los niveles de expresión a nivel de proteína del mismo y la frecuencia de infecciones severa en niños con SD y niños sanos utilizando los datos obtenidos previamente de las dos últimas variables mencionadas.

5. OBJETIVOS 5.1 Objetivo General Ampliar el conocimiento sobre el comportamiento del gen IFNAR1 en el sistema inmune de niños de 2 a 10 años con Síndrome de Down 5.2 Objetivos específicos Comparar los niveles de mRNA del gen IFNAR1 entre niños de 2-10 años con Síndrome de Down y niños sanos en el mismo rango de edad. Correlacionar los niveles de transcripción del gen IFNAR1 en sangre periférica, con los niveles de expresión proteica del IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica en niños de 2-10 años con Síndrome de Down. Correlacionar los niveles de mRNA del gen IFNAR1 con la frecuencia de infecciones severas en niños de 2-10 años con Síndrome de Down y controles sanos.

 

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6. METODOLOGÍA El desarrollo del presente trabajo se realizó bajo el marco del proyecto “Respuesta inmune en niños con Síndrome de Down” que se lleva a cabo en el Instituto de Genética Humana de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Javeriana. Este tiene como objetivo la búsqueda de correlaciones entre hallazgos inmunológicos y problemas clínicos relacionados especialmente a infecciones y enfermedades autoinmunes. Las muestras de sangre fueron proporcionadas por el Instituto de Genética Humana de la Pontificia Universidad Javeriana y la Secretaria Distrital de Salud. Para el grupo de casos con SD se obtuvieron 10 muestras de sangre de pacientes entre 2-10 años con los siguientes criterios de inclusión: diagnóstico clínico y citogenético de SD, firma de consentimiento informado e información completa sobre los antecedentes clínicos. Los criterios de exclusión fueron: diagnostico de trisomía 21 por translocación o mosaico, edad superior a 10 años, estar participando en otro protocolo de investigación, presencia de enfermedades que pudieran afectar el sistema inmune como inmunodeficiencia por HIV y cáncer, tratamiento (mayor de 14 días) con fármacos inmuno-moduladores o administración de hemo-derivados. Para el grupo de controles se obtuvieron 10 muestras de sangre de niños entre 2 y 10 años con los siguientes criterios de inclusión: estado de salud normal valorado por el personal médico que participa en el estudio y firma del consentimiento informado. Los criterios de exclusión fueron los mismos que para el grupo de pacientes con SD. Al momento de la toma de muestra se excluyeron pacientes y controles que presentaran signos y síntomas de infección. Los niños, cuyos padres o acudientes aceptaron participar en el proyecto y firmaron un consentimiento informado, fueron evaluados por consulta genética para la evaluación fenotípica y confirmación del diagnostico mediante la solicitud del cariotipo bandeo R con una resolución de 400-800 bandas en linfocitos de sangre periférica. Este estudio fue conducido en conformidad con requerimientos locales y nacionales para la protección de los derechos y bienestar de los individuos que participan en investigaciones biomédicas. El protocolo fue aprobado por el comité de ética de la Pontifica Universidad

 

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Javeriana y el consentimiento informado fue obtenido de todos los acudientes de los individuos incluidos en la investigación. La extracción de RNA de cada muestra se realizó con el kit QIAamp RNA Blood MiniKit Cat. de Qiagen según el cual se debe mezclar, poner en hielo y centrifugar a 400xg por 10 minutos a 4°C, 1.5mL de la muestra de sangre con 7.5mL del buffer de lisis EL para la lisis de eritrocitos (Este paso se repite una vez). Una vez se tienen los leucocitos intactos, se procede a agregarles 600 µL de buffer RLT y mezclar por pipeteo para la lisis de los leucocitos. Esta mezcla se traslada a una columna de tapa violeta proporcionada por el kit y se centrifuga a 13200rpm durante 2 minutos, para la homogenización de la muestra. Luego se agrega 1 volumen de etanol al 70% para precipitar RNA y se traslada a una nueva columna de tapa transparente proporcionada por el kit, se centrifuga a 12000rpm por 30 segundos y se conserva el precipitado. Se le aplica el tratamiento de DNAsa I para eliminar el DNA que haya en la muestra agregando 80µL de la mezcla de DNAsa I al precipitado obtenido previamente y dejando esto reposar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Posterior a esto se le aplica al precipitado 350µL de buffer RW1 y se centrifuga a 12000rpm durante 15 segundos para purificar y lavar el RNA, luego se agrega 500µL de buffer RPE y se centrifuga a 13200rpm durante 3 minutos para eluir el RNA y se conserva en tubos eppendorf de 1.5mL mezclado con 50µL de RNAse free water a -80°C. Cada muestra de RNA fue cuantificada por espectrofotometría. Luego, a partir de 1µg de RNA, se sintetizó cDNA, utilizando el kit Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR de Invitrogen. De acuerdo a este, para cada muestra se debe generar una reaccion con 1µg de RNA, 1µL de dNTPs, 1µL de oligo(dT) como primers, 2µL de buffer RT, 4µL de Cloruro de magnesio, 2µL de DTT, 1µL de inhibidor de RNAsas y 1µL de SuperScript II RT, la retrotranscriptasa. La reacción, de acuerdo al manual del kit, se lleva a cabo a 42°C por 50 minutos seguido de 70°C durante 15 minutos y 37°C durante 20 minutos para luego almacenar a -80°C hasta su posterior uso. La PCR en tiempo real fue llevada a cabo utilizando los primers proporcionados por SABiosciencies de Qiagen con el nombre de RT2 qPCR Primer Assay for Human IFNAR1 (for 200 reactions) con número de catálogo PPH00869F y numero de acceso RefSeq NM_000629. Para la reacción se utilizó el termociclador en tiempo real LightCycler 1.5 de Roche con el kit Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG de Invitrogen, siguiendo cuidadosamente el manual proporcionado por este último. El protocolo a utilizar fue:

 

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1 ciclo de denaturación inicial a 95 °C por 10 minutos 45 ciclos de anillamiento con 95°C durante 15 segundos seguidos de 60°C durante 1 minuto y 5 segundos a 74ºC donde se tomaba la fluorescencia. 1 ciclo de para temperatura melting con 95ºC durante 1 minuto seguido de 60ºC durante 2 minutos y finalmente la toma de fluorescencia continua durante el paso de 60ºC a 95ºC. 1 ciclo de enfriamiento a 40ºC durante 50 segundos. La cuantificación fue llevada a cabo extrapolando los resultados de amplificación de cada muestra a una curva estándar con concentraciones conocidas de cDNA. Para esto se obtuvieron 30µL del producto amplificado del segmento de interés de IFNAR1. Esta cantidad se puso a correr en un gel de agarosa de bajo peso y se extrajo la banda única que posteriormente se purificó utilizando el kit Wizard SV gel and PCR-Clean Up System de Promega. Con el cDNA purificado se procedió a cuantificarlo y con el software DNA copy calculator de Illumina obtener el número de copias por microlitro en la muestra. A partir de esta se realizaron diluciones 10 a 10 con concentraciones conocidas que se utilizaron para la construcción de la curva estándar. Cada valor de Ct vs Log arrojado por las muestras de los casos con SD y los controles sanos se extrapoló con los valores obtenidos en la curva. Los resultados de niveles de expresión proteica de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica, obtenidos mediante citometría de flujo multiparametrica y la frecuencia de infecciones severas, basadas en el numero de hospitalizaciones por infecciones retrospectivas por año,

fueron

obtenidos previamente bajo el marco del proyecto “Respuesta Inmune en niños con Síndrome de Down” y fueron proporcionados al presente trabajo para realizar las correlaciones entre éstos y los niveles de transcritos del gen IFNAR1. Para los análisis estadísticos ser utilizó el programa GraphPad PRISM. Para el primer objetivo específico, se utilizó una prueba no paramétrica de U Mann Whitney,. Para los siguientes objetivos específicos se realizó una prueba de Spearman con el fin de medir la correlación entre los niveles de transcritos del gen IFNAR1 con los niveles de expresión de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica y con la frecuencia de infecciones severas. Para todas las pruebas se usó una significancia de valores p < 0.05.

 

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Se debe aclarar que el trabajo se realizó a ciegas hasta el momento del análisis estadístico, es decir que no se conocía el grupo al que pertenecía cada muestra durante el desarrollo del trabajo.

7. RESULTADOS 7.1 Extracción de RNA Se obtuvieron 10 muestras de RNA de pacientes con SD y 10 muestras de RNA de controles sanos. Todas fueron tratadas con DNAsas para eliminar la presencia de DNA genómico. Los resultados de las cuantificaciones por medio de espectrofotometría y de pureza se muestran en la tabla 1 y 2. Tabla 1. Resultado de cuantificación y medición de pureza de RNA total de muestras de pacientes con SD. Numero de muestra

Cantidad RNA

Pureza 260/280

220

33 ng / µL

1.68

116

32.3 ng / µL

2.05

148

56.4 ng / µL

1.99

135

77.2 ng / µL

1.9

207

106.5 ng / µL

1.98

181

50.2 ng / µL

2.06

194

52.8 ng / µL

1.98

123

43 ng / µL

1.89

193

28.25 ng / µL

2.08

196

36.73 ng / µL

2

Tabla 2. . Resultado de cuantificación y medición de pureza de RNA total de muestras de controles sanos. Numero de muestra

Cantidad RNA

Pureza 260/280

133

26.8 ng / µL

2.11

163

47 ng / µL

2

120

30.66 ng / µL

2.1

101

54.5 ng / µL

1.95

154

28 ng / µL

1.85

131

78.2 ng / µL

1.9

174

39.3 ng / µL

1.87

212

40.5 ng / µL

1.88

 

19   177

35.1 ng / µL

2.15

203

41.42 ng / µL

1.86

7.2 Síntesis de cDNA A partir del 1µg de cada muestra de RNA obtenidas anteriormente, mediante transcripción reversa, se obtuvo cDNA total de cada muestra. 7.3. Estandarización de la prueba de qPCR En la figura 1 se muestra el gel de poliacrilamida con el resultado del protocolo de amplificación por PCR convencional. Se observa una única banda de cDNA de 70bp (fragmento IFNAR1) con temperaturas de anillamiento desde 59 °C hasta 62°C,

A

B Figura 2. A. Gel de poliacrilamida con banda esperada clara que muestra la estandarización del protocolo. B. Marcador de peso molecular utilizado.

 

20  

7.4 Curva estándar en qPCR. Eficiencia: 2,01 R2: 0.98

Figura 3. Curva estándar con base a la cual se realizó la cuantificación absoluta. 7.5 Cuantificación absoluta de niveles de expresión de mRNA de muestras de pacientes con SD y controles sanos (Ver Fig 4. Y 5. En anexos). Tabla 3. Cuantificación Absoluta del número de copias/µl del gen IFNAR1 en niños sanos de 2 a 10 años de edad CONTROLES Nro muestra

Copias/µL 133 163 120 101 154 131 174 212 177 203

8.00E+09 5.00E+07 4.00E+08 1.00E+10 2.00E+09 1.00E+08 3.00E+09 1.00E+10 3.00E+05 7.00E+02

Promedio de expresión en controles: 4.192*109copias/µL Mediana de expresión en controles: 1.016*109copias/µL Desviación estándar de expresión en controles: 5.839*109 copias/µL

 

21  

Tabla 4. Cuantificación Absoluta del número de copias/µl del gen IFNAR1 en niños con SD de 2 a 10 años de edad CASOS CON SD Nro muestra

Copias/µL 220 116 148 135 207 181 194 123 193 196

2.00E+04 1.00E+04 3.00E+04 3.00E+02 2.00E+04 4.00E+03 9.00E+03 6.00E+03 4.00E+02 9.00E+02

Promedio de expresión en casos SD: 10000 copias/µL Mediana de expresión en casos SD: 7450 copias/µL Desviación estándar de expresión en casos SD: 10313 copias/µL 7.6 Test de U Mann Whitney para comparación entre la expresión del mRNA del gen IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica entre casos con SD y controles. Tabla 5. Prueba de U Mann Whitney para comparar la expresión del gen IFNAR1 entre controles y pacientes con SD. Mann Whitney test P value Exact or approximate P value?

0,0007 Exact

P value summary

***

Significantly different? (P < 0.05)

Yes

One- or two-tailed P value? Sum of ranks in column A,B

Two-tailed 147 , 63

 

22  

Mann-Whitney U

8

Existen diferencias significativas entre los niveles de mRNA de IFNAR1 del grupo de niños con SD y del grupo de controles. Los niños con SD tienen un promedio de número de copias/µL del gen E+05 veces menor que el promedio de número de copias/µL de los niños controles sanos.

7.7. Medida de la expresión proteica de IFNAR1 expresadas en: (Intensidad Media de Fluorescencia/   perlas calibradoras de fluorescencia) X 100 en leucocitos de sangre periférica

CONTROLES Tabla 6. Medida de la expresión proteica de IFNAR1 expresadas en: (Intensidad Media de Fluorescencia/  perlas calibradoras de fluorescencia) X 100 en leucocitos de sangre periférica en controles. Nro de muestra

MIFcorregida 133 15,90 163 nd 120 nd 101 19,5 154 16,60 131 nd 174 10,16 212 10,6 177 nd 203 nd Promedio de expresión en controles: 14.55

Mediana de expresión en controles: 15.9 Desviación estándar de expresión en controles: 4.04

 

23  

CASOS CON SD Tabla 7. Medida de la expresión proteica de IFNAR1 expresadas en: (Intensidad Media de Fluorescencia/ perlas calibradoras de fluorescencia) X 100 en leucocitos de sangre periférica en casos con SD Nro de muestra

MIFcorregida 220 15,5 116 27,42 148 16,20 135 nd 207 12,90 181 15,70 194 10,20 123 10,40 193 nd 196 6,28 Promedio de expresión en casos SD: 15.47 Mediana de expresión en casos SD: 15.50 Desviación estándar de expresión en casos SD: 5.823 7.8 Test de U Mann Whitney para comparación entre la expresión del mRNA del gen IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica entre casos con SD y controles. Tabla 8. Prueba de U Mann Whitney para comparar la expresión de la proteína IFNAR1 entre controles y pacientes con SD. Mann Whitney test P value Exact or approximate P value? P value summary Significantly different? (P < 0.05) One- or two-tailed P value? Sum of ranks in column A,B Mann-Whitney U

0,8586 Exact ns No Two-tailed 44 , 34 16

De acuerdo a esto, no existen diferencias significativas en la expresión del de la molécula IFNAR1 entre niños de 2 a 10 años con SD y controles en el mismo rango de edad. Es decir que

 

24  

los niveles de expresión proteica de IFNAR1 en leucocitos de sangre total son similares entre el grupo de niños con SD y el grupo control 7.9 Pruebas de correlación entre niveles de mRNA del gen IFNAR1 en sangre periférica y los niveles de expresión proteica de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica en pacientes con SD. Tabla 9. Prueba de Spearman entre el número de copias del gen IFNAR1 y la expresión proteica de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica de niños con SD. Coeficiente de correlación r

0.548

Valor de p

0.171

Según el valor de p, los niveles de mRNA y los niveles de expresión proteica del gen IFNAR1, en este estudio, se comportan de manera independiente. 7.10. Pruebas de correlación entre niveles de mRNA del gen IFNAR1 en sangre periférica y la frecuencia de infecciones retroscpectivas por año en pacientes con SD y controles sanos. Tabla 10. Prueba de Spearman entre el número de copias del gen IFNAR1 y la frecuencia de infecciones retrospectivas por año en conjunto de muestras total Coeficiente de correlación r

-0.631

Valor de p

0.005

Cuando se analizan casos y controles en conjunto se encuentra correlación negativa entre los niveles de mRNA y la frecuencia de infecciones: a mayor número de copias de IFNAR1, menor es la frecuencia de infecciones.

 

25   8. DISCUSIÓN

Los resultados del presente estudio muestran una disminución en el número de copias del gen IFNAR1 en comparación con controles sanos. Aun así, al comparar la expresión proteica de la misma molécula entre los mismos grupos, no se observan diferencias significativas. Por otro parte, al buscar correlaciones entre los niveles de mRNA IFNAR1, la expresión proteica de la molécula y la frecuencia de infecciones severas, se encuentra que hay correlación inversa entre el número de copias de mRNA del gen y la frecuencia de infecciones severas y se observa una leve tendencia a que cuando hay incremento en el número de copias del gen IFNAR1 se da también incremento de los niveles proteicos de la misma molécula, sin embargo esto último no resulto significativo. A pesar de que la causa del Síndrome de Down se conoce desde 1959, los mecanismos por los que tres copias del cromosoma 21 resultan en el desarrollo anormal de las personas con esta condición, no se han podido elucidar claramente hasta el momento. Varias investigaciones enfocadas al estudio del genoma o transcriptoma completo han sido llevadas a cabo por medio de microarreglos o SAGE (siglas en inglés para Análisis Serial de la Expresión del Genoma) para analizar las variaciones en tejidos trisómicos comparados con tejidos euploides a partir de muestras y líneas celulares humanas o de ratones. Dichos estudios se han enfocado principalmente en líneas celulares del cerebro, el cerebelo o de neuronas en específico, considerando el interés en comprender los mecanismos involucrados en el déficit cognitivo del SD. Estos trabajos han mostrado variaciones complejas en el transcriptoma con un incremento en la expresión de varios genes en la Región critica del cromosoma 21 y en otros cromosomas (Rachidi & Lopes 2008.) Actualmente existen dos hipótesis que explican el desarrollo del fenotipo de las personas con SD. La primera dice que se debe a un desequilibrio global de la dosis génica del cromosoma 21; mientras la hipótesis alterna plantea que el fenotipo se da por un desequilibrio en la dosis génica de un pequeño número de genes ubicados en una región crítica del cromosoma 21. Sin embargo, una hipótesis no excluye a la otra y hay la posibilidad de que solo algunos genes estén directamente involucrados en rasgos fenotípicos específicos de SD mientras otros rasgos se den

 

26  

por el impacto que tiene el desequilibrio de la dosis génica en el balance normal de la expresión génica (Mao et al 2003). Al encontrarse diferencias significativas y una correlación directa entre la expresión del gen IFNAR1 y la frecuencia de infecciones severas en los resultados del presente estudio, podría considerarse que éste gen está involucrado en el desarrollo del fenotipo del Síndrome. Sin embargo, se requiere de un estudio que involucre más genes para poder inclinarse hacia alguna de estas hipótesis. Los estudios en muestras derivadas de cerebro fetal de Mao et al (2003) apoyan la hipótesis del desequilibrio global en el cromosoma 21, pues se observa un aumento en la expresión de los genes ubicados en éste. Aun así los autores dan a entender que sus resultados pueden estar siendo influenciados por el estado de desarrollo o edad de los casos estudiados, los procesos experimentales utilizados, por la falta de comparaciones con los niveles proteicos de cada gen, y el tipo de células evaluadas. De otra manera, Prandini et al (2007), establece que la variabilidad fenotípica que se manifiesta con la trisomía 21, se debe a un efecto, únicamente, de la expresión de los genes ubicados en el cromosoma 21 que muestran niveles variables de expresión dentro de la población, después de llevar a cabo un estudio entre pacientes con SD y controles pareados en líneas de células linfoblastoides y fibroblastos, en el que miden los niveles de expresión génica mediante qPCR. Con éste estudio se logró agrupar los genes del cromosoma 21 de acuerdo a su relación con la expresión en individuos euploides. El gen IFNAR1 se categorizó dentro del grupo A, el cual contiene los genes con el mínimo sobrelapamiento de expresión entre pacientes y controles o en otras palabras, son los genes con niveles de expresión consistentemente más altos en individuos con SD que en controles sanos, lo cual los hace candidatos a ser los genes que manifiestan el fenotipo constante en todos las personas con SD, entre esas la inmunodeficiencia. Yahya-Graison, et al. (2007), llevo a cabo un estudio, en células linfoblastoides, por medio de microarreglos, en el que los resultados permitieron agrupar los genes del cromosoma 21 en cuatro grupos diferentes de acuerdo a sus niveles de expresión en SD. La clase I contiene 30 genes con una proporción de expresión (SD/controles) de aproximadamente 1.5 correlacionada con la presencia de una tercera copia de cada uno de ellos. A esta clase pertenecen los genes que podrían ser responsables indirecta o directamente del fenotipo observado en SD. El gen IFNAR1 de acuerdo a dicho estudio, pertenece a la clase I. Con el presente trabajo, por el contrario, se

 

27  

encontró una disminución en la expresión del gen IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica con respecto a los individuos euploides, lo cual no permitiría ubicar el gen en ninguna de las clases, pues ninguna trata genes con proporciones SD/controles negativas, sin embargo la técnica utilizada fue PCR en tiempo real, lo cual puede generar variaciones en los resultados. Por otro lado, los resultados del estudio realizado por Sommer et al. (2008) en niños con SD de 1 a 4 años y controles del mismo rango de edad, en linfocitos de sangre periférica, encuentra una alta variación interindividual en la expresión de los genes del cromosoma 21. Sin embargo al comparar con controles no encuentran diferencias significativas en la expresión del mRNA. Las explicaciones que abordan, para tratar esto, dicen que el cromosoma 21 se considera como un cromosoma con pocos genes y por lo tanto contribuye poco al reporte de mRNA en linfocitos, con respecto a los genes de otros cromosomas. Además la técnica SAGE (utilizada en este estudio) es poco sensible a pequeñas variaciones en los niveles de expresión. Del mismo modo, el estudio realizado por Tanaka et al. (2012) no encontró diferencias significativas en la expresión de mRNA del gen IFNAR1 entre pacientes con SD y controles sanos (ambos grupos con enfermedad periodontal) en tejido gingival, suponiendo que a pesar de una tercera copia de este gen, en estos tejidos no hay aumento en su transcripción, y más aún encontró una disminución en la expresión de genes relacionados como STAT1 y IRF1. Estos estudios apoyan de alguna manera los resultados encontrados en el presente trabajo pues al haber genes con menor expresión en individuos con SD en comparación con controles normales, se podría pensar que la tercera copia de estos u otros genes, están generando un silenciamiento y regulaciones post transcripcionales que regulan la influencia de la expresión de una tercera copia. Otro estudio que apoya los resultados obtenidos, encontró que en ratones con SD, la mayoría de los transcritos están expresados en niveles similares o iguales con ratones normales y de los 330 transcritos estudiados, sin especificar cuales, 161 tienen una menor expresión en SD en comparación con los controles (Antonarakis et al. 2001). Las explicaciones a este fenómeno pueden estar relacionadas con lo que plantea Kahlem et al. (2004). Según este, al realizar un análisis cuantitativo encuentran que diferentes mecanismos de regulación génica pueden actuar positiva o negativamente dependiendo del tipo de tejido donde se midan. En un modelo simple, un represor en presencia de un desbalance de la dosis génica, podría tener un efecto

 

28  

correspondiente sobre los niveles de expresión del gen que éste regula. Aun así, los resultados pueden ser diferentes dependiendo del tipo de represor, cis o trans, pues cuando está en cis, se presentaría una tercera copia tanto del gen como del regulador. Sin embargo sobre el gen IFNAR1 no se mencionan reguladores de estos tipos. Similar a esto, Henrichsen et al. (2009). encuentra que en ratones, cuando hay variaciones en el número de copias de un gen, con la mayoría de los genes, esta no tiene un efecto significativo en los niveles de expresión relativa de ningún tejido, sugiriendo que existe un mecanismo de compensación o la inclusión incompleta de elementos regulatorios en el evento de duplicación/ deleción. La hipótesis la soportan con la observación de que la expresión de algunos genes esta correlacionada con la dosis génica solo en algunos tejidos, no en todos. Además de lo anterior, para estas diferencias entre los resultados de los diferentes estudios han surgido diferentes hipótesis. Kusters et al (2009), menciona que las deficiencias en el sistema inmune de SD pueden estar relacionadas con la sobre-expresión de las moléculas de adhesión localizadas en el cromosoma 21, lo cual lleva a una mayor afinidad entre las células, llevando a una maduración y función anormal, pero en la mayoría de los estudios genéticos sobre la trisomía 21 no se observa una expresión general del 150% (es decir un aumento en la proporción del 1.5), pues esta es específica para órganos en particular. Así mismo, los estudios del transcriptoma completo, mencionados anteriormente, demostraron que los niveles de variación transcripcional para cada gen, pueden cambiar en diferentes tejidos y regiones cerebrales, o dependiendo del estado de desarrollo de los casos estudiados los resultados pueden variar en pacientes con DS y modelos trisómicos en ratones (Rachidi & Lopes 2008). De manera similar, la metodología utilizada en los diferentes estudios podría ser un factor determinante en los resultados, debido a la sensibilidad que cada una de estas alcanza. Algunos de estas técnicas son SAGE, microarreglos y PCR en tiempo real. Cada una posee ventajas y desventajas específicas que influyen en los resultados. Como soporte, se tienen los estudios realizados por Etienne et al (2004) en los que comparan el desempeño de los microarreglos y de las qRT-PCR y encuentran que ambos tienen una buena eficiencia cuando el gen se expresa en niveles normales o altos, pero cuando el gen se expresa en niveles bajos la qRT-PCR demuestra una mayor sensibilidad. Aun así, cuando se quiere estudiar un grupo grande de genes se tendría

 

29  

que optar por SAGE o microarreglos, pues estos involucran el estudio de más de un gen, a diferencia de qRT-PCR en la que hay que trabajar cada gen por separado. Sobre este estudio específicamente, los resultados pueden estar muy influenciados por la metodología utilizada, la cual presentó una serie de problemas, pues se sabe que la PCR en tiempo real es una técnica de gran sensibilidad cuando se logra amplificar el target. Para lograr una mayor especificidad, es recomendable utilizar el sistema TaqMan pues con este método la sonda sobre la cual se mide la fluorescencia, se hibrida únicamente con el target esperado y no con productos inespecíficos como dímeros (Rosadas et al 2013). Para el presente estudio, se utilizó el SYBR Green I, el cual se intercala con cualquier cadena doble de DNA y por lo tanto, cuando hay presencia de dímeros de primers, este se hibrida tanto con el target como con los dímeros, y el ensayo pierde especificidad. Su elección para ser usado en el estudio tuvo que ver con su bajo costo, en comparación con el sistema TaqMan, y la facilidad con la que con éste, según la literatura, se puede estandarizar un ensayo (Amer & Almajhdi 2011). El éxito de cualquier ensayo de qPCR depende en gran medida del diseño de los primers y su habilidad para amplificar y reconocer, en la medida de los posible, un único target que represente de la mejor manera el gen a estudiar (Amer & Almajhdi 2011). Los primers elegidos fueron adquiridos en SABiosciences. Según la empresa, estos son ensayados y validados científicamente para usar con SYBR Green I, en PCR en tiempo real, y de estos no revelan la secuencia. Sin embargo, estos formaban dímeros de primer en 30 ciclos de amplificación y además, amplificaban DNA genómico. Esto generó una serie de problemas con respecto a la eficiencia y reproducibilidad del ensayo, pues finalmente se optó por utilizar un protocolo, diferente al preestablecido por la empresa para usar con estos primers específicamente, en el que la fluorescencia se tomó durante 5 segundos a 74 C, debido a que la Tm de los primers era de aproximadamente 70 C y para cada muestra se llevó a cabo un control –RT, con RNA como plantilla. La estandarización máxima que se logró consistió en una especificidad basada en la identificación de una única banda del tamaño esperada en un gel de poliacrilamida al 12% (Ver Fig 2). La toma de la fluorescencia a 74 C, temperatura a la cual se espera que los dímeros de los primers se disminuyeran lo máximo posible pero que aún se detectara el target esperado. Por otra parte, la linealidad y reproducibilidad, se alcanzaron mediante la curva estándar, la cual alcanzó

 

30  

una eficiencia de 2, 01 y al momento de reproducir los puntos de esta curva durante la toma de datos, la eficiencia alcanzada fue de 2,0. Otro aspecto para tener en cuenta con respecto a los resultados obtenidos, es la marca comercial del kit utilizado para qPCR, Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG de Invitrogen. Según, Sieber et al, (2010) después de comparar la eficiencia de 12 marcas comerciales diferentes de kit para SYBR Green I, entre esas la que se utilizó para el presente estudio, encontró que el kit de Invitrogen, tiene un promedio de eficiencia de -0.44, siendo 0,77 la eficiencia más alta alcanzada por el kit de Stratagene. Esto podría ser una explicación a la dificultad para lograr estandarizar el protocolo de amplificación. Finalmente, se debe tener en cuenta que el tamaño muestral el cual es reducido y por esta razón los resultados significancia. Por otro lado, se debe tener en cuenta el hecho de que para el presente estudio no fue posible utilizar un gen housekeeping pues, aunque se intentó estandarizar el protocolo para utilizar GAPDH, éste mostraba variaciones muy altas entre cada individuo. Teniendo en cuenta que un gen housekeeping se utiliza para normalizar los datos obtenidos sobre la expresión de un gen problema pues el primero se supone que se expresa de manera homogénea en tejidos específicos; se decidió finalmente hacer únicamente la cuantificación absoluta del gen problema por falta de tiempo para encontrar un gen cuya expresión fuera homogénea en leucocitos de sangre periférica. Seria conveniente, por los resultados tan sorprendentes, y por las diferencias tan marcadas entre la expresión del gen IFNAR1 entre controles y casos que se obtuvo en el presente estudio, hacer la comparación con respecto a la expresión de un gen housekeeping en las mismas muestras. Sin embargo, y pese a los problemas mencionados anteriormente, al realizar las comparaciones con los resultados del trabajo previo realizado por Martínez (2012) se encuentran consistencias que soportan el resultado actual. En primera instancia, se debe tener en cuenta la comparación entre la expresión de la proteína IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica, la cual sorprendentemente y a pesar de la diferencia estadísticamente significativa entre los niveles de mRNA del gen de cada grupo estudiado, no muestra diferencias entre niños con SD y controles. En otras palabras, los leucocitos en sangre periférica tanto de niños SD como de niños sanos, tienen los mismos niveles basales de la subunidad 1 del receptor para el interferón alfa. Por otro lado, los resultados de la correlación, entre los niveles de mRNA del gen IFNAR1 y la frecuencia de infecciones severas, muestran una tendencia a que a mayor número de copias del gen hay una disminución en la frecuencia de infecciones en niños con SD y controles. Para explicar estos

 

31  

resultados, se plantea la hipótesis de que las células estudiadas poseen unos niveles basales de la molécula, pero al ser estimuladas por la presencia de un patógeno la célula debe incrementar los niveles de la misma, y para esto se deben tener suficientes copias del mRNA que la codifican. Al presentar, los casos con SD, un número de copias tan reducido en comparación con los controles sanos, se esperaría que no pudieran sintetizar los receptores suficientes para la llegada de los interferones necesarios a cada célula. Esto podría considerarse como un factor de gran influencia con respecto a las insuficiencias de la respuesta inmune que hallazgos previos reportan como una característica del fenotipo del Síndrome de Down. Por lo tanto, un estudio sobre la expresión proteica de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica, estimulados por la presencia de un patógeno, se consideraría el paso a seguir.

9. CONCLUSIONES Existen diferencias significativas entre los niveles de mRNA del gen IFNAR1 entre niños con Síndrome de Dow de 2 a 10 años y controles en el mismo rango de edad. Según estas, a pesar de de la presencia de un tercer cromosoma 21, el número de copias del gen en leucocitos de sangre se disminuye en los casos con SD en comparación a los controles. Esto puede estar relacionado con mecanismos de regulación post-transcripcional que, cuando se presenta una tercera copia, genera un silenciamiento y/o represión de la transcripción. Aun así, la comparación de los niveles de expresión proteica de IFNAR1 en los mismos niños con SD y controles no muestra diferencias significativas. Sin embargo, se encontró una tendencia de los datos a que cuando el número de copias del gen IFNAR1 se incrementan, los niveles de intensidad de la expresión de la molécula IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica son mayores. Esto implica que los mecanismos post-traduccionales no están generando una regulación negativa de la expresión y el mRNA traducible, presente en los leucocitos de sangre periférica, logra ser traducido en su mayoría. De manera consistente, los datos presentaron una tendencia a que, a medida que el número de copias del gen IFNAR1, en leucocitos de sangre periférica, incrementa en niños de 2 a 10 años

 

32  

con SD; la frecuencia de infecciones severas que requirieron hospitalización en dichos niños es menor. Esto podría explicarse una vez se estudie la hipótesis mencionada anteriormente, según la cual, al reducirse el número de copias disponibles para ser traducidas, cuando se presenta trisomía 21, se reduce la posibilidad de expresión de la molécula en leucocitos estimulados y por lo tanto, hay complicaciones para que los interferones tipo I logren actuar sobre estas células. Esto puede estar influyendo negativamente, y de manera considerable, en la respuesta inmune a la presencia de patógenos y se asocia con la deficiencia en el sistema inmune que se ha reportado en los individuos con éste Síndrome. Por ende podría considerarse al gen IFNAR1 como un gen cuya expresión afecta el fenotipo de los niños con SD, haciéndolos susceptibles a presentar inmunodeficiencia. Sin embargo, los resultados pueden estar siendo influenciados por diferentes factores tales como la metodología utilizada durante el estudio, el tipo de tejido estudiado, la edad de los casos y controles, y especialmente el tamaño muestral utilizado.

10. RECOMENDACIONES

Sería conveniente realizar un estudio, a nivel molecular, más amplio que incluya un tamaño de muestra lo suficientemente grande para que la significancia de los resultados sea confiable. Además, es posible que al utilizar el sistema de Taq-Man sea más sencillo alcanzar la estandarización y una mayor eficiencia de la metodología, utilizando, claro esta, primers que no amplifiquen DNA genómico y normalizando los datos con la expresión de un gen housekeeping que se comporte homogéneamente en leucocitos de sangre periferica. Por otro lado, se recomienda realizar este tipo de estudios sobre otros genes involucrados en la respuesta inmune y sobre grupos de individuos en otros rangos de edades con esta condición. Y finalmente sería conveniente realizar un estudio para comprobar la hipótesis planteada como explicación a los resultados obtenidos.

 

33  

11. BIBLIOGRAFIA

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38  

12. ANEXOS

Niveles  de  expresión  de  IFNAR1   en  casos  y  controles     1.00E+10  

Copias/µL    

1.00E+08   1.00E+06   Promedio  de  expresion   con  n=10  

1.00E+04   1.00E+02   1.00E+00   CONTROLES  

CASOS  

Figura 4. Promedio de copias/µL del mRNA del gen IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica de controles y casos con SD

Niveles  de  expresión  proteica  de   IFNAR1  en  casos  y  controles  

MIFcorregida  

16   8   Promedio  de  expresion   con  n=  8  para  casos  y   n=5  para  controles  

4   2   1   CONTROLES  

CASOS  

Figura 5. Promedio de expresión proteica del gen IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica de controles sanos y casos con SD.

 

39  

Prueba de Spearman

MIFcorregida

30

20

10

0

0

10000

20000

30000

40000

mRNA

Figura 6. Prueba de correlación de Spearman entre los niveles de mRNA del gen IFNAR1 y los

Frecuencia de infecciones retrospectivas

niveles de expresión proteica del mismo IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica.

Prueba de Spearman 8 6 4 2 0 102

104

106

108

1010

1012

Copias IFNAR1/µL

Figura 7. Prueba de correlación de Spearman entre los niveles de mRNA del gen IFNAR1 y la frecuencia de infecciones severas de casos con SD y controles sanos.

 

40  

Tabla 11. Resultados de expresión proteica de IFNAR1 en leucocitos de sangre periférica. Y frecuencia de infecciones retrospectivas por año para cada muestra.

Leucosar1+%   Porcentaje  de  leucocitos  que  expresan  la  molécula    LEUCOS  AR1+  /ul   Número  de  leucocitos/ul  de  sangre  total  que  expresan  la  molécula   Intensidad  Media  de  Fluorescencia  es  decir,  la  iIntensidad  de   expresión  de  la  molécula  medida  en  unidades  arbitrarias  de   MIF   fluorescencia   MIF  integrada   Leucosar1+%  +  x    MIF   MIFcorregida   (MIF/perlas  calibradoras  de  fluorescencia)  X  100