ANALIZADORES

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

1

Analizadores

Cuadrupolo (Q) Trampa de iones (IT) Sector magnético-eléctrico (BE) Tiempo de vuelo (TOF) Resonancia iónica ciclotrónica (ICR) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

2

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

3

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Cuando un ion m/z deja la fuente: mv2/2 = z e V = Ec El tiempo (t) requerido para volar d es: v=d/t

m (d2 / t2) / 2 = z e V t2 = m d2 2zeV

t = m d2 1/2 z2eV

m / z puede ser calculado a partir de t Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

4

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) t = m d2 1/2 z2eV

Ejemplo: V = 2000 v d=1m

t H+= 1.7 µs

No tiene límite de m

t 2500 = 50 µs

1/2 t2 – t1 = d2 z2eV

( m2 )1/2 – ( m1 )1/2

fullereno C60 +. t 720 = 27.665 µs C5913C +. t 721 = 27.684 µs

∆t = 19 ns

Para mejorar la resolución: aumentar el largo del tubo disminuír la dispersión en energías Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

5

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

s0

sa

sd

v m/z

Detector E

t = t0 + ta + td Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

6

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) E kin = zeU E kin = 21 mv 2 s v= t m t = t 0 + ( 2 sa + sd ) 2 zeU

m = a + b ⋅t

2

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

7

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

t=

2 mk / z e

V0 + ε −

ε

D0 / V0 + mk / 2 z e

L0 /

V0 + ε

ε : energía inicial del ion (eV) D0 : distancia de extracción L0 : distancia en la zona de deriva V0 : voltaje de extracción

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

8

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Problema: Picos anchos (baja resolución). Causa: Iones con la misma masa tienen diferentes velocidades (dispersión de energía) Muestra + matriz Iones de igual masa con diferentes velocidades

+ +

+

Para mejorar la resolución: disminuír la dispersión en energías Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

9

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Problema: Picos anchos (baja resolución).

a

c

b

d

Causas: Iones con la misma masa a- parten a distinto tiempo b- parten de diferentes puntos c- tienen diferente velocidad d- poseen

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA inicial diferente dirección

Plano de enfoque espacial Extracción en dos etapas 10

Analizadores

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

11

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) ¿Cómo compensar la dispersión de energía inicial (y tiempo y espacio) de iones de igual masa?

Time-lag focusing TLF Delayed Extraction (DE) Pulse ion extraction (PIE) TOF con Reflectrón Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

12

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Delayed Extraction (DE) 0V

Iones de igual masa y diferente velocidad

+ +

Detector

+

1: No se aplica ningún campo eléctrico. Los iones difunden durante el ¨delay time¨.

+20 kV

+ +

+

+18 kV

2: Se aplica un campo eléctrico. El gradiente hace que los iones más lentos se aceleren más.

+ + +

0V 3: Los iones lentos alcanzan a los rápidos en el detector. Placa de muestra

¨Grid¨de potencial Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA variable

13

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Potenciales de extracción - DE Potencial variable (% del potencial acelerador potencial acelerador) (15-25) kV

+20 kV

Potential

Ground grid

+18 kV (90%)

Gradient

Al tubo de vuelo

Región de ionización

El gradiente de potencial y el tiempo de demora (delay time) deben ser ajustados para obtener la máxima resolución para un dado rango de masa. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

14

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Potenciales de extracción - DE Son parámetros interactivos

Kompact Maldi IV – Shimadzu-Kratos Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

15

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Delayed Extraction (DE) vs tiempo ¨Pulse Delay Time¨

potencial de aceleración Pulso láser

kV potencial variable

tiempo ¨delay time¨ de extracción (25-1000 ns) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

16

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Mejoras en la resolución por DE Linear mode Reflector mode delayed extraction R=1,100

10600

10800

continuous extraction R=125

11000

11200

11400

11600

m/z muestra: mezcla de ADN (36-mer) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

17

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Reflectrón

Es un espejo iónico que somete a los iones a un campo eléctrico uniforme repulsivo, que los refleja. Detector

Ion Source

Reflectrón (espejo iónico) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

18

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) reflectrón

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

19

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) E kin = zeU E kin = 21 mv 2

reflectrón

s v= t m t = t 0 + ( 2 sa + sd ) 2 zeU

m = a + b ⋅t

2

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

20

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Reflectrón

+ +

x y

Enfoca los iones

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

21

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Reflectrón Distancia penetrada por un ion de vix en el reflectrón : x=K/qE

K energía cinética del ion E campo en el reflectrón

Supongamos dos iones i e i´ con igual m y K´/K = a2

K = 0.5 m vix2

vix = (2 K / m)1/2

K´ = 0.5 m vi´x2

vi´x= (2 K´/ m)1/2 = (2 K a2 / m)1/2

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

vi´x = a vix

22

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Reflectrón El tiempo fuera del reflectrón : t = d / vix

vi´x = a vix

t´ = d / vi´x = d / a vix

t´ = t / a

El tiempo dentro del reflectrón : x=K/qE

x´ = K´ / q E = a2 K / q E = a2 x

Cuando llega a x: v = 0

v (promedio) = v ix / 2

en el reflectrón

t = 2 t0 = 2 x /(v ix / 2)

tr = 4 x / vix

t´r = 4 x´ / vi´x = 4 a2 x/ a vix = 4 a x /vix Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

t´r = a tr 23

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Reflectrón t´ = t / a

(K´/K = a2)

t´r = a tr

El tiempo total de vuelo : tT = t + tr

t´T = t´ + t´r = t / a + a t

Si a > 1 el ion con exceso de Ec tiene un vuelo más corto fuera y más largo dentro del reflectrón Lo opuesto con a < 1

Con los valores adecuados de E, V y d se compensan totalmente Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

24

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Modo lineal

¾ Masas

altas (> 50 kDa) ¾ Alta sensibilidad Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

25

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Modo Delayed Extraction (DE)

¾ ¾ ¾

Masas más bajas (< 40 kDa) Buena resolución Alta sensibilidad Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

26

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Modo reflectrón

¾ ¾ ¾

Masas bajas (< 10 kDa) Alta resolución Baja sensibilidad Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

27

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

Placa Extracción de muestra grids

Atenuador Prisma

Laser

Selector tiempo de iones

detector Lineal

Reflector detector Reflector

Celda de colisión

cámara vacío

vacío Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

28

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) reflectrón

Kompact Maldi IV – Shimadzu-Kratos Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

29

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Resolución y precisión en la determinación de melitina Resolution = 18100

15 ppm error

8000

6000

Resolution = 14200 Counts

24 ppm error 4000

Resolution = 4500 2000

55 ppm error 0

2840

2845

2850

Mass Exactas (m/z) Facultad de Ciencias y Naturales UBA

2855

30

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Mejoras en la resolución por DE Linear mode Reflector mode Modo lineal

delayed extraction R=1,100

10600

10800

Modo reflectrón

continuous extraction R=125

11000

11200

11400

11600

continuous extraction R=650

delayed extraction R=11,000

6130

6140

6150

6160

6170

m/z

m/z

muestra: mezcla de ADN (36-mer)

muestra: mezcla de ADN (20-mer)

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

31

Analizadores

Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) Características generales: Límite de m/z: ilimitada

API

Resolución: relativa s/lineal o reflectrón (10000) Se puede acoplar a otros analizadores (TOF, Q, LT, BE) y a pocas fuentes de ionización (MALDI) Lím. detección: 1-10 pg Velocidad de scaneo: muy rápida (> 106 u/s) Más difícil realizar EM/EM sin otros analizadores

Símbolo

Requerimiento de vacío: 10-7 torr (mín) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

Reflectrón

Lineal 32

Analizadores

Espectrometría de masa tándem con un Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF)

PSD (post-source decay) ¨Prompt fragmentation¨ : indistinguible en tiempo y espacio del evento de la ionización. Fragmentación metaestable (cuando ocurre en la zona de aceleración es perjudicial) Fragmentación post-fuente (Post-source fragmentation) Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

33

Analizadores

Espectrometría de masa tándem con un Analizador de Tiempo de Vuelo (TOF) TOF-TOF

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

34

Tandem

Híbridos

Q-TOF

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

35

Tandem

Híbridos

Q-TOF Removeable Sample cone

Extraction cone

Z-Spray Ion source

Transfer optics

Quadrupole (resolving)

Hexapole (collision cell) Reflectron

Waters-Micromass

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

¨modo V¨ 36

Tandem

Híbridos

Q-TOF

Waters-Micromass

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

¨modo W¨ 37

Tandem

Híbridos Ions in P u s h e r

Q-TOF V2

V1 V1 > V2

“W” Mirror MCP Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

38

Tandem

Híbridos

Q-TOF peptideo HR argentina2 69 (3.182) M3 [Ev-130948,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp); Cm (60:77) 1206.733 100

TOF MS ES+ 3.47e4

Espectro ESI de una mezcla de péptidos

%

2003.204 2017.231 1914.172 1220.740 1286.338

1387.857

1300

1400

2031.243

1900.182

0

mass 1200

1500

1600

1700

1800

1900

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

2000

2100

39

Tandem

Híbridos

Q-TOF peptideo CID950 argentina5 MaxEnt 3 7 [Ev-82828,It50,En1] (0.050,200.00,0.200,1400.00,2,Cmp)

1: TOF MSMS 950.00ES+ 1588.97

100

Espectro ESI MS/MS del ion m/z 1900

1503.92 1602.99 %

1517.93

1178.73 1192.75 411.26 527.33 541.34

312.21326.21 213.13 298.19 0

72.08 85.09 100

793.48 810.51 652.40

442.27 524.31

779.47

542.28

1900.16(M+H) +

1062.66

878.54

977.60 1048.65

1107.69

1404.85 1617.00

1291.78

1801.10

1907.04 M/z

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

1500

1600

1700

1800

1900

40

Tandem

MS/MS en un TOF

TOF - Modo reflectrón (ReTOF)

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

41

Tandem

MS/MS en un TOF

Post-Source Decay (PSD)

[M+H]+

100 75 50 25

80

Iones PSD de masas bajas

85

90

95

t/m

100 105 110 115

Iones PSD de masas altas

Ion molecular Precursor

Detector DE MALDI target

Ion gate

U1

Uacc Up

U2

Región libre de campo Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

42

Tandem

MS/MS en un TOF

Post-Source Decay (PSD) Selección de precursor (¨Ion gating¨)

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43

Tandem

MS/MS en un TOF

Post-Source Decay (PSD) (mpH)+ (mpH) v = (m1H) v + m2 v E0 = 0.5 (mpH) v2 E 1 = E0

(m1H)+ + m2 J

en modo lineal llegan a igual tiempo

v2 = 2 E0 / (mpH) m1H / mpH

E1 = 0.5 (m1H) v2

en modo reflectrón se diferencia mpH+ de sus fragmentos

Inconveniente: no se enfocan convenientemente Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

44

Tandem

MS/MS en un TOF

Post-Source Decay (PSD) Espejo PSD R = 1.00 ___ MH+ (PM 1000) enfocado ---- AH+ (PM 700) no enfocado ..... BH+ (PM 300) no enfocado Espejo PSD R = 0.7 ___ MH+ (PM 1000) no enfocado ---- AH+ (PM 700) enfocado ..... BH+ (PM 300) no enfocado Espejo PSD R = 0.3 ___ MH+ (PM 1000) no enfocado ---- AH+ (PM 700) no enfocado ..... BH+ (PM 300) enfocado Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

45

Tandem

MS/MS en un TOF

Post-Source Decay (PSD)

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

46

Tandem

MS/MS en un TOF

Post-Source Decay (PSD) Reflectrón de campo curvo: permite obtener el espectro completo de fragmentos

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47

Tandem

MS/MS en un TOF

PSD 14000 P

G

R

F

PF

S

R b8886.5

Bradykinin, MW 903.47

12000

Sequence: NH2-PRGFSPFR-COOH 10000 Counts 8000

y7 807.5

402.2

P

y3

70.2

b5

748.3

486.2

371.1 419.3

6000

R

302.1

y1

112.2155.1 175.2

4000 2000

F

120.3

b1

b2 195.1

y6

b4

b3

399.2

252.2

y2

710.4

y4 468.2

506.3

332.2

790.3

b7

y5

730.4

653.2

98.1

0 100

200

300 500 y Naturales 600 Facultad de400 Ciencias Exactas UBA Mass (m/z)

700

800

90048

Bibliografía

-Time-of-Flight Mass Spectrometry. Instrumentation and Applications in Biological Research. R. J. Cotter. 1996. ACS - Time-of-Flight Mass Spectrometry and its Applications. Ed. E. W. Schlag. 1994. Elsevier - Mass Spectrometry. Principles and Applications. De Hoffmann, E., Charette, J. y Stroobant, V. 1996. John Wiley & sons Ltd. - Mass Spectrometry. J. H. Gross. 2004. Springer - Practical Organic Mass Spectrometry. Chapman J. R. 1993. John Wiley & sons Ltd - Manuales Voyager y Kompact MALDI IV

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales UBA

49