4

CAUTION

This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated. Adherence to the given procedure is recommended.

SHEEP ANTI-HUMAN IgG, A, M AFF FITC (Prediluted)

For In-vitro Diagnostic Use Product Code: FA002, FA002.E

This product contains sodium azide and must be handled with caution – do not ingest or allow contact with skin or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive metal azides may be formed with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up.

Product manufactured by: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk

INTENDED USE

6

This product is intended to be used on The Binding Site’s (TBS) Rodent tissue (FS013, FS014, FS015, FS313 and FS314), Monkey Oesophagus (FS208) and HEp2 (FS001) slides to assist in the qualitative determination of autoantibodies in patient serum by indirect immunofluorescence. The identification of such autoantibodies aids in the diagnosis of autoimmune diseases. Suitability for use in other IFA combinations has not been assessed but use in such assays should not necessarily be excluded. 2

PRINCIPLE

An indirect immunofluorescence technique is used where patient samples and appropriate controls are incubated with substrate tissue. The unreacted antibodies are washed off and then the conjugate is applied. Unbound conjugate is washed off as before. Slides are viewed with a fluorescence microscope and positive samples are observed as apple green fluorescence which corresponds to the antibody of interest. 3

STORAGE AND STABILITY

This product should be stored at 2-8°C. DO NOT FREEZE. It is stable until the expiry date given on the label. Slight precipitation can occur on storage which may be removed by centrifugation and should not affect the performance characteristics.

Telephone : +44 (0)121 436 1000 Fax : +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

1

5

REAGENT

Antisera is prepared by immunising sheep with IgG, IgA and IgM purified from human serum. The resulting antiserum is then delipidated and if necessary, adsorbed to monospecificity by use of solid-phase adsorbants. Following adsorption, the antisera is affinity purified by binding to the specific antigen attached to an inert matrix and eluted with chaotropic buffers. The antiserum is then conjugated with fluorescein isothiocyanate (FITC) and unreacted fluorochrome is isolated by gel filtration. This product is diluted to an optimal concentration for use in indirect immunofluorescence. Preservatives are added and the product 0.2µm filtered. Evans blue is added to FA002.E as a red counterstain.

6.1

METHODOLOGY Materials supplied FA002, FA002.E

6.1.1 6.1.2

12.5mL Anti Human IgGAM AFF FITC (Prediluted conjugate) or Anti Human IgGAM AFF FITC with Evans Blue (Prediluted conjugate). Product insert.

6.2

Additional materials required

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Substrate slides. Phosphate buffered saline (PBS). Humid chamber for incubation steps. Negative and positive control sera. Mounting media and coverslips. Fluorescence microscope with 495nm exciter filter and 515nm barrier filter.

6.3

Test procedure (refer to appropriate slide insert for full details)

6.3.1

Add one drop of FA002/FA002.E to each well. Do not leave wells uncovered for longer than 15 seconds.

7

LIMITATIONS

The light source, filters and optics of different makes of fluorescence microscopes will influence the sensitivity of the assay. The performance of the microscope is significantly influenced by correct maintenance especially centring of the mercury vapour lamp and changing of the lamp after the recommended period of time. 8

REFERENCES

1.

Bradwell A.R., et al (1997). Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

2.

Bradwell A.R., et al (1999). Advanced Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

Insert Code: CIN320, Version: 2 January 2008, Page 1 of 6

Schaf ANTI-HUMAN IgG, A, M AFF FITC (Vorverdünnt)

Zur in vitro Diagnostik Bestell-Nr.: FA002, FA002.E In England hergestellt von: The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk

Dieses Produkt enthält Natriumazid und muss mit den entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen behandelt werden. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und sich in ärztliche Behandlung geben. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. 5

Dieses Produkt bei 2-8°C lagern. NICHT EINFRIEREN. Es ist so bis zum auf dem Etikett angegebenen Datum haltbar. Während der Lagerung kann eine leichte Präzipitatbildung auftreten. Das Präzipitat durch Zentrifugation entfernen, die Produktqualität wird dadurch nicht beeinträchtigt.

Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222 e-mail: [email protected]

6 1

VERWENDUNGSZWECK

6.1

Dieses Produkt kann zusammen mit Ratten- und Mausgewebe (FS013, FS014, FS015, FS313 and FS314), Affen-Oesophagus (FS208) und HEp-2-Zellen (FS001) von The Binding Site (TBS) verwendet werden. Es dient zum qualitativen Nachweis von Autoantikörpern in Patientenseren durch die indirekte Immunfloreszenz. Die Identifikation dieser Autoantikörper unterstützt die Diagnose von Autoimmun-Erkrankungen. Die Verwendung dieses Produktes zusammen mit anderen Substraten wurde nicht geprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen. 2

TESTPRINZIP

Der Test beruht auf der indirekten ImmunfluoreszenzTechnik. Das Patientenserum und entsprechende Kontrollen werden mit dem Substrat inkubiert. In einem Waschschritt werden die nicht reagierenden Antikörper entfernt und dann das Fluoreszein-Konjugat zugegeben. Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Die Beurteilung der Objektträger erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen im Bereich der Bindungsstellen zwischen dem Substrat und den Antikörpern eine apfelgrüne Fluoreszenz. 3

Bei dem Produkt mit der Bestell-Nr.: FA002.E wird Evans Blue für die Gegenfärbung (Rotfärbung) hinzugefügt. WARNUNGEN

TESTDURCHFÜHRUNG Gelieferte Materialien FA002, FA002.E

6.1.1

6.1.2

12,5mL Anti Human IgGAM-AFF FITC (Prediluted conjugate) oder Anti Human IgGAM-AFF FITC with Evans Blue (Prediluted conjugate) (vorverdünntes Konjugat). Arbeitsanleitung.

6.2

Zusätzlich benötigte Materialien

6.2.1 6.2.2

Substrat-Objektträger. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBSPuffer). Feuchte Kammer für die Inkubationen. Negativ- und Positivkontrollseren. Eindeckmedium und Deckgläschen. Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter.

6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.3

Testdurchführung (Detailangaben siehe spezifische Arbeitsanleitung).

6.3.1

Je einen Tropfen FA002/FA002.E auf jedes Well geben. Auftragsstellen nicht länger als 15 Sekunden unbedeckt lassen.

REAGENZIEN

Das Antiserum wird durch Immunisierung von Schafen mit gereinigtem, humanem IgG, IgA und IgM gewonnen. Das Antiserum wird delipidisiert und bei Bedarf durch Festphasen-Adsorption bis zur Monospezifität gereinigt. Nach der Adsorption wird das Antiserum affinitätsgereinigt, dazu wird das spezifische Antigen an eine inerte Matrix gebunden und anschließend mit einem chaotropen Puffer eluiert. Anschließend wird das Antiserum mit FluoreszeinIsothiocyanat konjugiert und das ungebundene Fluorochrom durch Gelfiltration entfernt. Das Reaktionsprodukt (Konjugat) wird optimal für die Verwendung in der indirekten Immunfluoreszenz verdünnt, mit Konservierungsstoffen versetzt und durch einen 0,2µm Fliter filtriert.

4

LAGERUNG UND STABILITÄT

7

GRENZEN DES TESTS

Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst. 8 1. 2.

REFERENZEN Bradwell A.R., et al (1997) Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. Bradwell A.R., et al (1999) Advanced Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

Dieses Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen.

Insert Code: CIN320, Version: 2 January 2008, Page 2 of 6

4

CONJUGUE AFF FITC DE MOUTON ANTI IgG, A, M HUMAINES (Prédilué)

Pour usage in vitro diagnostic Références : FA002, FA002.E Produit fabriqué en Angleterre par la société : The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Distribués en France par la société : The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex. Téléphone : 04.38.02.19.19 Fax : 04.38.02.19.20 e-mail : [email protected]

1

UTILISATION

Ces conjugués doivent être utilisés en conjonction avec les lames The Binding Site suivantes : tissus de rongeurs (réf. FS013, FS014, FS015, FS313 et FS314), lames d’œsophage de singe (FS208) et lames Hep2 (FS001) pour la détermination qualitative des autoanticorps dans le sérum humain en immunofluorescence indirecte. L’identification de tels anticorps apporte une aide dans le diagnostic des maladies autoimmunes. L’utilisation de ces réactifs pour d’autres tests en immunofluorescence indirecte n’a pas été évaluée mais ne doit pas être nécessairement exclue. 2

PRINCIPE

Une technique d’immunofluorescence indirecte est utilisée lorque les sérums et les contrôles appropriés sont incubés avec les lames de tissus. Les anticorps non fixés sont éliminés par lavage et le conjugué est déposé. Le conjugué non lié est également éliminé par lavage. Les lames sont ensuite observées sous microscope. Les sérums positifs présentent une fluorescence verte qui correspond à l’anticorps recherché. 3

REACTIF

L’antisérum est préparé en immunisant un mouton avec des IgG, IgA et IgM purifiées à partir de sérum humain. L’antisérum qui en résulte est délipidé et si nécessaire adsorbé de façon monospécifique en utilisant des adsorbants en phase solide. Après l’adsorption, l’antisérum est purifié par affinité par liaison de l’antigène spécifique à une matrice inerte, il est élué avec des tampons chaotropiques. L’antisérum est ensuite conjugué à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et le fluorochrome non fixé est isolé par filtration sur gel. Le conjugué est dilué à une concentration optimale pour être utilisé en immunofluorescence indirecte . Des conservateurs sont ajoutés et le produit est filtré à 0,2µm.

PRECAUTIONS

Ce produit doit être manipulé par des personnes compétentes en techniques de laboratoire. Il est recommandé de suivre scrupuleusement la procédure d’utilisation. Ce réactif contient de l’azide de sodium, il doit donc être utilisé avec précaution. Ne pas ingérer ou mettre en contact avec la peau ou les muqueuses. En cas de contact, laver à grande eau et consulter un médecin. Des azides de métaux explosifs peuvent se former avec le cuivre et le plomb, laver à grande eau les récipients afin d’éviter la formation des azides de métaux. 5

STOCKAGE ET STABILITE

Ces produits doivent être stockés à 2-8°C dès leur réception, ne pas congeler. Ils sont stables jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette du flacon. De faibles précipitations peuvent avoir lieu lors du stockage qui peuvent être éliminées par centrifugation, ceci n’affecte en rien les performances des réactifs. 6 6.1

METHODOLOGIE Matériel fourni FA002, FA002.E

6.1.1

6.1.2

12,5mL Anti Human IgGAM AFF FITC (Prediluted conjugate) ou Anti Human IgGAM AFF FITC with Evans Blue (Prediluted conjugate) (conjugué prédilué). Fiche technique.

6.2

Matériel nécessaire et non fourni

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Lames. Tampon PBS. Chambre humide (pour les étapes d’incubation). Contrôles négatif et positif. Milieu de montage et lamelles. Microscope avec filtre excitant à 495nm et filtre barrière à 515nm.

6.3

Procédure (cf. fiche technique des lames)

6.3.1

Ajouter une goutte de FA002/FA002.E à chaque puits. Ne pas laisser les puits non couverts plus de 15 secondes.

7

LIMITES

La source lumineuse, les filtres et les optiques des microscopes influent sur la sensibilité du test. Les performances du microscope dépendent de la qualité de la maintenance (changement de la lampe). 8

BIBLIOGRAPHIE

1.

Bradwell A.R., et al (1997). Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

2.

Bradwell A.R., et al (1999). Advanced Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

Du bleu d’Evans est ajouté à la référence FA002.E comme contre-colorant.

Insert Code: CIN320, Version: 2 January 2008, Page 3 of 6

IgG, A, M ANTI-HUMANO DE OVEJA FITC PURIFICADA POR AFINIDAD (prediluído)

Este producto contiene azida sódica y se debe manipular con precaución: no ingerir y evitar el contacto con piel o mucosas. En caso de contacto, lavar con agua abundante y consultar al médico. Las azidas de metal explosivo pueden contener metal o cobre; antes de desechar los reactivos, enjuáguelos con agua abundante para prevenir la formación de azida.

Para uso diagnóstico in-vitro Código de Producto: FA002, FA002.E Producto fabricado por: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk The Binding Site sucursal en España, C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected] web: www.bindingsite.es

5

ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO

Este producto se debe almacenar a 2-8°C. NO CONGELAR. Es estable hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Puede darse una ligera precipitación durante el almacenamiento que se puede eliminar por centrifugación y que no afecta a las características del funcionamiento. 6 6.1

METODOLOGÍA Materiales suministrados FA002, FA002.E

1

APLICACIÓN

6.1.1

Este producto está diseñado para su uso conjunto con tejido de roedor (FS013, FS014, FS015, FS313 y FS314), esófago de mono (FS208), y portas HEp2 (FS001) de The Binding Site (TBS) como ayuda en la determinación cualitativa de autoanticuerpos en suero por inmunofluorescencia indirecta. La identificación de estos autoanticuerpos ayuda al diagnóstico de enfermedades autoinmunes. No se ha analizado su compatibilidad de uso con otras combinaciones IFA pero no son necesariamente excluibles entre sí. 2

PRINCIPIO

Se usa una técnica de inmunofluorescencia indirecta mediante la que se incuban con tejido de substrato las muestras del paciente y los controles apropiados. Se eliminan los anticuerpos no reactivos y se aplica el conjugado. El conjugado no enlazado se elimina. Al examinar las placas con un microscopio de fluorescencia las muestras positivas se ven en color verde fluorescente correspondiente al anticuerpo en cuestión. 3

REACTIVO

6.2

Materiales adicionales requeridos

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Portaobjetos de sustrato. Buffer fosfato salino (PBS). Cámara húmeda para incubación. Sueros de control positivo y negativo. Material de montaje y cubreobjetos. Microscopio de fluorescencia con un filtro excitador de 495nm y un filtro de barrera de 515nm.

6.3

Procedimiento de la prueba (Consultar las instrucciones de los portaobjetos para más información) Añadir una gota de FA002/FA002.E a cada pocillo. No dejar los pocillos sin cubrir durante más de 15 segundos.

6.3.1

7

El antisuero se prepara inmunizando suero de oveja con IgG, IgA e IgM purificado procedente de suero humano. El antisuero resultante se deslipemiza y, si es necesario, se absorbe a monospecificidad mediante absorbentes de fase sólida. Tras la absorción, el antisuero se purifica por afinidad uniéndolo al antígeno específico adjunto a una matriz inerte y se elude con buffers caotrópicos. A continuación se conjuga el antisuero con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y el fluorocromo no reactivo se aísla por filtración en gel. Este producto está diluído a una concentración óptima para su uso en inmunofluorescencia indirecta. Contiene conservantes añadidos y está filtrado al 0,2µm. FA002.E contiene azul de Evans como tinción. 4

6.1.2

12,5mL Anti Human IgGAM AFF FITC (Prediluted conjugate o Anti Human IgGAM AFF FITC with Evans Blue (Prediluted conjugate) (Conjugado prediluído o conjugado prediluído con azul de Evans). Instrucciones del producto.

PRECAUCIÓN

LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

La fuente de luz, los filtros y objetivos de los diferentes tipos de microscopios de fluorescencia influirán en la sensibilidad del ensayo. El funcionamiento del microscopio depende considerablemente de su correcto mantenimiento, en especial el de la lámpara de vapor de mercurio. 8 1. 2.

REFERENCIAS Bradwell A.R., et al (1997). Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK. Bradwell A.R., et al (1999). Advanced Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

Este producto sólo debe ser utilizado por personas con una formación adecuada para los propósitos establecidos. Se recomienda atenerse al procedimiento. Insert Code: CIN320, Version: 2 January 2008, Page 4 of 6

CONJUGADO DE IgG, A, M ANTI- HUMANA DE OVELHA AFF com FITC (pré-diluído) Portuguese

pele ou membranas mucosas. Se ocorrer um contacto com o produto, deve-se lavar abundantemente com água e consultar um médico. Em contacto com canalizações de chumbo ou cobre, podem-se formar sais explosivos; para evitar que tal aconteça, fazer correr abundante quantidade de água aquando da inutilização dos reagentes. 5

Para diagnóstico in vitro Código do produto: FA002, FA002.E Produto fabricado por: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telefone: +44 (0)121 436 1000 Fax: +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

1

O produto deve ser conservado entre 2 a 8 ºC onde ficará estável até a data indicada na embalagem. NÃO CONGELAR. Pode ocorrer a formação de uma ligeira precipitação aquando do seu armazenamento, esta pode ser removido através de centrifugação o que, no entanto, não afectará as suas características e performances. 6

METODOLOGIA

6.1

Material fornecido FA002, FA002.E

UTILIZAÇÃO 6.1.1

A utilização deste controlo deve ser feita em conjunto com as lâminas de tecido de roedores da The Binding Site (TBS) (FS013, FS014, FS015, FS313, e FS314), esófago de macaco, (FS208) e as lâminas HEp-2 (FS001) como auxiliar na determinação qualitativa de autoanticorpos no soro de doentes através de imunofluorescência indirecta. A identificação destes autoanticorpos serve de auxiliar no diagnóstico de das doenças autoimunes. A compatibilidade de utilização em outras combinações IFA ainda não foi verificada, contudo a sua utilização nestes testes não deve ser posta de parte por completo. 2

PRINCIPIO

Quando é utilizada a técnica por imunofluorescência indirecta, as amostras dos doentes e os controlos apropriados são incubados com substrato de tecido. Os anticorpos não ligados são removidos através de lavagem e é aplicado o conjugado diluído de forma apropriada. O conjugado não ligado é eliminado por lavagem e as lâminas são observadas ao microscópio de fluorescência. Em ambas as técnicas, a positividade das lâminas manifesta-se através de uma fluorescência são observadas amostras positivas onde a “verde-maçâ” que corresponde ao anticorpo relevante. 3

REAGENTES

O antisoro é obtido através da imunização do carneiro com o imunogénio referido acima. O antisoro que resulta daí é adsorvido para o tornar monoespecifico e depois é purificado para lhe conferir uma elevada afinidade através da ligação ao antigénio específico a uma matriz inerte. O antisoro é então conjugado com FITC. O fluorocromo que não reagiu é removido através de filtração por gel. São adicionados conservantes e o produto é filtrado. (0,2µm). É adicionado Evans blue a FA002.E como um contrastante da cor vermelha. 4

CONSERVAÇÃO E ESTABILIDADE

PRECAUÇÕES

6.1.2

12,5mL Anti Human IgGAM AFF FITC (Prediluted Conjugate) ou Anti Human IgGAM AFF FITC with Evans Blue (Conjugado pré-diluído ou Conjugado pré-diluído com Evans Blue). Folheto de instruções.

6.2

Material adicional necessário

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Lâminas com substrato Tampão (PBS). Câmara húmida para as etapas de incubação. Soro controlo negativo e positivo. Meio de Montagem e lamelas. Microscópio Fluorescente com filtro de excitação 495nm e filtro de barreira de 515nm.

6.3

Execução do teste (consultar folheto de instruções da lâmina em questão para mais detalhes).

6.3.1

Adicionar uma gota de FA002/FA002.E em cada poço. Não deixar os poços descobertos por mais de 15 segundos.

7

LIMITAÇÕES

A fonte emissora de luz, filtros e ópticas de diferentes tipos de microscópicos fluorescentes podem influenciar a sensibilidade do teste. A performance do microscópio é influenciada de forma significativa pela manutenção correcta do microscópio principalmente no que diz respeito à lâmpada de vapor de mercúrio e mudar a mesma após a duração recomendada. 8

REFERÊNCIAS

1.

Bradwell A.R., et al (1997). Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

2.

Bradwell A.R., et al (1999). Advanced Atlas of Autoantibody Patterns. Pub: The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

Este conjugado deve ser utilizado somente por pessoal treinado adequadamente nestes métodos. Os componentes do kit contêm azida de sódio como conservante, pelo que terão que ser manuseados com precaução – não ingerir nem permitir o contacto com a Insert Code: CIN320, Version: 2 January 2008, Page 5 of 6

ANTI-IgG,A,M UMANE DI PECORA AFF FITC (prediluito) Italian

Per Uso Diagnostico in vitro Codice Prodotto: FA002, FA002.E Prodotto da: The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telefono: +44 (0)121 436 1000 Fax : +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]

1

4

Il presente prodotto deve essere utilizzato da personale specializzato. Si raccomanda di osservare la procedura del test alla lettera. Il prodotto contiene sodio azide e deve essere trattato con cautela – non ingerire né permettere il contatto con la pelle o le mucose. In caso di contatto, lavare con molta acqua e rivolgersi al medico. Azotidrati metallici esplosivi si possono formare con il rame e il piombo; per evitare l’accumulo di tali composti, far scorrere abbondante acqua sui reagenti eliminati. 5

INDICAZIONI

Questo prodotto è utilizzato sui seguenti vetrini The Binding Site (TBS): tessuto di roditore (FS013, FS014, FS015, FS313, FS314), esofago di scimmia (FS208) ed HEp2 (FS001), come prodotto complementare nella determinazione qualitativa degli autoanticorpi nel siero umano, mediante immunofluorescenza indiretta. L’identificazione di tali autoanticorpi costituisce un sussidio nella diagnosi delle malattie autoimmuni. L’idoneità all’uso in altre combinazioni IFA non è stata valutata ma l’utilizzo in tali dosaggi non deve essere necessariamente escluso.

PRECAUZIONI

CONSERVAZIONE E STABILITA’

Il prodotto deve essere conservato a 2-8°C ed è stabile fino alla data di scadenza indicata sull’etichetta. NON CONGELARE. In fase di conservazione si potrà osservare una lieve precipitazione eliminabile mediante centrifugazione, che non influirà sulle caratteristiche del dosaggio. 6

METODOLOGIA

6.1

Materiali forniti FA002, FA002.E

6.1.2

12,5mL Anti Human IgGAM FITC (Prediluted conjugate o Anti Human IgGAM FITC with Evans Blue (Prediluted conjugate) (Anti-IgGAM umane AFF FITC (coniugato prediluito) o Anti-IgGAM umane AFF FITC con Blu di Evans (coniugato prediluito). Scheda tecnica.

6.2

Materiale necessario ma non fornito

6.2.1 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6

Vetrini con substrato. Tampone PBS. Camera umida per le fasi d’incubazione. Sieri di controllo positivi e negativi. Soluzioni di montaggio e vetrini coprioggetti. Microscopio a fluorescenza con filtro a 495nm (exciter) e filtro a 515nm (barrier).

6.3

Procedura (Far riferimento alla metodica del vetrino per maggiori dettagli).

L’antisiero viene preparato immunizzando le pecore con IgG, IgA ed IgM purificate da siero umano. L’antisiero che ne risulta viene poi delipidato e se necessario adsorbito a monospecificità mediante fasi solide adsorbenti. Dopo l’adsorbimento, l’antisiero viene purificato per affinità mediante un legame con l’antigene specifico adeso ad una matrice inerte ed eluito con tamponi caotropici. L’antisiero viene poi coniugato con isotiocianato di fluoresceina (FITC) ed il fluorocromo non legato viene isolato mediante gelfiltrazione. Il presente prodotto è stato diluito ad una concentrazione ottimale per l’utilizzo in immunofluorescenza indiretta. Vengono aggiunti infine dei conservanti ed il prodotto viene filtrato a 0,2µm.

6.3.1

Aggiungere una goccia di FA003/FA002.E in ciascun pozzetto. Non lasciare i pozzetti scoperti per oltre 15 secondi.

Il Blu di Evans viene aggiunto al FA002.E, come colorazione rossa di contrasto.

8

2

PRINCIPIO

Viene impiegata una tecnica di immunofluorescenza indiretta in cui i campioni dei pazienti e i relativi controlli sono incubati con i tessuti. Gli anticorpi non specifici sono eliminati con il lavaggio, quindi viene applicato un coniugato fluoresceinato. I vetrini vengono poi lavati come prima per eliminare il coniugato non legato. Per la lettura dei vetrini si utilizza un microscopio a fluorescenza. I campioni positivi presentano una fluorescenza di colore verde brillante che corrisponde all’autoanticorpo che si vuole determinare. 3

6.1.1

REAGENTE

7

LIMITI DELLA PROCEDURA

La fonte luminosa, i filtri e l’ottica dei microscopi a fluorescenza di diverse marche influiranno sulla sensibilità del kit. La performance del microscopio è influenzata notevolmente da una corretta manutenzione, e in particolare dalla centratura e dalla sostituzione della lampada a vapori di mercurio dopo il periodo di tempo consigliato. BIBLIOGRAFIA

1.

Bradwell A R et al (1997). Atlas of autoantibody patterns on tissues. Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

2.

Bradwell A R et al (1999). Advanced atlas of autoantibody patterns. Publ. The Binding Site Ltd., Birmingham UK.

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