INSTRUCCIONES DE USO – MEDIOS EN PLACA LISTOS PARA USAR PA-254058.06

Rev.: April 2013

BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) USO PREVISTO BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) se utiliza en el procedimiento de prueba de sensibilidad por medio del método de difusión en disco antimicrobiano para cepas aisladas a partir de muestras clínicas, de especies de Haemophilus, como se describe en Approved Standard M2, publicada por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)1.

PRINCIPIOS Y EXPLICACION DEL PROCEDIMIENTO Método microbiológico. El agar Mueller Hinton suplementado con hemoglobina al 1% y enriquecimiento IsoVitaleX al 1% (agar chocolate Mueller Hinton) era el medio anteriormente recomendado para Haemophilus influenzae2. Extensos estudios realizados por Jorgensen y otros llevaron al desarrollo del medio de prueba de Haemophilus (HTM) 3,4. Este medio es agar Mueller Hinton suplementado con factor X (hemina o hematina), factor V (nicotinamida adenina dinucleótido, o NAD) y extracto de levadura. Una ventaja importante del agar HTM en comparación con el agar chocolate Mueller Hinton es la claridad óptica, lo que permite las mediciones de diámetro de zona desde el fondo de la placa, como es el procedimiento de prueba estándar para los organismos no exigentes en agar Mueller Hinton. Además, el agar HTM contiene niveles bajos de timidina y es, por consiguiente, adecuado para analizar trimetoprima/sulfametoxazol. Los criterios de interpretación para la prueba de sensibilidad antimicrobiana de Haemophilus se suministran en el documento de CLSI M100 (M2)1. Se debe consultar dicho documento para obtener más detalles. BD Haemophilus Test Medium Agar está formado por agar Mueller Hinton suplementado con factor X (hemina o hematina), factor V (nicotinamida adenina dinucleótido, o NAD) y extracto de levadura.

REACTIVOS BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) Fórmula* por litro de agua purificada Extracto de carne bovina 2,0 g Hidrolizado ácido de caseína 17,5 Almidón 1,5 Agar 17,0 Extracto de levadura 5,0 Hematina 0,015 Nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) 0,015 pH 7,3 ± 0,1 *Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento.

PRECAUCIONES . Solamente para uso profesional. No utilizar las placas si muestran evidencia de contaminación microbiana, decoloración, deshidratación, agrietamientos o cualquier otro signo de deterioro. La reducción excesiva de este medio debido a la deshidratación puede causar resultados de sensibilidad falsos. Consultar los procedimientos de manipulación aséptica, riesgos biológicos y desecho del producto usado en el documento INSTRUCCIONES GENERALES DE USO.

ALMACENAMIENTO Y VIDA UTIL Al recibir las placas, almacenarlas en un lugar oscuro a una temperatura entre 2 y 8 °C, envueltas en su envase original, hasta justo antes de usarlas. Evitar la congelación y el PA-254058.06

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calentamiento excesivo. Las placas pueden inocularse hasta su fecha de caducidad (ver la etiqueta en el paquete) e incubarse durante los períodos de incubación recomendados. Las placas de grupos de 10 placas ya abiertos pueden usarse durante una semana siempre que se almacenen en un lugar limpio a una temperatura entre 2 y 8 °C.

CONTROL DE CALIDAD DEL USUARIO Para el control de calidad del usuario, se deben consultar las normas de CLSI1 o, si procede, las normas nacionales. Sobre todo, deben seguirse los procedimientos descritos a continuación en Procedimiento de análisis, utilizando las cepas de referencia mencionadas en Materiales no suministrados. Las placas de BD Haemophilus Test Medium Agar (HTM) y los discos de antimicrobianos utilizados deben analizarse al menos dos veces por semana para determinar el rendimiento adecuado. Apariencia del medio sin inocular: Ámbar claro.

PROCEDIMIENTO Materiales suministrados BD Haemophilus Test Medium Agar (placas Stacker de 90 mm). Controladas microbiológicamente. Material no suministrado 1. Caldo de inóculo en tubo, tal como BD Trypticase Soy Broth (caldo de digerido de sojacaseína) o caldo Mueller Hinton II (con ajuste de cationes), para la preparación de un inóculo estándar y caldo estéril o solución salina para la dilución del inóculo. 2. Patrón de comparación de sulfato de bario (0,5 ml de 0,048 M BaCl2 [1,175% p/v BaCl22H2O] a 99,5 ml de 0,18 M [0,36 N] H2SO4 [1% v/v]). 3. Un dispositivo fotométrico para ajustar la turbidez de la suspensión de inóculo para que sea equivalente al patrón 0,5 de McFarland. 4. Como alternativa a los materiales anteriores (1 – 3), se puede utilizar el BD Prompt Inoculation System (dispositivo volumétrico de preparación de inóculo)5,6. 5. Cultivos de control: Haemophilus influenzaeATCC 49247, ATCC 49766 y ATCC 10211. 6. Discos de papel impregnados con cantidades específicas de agentes microbianos, tales como los discos de prueba de sensibilidad BD Sensi-Disc. 7. Dispensador, tal como el dispensador de 6 posiciones Sensi-Disc. 8. Regla u otro dispositivo para medir los tamaños de zona en milímetros. 9. Un incubador que produce una atmósfera con CO2 al 5% u otro dispositivo que produce una atmósfera aerobia enriquecida con CO2. 10. Un reactivo para realizar una prueba rápida de ß-lactamasa tal como los discos BD Cefinase. 11. Medios de cultivo auxiliar, reactivos y el equipo de laboratorio que se requiera. Tipos de muestras Este producto se utiliza para las pruebas de sensibilidad de cultivos puros de Haemophilus que se han aislado a partir de muestras clínicas (véase también CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO). Procedimiento de análisis 1. Preparar una tinción de Gram antes de comenzar con la prueba de sensibilidad para confirmar la pureza del cultivo y la posible identificación de Haemophilus. 2. Utilizar varias colonias bien aisladas extraídas directamente de una placa de agar chocolate del día anterior (preferentemente de 20 – 24 h) como origen del inóculo. 3. Se debe utilizar una prueba rápida de ß-lactamasa para la detección rápida de cepas resistentes a la penicilina, ampicilina o amoxicilina. 4. Preparar una suspensión del organismo de prueba en caldo Mueller Hinton, caldo Mueller Hinton II o solución salina al 0,9%. Dicha suspensión debe ajustarse a la turbidez del patrón 0,5 de McFarland mediante un dispositivo fotométrico. Esta suspensión contendrá PA-254058.06

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aproximadamente 1 – 4 x 108 UFC/mL. Se debe tener cuidado al preparar esta suspensión, porque las concentraciones de inóculo más elevadas pueden causar resultados resistentes falsos con algunos antibióticos b-lactámicos, en especial cuando se analizan cepas productoras de b-lactamasa de H. influenzae 1. 5. Se han considerado aceptables para fines de análisis sistemáticos (incluido el análisis de H. influenzae) métodos alternativos de la preparación del inóculo en los que se utilizan dispositivos que permiten la normalización directa de los inóculos sin un ajuste de la turbidez, tal como BD Prompt Inoculation System5,6. 6. Dentro de los 15 min de ajustar la turbidez del inóculo, sumergir una torunda estéril en el inóculo correctamente diluido y hacerla rodar firmemente varias veces contra la pared interna superior del tubo para exprimir el líquido en exceso. 7. Inocular toda la superficie del agar de una placa de BD Haemophilus Test Medium Agar tres veces, girándola 60 grados cada vez para obtener una inoculación uniforme. 8. La tapa puede dejarse entreabierta entre 3 y 5 min y la placa puede mantenerse a temperatura ambiente, pero no más de 15 min, para permitir que se absorba la humedad de la superficie antes de aplicar los discos impregnados con antibiótico. 9. Aplicar los discos mediante un dispensador de discos antimicrobianos, empleando precauciones asépticas. La mayoría de los agentes antimicrobianos produce zonas de inhibición más grandes cuando se les efectúan pruebas de Haemophilus en comparación con otros organismos. No deben colocarse más de cuatro discos antimicrobianos en una sola placa de 100 mm, y no más de seis de los siguientes discos: cefalosporinas de tercera generación (por ejemplo, cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona, ceftizoxima), aztreonam, imipenem o ciprofloxacina. Una vez colocados los discos sobre el agar, presionarlos con una aguja o pinza estéril hasta obtener un contacto completo con el medio. 10. A los 15 min después de aplicar los discos, invertir las placas e incubar durante 16 – 18 h a 35 °C en una atmósfera aerobia enriquecida con dióxido de carbono al 5%. 11. En una placa de BD Haemophilus Test Medium Agar, extender H. influenzae ATCC 10211 e incubar junto con las placas de prueba de sensibilidad para determinar si el medio favorece un crecimiento adecuado. Resultados 1. Examinar las placas después de 16 – 18 h de incubación. Se debe obtener una extensión donde confluye el crecimiento. Si sólo crecen colonias aisladas, el inóculo está demasiado diluido y debe repetirse la prueba. 2. Medir el diámetro de las zonas de inhibición completa (como se puede observar a simple vista), incluido el diámetro del disco, hasta el milímetro más cercano, con calibradores, una regla o una plantilla preparada para dicho propósito. Se sostiene un dispositivo de medición en la parte posterior de la placa, la que se sostiene sobre un fondo negro no reflejante e iluminado por arriba. 3. El criterio de valoración debe tomarse como el área que no muestre crecimiento visible evidente que pueda detectarse a simple vista. Desestimar el crecimiento leve de colonias diminutas que pueda detectarse con dificultad cerca del borde de la zona evidente de inhibición. Con trimetoprima y las sulfonamidas, las trazas de antagonistas en el medio pueden permitir cierto crecimiento leve; por consiguiente, desestimar el crecimiento ligero (20% o menos de la extensión del crecimiento) y medir el margen más evidente para determinar el diámetro de zona. Recuento e interpretación de los resultados Consultar el documento de CLSI M100 (M2) para obtener información acerca de cómo interpretar los resultados obtenidos con aislados clínicos de Haemophilus1. Se pueden notificar resultados resistentes, intermedios o sensibles, según los diámetros de zona obtenidos. Los organismos con resultado positivo de producción de beta-lactamasa deben considerarse resistentes a ampicilina a pesar de los diámetros de zona obtenidos. Debe tenerse en cuenta

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que las cepas de H. influenzae resistentes a la ampicilina se han descrito como carentes de actividad de beta-lactamasa7. Por lo tanto, si el diámetro de zona indica resistencia a la ampicilina, el aislado debe describirse como resistente a dicho antibiótico, aun si la prueba de b-lactamasa tiene resultado negativo. Se deben incluir cultivos de control siempre que se realicen las pruebas de sensibilidad o bien semanalmente, si se puede documentar un rendimiento satisfactorio conforme a CLSI Standard M2, que incluye las tablas (M100) con los diámetros de zona correctos1. Nota: Se publican periódicamente suplementos informativos al documento M2 del CLSI, o sus versiones revisadas, con tablas actualizadas de discos antimicrobianos y normas de interpretación. Consultar en las tablas más recientes las recomendaciones vigentes. La norma completa y sus suplementos informativos pueden obtenerse del National Committee for Clinical Laboratory Standards, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 EE.UU. Teléfono: ++1-610-688-1100.

CARACTERISTICAS DEL RENDIMIENTO Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO A. Estudio de reproducibilidad 8 Se evaluaron tres lotes de producción de BD Haemophilus Test Medium Agar con el procedimiento de prueba de sensibilidad con disco antimicrobiano (M2-A4), recomendado por el NCCLS en aquel momento9. En el estudio se utilizaron en total 12 agentes antimicrobianos (amoxicilina/clavulanato, ampicilina, ampicilina/sulbactam, cefaclor, cefonicida, ceftriaxona, cefuroxima, cloranfenicol, ciprofloxacina, rifampina, tetraciclina, trimetoprima/sulfametoxazol) y 14 cepas de H. influenzae. De las 14 cepas, 7 procedían de American Type Culture Collection (ATCC) y las otras 7 eran cultivos de referencia, que incluían seis aislados clínicos y un cultivo de control de calidad industrial. Los diámetros de zona obtenidos con cada uno de los tres lotes de medios se compararon con los criterios de interpretación (Tabla 2A) en M2-A49. En sólo seis casos se obtuvieron zonas con un lote que podría producir una categoría de interpretación diferente, en comparación con los otros dos lotes. De los seis resultados discrepantes, había cuatro con tetraciclina, uno con cefaclor y uno con cefuroxima. En el caso de la tetraciclina, el resultado habría producido una categoría de interpretación de sensible o intermedio (error menor). Con cefaclor y cefuroxima, la diferencia de 1 mm que se produjo daría un resultado de categoría intermedia o resistente, también un error menor. En este estudio se utilizaron cinco cepas de H. influenzae productoras de b-lactamasa. Con cada una de estas cepas, cada lote de agar HTM produjo diámetros de zona con ampicilina que podrían interpretarse como resultados resistentes. Dos de las cinco cepas también produjeron cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). Las zonas de cloranfenicol obtenidas con estas dos cepas serían acordes a la resistencia de cloranfenicol10,11. B. Comparación con agar chocolate Mueller Hinton8 El procedimiento de disco del NCCLS se realizó con 213 aislados clínicos de H. influenzae en agar HTM y agar chocolate Mueller Hinton9,12. Los agentes antimicrobianos analizados fueron ampicilina, ampicilina/sulbactam, amoxicilina/clavulanato y cloranfenicol. Fueron los únicos agentes antimicrobianos para los que los criterios de interpretación de diámetro de zona se habían definido para el agar chocolate Mueller Hinton13,14. Se obtuvieron los siguientes resultados.

Mueller Hinton Chocolate Agar Concordancia: 99.6%

S I R S = Sensible

BD Haemophilus Test Medium Agar S I 808 1 0 0 0 0 I = Intermedio

R 2 0 41

R= Resistente

Se produjeron dos errores mayores y un error menor con ampicilina. En ambos errores mayores, el BD Haemophilus Test Medium Agar produjo un resultado resistente, mientras que el agar chocolate Mueller Hinton produjo un resultado sensible. Ambos aislados dieron PA-254058.06

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resultado positivo para beta-lactamasa. Por consiguiente, el resultado resistente fue correcto. El error menor se produjo con un aislado que dio resultado intermedio en agar HTM y un resultado sensible en agar chocolate Mueller Hinton. C. Limitaciones del procedimiento Con respecto a algunas combinaciones de organismos-agente antimicrobiano, la zona de inhibición tal vez no tenga un borde claramente demarcado, lo que puede llevar a una interpretación incorrecta. La concentración incorrecta de inóculo puede producir resultados inexactos. Las zonas de inhibición pueden ser demasiado pequeñas si el inóculo es demasiado denso y pueden ser demasiado grandes y difíciles de medir si el inóculo está muy diluido. El almacenamiento incorrecto de los discos antimicrobianos puede causar pérdida de potencia y resultados resistentes falsos. La sensibilidad in vitro de un organismo a un agente antimicrobiano específico no necesariamente significa que el agente tendrá eficacia in vivo. Consultar los textos correspondientes para obtener instrucciones para la interpretación de resultados2,15.

REFERENCIAS 1. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS). Approved standard: M2. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. CLSI, Wayne, PA, USA.Search for latest version at www.clsi.org 2. Thornsberry, C., T.L. Gavan, E.H. Gerlach. 1977. Cumitech 6, New developments in antimicrobial agent susceptibility testing. Coordinating ed., J.C. Sherris. American Society for Microbiology, Washington, D.C 3. Jorgensen, J.H., J.S. Redding, L.A. Maher, and A.W. Howell. 1987. Improved medium for antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae. J. Clin. Microbiol. 25:21052113. 4. Jorgensen, J.H., A.W. Howell, and L.A. Maher. 1990. Antimicrobial susceptibility testing of less commonly isolated Haemophilus species using Haemophilus test medium. J. Clin. Microbiol. 28:985-988. 5. Baker, C.N., C. Thornsberry, and R.W. Hawkinson. 1983. Inoculum standardization in antimicrobial susceptibility testing: evaluation of overnight agar cultures and the rapid inoculum standardization system. J. Clin. Microbiol. 17:450-457. 6. Marsik, F., G. Evans, J. Fowler, and L. Thompson. 1989. Comparison of the BBL Prompt system, Abbott A-Just, and visual method for the preparation of Haemophilus influenzae inoculum for the Bauer-Kirby procedure, abstr. C-67, p. 404. Abstr. 89th Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 1989. 7. Doern, G.V., J.H. Jorgensen, C. Thornsberry, D.A. Preston, T.A. Tubert, J.S. Redding, and L.A. Maher. 1988. A national collaborative study of the prevalence of antimicrobial resistance among clinical isolates of Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 32:180-185. 8. Data on file. BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA. 9. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1990. Approved standard: M2-A4. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 4th ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 10. Azemun, P., T. Stull, M. Roberts, and A.L. Smith. 1981. Rapid detection of chloramphenicol resistance in Haemophilus influenzae. Antimicrob. Agents Chemother. 20:168-170. 11. Doern, G.V., G.S. Daum, and T.A. Tubert. 1987. In vitro chloramphenicol susceptibility testing of Haemophilus influenzae: disk diffusion procedures and assays for chloramphenicol acetyltransferase. J. Clin. Microbiol. 25:1453-1455. 12. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1984. Approved standard: M2-A3. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests, 3rd ed. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. 13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1987. Second Informational Supplement: M100-S2. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa. PA-254058.06

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14. Doern, G.V. and R.N. Jones. 1988. Antimicrobial susceptibility testing of Haemophilus influenzae, Branhamella catarrhalis, and Neisseria gonorrhoeae. Antimicrob. Agents Chemother. 32:1747-1753. 15. Woods, G.L., and J.A. Washington. 1995. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods, p. 1327-1341. In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. USA.

ENVASE/DISPONIBILIDAD BD Haemophilus Test Medium Nº de cat. 254058 Medios en placa listos para usar, 20 placas

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