ANÁLISIS DE LAS PROTEÍNAS CONSIDERACIONES GENERALES

PROTEÍNAS • SON COMPONENTES ABUNDANTES EN TODAS LAS CÉLULAS. • CASI TODAS (EXCEPTO LAS DE ALMACENAMIENTO) SON IMPORTANTES PARA LAS FUNCIONES BIOLÓGICAS Y/O LA ESTRUCTURA CELULAR. • LAS PROTEÍNAS DE LOS ALIMENTOS SON MUY COMPLEJAS.

COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS • ESTÁN CONSTITUÍDAS POR: HIDRÓGENO, CARBONO, NITRÓGENO, OXÍGENO Y AZÚFRE. • LOS “BLOQUES DE CONSTRUCCIÓN” DE LAS PROTEÍNAS SON 20 ∞-AMINOÁCIDOS. • LAS UNIONES ENTRE RESIDUOS DE AMINOÁCIDOS EN UNA PROTEÍNA SON ENLACES PEPTÍDICOS.

COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS • EL NITRÓGENO ES EL ELEMENTO MÁS DISTINTIVO PRESENTE EN LAS PROTEÍNAS. • GENERALMENTE LAS PROTEÍNAS RICAS EN AMINOÁCIDOS BÁSICOS CONTIENEN MÁS NITRÓGENO. • SIN EMBARGO, EL CONTENIDO DE NITRÓGENO EN VARIAS PROTEÍNAS ALIMENTICIAS VARÍA DE 13.4 19.1% DEBIDO A LA VARIACIÓN EN LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS ESPECÍFICA DE LAS PROTEÍNAS.

ESTEREOQUÍMICA DE LOS AMINOÁCIDOS

Los aa son estructuras tetraédricas

ISÓMEROS

“Bioquímica” Stryer, Berg y Tymoczko Ed. Reverté, S.A. 2003

La estructura tridimensional es de crucial importancia para la

función

Representación:

a) Tridimensional

b) En perspectiva

“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern Addison Wesley 2002

Representación:

c) En proyección

Alanina (Ala, A)

3.- CLASIFICACIÓN • Diversa: Elevado número y diversidad de propiedades • Se basa en cuatro criterios: • Químico (composición) • Simples • Conjugadas (holoproteína = apoproteína + grupo prostético)

- Glico-, lipo-, nucleoproteínas - metalo-, hemo-, flavo-proteínas • Estructural (forma) • Globulares • Fibrosas • Función • Físico (solubilidad)

NECDESIDAD DEL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS • CONTENIDO PROTÉICO TOTAL • COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS • CONTENIDO DE ALGUNA PROTEÍNA PARTICULAR EN UNA MEZCLA • CONTENIDO PORTEÍCO DURANTE EL AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE UNA PROTEÍNA • NITRÓGENO NO PROTÉICO • VALOR NUTRITIVO DE UNA (DIGESTIBILIDAD, BALANCE PROTÉICO)

CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • PRODUCTOS LÁCTEOS LECHE ENTERA 3.5% LECHE DESHIDRATADA DESGRASADA 35.9% QUESO CHEDDAR 25% • HUEVOS

12.9%

CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • CARNES RES, BISTEAK, MAGRO CON GRASA 28.6% PUERCO, MAGRO CON GRASA, DESHUESADO 17.1% PECHUGA DE POLLO 27.3% • PESCADO BACALAO COCINADO 28.5% ATÚN EN ACEITE ENLATADO 24.2%

CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • CEREALES ARROZ, INTEGRAL, CRUDO ARROZ REFINADO, CRUDO HARINA DE TRIGO INTEGRAL HARINA DE MAÍZ SPAGHETTI, SECO ALMIDÓN DE MAÍZ

7.5% 6.7% 13.3% 7.8% 12.5% 0.3%

CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • FRUTAS Y VEGETALES PAPA ENTERA, CRUDA 1.6% ESPÁRRAGOS VERDES 2.5% TAPIOCA 0.6% FRIJOLES, SECOS, TODAS LAS VARIEDADES 22.3% SOYA SECA 34.1%

CONTENIDO PROTÉICO EN LOS ALIMENTOS • FRUTAS Y SEMILLAS MANZANA ENTERA, CRUDA ALMENDRAS ENTERAS

0.2% 18.6%

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS • • • • • • • • •

MÉTODO DE KJELDAHL MÉTODO DE BIURET MÉTODO DE LOWRY MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) MÉTODO DE ABSORCIÓN UV A 280nm MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE MÉTODO DE BRADFORD MÉTODO DE LA NINHIDRINA MÉTODO TURBIDIMÉTRICO

MÉTODO DE KJELDAHL (JOHANN KJELDAHL, 1883) • DIGESTIÓN CON H2SO4 CON LA ADICIÓN DE PERMANGANATO DE POTASIO PARA COMPLETAR LA OXIDACIÓN Y CONVERSIÓN DEL NITRÓGENO A SULFATO DE AMONIO. • NEUTRANLIZACIÓN DE LA DIGESTA DILUIDA, SEGUIDA DE UNA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO ESTÁNDAR CON UN CONTENIDO DE IODURO DE POTASIO E YODATO. • TITULACIÓN DEL YODO LIBERADO CON TIOSULFATO DE SODIO ESTÁNDAR

MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL • SE HAN AÑADIDO CATALIZADORES COMO: Hg, Cu, Se, Ti AL H2SO4 PARA LOGRAR UNA DIGESTIÓN COMPLETA. EL DIÓXIDO DE SELENIO Y EL SULFATO DE COBRE EN PROPORCIÓN 3:1 SON MUY EFECTIVOS EN LA DIGESTIÓN.

MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL • EL SULFATO DE POTASIO SE UTILIZA PARA AUMENTAR EL PUNTO DE EBULLICIÓN DEL ÁCIDO SULFÚRICO PARA ACELERAR LA DIGESTIÓN. • EL SULFURO O TIOSULFATO DE SODIO SE AÑADEN A LA DIGESTA DILUIDA PARA AYUDAR A LIBERAR EL NITRÓGENO DEL Hg EL CUAL TIENDE A ADHERIR AMONIO.

MODIFICACIONES PARA EL MEJORAMIENTO DEL MÉTODO DE KJELDAHL • EL AMONIACO SE DESTILA DIRECTAMENTE EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO Y ES SEGUIDO DE UNA TITULACIÓN CON UN ÁCIDO ESTÁNDAR. • SE UTILIZAN LA COLORIMETRÍA Y LA CROMATOGRAFÍA IÓNICA PARA DETERMINAR EL CONTENIDO DE NITRÓGENO POSTERIOR A LA DIGESTIÓN.

PROCEDIMIENTO GENERAL Y REACCIONES • DIGESTIÓN EL SULFATO DE AMONIO NO VOLÁTIL SE FORMA DE LA REACCIÓN DEL NITRÓGENO Y EL ÁCIDO SULFÚRICO. DURANTE LA DIGESTIÓN SE LIBERA EL NITRÓGENO PROTÉICO PARA FORMAR IONES DE AMONIO. EL ÁCIDO SULFÚRICO OXIDA LA MATERIA ORGÁNICA Y SE COMBINA CON EL AMONIO FORMADO.

DIGESTIÓN • LOS ELEMENTOS CARBONO E HIDRÓGENO SE CONVIERTEN EN DIÓXIDO DE CARBONO Y AGUA PROTEÍNA

Ácido Sulfúrico Calor, catalizador

(NH4)2 SO4

NEUTRALIZACIÓN Y DESTILACIÓN • LA MUESTRA DIGERIDA SE DILUYE CON AGUA. • SE AÑADE EL ÁLCALI QUE CONTIENE TIOSULFATO DE SODIO PARA NEUTRALIZAR AL ÁCIDO SULFÚRICO. • EL AMONÍACO FORMADO SE DESTILA EN UNA SOLUCIÓN DE ÁCIDO BÓRICO QUE CONTIENE LOS INDICADORES AZÚL DE METILENO Y ROJO DE METILO.

REACCIONES DE LA NEUTRALIZACIÓN Y LA DESTILACIÓN (NH)2SO4+ 2NaOH → 2NH3+Na2SO4+2H2O

NH3+ H3BO3 → (ácido bórico)

NH4 + H2BO3(ión borato)

REACCIONES DE LA TITULACIÓN • EL ANIÓN BORATO (PROPORCIONAL A LA CANTIDAD DE NITRÓGENO) SE TITULA CON HCl ESTANDARIZADO: H2BO3- + H+ → H3BO3

CÁLCULOS

MOLES DE HCl = MOLES DE NH3 = MOLES DE NITRÓGENO EN LA MUESTRA

FUNCIÓN DEL BLANCO EN LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS • SE DEBE UTILIZAR UN BLANCO CON REACTIVOS PARA SUSTRAER EL NITRÓGENO REACTIVO DEL NITRÓGENO DE LA MUESTRA.

• N HCl = NORMALIDAD DEL HCl EN MOLES /1000 mL • VOL. ÁCIDO CORREGIDO = mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA LA MUESTRA) – (mL DE ÁCIDO ESTÁNDAR PARA EL BLANCO) • 14 =

PESO ATÓMICO DEL NITRÓGENO

%N = N HCl X VOLUMEN DE ÁCIDCORR. X 14g N2 x 100 g. DE MUESTRA 1 mol

FACTOR • SE UTILIZA UN FACTOR DE CONVERSIÓN DE % DE N2 A % DE PROTEÍNA CRUDA. • LA MAYORÍA DE LAS PROTEÍNAS CONTIENEN 16% DE N2 • EL FACTOR DE CONVERSIÓN ES: 6.25 (100/16 = 6.25) %N2 X 6.25 = %PROTEÍNA %N2 = %PROTEÍNA x 0.16

FACTORES DE CONVERSIÓN PARA ALGUNOS ALIMENTOS ALIMENTO %N2PROTEÍNA HUEVO O 16 CARNE, MAÍZ LECHE 15.7 TRIGO 18 SOYA 17.51 AVENA 17.15

FACTOR 6.25 6.38 5.7 5.71 5.83

EJEMPLO: CÁLCULOS

PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN • NESSLERIZACIÓN NH4OH + 2HgI2+ 2KI + 3KOH → NH4Hg2I + 7KI + 4H2O ( rojo-naranja, 440nm) RÁPIDO Y FÁCIL PERO EL IODURO DIMERCÚRICO DE AMONIO ES COLOIDE Y EL COLOR ES INESTABLE

PROCEDIMIENTOS ALTERNATIVOS DE DESTILACIÓN Y TITULACIÓN • MEDICIÓN DEL pH POSTERIOR A LA DESTILACIÓN EN UN VOLUMEN CONOCIDO DE ÁCIDO BÓRICO • MEDICIÓN DIRECTA DEL AMONÍACO, MEDIANTE EL MÉTODO DE CROMATOGRAFÍA IÓNICA

VENTAJAS DEL MÉTODO DE KJELDAHL • • • • •

APLICABLE A TODO TIPO DE ALIMENTOS RELATIVAMENTE SIMPLE BARATO PRECISO ES EL MÉTODO OFICIAL PARA MEDIR EL CONTENIDO DE PROTEÍNA CRUDA

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE KJELDAHL • MIDE EL NITRÓGENO ORGÁNICO TOTAL, NO SÓLO EL NITRÓGENO PROTÉICO • CONSUME MUCHO TIEMPO (AL MENOS 2 HORAS PARA COMPLETARSE) • PRECISIÓN MÁS POBRE QUE EL MÉTODO DE BIURET • USA REACTIVOS CORROSIVOS

DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BIURET • FUNDAMENTO AL FORMAR COMPLEJOS LOS IONES CÚPRICOS CON LOS ENLACES PEPTÍDICOS DE LAS PROTEÍNAS SE PRODUCE UN COLOR VIOLETAMORADO BAJO CONDICIONES ALCALINAS.

LA ABSORBANCIA DEL COLOR PRODUCIDO ES LEÍDO A 540nm.

LA INTENSIDAD DEL COLOR (ABSORBANCIA) ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA.

PROCEDIMIENTO PARA EL MÉTODO DE BIURET • 5 mL DE REACTIVO DE BIURET SE MEZCLA CON 1mL DE SOLUCIÓN PROTÉICA (1-10 mg DE PROTEÍNA/mL). EL REACTIVO INCLUYE SULFATO DE COBRE, NaOH, Y TARTRATO DE SODIO Y POTASIO EL CUAL SE UTILIZA PARA ESTABILIZAR EL IÓN COBRE EN LA SOLUCIÓN ALCALINA

PROCEDIMIENTO PARA EL MÉTODO DE BIURET • DESPUÉS DE REPOSO A TEMPERATURA AMBIENTE DURANTE 15 A 30 MINUTOS, SE LEE LA ABSORBANCIA A 540nm CONTRA UN BLANCO CON SÓLO REACTIVO. • SI LA REACCIÓN NO ES CLARA DEBE CENTRIFUGARSE LA MUESTRA PREVIO A LA LECTURA DE LA ABSORBANCIA

PROCEDIMIENTO PARA EL MÉTODO DE BIURET • SE DEBE ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR DE CONCENTRACIÓN VS ABSORBANCIA UTILIZANDO ALBÚMINA DE SUERO DE BOVINO (BSA) PARA COMPARACIÓN CON LA MUESTRA BAJO ESTUDIO

VENTAJAS DEL MÉTODO DE BIURET • • • • •

MENOS CARO QUE EL MÉTODO DE KJELDAHL RÁPIDO (SE PUEDE COMPLETAR EN MENOS DE 30 MINUTOS) ES EL MÉTODO MÁS SIMPLE DE ANÁLISIS DE PROTEÍNAS NO ES FRECUENTE ENCONTRAR DERIVACIONES DE COLOR POCAS SUBSTANCIAS NO PROTÉICAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN DE BIURET • NO DETECTA N2 DE FUENTES NO PROTÉICAS O NO PEPTÍDICAS

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE BIURET • NO ES MUY SENSIBLE COMPARADO CON EL MÉTODO DE LOWRY • REQUIERE DE AL MENOS 2 A 4 mg DE PROTEÍNA POR PRUEBA • LAS CONCENTRACIONES ALTAS DE SALES DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN • PUEDE OCURRIR OPALESCENCIA EN LA SOLUCIÓN FINAL SI ESTÁN PRESENTES ALTAS CONCENTRACIONES DE LÍPIDOS O CARBOHIDRATOS • DEBE ESTANDARIZARSE EL COLOR MEDIANTE CANTIDADES DE PROTEÍNA CONOCIDAS

MÉTODO DE LOWRY • FUNDAMENTO COMBINA LA REACCIÓN DE BIURET CON LA REDUCCIÓN DEL REACTIVO DE FENOL FOLINCIOCALTEAU (ÁCIDO FOSFOMOLÍBDICOFOSFOTÚNGSTICO) POR LOS RESIDUOS DE TIROSINA Y TRIPTOFANO DE LAS PROTEÍNAS. EL COLOR AZULOSO DESARROLLADO ES LEÍDO A 750nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA BAJA) O A 500nm (ALTA SENSIBILIDAD PARA UNA CONCENTRACIÓN PROTÉICA ALTA)

VENTAJAS DEL MÉTODO DE LOWRY • MUY SENSIBLE • MENOS AFECTADO POR LA TURBIDEZ DE LA MUESTRA • MÁS ESPECÍFICO QUE LA MAYORÍA DE LOS OTROS MÉTODOS • RELATIVAMENTE SIMPLE • SE PUEDE COMPLETAR EN 1 A 1.5 HORAS

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LOWRY • EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES PROTEÍNAS (MÁS QUE EL MÉTODO DE BIURET) • EL COLOR NO ES ESTRICTAMENTE PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS • LA SACAROSA, LÍPIDOS, BUFFERS FOSFATO, MONOSACÁRIDOS Y HEXOAMINAS INTERFIEREN CON LA REACCIÓN • LAS ALTAS CONCENTRACIONES DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFATO DE AMONIO Y COMPUESTOS CON SULFHIDRILO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN

MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • FUNDAMENTO SE BASA EN EL PRINCIPIO DE QUE LAS PROTEÍNAS REDUCEN LOS IONES CÚPRICOS A IONES CUPROSOS BAJO CONDICIONES ALCALINAS. LOS IONES CUPROSOS REACCIONAN CON EL BCA (VERDOSO) PARA FORMAR UN COLOR MORADO. EL COLOR FORMADO ES PROPORCIONAL AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA

VENTAJAS DEL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • SENSIBILIDAD COMPARABLE A LA DEL MÉTODO DE LOWRY (0.5mg a 10mg) • LA MEZCLA EN UN PASO ES MÁS FÁCIL QUE EN EL MÉTODO DE LOWRY • EL REACTIVO ES MÁS ESTABLE QUE EL REACTIVO DE LOWRY • LAS SALES DE BUFFER Y DETERGENTE NO IÓNICO NO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN • LAS CONCENTRACIONES DEL MEDIO DE REACTIVOS DESNATURALIZANTES NO INTERFIEREN (GUANIDINA 4M-HCl O UREA 3M)

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DEL ÁCIDO BICINCONÍNICO (BCA) • EL COLOR NO ES ESTABLE CON EL TIEMPO. SE NECESITA CONTROLAR CUIDADOSAMENTE EL TIEMPO ENTRE EL ANÁLISIS Y LA LECTURA EN ABSORBANCIA. • LOS AZÚCARES REDUCTORES INTERFIEREN CON LA REACCIÓN. • ALTAS CONCENTRACIONES DE SULFATO DE AMONIO INTERFIEREN CON LA REACCIÓN. • LA RESPUESTA EN LA ABSORBANCIA NO ES LINEAL

MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280nm • FUNDAMENTO LAS PROTEÍNAS MUESTRAN UN FUERTE GRADO DE ABSORCIÓN A 280nm EN UV, PRINCIPALMENTE DEBIDO PRINCIPALMENTE A LOS RESIDUOS DE TRIPTOFANO Y LA TIROSINA DE LAS PROTEÍNAS. YA QUE LAS CONCENTRACIONES DE ESTOS AMINOÁCIDOS EN LAS PROTEÍNAS ES FRANCAMENTE CONSTANTE SE PUEDE UTILIZAR LA ABSORBANCIA A 280nm PARA ESTIMAR LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS USANDO LA LEY DE BEER

MÉTODO DE ABSORCIÓN EN ULTRAVIOLETA A 280nm • FUNDAMENTO DADO QUE CADA PROTEÍNA TIENE UNA COMPOASICIÓN ÚNICA DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS, EL COEFICIENTE DE EXTINCIÓN (E280) O SU ABSORTIVIDAD MOLAR (Em) DEBEN SER DETERMINADOS PARA PROTEÍNAS INDIVIDUALES PARA LA ESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO

VENTAJAS DEL MÉTODO DE ABSORCIÓN EN UV (280nm) • MÉTODO RÁPIDO Y RELATIVAMENTE SENSIBLE (VARIAS VECES MÁS SENSIBLE QUE EL MÉTODO DE BIURET) • NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO Y OTRAS SALES BUFFER • MÉTODO NO DESTRUCTIVO • UTILIZADO EN DETECCIÓN POST-COLUMNA DE LAS PROTEÍNAS

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE ABSORCIÓN EN EL UV (280nm) • LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS TAMBIÉN ABSORBEN EN LA REGIÓN DE 280nm • EL CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS AROMÁTICOS DIFIERE CONSIDERABLEMENTE EN VARIAS PROTEÍNAS. • LA SOLUCIÓN DEBE SER CLARA E INCOLORA. LA TURBIDEZ PUEDE PRODUCIR RESULTADOS ERRÁTICOS • SE REQUIERE UN SISTEMA RELATIVAMENTE PURO PARA UTILIZAR ESTE MÉTODO

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR ADHESIÓN DE UN COLORANTE

• ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO

• MÉTODO DE BRADFORD

ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO • FUNDAMENTO LA MUESTRA PROTÉICA SE MEZCLA CON UNA CANTIDAD EXCESIVA CONOCIDA DE UN COLORANTE ANIÓNICO EN UNA SOLUCIÓN BUFFER. LAS PROTEÍNAS SE UNEN AL COLORANTE PARA FORMAR UN COMPLEJO INSOLUBLE.

ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO • FUNDAMENTO SE MIDE EL COLORANTE NO ADHERIDO, SOLUBLE POSTERIOR A LA EQUILIBRACIÓN DE LA REACCIÓN Y LA REMOCIÓN DEL COMPLEJO INSOLUBLE POR CENTRIFUGACIÓN Y FILTRACIÓN. EL COLORANTE NO ADHERIDO ESTÁ INVERSAMENTE RELACIONADO AL CONTENIDO PROTÉICO DE LA MUESTRA

ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO • FUNDAMENTO PROTEÍNA + EXCESO DE COLORANTE → COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE INSOLUBLE + COLORANTE NO ADHERIDO SOLUBLE

COLORANTES UTILIZADOS EN ESTE MÉTODO • ÁCIDO SULFÓNICO ANIÓNICO NARANJA ÁCIDO 12 NARANJA G NEGRO AMIDO 10B UNEN GRUPOS CATIÓNICOS DE LOS RESIDUOS BÁSICOS DE AMINOÁCIDOS (IMIDASOL DE LA HISTIDINA, GUANIDINA DE LA ARGININA Y EL GRUPO ε-AMINO DE LA LISINA) Y EL GRUPO LIBRE TERMINAL AMINO DE LAS PROTEÍNAS.

VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO • MÉTODO RÁPIDO (15 MINUTOS O MENOS) • BARATO • RELATIVAMENTE EXACTO PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS EN ALIMENTOS • PUEDE UTILIZARSE PARA ESTIMAR LOS CAMBIOS EN EL CONTENIDO DE LISINA DISPONIBLE DE LOS CEREALES DURANTE SU PROCESAMIENTO.

VENTAJAS DEL MÉTODO DE ADHESIÓN DE COLORANTE ANIÓNICO

• NO UTILIZA REACTIVOS CORROSIVOS • NO MIDE NITRÓGENO NO PROTÉICO • MÁS PRECISO QUE EL MÉTODO KJELDAHL

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA ADHESIÓN DEL COLORANTE ANIÓNICO • LAS PROTEÍNAS DIFIEREN EN SU CONTENIDO DE AMINOÁCIDOS BÁSICOS DIFIEREN EN SU CAPACIDAD DE ADHESIÓN DEL COLORANTE • SE NECESITA ELABORAR CURVA DE CALIBRACIÓN • MUCHOS COMPONENTES NO PROTÉICOS TAMBIÉN SE PUEDEN ADHERIR AL COLORANTE (ALMIDÒN), METALES (Ca O P) Y CAUSAR ERRORES EN LOS RESULTADOS

MÉTODO DE BRADFORD • FUNDAMENTO EL AZÚL BRILLANTE G-250 COOMASSIE SE ADHIERE A LA PROTEÍNA, EL COLORANTE SE TORNA DE ROJIZO A AZULADO YE L MÁXIMO DE ABSORCIÓN DEL COLORANTE CAMBIA DE 465 A 595nm. EL CAMBIO EN LA ABSORBANCIA A 595nm ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN LA MUESTRA.

VENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD • MÉTODO RÁPIDO (LA REACCIÓN SE PUEDE COMPLETAR EN 2 MINUTOS) • REPRODUCIBLE • SENSIBLE (MUCHO MÁS QUE EL MÉTODO DE LOWRY) • NO EXISTE INTERFERENCIA DE CATIONES COMO K+, Na+, Y Mg+

VENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD • NO EXISTE INTERFERENCIA DEL SULFATO DE AMONIO • NO EXISTE INTERFERENCIA DE LOS POLIFENOLES NI CARBOHIDRATOS COMO LA SACAROSA • MIDE PROTEÍNA O PÉPTIDOS CON UNA MASA MOLECULAR APROXIMADAMENTE IGUAL O MAYOR DE 4 000 DALTONS

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE BRADFORD • EL COMPLEJO PROTEÍNA-COLORANTE FORMADO PUEDE UNIRSE A LAS CELDAS DE CUARZO • EL COLOR VARÍA CON DIFERENTES TIPOS DE PROTEÍNAS. • LA PROTEÍNA ESTÁNDAR DEBE SELECCIONARSE CON MUCHO CUIDADO • INTERFERENCIA CON DETERGENTES.

MÉTODO DE LA NINHIDRINA • FUNDAMENTO AL SER HERVIDOS EN UN BUFFER A UN pH DE 5.5 EN PRESENCIA DE NINHIDRINA E HIDRINDANTINA, LOS AMINOÁCIDOS, AMONÍACO, Y LOS GRUPOS AMINO PRIMARIOS, ORIGINAN UN COLOR MORADO RUHEMANN

VENTAJA DEL MÉTODO DE LA NINHIDRINA

• MÉTODO RELATIVAMENTE RÁPIDO SI SE COMPARA CON EL MÉTODO DE KJELDAHL

DESVENTAJAS DEL MÉTODO DE LA NINHIDRINA • LA PRESENCIA DE PEQUEÑAS CANTIDADES DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS, AMINAS PRIMARIAS, Y AMONÍACO OCASIONA UNA SOBREESTIMACIÓN DEL CONTENIDO PROTÉICO • BAJA PRECISIÓN • EL COLOR VARÍA CON LA DIFERENTE COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS • SE NECESITA ELABORAR UNA CURVA ESTÁNDAR EN CADA ANÁLISIS