Aparato de Golgi Introducción El tema de RE incluyó una descripción del tráfico de proteínas denominado biosintético, el cual incluía al aparato de Golgi como organelo cuya función primordial es distribuir las proteínas hacia su destino final : lisosomas, membrana plasmática o al exterior. Toda la distribución se realiza a través de vesículas que se desprenden del organelo origen y se fusionan a la membrana del organelo destino. Todos los organelos de las vías endocítica y biosintética, poseen un lumen que es topológicamente equivalente con el exterior de la célula. La vía del RER al Golgi y con

Prof. Iván Rebolledo

destino a la membrana es la llamada “por defecto”, debido a que las proteínas no necesitan señales especiales; es decir, una proteína originada en RER automáticamente se moverá al Golgi y de aquí a la membrana, a menos que contenga alguna señal que le obligue a ir a otro organelo (lisosoma).

Estructura El Golgi se encuentra generalmente cerca del centro de la célula, próximo al núcleo, aunque según la función primordial de la célula, pudiera encontrarse en otra posición (citoplasma apical en células caliciformes, periférico en hepatocitos).

Cara cis Vesícula del Golgi

Retículo cis

cis medial trans

Retículo trans Vesícula secretora

Cara trans

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Está integrado por cisternas aplanadas que semejan a una “pila de platos”, rodeadas por gran cantidad de vesículas que corresponden al tráfico hacia, desde e inter Golgi. Posee una superficie de entrada llamada cis que suele ser convexa y una superficie de salida llamada trans que suele ser cóncava. Entre las cisternas cis y trans se encuentran las cisternas mediales. Las cisternas cis y trans se asocian con cisternas irregulares abundantes en vesículas, denominándose retículo cis y retículo trans. En resumen y con orden : retículo cis, cisterna cis, cisterna medial, cisterna trans y retículo trans. Se considera al retículo cis como la zona intermedia entre RER y Golgi pudiendo moverse las vesículas en ambos sentidos; el retículo trans es una zona intermedia de distribución hacia lisosomas, exterior o membrana.

Las proteínas de membrana del RER tiene la secuencia KKXX, donde K es lisina y X cualquier otro aminoácido. Por ingeniería genética se han eliminado estas secuencias señal de retención de las proteínas residentes y ella son excretadas fuera de la célula; en cambio, si se añade alguna de dichas secuencias a una proteína que será secretada, ella se convierte en residente, produciéndose una carencia de ella en el medio externo. La presencia de la zona retículo cis permite que puedan recuperarse las proteínas residentes que pudieran haberse escapado desde el RER, esto se logra por la presencia de receptores para estas secuencias señal de retención, entonces, cuando llega el complejo receptor– secuencia al lumen del RER, las condiciones iónicas determinan la disociación de la secuencia del receptor, el cual retorna al retículo cis.

Proteínas lisosomales Las proteínas plegadas y ensambladas correctamente pueden salir del RER hacia el Golgi utlizando el sistema de vesículas; sin embargo, las proteínas residentes poseen una señal para permanecer en el RER, caso del BiP, proteína residente del lumen del RER y que posee una secuencia corta de 4 aminoácidos identificada como KDEL (Lys–Asp–Glu–Leu).

Las proteínas lisosomales son sintetizadas en el RER y a través del Golgi llegan hasta los lisosomas. La pregunta aquí es : ¿cómo reconoce el Golgi que una proteína pertenece al lisosoma y debe guiarla hacia ese destino? Ya que todas las glucoproteínas que abandonan el RER son idénticas en su cadena oligosacarídica la diferencia está en la cadena polipeptídica.

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De hecho, las proteínas lisosomales disponen de una serie de aminoácidos no contíguos que constituyen el llamado parche señal, el cual puede ser reconocido por una enzima llamada NAcGlc-fosfotransferasa. Esta enzima posee dos sitios : uno de reconocimiento del parche señal de la proteína lisosomal y otro, el sitio catalítico, con propiedades fosfotransferasa, es decir, donante de PO4, específicamente a la manosa. Una vez unida la proteína lisosomal a la NAcGlc-fosfotransferasa a través del sitio de reconocimiento del parche señal, la enzima ubica una molécula de NAcGlc–UDP en su sitio catalítico. Allí elimina un UMP dejando un PO4 unido a NAcGlc, el cual se une a una manosa de la cadena oligosacarídica. En este estado, la proteína lisosomal se desprende de la enzima NAcGlc– fosfotransferasa. Una segunda enzima elimina la NAcGlc quedando la enzima lisosomal marcada con PO4 en una manosa terminal. Debido a que el PO4 se une al carbono 6 de la manosa, se denomina manosa–6–fosfato (M–6–P).

Unión parche señal al sitio renocimiento Enzima lisosomal

Unión NAcGlc-UDP al sitio catalítico NAcGlc-fosfotransferasa

Sitio catalítico

Sitio reconocimiento

Estas proteínas lisosomales marcadas con PO4 en sus manosas son movilizadas a través de las cisternas cis, medial y trans del Golgi sin sufrir modificaciones en su estructura. Al llegar al retículo trans se encuentran con receptores de membrana que reconocen las M–6–P, son los receptores M–6–P. Las enzimas lisosomales unidas a su receptor son movilizadas hacia los lisosomas a través de vesículas cubiertas con clatrina. Al llegar al lisosoma, se encuentran en un lumen con pH ácido (cerca de 5.0), ambiente en el cual la enzima se disocia de su receptor, quedando así lista para actuar y el receptor

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Procesamiento de la cadena oligosacarídica

retorna mediante vesículas hacia las cisternas retículo trans del Golgi para ser utilizados de nuevo. Algunos receptores de M–6–P llegan a la membrana plasmática, con la finalidad de capturar aquellas proteínas lisosomales que ocasionalmente pudieran haber sido secretadas.

Recordemos que la glucoproteína que abandona el RER posee en su cadena oligosacarídica 8 manosas. Sin embargo, al salir de la cisterna trans del Golgi posee 3 NAcGlc, 3 manosas, 3 Gal y 3 NANA. Es evidente que ha perdido 5 manosas y ha adquirido en su lugar 9 otros residuos glucosídicos, todo esto ha ocurrido en su tránsito por las cisternas del Golgi. La pregunta aquí es qué proceso ocurre en cada cisterna del Golgi.

Existen enfermedades causadas por ausencia o defectos de la NAcGlc fosfotransferasa, la cual no fosforila a las manosas de las proteínas lisosomales, de tal forma que no son “marcadas” para su destino en el lisosoma. Estas proteínas son secretadas fuera de la célula. La consecuencia de esta eliminación anormal de las enzimas lisosomales es que se acumulan dentro de la célula los metabolitos que debieran ser degradados en forma de grandes inclusiones, alterando la función normal de la célula. Precursor hidrolasa lisosomal Unión al receptor M-6-P

Análisis autoradiográficos a ME, con residuos glucosídicos marcados con H radioactivo, han evidenciado que la adición de manosa–3H ocurre en RER, la adición de NAcGlc–3H ocurre en la cisterna medial del Golgi y que la adición de Gal–3H y NANA–3H ocurre en la cisterna trans del Golgi. Transporte dependiente de receptor

Adición del PO4 M-6-P

Cubierta clatrina

Transporte vesicular

Disociación en pH ácido

Receptor María-6-P en vesícula yemándose Retículo cis

Retículo trans

Endosoma tardío

Remoción del PO4

Enzima lisosomal madura

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Síntesis de proteína RE

Retículo cis Fosforilación enzimas lisosomales

cis Remoción de manosas Remoción de manosas Adición de NAcGlc Adición de Gal

medial

No está aún claro si las enzimas comprometidas en estos eventos de eliminación y adición de residuos glucosídicos están restringidos a una cisterna en particular o si su distribución es graduada a través de las cisternas. Se sugiere que esta última proposición pudiera ser la correcta, de hecho, las Man se eliminan en dos cisternas (cis y medial)

La importancia de la presencia de la cadena oligosacarídica en las Adición de NANA Retículo proteínas es demostrada en los siguientes casos : (a) la secreción trans de Ig G es bloqueada por la Vesícula ausencia de la cadena Lisosoma secretora oligosacarídica y es retenida en RER por un plegamiento defectuoso Membrana plasmática derivado de esa misma carencia; (b) la fibronectina sintetizada por fibroblastos es más susceptible a la Esto deduce también que las degradación cuando carece de la enzimas correspondientes a la cadena oligosacarídica. eliminación y adición de residuos glucosídicos se encuentran en las Secreción contínua y regulada diferentes cisternas del Golgi. Con esta y otras técnicas (detección de Todas las células secretan enzimas en subfraccionamientos de proteínas en forma contínua, las cisternas) se ha configurado un independiente de cualquier estímulo: proceso secuencial de modificación son de secreción contínua. Por otra de los componentes de la cadena parte, algunas células almacenan oligosacarídica : 3 Glu y 1 Man son ciertas proteínas en vesículas y eliminados en el RER antes de solo la secretan bajo ciertos pasar al Golgi. 3 Man son eliminadas estímulos específicos, caso de en la cisterna cis del Golgi. 2 Man células hipofisiarias que secretan más en la cisterna medial del Golgi ACTH o células pancreáticas que en donde se añaden 3 NAcGlc. 3 secretan insulina. Son de secreción Gal y 3 NANA son añadidas en la regulada. cisterna trans del Golgi. trans

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Transporte vesicular El REL, el RER, los distintos compartimentos del Golgi, los lisosomas, las vesículas secretoras y la membrana plasmática son organelos membranosos con una constitución propia de proteínas, que permite caracterizar molecularmente a cada uno de ellos. La síntesis de proteínas se inicia en el citosol y continua en el RER. Desde este organelo, las proteínas se movilizan hasta su destino definitivo a través de vesículas. La pregunta aquí es : ¿cómo “sabe” la vesícula cuál es su destino final? El primer paso en el transporte vesicular es la formación de la vesícula por yemación desde una membrana. La superficie citosólica de la vesícula está cubierta con proteínas y parece ser que el ensamble de estas proteínas conduce a la yemación de las vesículas.

(b) otros dos tipos de vesículas que se yeman desde el RER y el Golgi, cuya cubierta proteica NO contiene clatrina. Se las han llamado vesículas COP (del inglés, coat protein). De estas se han caracterizado dos subtipos : COP-I que se yeman desde el Golgi y las COP-II que lo hacen desde el RER.

Las vesículas cubiertas con clatrina están compuestas por dos tipos de proteínas : la clatrina, que viene a constituir una estructura en forma de canasto que distorsiona la membrana de origen y favorece la yemación; y la adaptina, que actúa como intermediaria entre la clatrina y proteínas de membrana. Hay unas adaptinas propias para la endocitosis y otras para la exocitosis

Proteína lisosomal

Receptor M-6-P

Se han caracterizado 3 clases de vesículas cubiertas con proteínas que funcionan en diferentes tipos de transportes : (a) vesículas cubiertas con clatrina, que actúan en la endocitosis y en el transporte de moléculas desde el retículo trans Golgi hacia lisosomas.

Adaptina Memb

ra na

Clatrina

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Es interesante saber que las proteínas de las vesículas COP-I pueden interactuar con la secuencia KKXX presente en las proteínas de membrana del RER. Esta relación molecular sugiere que las vesículas COP-I servirían para recuperar proteínas residentes del RER desde el Golgi (vía anterógrada). Tanto las vesículas cubiertas con clatrina como las vesículas COP-I originadas desde el retículo trans del Golgi, requieren de una proteína que maneje los ciclos GTP-GDP. La proteína se denomina ARF (del inglés, ADP ribosylation factor). Cuando el ARF posee GTP promueve la organización de la cubierta proteica de las vesículas; cuando el GTP se hidroliza a GDP, se produce la desorganización de la cubierta. La fusión de una vesícula con su membrana blanco (o destino) incluye dos procesos. El primero, es el reconocimiento específico de la vesícula a su membrana blanco. El segundo, es la fusión de las membranas para entregar el contenido de la vesícula. El reconocimiento se logra por la presencia en la membrana de la vesícula de un complejo proteico denominado v-SNARE que se complementa exactamente con otro complejo en la membrana blanco llamado t-SNARE.

Vesícula

Membrana blanco

Vesícula

Membrana blanco SNARE : receptor de SNAP SNAP : proteína soluble de unión con NSF NSF : proteína de fusión sensible a la N-etilmaleimida

Una vez que se han acoplado los complejos proteicos v-SNARE de las vesículas con los t-SNARE de las membranas blanco, se añaden las proteínas NSF y SNAP que participan en el proceso general de fusión de membranas.