ANTI-AB NEUTRALISING REAGENT

6.3

Test procedure

6.3.1

Remove slides from refrigerator and equilibrate to room temperature.

6.3.2

Dilute two aliquots of patient sera; one in PBS and the other in AB neutralising reagent.

6.2.3

Remove slide from foil bag and place in a humid chamber (e.g. The Binding Site's Magnetic Staining Chamber Code: BD010).

6.2.4

Add 50µL of patient sera diluted in PBS and 50µL of patient sera diluted in AB neutralising reagent to appropriate wells.

6.2.5

Incubate for 30 minutes at room temperature.

6.3.6

Rinse slides with a stream of PBS. Wash slides for 5-10 minutes in PBS in a rack with agitation.

6.3.7

Blot around each well and return slide to humid chamber. Immediately add 50µL of anti human IgG AFF (monkey adsorbed) FITC conjugate. Do not leave wells uncovered for longer than 15 seconds.

6.3.8

Incubate slides for 30 minutes in the dark.

6.3.9

Rinse slides with a stream of PBS. Wash slides for 5-10 minutes in PBS in a rack with agitation.

6.3.10

Dry around the wells, add mounting media to each well and cover with a coverslip.

6.3.11

View slides under a fluorescence microscope.

For in-vitro diagnostic use Product Code: FA200 Product manufactured by: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telephone : +44 (0)121 436 1000 Fax : +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

1

INTENDED USE

This product is intended for use in eliminating or reducing the staining produced by anti-AB antibodies in indirect immunofluorescence assays utilising The Binding Site’s monkey tissue substrates. 2

SUMMARY AND EXPLANATION

Certain monkey tissues (especially oesophagus, salivary gland and pancreas) express AB antigens and the binding of anti-AB antibodies can be mistaken for a true autoantibody reaction. In oesophagus, the AB staining pattern can mimic pemphigus staining, although blood group antibodies will also stain capillaries in the oesophageal musculature. In salivary gland, ductal and capillary staining can be seen. In pancreas, acinar cell and capillary staining can be seen. Use of this neutralising reagent will reveal whether these observed staining patterns are produced by anti-AB antibodies (ref. 1). 3

REAGENTS

Anti-AB neutralising reagent contains a mixture of soluble AB antigens. It is preserved using 0.099% sodium azide and 0.02% sodium meta-arsenite. 4

This product contains sodium azide and must be handled with caution – do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive metal azides may be formed with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated. Adherence to the given procedure is recommended. Proper handling and disposal methods should be established for all potentially infective samples tested with this product; only personnel adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures. STORAGE AND STABILITY

This product should be stored at 2-8°C. It is stable until the expiry date given on the label. 6

Elimination or reduction of fluorescence when the sample is diluted in AB neutralising reagent indicates the presence of anti-AB antibodies in the sample which are binding to AB antigens in the tissue substrate. 8

LIMITATIONS

The light source, filters and optics of different makes of fluorescence microscopes will influence the sensitivity of the assay. The performance of the microscope is significantly influenced by correct maintenance especially centring of the mercury vapour lamp and changing of the lamp after the recommended period of time. This test alone should not be considered diagnostic. All other factors including the clinical history of the patients and other serological or biopsy results must also be taken into account. 9 1.

10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7

REFERENCES Bradwell A. R., et al. (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. SUMMARY OF PROCEDURE Dilute patient sera and controls in PBS and in neutralising reagent. Add control and patient samples to appropriate wells and incubate at room temperature for 30 minutes. Wash slides in PBS for 5-10 minutes. Add anti human IgG AFF (MA) FITC to each well and incubate for 30 minutes in the dark. Wash slides in PBS for 5-10 minutes. Mount slides. View under a fluorescence microscope.

METHODOLOGY

6.1

Materials Supplied

6.1.1 6.1.2

5mL anti-AB Neutralising Reagent. Product insert.

6.2

Additional materials required

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Substrate slides Phosphate buffered saline (PBS) Humid chamber for incubation steps Anti-human IgG AFF (monkey adsorbed) FITC conjugate Mounting media and coverslips Fluorescence microscope with 495nm-exciter filter and 515nm barrier filter Optional: Use of The Binding Site's anti-AB "false positive" control serum (code: BP221) may also help differentiate anti-AB reactions from true autoantibody staining

6.2.7

RESULTS

CAUTION

This product contains 0.099% sodium azide and 0.02% sodium metaarsenite as preservatives.

5

7

Insert Code: HIN130, Version: 23rd October 2008 Page 1 of 6

ANTI-AB NEUTRALISIERUNGSREAGENZ

Nur zur in-vitro Diagnostik

6.2

Zusätzlich benötigte, nicht gelieferte Materialien

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Substrat-Objektträger Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Feuchte Kammer für die Inkubationsschritte Anti-human Ig AFF (MA) FITC Konjugate Eindeckmedium und Deckgläschen Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter Optional: TBS anti-AB-‘Falsch-positives’-Kontrollserum (BestellNr.: BP221) zur Unterscheidung einer anti-AB-Antigen-Reaktion von einem wahren Autoantikörpermuster

6.2.7

Bestell-Nr.: FA200 In England hergestellt von: The Binding Site, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, United Kingdom. www.bindingsite.co.uk Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D-68723 Schwetzingen, Deutschland. Telefon : +49 (0) 6202 92 62 0 Fax : +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: [email protected]

1

VERWENDUNGSZWECK

Dieses Produkt dient zur Reduktion der Fluoreszenzfärbung, die durch antiBlutgruppen-AB-Antikörper (Anti-AB) in der indirekten Immunfluoreszenz auf Affen-Gefrierschnitten von The Binding Site (TBS) auftreten können. 2

WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN

Dieses Produkt enthält 0,099% Natriumazid und 0,02% Natrium-MetaArsenit als Konservierungsmittel. Dieses Produkt enthält Natriumazid und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Bleioder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiöses Material entsprechen und der Test nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. Dieses Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal für den angegebenen Verwendzungszweck verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen. Die zu untersuchenden Patientenseren sollten als potentiell infektiös angesehen werden – entsprechende Umgangs- und Entsorgungsmethoden beachten. Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden. 5

LAGERUNG UND STABILITÄT

6.1

Objektträger aus dem Kühlschrank nehmen und auf Raumtemperatur erwärmen lassen.

6.3.2

Von jedem Patientenserum und des anti-AB ‘Falsch-Positives’ Kontrollserum je 2 Aliquots verdünnen: ein Aliquot mit PBSPuffer und das andere mit dem Anti-AB-Neutralisierungsreagenz.

6.3.3

Die Objektträger aus dem Folienbeutel nehmen, beschriften und in eine feuchte Kammer (z.B. TBS magnetische Färbekammer, Bestell-Nr.: BD010) legen.

6.3.4

Je 50µL der beiden Aliquots auf die jeweiligen Felder auftragen.

6.3.5

30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

6.3.6

Die Objektträger aus der feuchten Kammer nehmen und rasch mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen. Dabei nicht direkt in die Auftragsfelder spritzen. Die Objektträger anschließend 5–10 min. in einem PBS-Bad unter Schütteln waschen.

6.3.7

Objektträger aus dem Bad nehmen und überschüssigen Puffer abschütteln. Objektträger um die Auftragsstellen herum abtrockenen und wieder in die feuchte Kammer legen. Sofort, d.h. innerhalb von 15 sec. 50µL des anti-human-FITCKonjugats auftragen.

6.3.8

30 min. im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.

6.3.9

Waschen der Objektträger wie unter 6.3.5 beschrieben.

6.3.10

Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen und rasch um die Auftragsstellen herum abtrocknen und jeweils 1 Tropfen Eindeckmedium auf die Auftragsstellen tropfen. Das Deckgläschen sorgfältig auflegen.

6.3.11

Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten.

7

8

Dieser Test allein ist nicht als diagnostischer Beweis ausreichend. Alle Ergebnisse sollten immer nur im Zusammenhang mit anderen Laborbefunden (Serologie, Biopsien) und dem klinischen Bild des Patienten betrachtet werden. 9 1.

10.1

10.3 10.4

Gelieferte Materialien

GRENZEN DER METHODE

Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst.

10.2

TESTDURCHFÜHRUNG

ERGEBNISSSE

Ist bei einem Aliquot, das mit dem Anti-AB-Neutralisierungsreagenz verdünnt wurde, die Fluoreszenz im Vergleich zu dem PBS-Aliquot reduziert, oder vollständig entfernt, ist dies als Hinweis auf Anti-AB-Antikörper in der Probe zu werten.

10

Dieses Produkt bei 2-8°C lagern. Es ist so bis zum auf dem Etikett angebenen Haltbarkeitsdatum stabil 6

6.3.1

REAGENZIEN

Das Anti-AB-Neutralisierungs-Reagenz enthält eine Mischung von löslichen AB-Antigenen. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid und 0,02% Natrium-Meta-Arsenit. 4

Testdurchführung

EINFÜHRUNG

Verschiedene Affengewebe, besonders Oesophagus, Speicheldrüse und Pankreas exprimieren AB-Antigene. Durch die Bindung von anti-ABAntikörper aus dem Patientenserum kann dies als Autoantikörper-Reaktion missinterpretiert werden. Auf dem Oesophagus kann das AB-Fluoreszenzmuster ein Pemphigus-Muster vortäuschen, wobei aber die BlutgruppenAntikörper auch die Kapillaren in der Muskulatur des Oesophagus anfärben. In der Speicheldrüse tritt eine Färbung der Ausführungsgänge und der Kapillaren auf. Im Pankreas wird eine Färbung der Azini-Zellen und der Kapillaren gefunden. Durch die Verwendung dieses Neutralisierungsreagenz kann gezeigt werden ob die beobachteten Fluoreszenzmuster durch Anti-AB-Antikörper verursacht werden (Ref. 1). 3

6.3

6.1.1 5mL anti-AB Neutralising Reagent (anti-AB Neutralisierungs-Reagenz) 6.1.2 Arbeitsanleitung. 10.5 10.6 10.7

REFERENZEN Bradwell A. R., et al. (1999) Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK KURZANLEITUNG Patientenseren und Kontrollen mit PBS und Anti-ABNeutralisierungsreagenz verdünnen. Kontrollen und Patientenproben auf einen geeigneten Objektträger auftragen. 30 min. bei Raumtemperatur inkubieren.. Objektträger 5-10 min. mit PBS-Puffer waschen. Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum gut abtrocknen und anti-human-IgG-AFF-FITC-Konjugat auf jede Auftragsstelle tropfen. 30 min. bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Objektträger 5-10 min. mit PBS-Puffer waschen. Objektträger eindecken und Deckgläschen aufsetzen. Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten.

Insert Code: HIN130, Version: 23rd October 2008 Page 2 of 6

REACTIF NEUTRALISANT ANTI-AB Pour une utilisation en diagnostic in-vitro Référence : FA200

6.3

Procédure

6.3.1

Sortir les lames du réfrigerateur et les ramener à température ambiante.

6.3.2

Diluer deux aliquots des sérums de patient ; un dans le PBS et l’autre dans le réactif neutralisant AB.

6.2.3

Sortier les lames de leur emballage et les placer en chambre humide (The Binding Site, référence BD010).

6.2.4

Déposer 50µL de sérum de patient dilué dans le PBS et 50µL de sérum de patient dilué dans le réactif neutralisant AB dans les puitqs appropriés.

6.3.5

Incuber 30 minutes à température ambiante.

6.3.6

Rincer les lames avec un jet de tampon PBS. Laver les lames 5 à 10 minutes dans du tampon PBS sous agitation.

6.3.1

Sécher le pourtour de chaque puits et remettre la lame en chambre humide. Ajouter immédiatement 50µL par puits de conjugué IgG AFF FITC (asorbé sur singe). Ne pas laisser les puits non couverts plus de 15 secondes.

6.3.8

Incuber les lames 30 minutes à l’obscurité.

6.3.9

Rincer les lames avec un jet de tampon PBS. Laver les lames 5 à 10 minutes dans du tampon PBS sous agitation.

6.3.10

Sécher le pourtour des puits et ajouter du milieu de montage dans chaque puits et couvrir la lame d’une lamelle.

6.3.11

Observer les lames sous microscope à fluorescence.

Produits fabriqués en Angleterre par la société : The Binding Site, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, United Kingdom. Distribués en France par la société : The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 St-Egrève Cedex The Binding Site, France Téléphone : 04.38.02.19.19. Fax : 04.38.02.19.20. e-mail : [email protected]

1

UTILISATION

Ce réactif est spécialement conçu pour éliminer ou réduire le bruit de fond produit par des anticorps anti-AB en immunofluorescence indirecte sur coupes de tissus de singe de la société The Binding Site. 2

PRESENTATION

Certains tissus de singe (en particulier l’oesophage, les glandes salivaires et le pancréas) expriment des antigènes AB et la liaison des anticorps antiAB peut être confondue avec une réelle réaction d’autoanticorps. Dans l’œsophage, l’aspect du marquage des anticorps anti-AB mime l’aspect pemphigus bienque les anticorps anti-groupes sanguins marquent également les capilaires du muscle de l’oesophage. Dans les glandes salivaires, un marquage des capilaires peut également être rencontré. Il en est de même pour les capilaires et les acinis du pancréas. L’utilisation de ce réactif neutralisant permet de savoir si les marquages observés sont produits par les anticorps anti-AB (réf. 1). 3

REACTIF

Ce réactif neutralisant anti-AB contient un mélange d’antigènes solubles AB. Conservateurs : 0,099% d’azide de sodium, 0,02% de méta-arsenite de sodium. 4

7

Si vous observez une élimination ou une diminution de la fluorescence avec l’échantillon dilué dans le réactif neutralisant AB, ceci indique la présence d’anticorps anti-AB dans l’échantillon qui se sont liés aux antigènes AB présents dans le tissu. 8

Ce test ne permet pas d’établir de diagnostic. D’autres facteurs incluant l’historique clinique des patients et d’autres résultats sérologiques ou biopsies doivent être pris en considération.

PRECAUTIONS

9

Ne pas ingérer ou mettre ce réactif en contact avec la peau ou les muqueuses. En cas de contact, rincer à grande eau et consulter un médecin. Des azides de métaux explosifs peuvent se former en présence de cuivre ou de plomb. Lors de l’évacuation des réactifs, rincer à grande eau afin d’éviter leurs formations.

1.

Ce réactif doit être utilisé par du personnel qualifié. Il est recommandé de suivre le protocole indiqué. Les échantillons testés pouvant être potentiellement infectieux, il est recommandé de les manipuler avec précaution. Seul un personnel formé est autorisé à utiliser ce réactif.

10.1

STOCKAGE ET STABILITE

Ce réactif doit être stocké à 2-8°C. Il est stable jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette du flacon. 6

10

10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7

REFERENCE Bradwell A. R., et al. (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. RESUME DE LA PROCEDURE Diluer les sérums de patients et les contrôles dans le PBS et dans le réactif neutralisant. Ajouter les sérums de patients et les contrôles et incuber 30 minutes à température ambiante. Laver les lames en PBS 5 à 10 minutes. Ajouter le conjugué IgG AFF FITC (asorbé sur singe) à chaque puits et incuber 30 minutes dans l’obscurité. Laver les lames dans un tampon PBS 5 à 10 minutes. Monter les lames. Observer les lames sous microscope à fluorescence.

METHODOLOGIE

6.1

Matériel fourni

6.1.1 6.1.2

5mL anti-AB Neutralising Reagent (réactif neutralisant anti-AB) Fiche technique

6.2

Matériel nécessaire et non fourni

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Lames de singe Tampon PBS Chambre humide pour les étapes d’incubation Conjugué FITC (MA) anti-immunoglobulines humaines Milieu de montage et lamelles Microscope à fluorescence (filtre excitant : 495nm, filtre barrière : 515nm) Optionnel : L’utilisation du sérum de contrôle “faux-positif” antiAB (référence : BP221) peut aider à différencier les réactions anti-AB du vrai marquage des autoanticorps

6.2.7

LIMITES

La source de lumière, les filtres et les optiques du microscope influencent la sensibilité du test. Les performances du microscope sont significativement influencées par une maintenance correcte en particulier par le centrage de la lampe à vapeur de mercure et le changement de la lampe après la période recommandée.

Ce réactif contient 0,099% d’azide de sodium et 0,02% de métaarsenite de sodium comme conservateurs.

5

RESULTATS

Insert Code: HIN130, Version: 23rd October 2008 Page 3 of 6

REACTIVO NEUTRALIZANTE ANTI-AB Spanish

Para diagnóstico in-vitro Código: FA200 Producto fabricado por: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk The Binding Site sucursal en España, C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected] web: www.bindingsite.es

1

UTILIZACIÓN

Este producto está preparado para eliminar o reducir el marcaje producido por anticuerpos anti-AB en ensayos de inmunofluorescencia indirecta al utilizar sustratos de tejidos de mono de Binding Site. 2

RESUMEN Y EXPLICACIÓN

Algunos tejidos de mono (especialmente esófago, glándula salivar y páncreas) expresan antígenos AB y la unión de anticuerpos anti-AB puede confundirse con una reacción real de auto-anticuerpos. En el esófago, el patrón de tinción de AB puede ser similar al patrón de pénfigo, aunque los anticuerpos de grupo sanguíneo marcarán también los capilares de la musculatura del esófago. En la glándula salivar se observa una tinción en conductos y capilares. En el páncreas se observa una tinción en las células de los acinos pancreáticos y en los capilares. La utilización de este reactivo neutralizante indicará si los patrones de tinción observados son debidos a anticuerpos anti-AB (ref. 1). 3

REACTIVOS

El reactivo neutralizante anti-AB contiene una mezcla de antígenos AB solubles. Contiene azida sódica 0,099% y meta-arsenito sódico 0,02% como conservantes. 4

PRECAUCIONES

Este producto contiene azida sódica 0,099% y meta-arsenito sódico 0,02% como conservantes. El producto contiene azida sódica como conservante y debe ser manipulado con precaución, evitando su ingestión y el contacto directo con la piel y mucosas. Si se diera dicho contacto, lavar con abundante agua y consultar al médico. Pueden formarse azidas explosivas en contacto con el cobre y plomo de los desagües, al eliminar el reactivo dejar correr abundantes cantidades de agua para evitar la formación de dichos compuestos. Este producto debe ser utilizado únicamente por personas correctamente entrenadas para el fin indicado. Se recomienda seguir el procedimiento descrito. Deben establecerse procedimientos adecuados para la manipulación y eliminación de todas las muestras potencialmente infecciosas ensayadas con este producto, y únicamente personal con entrenamiento adecuado debe llevar a cabo dichos procedimientos. 5

METODOLOGÍA

Retire los portaobjetos del frigorífico y equilibre a temperatura ambiente.

6.3.2

Diluya dos alícuotas del suero del paciente, una en PBS y otra en el reactivo neutralizante AB.

6.3.3

Saque el portaobjetos de la bolsa y colóquelo en la cámara húmeda (como la Cámara Magnética de Binding Site, código BD010).

6.3.4

Añada 50µL del suero del paciente diluido en PBS y 50µL del suero del paciente diluido en reactivo neutralizante AB en los pocillos correspondientes.

6.3.5

Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

6.3.6

Lave los portaobjetos con un chorro de PBS. Lave los portaobjetos durante 5-10 minutos por inmersión en PBS y con agitación.

6.3.7

Seque alrededor de cada pocillo y vuelva a colocar el portaobjetos en la cámara húmeda. Añada inmediatamente 50µL de conjugado IgG anti-humano AFF (adsorbido para mono) FITC. No deje los pocillos sin cubrir durante más de 15 segundos.

6.3.8

Incube los portaobjetos durante 30 minutos en la oscuridad.

6.3.9

Lave los portaobjetos con un chorro de PBS. Lave los portaobjetos durante 5-10 minutos por inmersión en PBS y con agitación.

6.3.10

Seque alrededor de los pocillos, añada medio de montaje en cada pocillo y cubra con un cubreobjetos.

6.3.11

Observe los fluorescencia.

7

Material suministrado

6.1.1 6.1.2

5mL Reactivo neutralizante anti-AB. Hoja de instrucciones.

6.2

Material adicional requerido

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Portaobjetos de sustrato Tampón fosfato (PBS) Cámara húmeda para los pasos de incubación Conjugado IgG anti-humano AFF (adsorbido para mono) FITC. Medio de montaje y cubreobjetos Microscopio de fluorescencia con un filtro de excitación de 495nm y un filtro barrera de 515nm Opcional: la utilización del suero control “falso positivo” anti-AB (código BP221) de Binding Site también puede ayudar a diferenciar las reacciones anti-AB de los marcajes de autoanticuerpos verdaderos

portaobjetos

utilizando

un

microscopio

de

RESULTADOS

La eliminación o reducción de la fluorescencia cuando una muestra se diluye en reactivo neutralizante AB, indica la presencia de anticuerpos antiAB en la misma, que se han unido a los antígenos AB presentes en el sustrato. 8

LIMITACIONES

La fuente de luz, filtros y ópticas de marcas distintas de microscopios de fluorescencia influyen en la sensibilidad del ensayo. La funcionalidad del microscopio está influida de modo significativo por su correcto mantenimiento, sobre todo por el centrado de la lámpara de vapor de mercurio y por el cambio de la lámpara tras el periodo de tiempo recomendado. No puede establecerse un diagnóstico basado únicamente en los resultados de este test. Deben tenerse en cuenta también el resto de factores, como la historia clínica, otros resultados serológicos o biopsias. 9 1.

10

10.3 10.4 10.5 10.6 10.7

6.1

6.2.7

Procedimiento de ensayo

6.3.1

10.1 10.2

CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD

El producto ha de conservarse a 2-8ºC y es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. 6

6.3

BIBLIOGRAFÍA Bradwell A. R., et al. (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. RESUMEN DEL PROCEDIMIENTO Diluya muestras y controles en PBS y reactivo neutralizante. Añada control y muestras a los pocillos e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos en PBS durante 5-10 minutos. Añada conjugado IgG anti-humano (MA) FITC en cada pocillo e incube durante 30 minutos en la oscuridad. Lave los portaobjetos en PBS durante 5-10 minutos. Monte los portaobjetos. Observe con un microscopio de fluorescencia.

Insert Code: HIN130, Version: 23rd October 2008 Page 4 of 6

6.3

Procedimento do teste

6.3.1

Retirar as lâminas do frigorífico para que estas fiquem à temperatura ambiente.

Para diagnóstico in vitro

6.3.2

Diluir duas aliquotas do soro do doente; uma em PBS e outra em reagente neutralizante AB.

Código do Produto: FA200

6.3.3

Retirar as lâminas do invólucro de alumínio e colocar na câmara húmida (ex. Magnetic Staining Chamber da The Binding Site, Cod. BD010).

6.3.4

Adicionar 50µL do soro do doente em PBS e 50µL de soro diluido em reagente neutralizante AB nos poços respectivos.

6.3.5

Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente.

6.3.6

Lavar com um esguicho de PBS. Colocar as lâminas numa rack e lavá-las durante 5-10 minutos, agitando.

6.3.7

Passar à volta com papel absorvente (blotter) e recolocar na câmara húmida. Adicionar, de imediato, 50µL de conjugado de IgG anti-humana AFF com FITC. Não deixar os poços descobertos por mais de 15 segundos.

6.3.8

Incubar durante 30 minutos no escuro.

6.3.9

Lavar com um esguicho de PBS. Colocar as lâminas numa rack e lavá-las durante 5-10 minutos, agitando.

6.3.10

Passar à volta com papel absorvente (blotter), adicionar o meio de montagem a cada poço e cobrir com uma lamela.

6.3.11

Visualizar as lâminas no microscópio de fluorescência.

REAGENTE NEUTRALISANTE ANTI-AB Portuguese

Produto fabricado por: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telefone: +44 (0)121 436 1000 Fax : +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

1

UTILIZAÇÃO

Este reagente é utilizado na eliminação ou redução da coloração provocada pelos anticorpos anti-AB em testes de imunofluorescência indirecta com a utilização de substratos de tecido de macaco da The Binding Site. 2

RESUMO E EXPLICAÇÃO

Certos tecidos provenientes do macaco (nomeadamente do esófago, da glândula salivar e pâncreas) contêm antigénios AB, podendo assim provocar uma confusão entre a ligação dos anticorpos anti-AB e a verdadeira reacção dos autoanticorpos. No esófago, o padrão de coloração AB pode ser semelhante ao padrão apresentado pelo pemphigus , apesar de que os anticorpos do grupo sanguíneo podem também marcar os tubos capilares na musculatura do esófago. Na glândula salivar, pode ser observada coloração ductal e capilar. No pâncreas, pode ser observada coloração capilar e da célula acinar. Através da utilização deste reagente neutralizante será possível verificar se estes padrões de coloração são produzidos ou não por anticorpos anti-AB (Ref. 1). 3

REAGENTES

O reagente neutralizante Anti-AB contém uma mistura solúvel de antigénios AB. Contém 0,099% de azida sódica e 0,02% de sódio meta-arsenato como conservantes. 4

PRECAUÇÕES

Este produto contém 0,099% de azida de sódio e 0,02% de sódio metaarsenato como conservantes. Este produto contêm azida de sódio como conservante, pelo que terá que ser manuseado com precaução – não ingerir nem permitir o contacto com a pele ou membranas mucosas. Se ocorrer um contacto com o produto, deve-se lavar abundantemente com água e consultar um médico. Em contacto com canalizações de chumbo ou cobre, podem-se formar sais explosivos; para evitar que tal aconteça, fazer correr abundante quantidade de água aquando da inutilização dos reagentes. Deve proceder-se a um manuseamento e métodos de inutilização adequados para todo o material potencialmente infectado e apenas a pessoal treinado adequadamente nestes métodos deverá ser permitida a execução destes procedimentos. 5

CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE

Este produto deve ser conservado entre 2-8°C. Permanece estável até a data de validade indicada no rótulo. 6

RESULTADOS

Eliminação ou redução da fluorescência, quando a amostra é diluída em reagente neutralizante AB, indica a presença de anticorpos anti-AB na amostra que se liguem aos antigénios AB no substrato do tecido. 8

LIMITAÇÕES

A fonte emissora de luz, filtros e ópticas de diferentes tipos de microscópicos fluorescentes podem influenciar a sensibilidade do teste. A performance do microscópio é influenciada de forma significativa pela manutenção correcta do microscópio principalmente no que diz respeito à lâmpada de vapor de mercúrio e mudar a mesma após a duração recomendada. Este teste só por si não pode ser considerado diagnóstico. Todos os outros factores incluindo história clínica dos doentes e outros resultados serológicos ou biopsias também devem ser considerados. 9 1.

10 10.1 10.2 10.3 10.4 10.5 10.6 10.7

REFERENCIAS Bradwell A. R., et al. (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. RESUMO DA TÉCNICA Diluir o soro do doente juntamente com os controlos em PBS e em reagente neutralizante. Adicionar o controlo e as amostras nos poços apropriados e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. Lavar as lâminas em PBS durante 5-10 minutos. Adicionar conjugado de IgG anti humana AFF (MA) com FITC em cada poço e incubar durante 30 minutos no escuro. Lavar as lâminas em PBS durante 5-10 minutos. Montar as lâminas. Visualizar as lâminas no microscópio de fluorescência.

METODOLOGIA

6.1

Material fornecido

6.1.1 6.1.2

5mL anti-AB Neutralising Reagent Folheto de Instruções.

6.2

Material adicional necessário

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Lâminas com substrato Tampão (PBS) Câmara de Húmida para as etapas de incubação Conjugado de IgG anti-humana AFF com FITC Meio de Montagem e lamelas Microscópio Fluorescente com filtro de excitação de 495nm e filtro de barreira de 515nm Opcional: A utilização do soro de controlo "falso positivo" anti-AB da The Binding Site (cod. BP221) poderá também ajudar a diferenciar as reacções anti-AB da verdadeira coloração pelos anticorpos

6.2.7

7

Insert Code: HIN130, Version: 23rd October 2008 Page 5 of 6

REAGENTE NEUTRALIZZANTE ANTI-AB Italian

6.3

Procedura

6.3.1

Togliere i vetrini dal frigorifero e portarli a temperatura ambiente.

6.3.2

Diluire due aliquote del campione di siero; una in PBS e l’altra nel reagente neutralizzante anti-AB.

6.3.3

Togliere i vetrini dalla custodia e porli in camera umida (p.e. Camera di Colorazione Magnetica, Codice BD010).

6.3.4

Dispensare 50µL del campione di siero diluito in PBS e 50µL del campione di siero diluito nel reagente neutralizzante anti-AB nei rispettivi pozzetti.

6.3.5

Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.

6.3.6

Risciacquare i vetrini con PBS da una bottiglia di plastica a pressione. Posizionare i vetrini in un rack, immergerli nel PBS e agitare per 5-10 minuti.

6.3.7

Asciugare intorno ai pozzetti con le carte assorbenti e riportare i vetrini nella camera umida. Coprire immediatamente ogni pozzetto con 50µL di coniugato anti-IgG umane AFF FITC (adsorbito con tessuto di scimmia). Non lasciare i pozzetti scoperti per oltre 15 secondi.

6.3.8

Incubare per 30 minuti al buio.

6.3.9

Risciacquare i vetrini con PBS da una bottiglia di plastica a pressione. Posizionare i vetrini in un rack, immergerli nel PBS e agitare per 5-10 minuti.

6.3.10

Asciugare intorno ai pozzetti, aggiungere la soluzione di montaggio in ciascun pozzetto e coprire con un vetrino coprioggetti.

6.3.11

Leggere i vetrini con il microscopio a fluorescenza.

Per uso diagnostico in vitro Codice Prodotto: FA200 Prodotto da: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telefono: +44 (0)121 436 1000 Fax : +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

1

INDICAZIONI

Questo prodotto è utilizzato per eliminare o ridurre la colorazione prodotta dagli anticorpi verso i gruppi sanguigni A e B nei dosaggi in immunofluorescenza indiretta su vetrini The Binding Site (TBS) con substrato di tessuto di scimmia. 2

RIASSUNTO E DESCRIZIONE

Alcuni tessuti di scimmia (in particolar modo l’esofago, le ghiandole salivari ed il pancreas) esprimono antigeni AB ed il legame degli anticorpi anti-AB può essere erroneamente scambiato per un’autentica reazione con autoanticorpi. Nell’esofago, il pattern di colorazione AB è molto simile a quello associato al pemfigo, sebbene gli anticorpi verso i gruppi sanguigni coloreranno anche i capillari della muscolatura esofagea. Nelle ghiandole salivari si potrà osservare una colorazione dei dotti e dei capillari. Nel pancreas si coloreranno le cellule acinari ed i capillari. L’utilizzo del presente reagente neutralizzante rivelerà se i suddetti pattern sono in realtà dovuti ad anticorpi anti-AB (rif.1). 3

REAGENTI

Il reagente neutralizzante anti-AB contiene una miscela di antigeni AB solubili. I conservanti utilizzati sono la sodio azide allo 0,099% e la sodio meta-arsenite allo 0,02%. 4

PRECAUZIONI

Il presente prodotto contiene sodio azide allo 0,099% e sodio metaarsenite allo 0,02% come conservanti. Il prodotto contiene sodio azide e deve essere trattato con cautela – non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici esplosivi si possono formare con il rame e il piombo; per evitare l’accumulo di tali composti, far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. Il presente prodotto deve essere utilizzato da personale specializzato. Si raccomanda di osservare la procedura del test alla lettera. È opportuno stabilire delle apposite modalità per la manipolazione e lo smaltimento di campioni potenzialmente infettivi dosati con il presente prodotto. Tali procedure dovrebbero essere eseguite solamente da personale qualificato per la gestione di materiali potenzialmente infetti. 5

CONSERVAZIONE E STABILITA’

Materiali forniti

6.1.1 6.1.2

5mL anti-AB Neutralising Regent (Reagente neutralizzante antiAB) Scheda tecnica.

6.2

Materiale necessario ma non fornito

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4

Vetrini con substrato Tampone PBS Camera umida per le fasi d’incubazione Coniugato anti-IgG umane AFF FITC (adsorbito con tessuto di scimmia) Soluzioni di montaggio e vetrini coprioggetti. Microscopio a fluorescenza con filtro a 495nm (exciter) e filtro a 515nm (barrier) Facoltativo: L’uso del siero di controllo “Falso Positivo” anti-AB The Binding Site (codice BP221) può costituire un valido aiuto nel differenziare le reazioni di tipo anti-AB dalle autentiche colorazioni attribuibili ad autoanticorpi

6.2.5 6.2.6 6.2.7

8

LIMITI DELLA PROCEDURA

La fonte luminosa, i filtri e l’ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche influiranno sulla sensibilità del kit. La performance del microscopio è influenzata notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla sostituzione della lampada a vapori di mercurio dopo il periodo di tempo consigliato. Questo test da solo non permette la formulazione di una diagnosi. E’ necessario prendere in considerazione tutti gli altri fattori compresa l’anamnesi clinica dei pazienti e altri risultati sierologici o della biopsia. 9 1.

10 10.1

10.3 10.4

METODOLOGIA

6.1

RISULTATI

La scomparsa o la riduzione della fluorescenza nel campione diluito con il reagente neutralizzante anti-AB indica la presenza in tale siero di anticorpi anti-AB che si legano agli antigeni AB sul tessuto substrato.

10.2

Il prodotto deve essere conservato a 2-8°C ed è stabile fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta. 6

7

10.5 10.6 10.7

BIBLIOGRAFIA Bradwell A. R., Stokes R. P. and Mead G. P. (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. SINTESI DELLA PROCEDURA Diluire i sieri dei pazienti e i controlli con PBS e con reagente neutralizzante. Dispensare i controlli e i sieri dei pazienti nei rispettivi pozzetti e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare i vetrini in PBS per 5-10 minuti. Aggiungere il coniugato anti-IgG umane AFF FITC (adsorbito con tessuto di scimmia) in ogni pozzetto e incubare per 30 minuti al buio. Lavare i vetrini in PBS per 5-10 minuti. Montare i vetrini. Leggere i vetrini con il microscopio a fluorescenza.

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