Origen de la variabilidad del reflejo monosináptico

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Benemérita Universidad Autónoma de Puebla

Instituto de Fisiología Tesis de Maestría

Mecanismos de modulación de la variabilidad del reflejo monosináptico de la médula espinal del gato Laboratorio de Neurofisiología Integrativa

Alumno: M. C. Gerardo Rojas Piloni Tutor: Dr. Elías Manjarrez López

Origen de la variabilidad del reflejo monosináptico

Resumen

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RESUMEN La observación de que el reflejo monosináptico fluctúa se realizó a principios del siglo XX, sin embargo, no fue hasta 1955 cuando Hunt atribuyó este fenómeno a las variaciones en el potencial de membrana de las motoneuronas, es decir, a efectos postsinápticos. En contraste, Rudomin y Dutton en 1969 encontraron que la variabilidad del reflejo monosináptico es originada por la activación de vías neuronales que producen inhibición presináptica. Estos investigadores propusieron que el papel funcional de la inhibición presináptica sobre las fluctuaciones, sería la de incrementar el contraste motor entre músculos agonistas y antagonistas, y supusieron que este tipo de modulación podría tener alguna función en el control del movimiento. Recientemente, ha sido identificado un grupo neuronal en el asta dorsal de la médula espinal del gato con alta actividad espontánea, el cual está localizado en la misma región donde se encuentran las neuronas que responden a la estimulación de aferentes cutáneos de bajo umbral. Ello ha sugerido que las neuronas que generan los potenciales espontáneos registrados en la superficie dorsal de la médula espinal (nCDP´s espontáneos) son interneuronas que reciben entradas sinápticas de aferentes cutáneos. Esto es consistente con el hallazgo de que los potenciales de campo producidos por la activación de fibras de origen cutáneo se facilitan cuando los preceden nCDP's espontáneos. Además, se sabe que la inhibición presináptica de aferentes musculares es modulada por influencia de vías cutáneas, por lo que se sugiere que ambos fenómenos se encuentren interrelacionados, es decir, que las neuronas que generan los nCDP´s espontáneos posiblemente pueden modular la información sensoriomotora. En este proyecto se exploró la contribución de las neuronas del asta dorsal que son responsables de generar los nCDP's espontáneos, sobre la variabilidad del reflejo monosináptico, así como su influencia en la inhibición presináptica de aferentes musculares, ya que existe una alta relación entre la actividad de estas neuronas con las respuestas producidas por estimulación de aferentes cutáneos. Nuestros resultados muestran que las neuronas responsables de generar los nCDP´s espontáneos facilitan la vía refleja monosináptica y esta facilitación tiene un curso temporal similar al de la fase de caída de estos potenciales espontáneos. Damos evidencias de que las fluctuaciones de los reflejos monosinápticos son originadas, en parte, por la actividad de las neuronas que generan los nCDP´s espontáneos. Ademas, mostramos que las neuronas que originan los nCDP´s espontáneos ejercen un efecto inhibitorio sobre la inhibición presináptica de la vía refleja monosináptica, explicando así su modo de acción Los datos reportados sugieren una posible influencia de las neuronas que generan los nCDP's espontáneos sobre la vía refleja, modulando la variabilidad y amplitud de las respuestas monosinápticas, posiblemente por mecanismos tanto pre como postsinápticos.

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Introducción

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INTRODUCCIÓN

La selección natural ha generado una gran variedad de receptores sensoriales que cumplen la función de informar al organismo los cambios producidos, tanto en el medio externo como en el medio interno. De esta manera, el sistema nervioso central (SNC) coordina los movimientos con base en la información que recibe del exterior (somestesia) por un lado, y por otro, con la información que recibe de los propios órganos (propiocepción) (Gordon, 1979).

Los músculos contienen receptores sensibles a diferentes estados del propio músculo. Se conocen particularmente dos tipos de receptores que se distinguen por su importancia en el control motor: los husos musculares y los órganos tendinosos de Golgi; ambos se encuentran distribuidos ampliamente en todos los músculos esqueléticos (Livington, 1986).

Husos musculares.

Los husos musculares son estructuras elongadas localizadas de manera paralela a las fibras musculares. Están compuestos de fibras musculares especializadas, a las cuales se les ha llamado fibras intrafusales, con la finalidad de distinguirlas de las fibras musculares de trabajo (fibras extrafusales). Los husos musculares son receptores formados de tres clases de fibras intrafusales: las fibras de cadena nuclear que tienen diámetro pequeño y se han nombrado así por que sus núcleos se distribuyen en forma de cadena a lo largo de la fibra; también hay dos tipos de fibras que tienen un

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diámetro y tamaño mayor denominadas fibras de bolsa nuclear estáticas y dinámicas, que se denominan de esta manera porque sus núcleos se agrupan formando un ensanchamiento en forma de bolsa localizado cerca del centro de la fibra (Stratton, 1984). Todas estas estructuras se encuentran encapsuladas en tejido conectivo, y entre la cúpula y los componentes del huso existe un fluido viscoso que lubrica el movimiento de las fibras musculares (Gordon y Ghez, 1991). Las fibras intrafusales no contribuyen en la contracción del músculo, pues son reducidas en número en relación a las fibras extrafusales. Los tres tipos de fibras intrafusales juegan un papel importante que determina el patrón de descarga de las terminales sensoriales que inervan a los husos musculares (Harris y Henneman, 1980).

Los husos musculares se encuentran inervados tanto por fibras sensoriales como por terminaciones motoras (Gordon y Ghez,1991). Las fibras sensoriales que inervan a los husos musculares principalmente son de tipo Ia y II, aunque también se ha descrito que emergen otras aferentes de diámetro pequeño que terminan libremente, probablemente con funciones termorregulatorias o bien como nociceptores (Boyd, 1975). Las fibras Ia forman terminaciones anuloespirales, es decir, se encuentran rodeando a las fibras intrafusales. De esta manera, cuando el huso muscular cambia su longitud se produce una despolarización de la membrana de los axones sensoriales, generando la descarga de potenciales de acción (Patton, 1965). Los axones aferentes Ia terminan en todos los tipos de fibras intrafusales, en cambio los aferentes tipo II solo terminan en las fibras de cadena nuclear y en las fibras de la bolsa nuclear estáticas (Boyd, 1980). (Fig. 1)

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Tendón

Cápsula de tejido conectivo del huso muscurar

Fibra muscular intrafusal

Fibra muscular extrafusal

Fascia muscular

Tendón

Figura 1. Representación esquemática de la estructura y localización de los receptores a estiramiento y tensión del músculo. Los husos musculares se encuentran orientados en paralelo respecto a las fibras musculares, inervados por fibras aferentes Ia, II así como eferentes de motoneuronas γ. En cambio los órganos tendinosos de Golgi principalmente están inervados por fibras aferentes Ib y se encuentran orientados en serie respecto a las fibras musculares (modificado de Harris y Henneman, 1980).

Órgano tendinoso de Golgi

Los axones motores que inervan las fibras intrafusales se conocen como motoneuronas γ, en cambio, las motoneuronas α inervan las fibras extrafusales. Las motoneuronas γ se encuentran regulando la sensibilidad del huso muscular, pues su activación produce contracción de las fibras intrafusales (Hasan y Stuart, 1984). Existen dos tipos de motoneuronas γ: las motoneuronas γ dinámicas, que inervan solo las fibras de la bolsa nuclear dinámicas y las motoneuronas γ estáticas, las cuales inervan tanto las fibras de cadena nuclear como las fibras de la bolsa nuclear estáticas (Harris y Henneman, 1980).

Cuando un músculo es estirado, se activan los husos musculares y de esta manera se incrementa la frecuencia de descarga de las aferentes que inervan dichos receptores. Existen dos fases en el cambio de longitud de las fibras que componen

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los husos musculares: una fase dinámica, que es el periodo en el que está ocurriendo el cambio de longitud, y una fase estática cuando el músculo se ha estabilizado en una nueva longitud. Cuando ocurre el estiramiento las fibras Ia y II incrementan su frecuencia de descarga, pero cuando ocurre un acortamiento disminuye más rápidamente la frecuencia de descarga de las aferentes del tipo Ia que de las del tipo II (Matthews, 1972). Además, durante la fase dinámica del estiramiento las aferentes Ia descargan a mayor frecuencia que durante la fase estática del estiramiento, en cambio las fibras II incrementan gradualmente su frecuencia de descarga y esta no varía durante la fase estática del estiramiento (ver Gordon y Guez, 1991). Las fibras de bolsa nuclear dinámicas tienen una respuesta elástica al estiramiento en su región central y una respuesta viscoelástica en sus extremos, es decir, la resistencia al estiramiento es proporcional a la magnitud de éste, en cambio las fibras de bolsa nuclear estáticas y las fibras de cadena nuclear tienen respuestas más uniformes a todo lo largo de ellas (Boyd y Ward, 1975). Así, durante un estiramiento, las aferentes que inervan las fibras de bolsa nuclear dinámicas (aferentes Ia) incrementan su frecuencia de descarga durante la fase dinámica del estiramiento, pero la disminuyen gradualmente durante la fase estática de éste. Sin embargo, las aferentes que inervan las fibras de cadena nuclear y las fibras de la bolsa nuclear estáticas (aferentes Ia y II), incrementan su frecuencia de descarga durante la fase dinámica del estiramiento y mantienen su actividad aún durante la fase estática del estiramiento (ver figura 2). Las aferentes Ia son altamente sensibles a la velocidad del estiramiento y se han especializado en responder de manera eficaz a estos cambios de longitud, en cambio las aferentes II probablemente se encuentren participando en informar el estado del sistema (Willis y Coggeshall, 1991).

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Motoneurona dinámica γ

A

Aferente del grupo I

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Aferente del grupo II

Motoneurona estática γ Fibra de bolsa nuclear

Terminación primaria

Terminación secundaria

Fibra de cadena nuclear

B 1 kg 200 µV

Fibra Ia

1 kg 200 µV

Fibra II 1 seg

Figura 2. Inervación de los tipos de fibras intrafusales y sus descargas características. A, representación de los tipos de fibras intrafusales presentes en los husos musculares de mamíferos y su inervación. B, registros realizados en las fibras aferentes del tipo I y II durante el estiramiento. Nótese que las fibras Ia descargan durante la fase dinámica del estiramiento, en tanto que las fibras del grupo II continuan descargando en la fase estática del estiramiento. (modificado de Harris y Henneman, 1980).

Órganos tendinosos de Golgi.

Los órganos tendinosos de Golgi están inervados sólo por fibras aferentes del grupo I y se conocen como fibras aferentes Ib. Estos órganos sensitivos son estructuras encapsuladas de aproximadamente 100 mm de diámetro y 1 mm de largo que se localizan entre la unión de las fibras extrafusales del músculo con el tendón. Las fibras Ib, que inervan al órgano tendinoso de Golgi, se entretejen entre fibras de colágeno que también pertenecen a dicho órgano, de tal forma que cuando existe

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tensión, las fibras de colágeno comprimen a las fibras sensoriales y las activan (Harris y Henneman, 1980).

Las diferencias funcionales entre los órganos tendinosos de Golgi y los husos musculares radican en su arreglo anatómico, pues mientras los husos musculares se localizan en paralelo a las fibras del músculo, los órganos tendinosos de Golgi se encuentran en serie con dichas fibras (ver figura 1), determinando que ambos receptores tengan características distintas (Matthews, 1972).

Como ya se mencionó, los husos musculares juegan un papel importante en el control motor. Si un músculo es estirado, las aferentes Ia sufren un incremento en su actividad eléctrica, mientras que las fibras Ib no varían significativamente su frecuencia de descarga (Patton, 1965). En cambio, si ahora el músculo se contrae, por efecto de la activación de motoneuronas a, las fibras Ia disminuyen su frecuencia de descarga mientras que las fibras Ib la incrementan significativamente (Hunt y Kuffler, 1951; Matthews, 1972; Gordon y Guez, 1991). Estos resultados han permitido suponer que tanto los husos musculares como los órganos tendinosos de Golgi, otorgan información sobre el estado mecánico del músculo, pues mientras los husos musculares informan sobre el grado de estiramiento en el que se encuentra el músculo, los órganos tendinosos de Golgi informan sobre la tensión desarrollada durante la ejecución de un acto motor (Antuñez, 1979).

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El reflejo miotático.

El reflejo espinal más ampliamente estudiado es el reflejo miotático, que es una respuesta de contracción muscular que se produce cuando el músculo es estirado. A principios del siglo XX, Sir Charles Sherrington encontró que el reflejo miotático requiere tanto de una entrada sensorial a la médula espinal, como de la salida motora hacia el músculo, pues este tipo de reflejo se suprime al seccionar tanto las raíces dorsales o las ventrales de la médula espinal en el gato y sigue presente aún en animales espinalizados a nivel intercolicular (Sherrington, 1925).

Las fibras aferentes Ia que inervan los husos musculares, establecen conexiones monosinápticas en la médula espinal con motoneuronas que inervan el mismo músculo (homónimas), así como motoneuronas que inervan músculos sinergistas (heterónimas). Mendell y Henneman (1971) encontraron que un total de 60 fibras Ia del músculo gastrocnemio medial del gato, establecen contacto con 300 motoneuronas, de las cuales, el 60% eran motoneuronas que provenían de músculos sinergistas, como son el gastrocnemio lateral y el sóleo. Estos mismos autores reportaron que los potenciales sinápticos excitatorios (EPSP's) registrados en las motoneuronas difieren en la amplitud, siendo mayores los EPSP's registrados en las motoneuronas homónimas con respecto a aquellos registrados en motoneuronas heterónimas. De esta manera, las aferentes Ia provenientes de los husos musculares activan monosinápticamente tanto a motoneuronas homónimas así como a motoneuronas heterónimas (Brown y Fyffe, 1981).

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Las aferentes del grupo II, las cuales también responden al estiramiento del músculo, ejercen una excitación sobre motoneuronas homónimas (Matthews, 1972) con una latencia mayor a 1.4 ms, lo que sugiere un circuito probablemente di o trisináptico (Mendell y Henneman, 1980). En cambio, la latencia del reflejo producido al estimular aferentes Ia resulta ser de entre 0.7 y 0.8 ms, lo que indica un reflejo monosináptico. Este hecho fue demostrado por Renshaw (citado en: Ruch y cols., 1974), y posteriormente con mayor detalle por otros investigadores (Brock y cols., 1952; Eccles, 1964a; Brown y Fyffe, 1981).

El reflejo miotático es más débil y más variable en animales intactos que en animales descerebrados, esto se debe a que en animales descerebrados, todos los reflejos espinales se facilitan (Gordon y Guez, 1991). En cambio, en animales intactos, existe un balance entre la inhibición y la facilitación de los reflejos espinales debido a vías descendentes provenientes de la corteza cerebral, u otras vías provenientes de centros superiores, que de manera normal se encuentran modulando diferentes reflejos espinales. Esto quiere decir que existe un tono inhibitorio descendente que se pierde por la descerebración, facilitando los reflejos espinales (Sherrington, 1947).

Inhibición espinal.

La primera evidencia de inhibición neuronal por estimulación de nervios apropiados se obtuvo en 1845 por los hermanos Weber (citado en: Davidoff y Hackman, 1984). Su clásica demostración de la acción del nervio vago en el corazón fue segui-

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da en los años posteriores por otros ejemplos de inhibición periférica, pero fueron las observaciones de Sechenov (citado en: Davidoff y Hackman, 1984) las primeras que indicaban la existencia de inhibición en el SNC. Sherrington (1925) demostró que la inhibición es un proceso activo, y no solo la ausencia de excitación, también desarrolló el concepto de inervación recíproca como un elemento normal del reflejo. Estas ideas fueron analizadas con detalle posteriormente por Eccles (1964a), el cual mediante registros intracelulares de motoneuronas mostró que los potenciales postsinápticos inhibitorios (IPSP's) en la membrana de motoneuronas, estaban asociadas con inhibición espinal. Existen principalmente tres tipos de inhibición espinal: inhibición postsináptica, inhibición recíproca e inhibición presináptica las cuales serán discutidas brevemente (Davidoff y Hackman, 1984).

Inhibición postsináptica.

Lloyd (1946a) no solo mostró que la estimulación de aferentes Ia produce excitación monosináptica en las motoneuronas α homónimas, también encontró que esta misma estimulación produce inhibición de reflejos de músculos antagonistas. Es decir, la activación de aferentes Ia produce inhibición de motoneuronas que inervan músculos antagonistas (Lloyd 1941, 1946a, 1946b; Laporte y Lloyd, 1952); este tipo de inhibición se denominó inhibición postsináptica. Posteriormente, haciendo análisis sobre las latencias en esta inhibición, se encontró que la latencia en la inhibición del músculo antagonista resultaba ser 0.8 ms mayor que la latencia de los EPSP's de los músculos agonistas (Brock y cols., 1952; Eccles y cols., 1956). Ello indicó que la inhibición postsináptica está mediada por una sola interneurona inhibitoria (Fig. 3),

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la cual al ser activada, libera glicina sobre la motoneurona produciendo un IPSP (Eccles, 1957). De esta manera, cuando un músculo se contrae por efecto de la activación de aferentes Ia, el músculo antagonista se inhibe. A esta inhibición se le conoce como inhibición recíproca.

La inhibición postsináptica producida por la estimulación de fibras Ia, también conocida como inhibición recíproca o inhibición Ia de músculos antagonistas, tiene un curso temporal muy característico: una latencia de aproximadamente 0.5 ms que se atribuye al retardo sináptico; alcanza su efecto máximo como a los 2 ms y

A

Inhibición Postsináptica

Reflejo Monosináptico

B

Inhibición Presináptica

Motoneurona α Aferentes Ia

Motoneurona α

Motoneurona α

Interneurona inhibitoria presináptica (libera GABA)

Interneurona inhibitoria Ia o recíproca (libera glicina)

Fig. 3 Inhibición del reflejo monosináptico. A, como respuesta a un estiramiento del músculo, las fibras Ia aumentan su frecuencia de descarga; estas fibras llegan hasta la médula espinal donde hacen contacto sináptico con motoneuronas α las cuales se dirigen de regreso al mismo músculo. Este reflejo puede ser inhibido mediante inhibición postsináptica, la cual está mediada por una interneurona glicinérgica que es activada por fibras Ia de músculos antagonistas. B, la inhibición presináptica en cambio, está mediada por dos interneuronas (así como por el neurotransmisor GABA). Modificado de Rudomin y Schmidt, 1999.

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decae lentamente desapareciendo aproximadamente a los 8 ms (Coombs y cols., 1955; Curtis y Eccles, 1959; Jankowska y Roberts, 1972). Las interneuronas inhibitorias Ia se han identificado por medio de registros intracelulares (Hultborn y cols., 1971) o mediante estudios de inyecciones intracelulares de peroxidasa de rábano (Jankowska y Lindström, 1972), revelando estar localizadas muy cercanas al núcleo motor de la médula, en la lámina VII de Rexed.

Existen otros tipos de inhibiciones postsinápticas, como las producida por la estimulación de aferentes de los órganos tendinosos de Golgi (fibras Ib), la cual se conoce como inhibición no recíproca pues las aferentes Ib inhiben a motoneuronas homónimas (Laporte y Lloyd, 1952), esto es, se genera en el mismo músculo por lo que también se conoce como inhibición autogenética. Una característica que distingue a los grupos de interneuronas que median la inhibición postsináptica radica en la diferencia de las entradas sinápticas que reciben. Por un lado las interneuronas inhibitorias activadas por aferentes Ib (interneuronas Ib) reciben también influencia sináptica de aferentes Ia, sin embargo las interneuronas inhibitorias activadas por aferentes Ia (interneuronas Ia) no tienen influencia de aferentes Ib (Hultborn y cols., 1971; Jankowska, 1992). Además, se sabe que las fibras aferentes de origen cutáneo facilitan las respuestas de las interneuronas Ib que se producen al estimular aferentes Ib (Lundberg y cols., 1975); esto es relevante en la terminación de un movimiento cuando se activan receptores cutáneos.

Las interneuronas Ib se localizan principalmente en las láminas VI y VII de Rexed (Eccles, 1964a). Además, establecen contacto sináptico con neuronas del tracto

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espinocerebeloso dorsal o columnas de Clarke (Hongo y cols., 1978). Lo cual ha permitido identificar dichas interneuronas por sus respuestas al estimular antidrómicamente las columnas de Clarke (Rudomin y cols., 1987; Jankowska, 1992).

Inhibición recurrente

En 1941, Renshaw demostró que los impulsos antidrómicos en las motoneuronas pueden inhibir la respuesta refleja monosináptica de motoneuronas α que inervan músculos sinergistas (Pompeiano, 1984). Esta inhibición se encuentra mediada por interneuronas (interneuronas de Renshaw) localizadas en el asta ventral de la médula espinal que inhiben a motoneuronas α (Eccles, 1964a). Las interneuronas de Renshaw pueden ser activadas por motoneuronas α, y a su vez estas pueden hacer contactos sinápticos con motoneuronas homónimas, así como con interneuronas Ia que median la inhibición recíproca (Pompeiano, 1984). Ha sido sugerido que este tipo de inhibición también juega un papel importante en el control de la postura y el movimiento (Henneman, 1980).

Inhibición presináptica.

Además de la inhibición postsináptica, la transmisión sináptica también puede ser modulada a nivel presináptico. Los EPSP’s registrados en motoneuronas extensoras, pueden ser reducidos de tamaño por pulsos condicionantes producidos en aferentes Ia de músculos flexores (Frank y Fuortes, 1957). Lo importante de estas observaciones es que estos pulsos condicionantes producen inhibición sin alterar las

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propiedades de la membrana postsináptica de las motoneuronas, despolarizando a las fibras aferentes. Esta despolarización de terminales presinápticas disminuye la amplitud del potencial de acción que viaja por dichas terminales, provocando una disminución en la cantidad de neurotransmisor liberado, causando así la llamada inhibición presináptica (Eccles, 1964a y 1964b). Además, se ha sugerido que este efecto se debe en parte a un decremento en corrientes de calcio voltaje dependientes en las aferentes que contactan sinápticamente con las motoneuronas (véase Dunlap, 1998).

La despolarización de las aferentes que ocurre concomitantemente con la inhibición presináptica ha sido llamada despolarización de aferentes primarias (PAD por sus siglas en inglés) y se le ha asociado como el agente causal de la inhibición presináptica (de acuerdo a la hipótesis propuesta por Eccles a inicios de la década de 1960). La PAD tiene una latencia compatible con procesos sinápticos que involucran dos sinapsis, esto es, de 3 a 5 ms (Eccles y cols. 1962b; Eccles y cols., 1963a) (Fig. 3B). Además, existe suficiente evidencia que demuestra que el GABA es el neurotransmisor responsable de la PAD (DeGroat, 1972; Nishi y cols., 1974; Gallagher y cols., 1979; Nistri y Constanti, 1979; Nistri, 1983), pues los antagonistas del GABA, como la bicuculina y la pricotoxina, reducen la PAD (Eccles y cols., 1963b; Schmidt, 1963; Tabecic y Phillis, 1969; Levy y cols., 1971; Davidoff, 1972; Barker y Nicoll, 1973; Levy, 1975; Constanti y Nistri, 1976; Gmelin y Cerletti, 1976; Curtis y cols., 1977; Quevedo y cols., 1995). El efecto del GABA en la PAD, ha llevado a suponer que este fenómeno es debido a que el potencial de equilibrio del cloro se encuentra por arriba del potencial de membrana, posiblemente por la presencia de un

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cotransportador de Cl-, Na+, K+ sensible a furosemida y bumetanida que mantiene altos los niveles de cloro en las aferentes sensoriales (Alvarez-Leefmans, 1998; Rudomin y Schmidt, 1999), de esta forma el GABA provocaría una corriente de cloro saliente que despolarizaría dichas aferentes.

El curso temporal de la inhibición presináptica es más prolongado que el de la inhibición postsináptica: tiene una latencia de 3-5 ms, con un efecto máximo a los 20 ms, y aún persiste de 100 a 200 ms después de la aplicación del estímulo condicionante (Eccles y cols., 1962a). Este curso temporal en la inhibición presináptica es muy similar al curso temporal de la PAD, por lo que para explicar la larga duración de esta despolarización ocurrida en las fibras aferentes se ha supuesto que es debida a una actividad sostenida de las interneuronas que producen la inhibición presináptica (Eccles, 1964a), o bien, a una liberación y/o recaptura lenta del GABA (Rudomin y Muñoz-Martínez, 1969). De cualquier forma, es importante resaltar que existe un control de la información aferente que puede ser modulado por información aferente, es decir, la entrada de información sensorial regula la transmisión de información antes de que sea transmitida hacia la salida motora (Willis y Coggeshall, 1991; Rudomin y Schmidt, 1999).

Efectos de la inhibición pre y postsináptica en las fluctuaciones del reflejo monosináptico.

Se sabe que los reflejos monosinápticos provocados por la aplicación de pulsos de amplitud constante a las aferentes musculares, presentan fluctuaciones en su

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tamaño (Sherrington, 1925; Hunt, 1955). Se ha sugerido que dicha variabilidad de la respuesta monisináptica es función del número de motoneuronas activadas, y se debe principalmente a la actividad de fondo de interneuronas que controlan directa o indirectamente la excitabilidad de poblaciones de motoneuronas (Hunt, 1955; Rall y Hunt 1955; Somjen y Heath, 1966).

Como ya se ha mencionado, la transmisión monosináptica de aferentes Ia a motoneuronas, puede ser modulada a nivel presináptico (Eccles, 1964a). En algunos estudios se ha mostrado que la variabilidad del reflejo monosináptico se reduce significativamente cuando la estimulación que produce dicho reflejo, es precedida por estimulación de aferentes que producen PAD; sin embargo, no se ha podido observar una reducción de la variabilidad de los reflejos cuando se estimulan aferentes que producen inhibición postsináptica (Rudomin y Dutton 1967, 1969a; Rudomin y cols., 1968). También se ha observado una variabilidad en potenciales registrados por estimulación antidrómica de fibras aferentes Ia. Esta variabilidad se reduce condicionando con estímulos a fibras cutáneas, pero aunado a este fenómeno se ha observado un aumento en la excitabilidad de dicha respuesta, indicando que probablemente las vías cutáneas inhiben otras vías aferentes involucradas en la inhibición presináptica (Rudomin y Dutton, 1969b).

El potencial de raíz dorsal.

Los potenciales negativos lentos de raíz dorsal (DRP’s por sus siglas en inglés) fueron descritos desde hace mucho tiempo (Barron y Matthews, 1938), sugi-

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riendo que estos se originan como consecuencia de ciertas propiedades de fibras aferentes o bien, de la actividad de interneuronas (véase revisión en Willis, 1999). Los DRP's pueden ser provocados por la estimulación de otras raíces dorsales (Barron y Mattews, 1938), por la estimulación de aferentes musculares o cutáneas (Eccles, 1964a), por la estimulación de sitios específicos del encéfalo (Andersen y cols., 1962; Iles, 1996), por estimulación a estructuras pertenecientes al tallo cerebral (Quevedo y cols., 1995), así como por la estimulación del tracto de Lissauer (Cervero y cols., 1978; Wall y Yaksh, 1978; Wall y Lidierth, 1997).

El DRP producido por la estimulación de fibras aferentes es mayor cuando se estimulan aferentes de origen cutáneo que cuando se estimulan aferentes musculares (Wall, 1958; Eccles y cols., 1963a y 1963c). El DRP es una consecuencia de la PAD y, como ya se mencionó, está asociado al fenómeno de inhibición presináptica (Eccles y cols., 1963a y 1963b). Es importante mencionar que el DRP que se produce por la estimulación de aferentes cutáneas es producto de una despolarización exclusivamente de aferentes de origen cutáneo y de una pequeña fracción de aferentes Ib. Sin embargo, la estimulación de fibras musculares Ib puede producir DRP's por despolarización de aferentes Ib y por la despolarización de una fracción pequeña de aferentes Ia, así como de aferentes cutáneos. Casualmente, el DRP producto de la estimulación de aferentes Ia, solo es debido a la despolarización de aferentes Ia, como se resume en la figura 4 (Eccles y cols., 1963c).

Hay evidencias que sugieren que interneuronas presentes probablemente en la sustancia gelatinosa de Rolando en el dorso de la médula (Lámina II superficial),

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están involucradas en la generación de los DRP’s (Wall y

Fibras que producen la PA D

Lidierth, 1997), y por lo tanto en la modulación de la informa-

Fibras en las que se registra la PAD

Ia Flexor

ción sensorial. Además, se tie-

Ib

Ia

Ia

Ib

ne evidencia de que los DRP's pueden ocurrir espontáneamente en la médula espinal aislada y que los DRP's espontáneos

Extensor

Ib CUT

CUT

ocurren en sincronía con actividad espontánea de neuronas localizadas entre las láminas III y

Figura 4. A la izquierda se muestran los tipos de aferentes que al ser estimuladas despolarizan a las fibras aferentes que se localizan a la derecha. El grosor de las flechas indica la magnitud media de la PAD producida en las fibras aferentes registradas intracelularmente (n=100). (Modificado de Eccles y cols., 1963c).

VI, además de la existencia de correlación cruzada entre la actividad de pares de raíces dorsales ipsilaterales (Kerkut y Bagust, 1995). Estas evidencias, sugieren que hay una relación funcional entre los potenciales producidos en las raíces dorsales (DRP´s) y los generados por la actividad sincrónica de neuronas del asta dorsal, como se verá en la siguente sección.

Actividad espontánea de grupos de neuronas en el asta dorsal de la médula espinal

Un tipo de registro que se ha llevado a cabo principalmente para analizar la actividad eléctrica de la médula espinal, es el electroespinograma (SEG, por sus siglas en inglés). Con este tipo de registro se han caracterizado potenciales provocados

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por la estimulación de entradas sensoriales a la médula espinal. El SEG se puede registrar mediante electrodos finos de plata clorurada que se insertan en la médula espinal (Gasteiger e Ichikawa, 1963). Otro tipo de registros de la actividad eléctrica intraespinal se puede obtener mediante microelectrodos que se insertan en la médula espinal. Con este método, ha sido posible obtener registros de potenciales de campo extracelulares (EFP´s por sus siglas en inglés) producidos por la estimulación de aferentes cutáneos o musculares (Willis y cols., 1973).

Con estas técnicas se han descrito potenciales espontáneos registrados en el dorso de la médula (nCDP's espontáneos, por sus siglas en inglés), es decir, potenciales no provocados que ocurren en el tiempo, los cuales no son debidos a la actividad del encéfalo, pues en gatos espinalizados están presentes, aunque las vías descendentes pueden modularla (Levitan y cols., 1968; Kasprzaky gasteiger, 1970). Esta actividad espontánea ha sido estudiada por Gasteiger e Ichikawa (1963), quiénes encontraron que en el gato, los nCDP’s espontáneos son de dos clases: potenciales de amplitud promedio mayor a 125±50 µV y duración de 40±10 ms, y otros de amplitud menor de 25±10 µV y una duración de 10±5 ms. En otros trabajos, también se han caracterizado este tipo de potenciales espontáneos, en relación a su origen e influencias (Manjarrez y cols, 1996; 1997; 1998) como se describirá con detalle mas adelante.

Esta actividad espontánea de la médula espinal se encuentra presente también en las raíces dorsales y ventrales en preparaciones de médula espinal aislada de hámster (Kerkut y Bagust, 1995). Se ha propuesto que los mecanismos involucrados en la generación de los DRP´s espontáneos es producida sinápticamente, por los mismos

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mecanismos que producen la PAD de aferentes primarios (Bagust y cols., 1985). En el asta dorsal de la médula espinal existe una gran cantidad de neuronas sensoriales que presentan actividad espontánea (la cual se define como actividad eléctrica no provocada por algún estímulo; Sandkühler y cols., 1995). Además, se ha encontrado que las neuronas del asta dorsal de la médula espinal (láminas III-VI) con actividad espontánea difieren de aquellas neuronas silentes, en que ellas poseen campos receptivos mayores y una gran sensibilidad a la estimulación selectiva de receptores de la piel (Brown y cols., 1973 y 1998). Es bien sabido que las neuronas que reciben entradas sinápticas de aferentes cutáneos se distribuyen más dorsalmente (Láminas IV-VI), que aquellas interneuronas que responden a la activación de aferentes musculares (Lámina VII) (Willis y cols., 1973; Willis y Coggesall, 1991).

Aunque al principio no se otorgó una significancia fisiológica importante a la actividad espontánea que se registra en el dorso de la médula (nCDP's espontáneos), algunas evidencias sugieren que esta actividad espontánea podría participar en la modulación de respuestas espinales ante ciertos estímulos, como los reflejos polisinápticos que se producen por activación de aferentes cutáneos (Rothmeier y Gasteiger, 1968; Gasteiger y Brust-Carmona, 1964; Molt y Gasteiger, 1976). En otros estudios se han observado oscilaciones periódicas en la actividad espontánea del dorso de la médula que aparecen por influencia de la formación reticular (Levitan y cols., 1968). De estos trabajos se puede concluir que las neuronas que generan los nCDP´s espontáneos pueden ser moduladas por influencias supraespinales.

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Recientemente, se ha descrito una población neuronal en el asta dorsal de la médula espinal del gato, que muestra gran actividad espontánea asociada a los nCDP’s espontáneos, y que es de origen cutáneo, pues los potenciales de campo producidos por activación de aferentes cutáneos, pueden ser facilitados cuando están precedidos por nCDP’s espontáneos (Manjarrez y cols., 1996, 1997, 1998). A continuación se describen estos hallazgos con mayor detalle.

Localización intraespinal de los grupos de interneuronas que producen los nCDP’s espontáneos

Gasteiger e Ichikawa en 1963 y Rudomin y colaboradores en 1987 sugirieron que los nCDP’s espontáneos se originaban de la actividad espontánea de neuronas en el asta dorsal de la médula espinal y quedó como un problema abierto el poder determinar con precisión la región donde se originan estos potenciales. Para responder esta pregunta, Manjarrez y colaboradores (1996) promediaron (n=32) el potencial extracelular de campo espontáneo (EFP) registrado con el microelectrodo en diferentes profundidades y sincronizado con la aparición de un nCDP espontáneo. De esta manera midieron la amplitud de los EFP’s espontáneos a un tiempo fijo y construyeron las gráficas de amplitud contra profundidad (Figura 5C). Los resultados indicaron que hay un lugar preferente, cuya máxima negatividad (el pozo de corriente), está alrededor de 1400 µm por debajo de la superficie de la médula espinal y se encuentra localizado en una región del asta dorsal que corresponde a las láminas de Rexed III-VI, donde también se localizan las interneuronas que responden a la activación de aferentes cutáneos (Fig. 5C). Estos resultados sugieren que las neuronas

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que generan los nCDP’s espontáneos podrían ser las mismas interneuronas que responden monosinápticamente a la estimulación de aferentes cutáneos de bajo umbral (Manjarrez y cols., 1996, 1997, 1998).

Durante la ejecución de un acto motor existe una interacción de sistemas segmentales con sistemas aferentes y descendentes; así, los reflejos dependen del estado de muchas interneuronas espinales que reciben gran cantidad de influencias (Skinner y Willis, 1970; Fu y cols, 1974; Skinner y Remmel, 1978; Edgley y Jankowska, 1987; Wall y Lidierth,1997). Es posible pensar entonces en grupos neuronales que son los responsables de la fluctuación en los reflejos espinales. Entre los grupos de neuronas candidatos se encuentran: las neuronas que median la inhibición presináptica (Rudomin y Dutton, 1969a); las neuronas de la sustancia gelatinosa (Wall y Lidierth, 1997), pues se les ha asociado con la generación de DRP’s espontáneos; o bien, las neuronas que generan los nCDP’s espontáneos (Manjarrez y cols., 1996, 1997, 1998).

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A

50 µV

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nCDP-espontáneo

100 ms nCDP-espontáneo

B

50 ms

nCDP provocado CDP

C

EFP-espontáneo

EFP

EFP provocado AMPLITUD DEL EFP (µV) 100

0

-100

-200

-300

EFP-espontáneo

2000

PROFUNDIDAD (µm)

EFP provocado

0

2 mm

_

+

4000

Figura 5. Distribución intraespinal de los potenciales de campo asociados a nCDP's espontáneos y potenciales de campo monosinápticos producidos por estimulación de aferentes cutáneos. A, nCDP's-espontáneos registrados en la superficie de la médula espinal a nivel L6 (izquierda) y nCDP's espontáneos promedio obtenidos por aquellos potenciales espontáneos que excedieron un nivel de ventana arbitrario mostrado por la línea horizontal (derecha). B, nCDP's espontáneos promediados (como en A) y nCDP's registrados en el dorso de la médula provocados por estimulación al nervio cutáneo peroneo superficial (pulsos únicos, 1.2xT). C, izquierda: potenciales promedio de campo extracelulares (EFP's) espontáneos y provocados por la estimulación al nervio peroneo superficial registrados a diferentes profundidades como lo indican la flechas. Centro: Gráfica de amplitud de los nCDP's-espontáneos (círculos) y EFP's provocados (triángulos) contra la profundidad del registro. Derecha: sección transversal del segmento espinal L6 superponiendo los contornos isopotenciales de los EFP's espontáneos y provocados derivados de una serie de 4 penetraciones mostradas por las líneas paralelas. Nótese que la negatividad máxima parece ocurrir en la misma región del asta dorsal.

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Planteamiento del problema

Se ha mencionado anteriormente que las neuronas que responden a la activación de aferentes cutáneos, se localizan en la misma región (Láminas III-VI) que las neuronas responsables de generar los nCDP´s espontáneos (Manjarrez y cols., 1996). Además, las neuronas que responden a la estimulación de aferentes cutáneos presentan efectos sobre la vía del reflejo monosináptico (Lund y cols., 1965), actuando sobre de la interneurona de primer orden que media la PAD de aferentes Ia (Rudomin y cols., 1986). Aunado a estos resultados, se tiene evidencia de que la variabilidad de los reflejos monosinápticos puede ser modulada presinápticamente (Rudomin y Dutton, 1969a), por lo que en este trabajo nos propusimos explorar si las interneuronas del asta dorsal, que son responsables de generar los nCDP’s espontáneos, contribuyen a la variabilidad que presenta la amplitud del reflejo monosináptico, de la misma manera que lo hace la influencia de los aferentes cutáneos.

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Hipótesis y Objetivos

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HIPÓTESIS El origen de la variabilidad en la amplitud del reflejo monosináptico se debe, en parte, a la participación de las fluctuaciones de la actividad espontánea poblacional de interneuronas del asta dorsal de la médula espinal.

OBJETIVOS Objetivo general. Examinar la relación funcional entre las fluctuaciones de la actividad espontánea poblacional de las interneuronas del asta dorsal y la amplitud del reflejo monosináptico.

Objetivos específicos. 1. Analizar la amplitud de las respuestas monosinápticas cuando son precedidas por nCDP´s espontáneos (de diferente amplitud). 2. Analizar la amplitud de las respuestas reflejas monosinápticas que son precedidas por nCDP´s espontáneos registrados en el dorso de la médula a diferentes intervalos de tiempo. 3. Explorar el efecto de la activación de las neuronas que generan los nCDP´s espontáneos sobre la amplitud de los reflejos monosinápticos condicionados por la estimulación de fibras que producen inhibición presináptica. 4. Explorar el efecto de la activación de las neuronas que generan los nCDP´s espontáneos sobre la despolarización de aferentes primarios musculares.

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Material y Métodos

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MATERIAL Y MÉTODOS

Preparación experimental.

Para los experimentos se emplearon 32 gatos anestesiados con pentobarbital sódico a una dosis de 35 mg/kg i.p. La presión arterial fue monitoreada mediante un cateter colocado en la arteria carótida izquierda y conectada a un transductor de presión. La temperatura fue mantenida a 37°C irradiando luz infrarroja. En cada experimento se expuso la médula espinal, a nivel lumbosacro y torácico bajo mediante una laminectomía de las vértebras correspondientes. Se seccionaron las raíces ventrales L5, L6, L7 y S1, así como las columnas dorsales a nivel de T12. Se disecaron y seccionaron los nervios del bíceps posterior y semitendinoso (PBSt), sural (SU), peroneo superficial (SP), gastrocnemio-soleo (GS). Estos nervios fueron montados en electrodos bipolares de plata clorurada con la finalidad de estimulación.

Registro.

Se realizó el registro de potenciales de raíz dorsal (DRP’s) a nivel de L7 por medio de electrodos bipolares de gancho de plata clorurada. Simultáneamente se hizo el registro del reflejo monosináptico en las raíces ventrales a nivel de L7 y en algunos casos L6. Los potenciales espontáneos del dorso de la médula (nCDP´s espontáneos) se registraron a través de un electrodo de plata con un polo colocado en el dorso de la médula, en forma de bolita para no lesionar el tejido, y el otro insertado en los músculos paravertebrales.

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Material y Métodos

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Las señales registradas del CDP, DRP y el reflejo monosináptico se llevaron a amplificadores de AC (Grass P511), donde las señales se amplificaron x5000 para el caso del CDP, x2000 para el reflejo monosináptico y x10000 para el caso del DRP. Las frecuencias de corte (filtros pasa bajas y pasa altas) de los registros fueron de 0.3 Hz y 30 KHz para todas las señales registradas. Posteriormente, las señales se digitalizaron (frecuencia de digitalización 100 KHz) en una interface analógico digital (DigiData 1200 de Axon Instruments) para su posterior análisis. La actividad espontánea del dorso de la médula (nCDP's espontáneos) se pasó por un discriminador de ventana (WPI 121) de tal forma que cuando un potencial espontáneo superó el nivel de ventana indicado, se generararon pulsos de estimulación programados a los nervios indicados anteriormente. Esto se hizo con la finalidad de inducir un reflejo monosináptico y correlacionar la respuesta de la estimulación cuando fue precedida por un potencial espontáneo del dorso de la médula.

Los reflejos monosinápticos se provocaron mediante la estimulación a los nervios musculares GS y PBSt mediante un estimulador de pulsos programable (Master 8 de AMPI). La intensidad de la estimulación se expresó como múltiplos del valor umbral (xT), que para las fibras sensoriales se determinó cuando apareció la primera deflección negativa (salva aferente) registrada en el dorso de la médula.

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Método de discriminación por amplitud de las señales.

Los nCDP’s espontáneos fueron seleccionados por amplitud mediante un discriminador de ventana. De esta manera, un evento espontáneo específico pudo activar un estímulo a las fibras sensoriales que produjeron el reflejo monosináptico, con lo cual

A 50 µV 150 ms

B

se obtuvieron reflejos que sólo fueron precedidos por eventos

nCDP + Reflejo

Reflejo sólo

espontáneos.

nCDP sólo

CDP

VRP

Método de estimulación activada por eventos espontáneos.

Se empleó un dispositivo electrónico que permitió examinar la respuesta producida por la estimulación de una vía sensorial, cuando esta fue precedida a distintos intervalos de tiempo por potenciales espontáneos registrados en el dorso de la médula (Fig. 6). El sistema genera un pulso de sincronía o de

Estímulo 1

Estímulo 2

Discriminador Analógico T1 de Alternancia IN nCDP

OUT Stim

T2 T3

Figura 6. Representación esquemática del sistema que permitió el análisis de respuesta a estímulos de vías sensoriales precedidas por nCDP´s. A, Potenciales espontáneos registrados en la superficie de la médula espinal (nCDP’s espontáneos), la línea punteda esquematiza el nivel de ventana bajo el cual fueron discriminados. B, Diagrama esquemático del funcionamiento del equipo. Este consta de una entrada, tres salidas de sincronía (T1, T2, T3) y una de estimulación (Stim) que fue usada para activar las aferentes sensoriales (con los estímulos 1 y 2) y producir los potenciales provocados. La ocurrencia de T1 indica que un potencial provocado (condicionado) fue precedido por un nCDP, T2 corresponde a un potencial provocado (no-condicionado) y T3 a la ocurrencia de un nCDP espontáneo solo.

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estimulación específicamente cuando un evento espontáneo aparece, además de impedir durante un tiempo que es definido por el usuario, que un nuevo evento espontáneo genere los pulsos de sincronía o estimulación. Este sistema solo requiere que la entrada sea una señal de voltaje variable en el tiempo que pueda ser discriminada por amplitud. El equipo permite la alternancia de tres eventos: el potencial provocado (por el estímulo de prueba 1) precedido por el potencial espontáneo (nCDP), el potencial provocado (por el estímulo de prueba 2) no precedido por un potencial espontáneo y el potencial espontáneo solo (Fig. 6). La alternancia de estos eventos ocurre con un intervalo de tiempo elegido por el usuario (0.5-2s). Ello garantiza que las comparaciones promedio entre las respuestas condicionadas y no-condicionadas no se vean afectadas por posibles no estacionariedades atribuibles al estado de la preparación experimental.

Cada vez que un potencial espontáneo es detectado por un discriminador de ventana, un pulso TTL, referido a este potencial, es enviado al equipo. Entonces se activa el siguiente protocolo (Fig. 6B) que se divide en dos partes:

I) Un intervalo de tiempo (0-200ms) después de haber accesado el pulso TTL (correspondiente al nCDP espontáneo discriminado), se activa el estímulo de prueba 1 que genera un potencial provocado (condicionado). En seguida el equipo empieza a monitorear la entrada con el objeto de detectar cualquier nCDP espontáneo que ocurra en un rango de 0.5-1 s de intervalo de muestreo (seleccionado por el usuario). Si en este intervalo no se presenta un nCDP espontáneo, se activa el estímulo de prueba 2 que genera un potencial provocado (no-condicionado); de lo contrario, no se pro-

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Material y Métodos

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duce estimulación II) y se inhabilitan los estímulos 1 y 2, permitiendo la detección de un nCDP espontáneo solo. Estas dos partes del protocolo se activan sucesivamente en forma alternada, de manera que cuando ocurre un nCDP espontáneo, comienza la parte I del protocolo con intervalo de tiempo de 1-2s (seleccionado por el usuario). Terminado este intervalo, el equipo está listo para llevar a cabo la parte II en cuanto reciba otro nCDP espontáneo, y así sucesivamente. De esta manera se obtienen reflejos precedidos por nCDP's espontáneos, asi como reflejos no precedidos por dichos eventos.

Análisis de datos.

Se calculó la varianza de la amplitud que presentó el reflejo monosináptico a diferentes niveles de discriminación. Este análisis se realizó tomando en cuenta diferentes intervalos de tiempo entre la ocurrencia de un nCDP espontáneo y la estimulación provocada a algún nervio. Se hizo el cálculo del coeficiente de correlación lineal entre las amplitudes de los nCDP’s espontáneos y los reflejos monosinápticos.

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Resultados

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RESULTADOS

En este estudio se emplearon 32 gatos adultos sin distinción de su sexo. En una primera serie de experimentos, se analizó el efecto de la activación espontánea de las neuronas que generan los nCDP's espontáneos sobre la respuesta refleja monosináptica producida por la estimulación al nervio GS. Con ayuda del estimulador activado por eventos espontáneos (vease métodos) fue posible obtener reflejos que no estuvieron precedidos por nCDP's espontáneos (Fig. 7A-B), ya que el sistema realiza una estimulación automática cuando detecta que no se ha presentado ningún evento que rebase el nivel de ventana bajo los cuales se discriminan dichos nCDP's espontáneos. En la figura 7D se ilustra el registro promedio de los reflejos monosinápticos precedidos por nCDP´s espontáneos de amplitud fija. Las figuras 7B-D corresponden a los registros expandidos de reflejos monosinápticos empleados para obtener la figura 7E. Se eligió un intervalo de tiempo de 15 ms entre los nCDP's espontáneos condicionantes y la estimulación que produjo el reflejo monosináptico. Se empleó dicho intervalo ya que el mayor efecto en la reducción de la variabilidad de los reflejos monosinápticos por condicionamiento de aferentes cutáneos se obtiene entre los 15 y 20 ms (Rudomin y cols., 1969). Los resultados obtenidos muestran que los reflejos precedidos por nCDP's espontáneos presentaron una amplitud mayor que aquellos que no fueron precedidos por dichos eventos (Fig. 7E). Se puede observar una diferencia del 62.9% en la amplitud de reflejos condicionados por nCDP's espontáneos respecto a reflejos que no se encontraron precedidos por estos eventos espontáneos. El mismo análisis se realizó en cinco experimentos, obteniéndose una diferencia promedio de un 55.6±12.2%, la cual fue estadísticamente

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Resultados

significativa (p