AGROBIOTECNOLOGIA CURSO 2016

Biocontrol de insectos plaga de la agricultura Marcelo Berretta

Departamento de Fisiología, Biología Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

Sumario Impacto de los insectos en la agricultura Entomotoxinas de Bacillus thuringiensis Plantas Bt Estrategias para evitar el surgimiento de resistencia Otras proteínas con actividad insecticida Silenciamiento génico Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Control Microbiano Referencias

Impacto de los insectos en la agricultura

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Impacto de los insectos en la agricultura Los insectos producen de 15% a 35% de las pérdidas agrícolas a nivel mundial. Mercado global de agroquímicos (3,5 millones de ton i.a.) Valor de las ventas por región (en miles de milones de U$S)

% de ventas por tipo de agroquímico 9% 22%

9

1,5

12

42% Europa herbicidas

Total: U$S 8.110 M

insecticidas

Asia

Total: U$S 98.000 M

fungicidas

Norteamérica

otros

Africa/Medio Oriente

10 27% M Total: U$S 8.110

América Latina

12

Total: U$S 98.000 M

Tomado de: Pretty y Pervez Bharucha, Insects, 2015

Eficacia promedio de las prácticas de control de plagas y enfermedades para reducir las pérdidas agrícolas Datos globales 2001-03

Tomado de: Oerke, J Agr. Sci., 2006

Evolución del mercado argentino de fitosanitarios

Tomado de Masiá & Moltoni, CLADEIII/JHE XXIII, 2012.

Insectos plaga de la agricultura Lepidoptera orugas

Anticarsia gemmatalis - Oruga de las leguminosas

Diatraea saccharalis - Barrenador del tallo

Spodoptera frugiperda - Oruga militar tardía

Insectos plaga de la agricultura Díptera - moscas y mosquitos

Coleóptera - escarabajos

Ceratitis capitata - Mosca de los frutos

Hemíptera – chinches y pulgones

Bemisia tabaci - Mosca blanca

Anthonomus grandis – Picudo del algodonero

http://inta.gob.ar/documentos/insectos-perjudiciales-de-la-soja-y-su-manejo-integrado-en-la-region-pampeana-central/

El uso de insecticidas juega un papel principal en el combate de las plagas agrícolas • Los insecticidas químicos son poco selectivos y afectan por igual a plagas e insectos benéficos • Su acumulación en el medio ambiente es perjudicial para otras especies • Pueden afectar la salud de los operarios agrarios • Inciden en forma desfavorable en los costos de producción

Efectos no deseados de los insecticidas sobre las plagas Resurgencia por supresión de enemigos naturales Emergencia de plagas secundarias

Generación de resistencia

Tomado de: Hajek, 2004. Natural Enemies. Cambridge University Press

Insecticidas químicos, bioinsecticidas (insecticidas microbianos) y cultivos GM resistentes a insectos

Ventajas y desventajas de los bioinsecticidas y cultivos GM comparados con los insecticidas químicos Bioinsecticidas

Cultivos GM

Reducción del uso de insecticidas químicos de amplio espectro Reducción de la contaminación ambiental y de la exposición a tóxicos por parte de los operarios Ahorros en costos de producción

Ventajas

Mayor velocidad de biodegradación Mayor estabilidad ante factores ambientales Acción más efectiva sobre insectos que se desarrollan dentro de los tejidos vegetales Especificidad demasiado estrecha

Desventajas

Gastos metabólicos de la panta debido a la expresión constitutiva del insecticida

Proteínas con actividad insecticida

•

Proteínas de origen microbiano - -endotoxinas de Bacillus thuringiensis

•

Proteínas de origen vegetal - Inhibidores de proteinasas - Inhibidores de -amilasas - Lectinas - Quitinasas

•

Proteínas de origen animal - Inhibidores de proteinasas - Quitinasas

Entomotoxinas de Bacillus thuringiensis

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Bacillus thuringiensis

 Es una bacteria Gram+ que forma esporas y se distingue de otros bacilos porque produce cristales compuestos de una o más -endotoxinas (proteínas Cry).  Existe una gran variedad de toxinas pertenecientes a esta familia y cada una de ellas posee actividad específica contra insectos lepidópteros, coleópteros, dípteros e himenópteros.

Subespecies B.t. thuringiensis

B.t. kurstaki

Bt israelensis

B.t. tenebrionis

B.t. aizawai

B.t. kyushuensis

B.t. morrisoni

B.t. morrisoni

B.t. fukuensis

B.t. medellin

B.t. san diego

B.t. thompsoni

B.t. canadiensis

B. thurigiensis produce -endotoxinas durante la esporulación

Estadios del ciclo de vida de Bacillus thuringiensis.

(6-7 horas)

Microscopía electrónica de células de Bacillus thuringiensis durante la esporulación. Las endotoxinas se producen en forma de cristales de forma regular, de allí el nombre Cry (crystal) asignado a estas proteínas. El cristal se halla adyacente a la espora (ES).

Cry

Cry

ES

ES

Gentileza Dr. D. H. Sauka

Los cristales de las toxinas Cry presentan morfologías que pueden servir para establecer su clasificación A

B

C

D

E

F

Gentileza de D. H. Sauka

Cristales paraesporales de B. thuringiensis. A: Cristales bipiramidales; B: Cristales ovoides; C: Cristales cuadrados aplanados; D: Cristales bipiramidales y cúbicos; E: Cristales amorfos; F: Cristales bipiramidales atípicos y en forma de barras. Barra en A, B, C, D y F: 1 m; barra en E: 0,5  m

Insecticidas basados en -endotoxinas de B. thuringiensis • Las preparaciones de Bacillus thurigiensis se han empleado en forma de sprays en distintos excipientes. Su uso no fue muy difundido por: - Baja estabilidad de los cristales - Baja penetrabilidad (no son insecticidas sistémicos) - Especificidad demasiado estrecha

Microscopía electrónica de cristales de proteínas Cry

• Actualmente su uso está restringido a ciertos tipos especiales de manejo integrado como, por ejemplo, los de la agricultura orgánica.

-endotoxinas • Toxinas Cry - Se producen durante la esporulación como inclusiones citoplásmicas (cristales; ~20 % de la proteína total). - Son proteínas de 130-60 kDa. Sufren procesamientos N- y C-terminales. Se ha dilucidado su estructura por cristalografía de rayos X. - Actúan produciendo lisis osmótica en el epitelio intestinal. - Se han caracterizado dos tipos de receptores: cadherina y un aminopeptidasa N.

• Toxinas Cyt - Se producen durante la esporulación como inclusiones citoplásmicas (citolisinas). - Son proteínas diméricas de ~70 kDa. Se ha dilucidado su estructura por cristalografía de rayos X. - Actúan produciendo lisis osmótica en el epitelio intestinal. - No se conocen los receptores.

Proteínas VIP • Vegetative Insecticidal Proteins (VIPs) - Se producen durante el crecimiento vegetativo como proteínas de secreción. Producen lisis en el epitelio intestinal. - Vip1/Vip2 forman toxinas binarias (52/100 Kda). VIP2 tiene actividad ADPribosilasa. - VIP3a es una proteína de 88 kDa. Se une a una proteína similar a tenascina en el epitelio intestinal y se postula que produce muerte celular por inducción de un proceso apoptótico. Es activa contra varios lepidópteros.

• Otros factores de virulencia: - Fosfolipasas, α-exotoxinas (termolábiles) β-exotoxinas (análogos de ATP), metaloproteasas, quitinasas

Estructura de las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis

Toxina activa

bp

Toxina activa Tomado de: de Maagd et al., Trends in Plant Sci., 1999.

Dominio I - inserción en la membrana y formación de poros. Dominio II - Dominio III - reconocimiento y unión al receptor.

Los dominios funcionales se hallan extensamente conservados en las diferentes clases de -endotoxinas

Adaptado de: Maag et al., Trends in Genetics, 2001

Las estructuras moleculares de muchas proteínas Cry son bien conocidas

Estructuras tridimensionales de proteínas Cry tóxicas para lepidópteros, coleópteros, lepidópteros y dípteros. Los dominios I, II y III se indican en celeste, verde y magenta, respectivamente

Se reportaron cerca de 700 toxinas Cry agrupadas en 282 holotipos. El rango primario comprende holotipos de 1-72.

45%

Rango secundario

78%

Rango terciario

95%

Tomado de: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/

Clasificación de proteínas Cry

Rango primario

Nomenclatura de proteínas Cry Cry1A (Cry1Aa, Cry1Ab,…)

Nomenclatura original

Cry1

lepidópteros

CryI

Cry4

dípteros

CryIV

Cry3

coleópteros

CryIII

Cry2

lepidópteros/dípteros

CryII

Se han descrito unas 35 entomotoxinas Cyt que se agrupan en 11 holotipos. El rango primario comprende holotipos de 111, el secundario de A-D y el terciario de a-b.

Rango primario

Rango secundario

Rango terciario

1-11

A-D

a-b

Tomado de: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/

Clasificación de proteínas Cyt

Nomenclatura de toxinas VIP

1-3

• Se han descrito 96 toxinas VIP distribuidas en 28 holotipos. •Se ha propuesto clasificarlas siguiendo el mismo sistema adoptado para las toxinas Cry. El rango primario comprende holotipos de 1-3, el secundario de A-D y el terciario de a-h. • Desde los primeros reportes a mediados de los 90, la tasa de descubrimiento de nuevas toxinas VIP se ha incrementado en forma parecida a la de las toxinas Cry en la década anterior.

Rango secundario Rango terciario

A-D

a-h

Tomado de: http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/

Rango primario

Modo de acción de las proteínas Cry

Etapas del ciclo de vida de B. thuringiensis en el tracto gastrointestinal de la larva de un insecto. La condiciones de solubilización, el procesamiento por proteasas propias del insecto y el reconocimiento de receptores específicos, determinan el rango de toxicidad de las proteínas Cry

Modo de acción de las proteínas Cry

III I

II

Adaptado de: Maag et al., Trends in Genetics, 2001

a) Después de la ingestión, los cristales se disuelven en el jugo gástrico del insecto a pH 10. b) Las extremidades C- y N-terminales (fragmentos púrpura y amarillo) son procesadas por proteasas específicas del insecto. c) La toxina activa se une a receptores en las membranas de las células epiteliales mediante los dominios II y III. d) Luego de un probable rearreglo del dominio I, una horquilla de forma helicoidal se inserta en la membrana plasmática de las células intestinales. e) La toxina forma poros, posiblemente bajo la forma de oligómeros.

Posibles receptores de proteínas Cry cadherina

microdominio de membrana

Arriba: Modelo de mecanismo de acción mediado por cadherina. 1: unión a una molécula similar a cadherina y clivaje de la hélice -1; 2: estructura oligomérica pre-poro; 3: unión del oligómero a aminopepetidasa N (APN); 4: formación de l poro. Abajo: Modelo de unión bifásica secuencial de Cry1Ac a APN de Lymantria dispar. A: reconocimiento por parte del dominio III y unión al receptor por el sitio glicosilado de APN (1). B: unión del dominio II a su sitio de reconocimiento (2). El dominio I se insertaría luego en la membrana.

Efectos citotóxicos en el gusano de la raíz del maíz Inmunohistoquímica

Planta control

Planta transgénica

MV

MV GE

A

B

C Tomado de: Moellenbeck et al., Nature Biotechnology, 2001.

A) Inmunohistoquímica mostrando la unión de la toxina a las microvellosidades del epitelio intestinal. B) Sección transversal del tracto digestivo de la larva a las 48 h de alimentarse de una raíz de planta control no transgénica. C) Sección transversal del tracto digestivo de la larva a las 48 h de alimentarse de una raíz transgénica que expresa un gen cry. MV: microvellosidades GE: epitelio intestinal

Las -endotoxinas tienen actividades que afectan específicamente a diferentes órdenes de insectos Porcentaje de toxicidad relativa de diferentes -endotoxinas del tipo Cry I contra distintos insectos lepidópteros

%

La diversidad de toxinas (y de sus especificidades) podría haberse generado por permutación de dominios funcionales

Adaptado de: Maag et al., Trends in Genetics, 2001

La permutación de dominios es un mecanismo potencial para generar diversidad. Los dominios con similaridad de secuencia entre toxinas Cry naturales, híbridas y quimeras Los dominiosartificialmente con similitud de se secuencia entre indican cómo para podrían habersecomo originado toxinashaberse por obtenidas señalan en toxinas distintos colores mostrar podrían permutación de dominios entre diferentes precursores. Los dominios con colores idénticos en diferentes toxinas originado toxinas naturales por permutación de dominios (domain swapping) entre diferentes identifican a los vecinos más próximos en los árboles filogenéticos de dominios separados. Las toxinas cuyas precursores. Los dominios con colores idénticos identifican a los vecinos más próximos en composiciones figuran entre paréntesis son híbridos obtenidos por recombinación in vivo o por intercambio de los árboles filogenéticos. Las toxinas cuyas composiciones figuran entre paréntesis son fragmentos de restricción. híbridos obtenidos por recombinación in vivo o por intercambio de fragmentos de restricción

Modo de acción propuesto para las toxinas binarias Vip1/Vip2

Tomado de: Chakroun et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2016

Las bases de datos de selectividad de las toxinas Cry permiten una selección rápida de genes candidato

Las fichas de actividad de las toxinas Cry y los protocolos utilizados para los ensayos con lepidópteros, coleópteros, dípteros, himenópteros, otros ártrópodos y nemátodos pueden consultarse en bases de datos establecidas a tal efecto

http://cfs.nrcan.gc.ca/subsite/glfc-bacillus-thuringiensis/summaries

Las proteínas Cry no son tóxicas para mamíferos

CryH14

Toxicidad oral comparada de la toxina CryH14 en animales de laboratorio

Plantas Bt

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Primeras construcciones utilizadas en la transformación Nicotiana tabacum con el gen cry1A

Adaptado de: Vaeck et al., Nature 1987.

PTR (1’ y 2’): promotor bifuncional de manopina sintetasa del plásmido pTiAc de Agrobacterium 3’t7: señal de poliadenilación. neo: gen de resistencia a kanamicina. 3’OCS: terminador de octopina sintetasa

Viabilidad de larvas de Manduca sexta alimentadas con hojas de Nicotiana tabacum transgénica Plantas de Nicotiana tabacum transformadas con la fusión bt:neo860.

A

B Adaptado de: Vaeck et al., Nature 1987.

Manduca sexta

El nivel de expresión de las proteínas Cry es crítico para lograr una protección efectiva Los niveles de expresión de los genes cry resultaban demasiado bajos para controlar a la mayoría de los insectos de interés agronómico • Los niveles de expresión alcanzados utilizando el gen nativo eran del orden de 1 ng de proteína Cry por mg de tejido. • Los genes bacterianos poseen un contenido de AT de 60-70%, mientras que los genes de plantas poseen un 40-50%. • Para “vegetalizar” los genes cry deben introducirse una serie de modificaciones en la secuencia nucleotídica. - Utilizar sólo la región amino terminal (toxina activa). - Adaptar el gen al uso de codones de la planta. - Eliminar los sitios de terminación (AATAAA). - Eliminar los sitios potenciales de splicing. - Eliminar los sitios de inestabilidad de ARNm (ATTTA).

• Mediante estas modificaciones, se consigue aumentar los niveles de expresión entre 100 a 500 veces en comparación con el nivel de expresión del gen original.

Cantidad de proteína Cry sintetizada en los principales maíces Bt comerciales Product namea

Event

Syngenta Agrisure® BT 111 CB Monsanto YieldGard® MON 8102 Corn Borer Monsanto YieldGard® MON 8633 Rootworm Monsanto YieldGard MON 880174 VT™ Rootworm Monsanto Genuity™ VT MON 890345 Double PRO™ DowAgrosciences Pioneer Hi-Bred Herculex® I Dow AgroSciences Pioneer Hi-Bred Herculex® RW

TC15076

Cry Protein

f Cry/Shoot Cry/Rootc Cry/Plantd e Cry/ha Plants/ha b (g dw) (g dw) (ug) (kg/ha)

Cry1Ab Cry1Ab Cry3Bb1

4321

65.500

0,283

2594

79.040

0,205

20410

4216

24626

79.040

1,946

Cry1A.105 Cry2Ab2

6280 2826 4553

1550 620 496

7830 3446 5049

79.040 79.040 79.040

0,619 0,272 0,399 0,671

Cry1F

1207

165

1372

79.040

0,108

26376

2647

29023

79.040

2,294

5825

567

6392

79.040

7536 2983 4553 1413 24649 5275

2015 651 558 185 2623 586

9551 3634 5111 1598 27272 5861

79.040 79.040 79.040 79.040 79.040 79.040

0,505 2,799 0,755 0,287 0,404 0,126 2,156 0,463 4,191

Cry3Bb1

Cry34Ab1 DAS 5912277 Cr35Ab1

MON 880174 Cry3Bb1 Cry1A.105 Monsanto MON 890345 Cry2Ab2 Genuity™SmartStax™, 6 DowAgrosciences TC 1507 Cry1F SmartStax™ DAS 59122- Cry34Ab1 77 Cr35Ab1

Tomado de: Benbrook, Environ. Sci. Europe, 2012

Resumen de las modificaciones realizadas en tres versiones del gen cry9Aa2 (G7, G10 y G14) en comparación con el gen cry9Aa2 nativo

Cry9Aa2

G7

G10

G14

Cambios de nucleótidos

0

52

68

85

Región modificada

-

1-693

1-1124

1-1752

% de contenido AT

63,4

61,6

60,9

60,2

Señales de poliadenilación

13

7

6

0

Regiones 5` de splicing

2

0

0

0

Secuencia de terminación

1

0

0

0

Motivos ATTTA

13

10

10

8

Codones modificados

-

47

62

79

Codones poco frecuentes

4

1

0

0

Tomado de: Gleave et al., Mol. Breed., 1998.

Bioensayo con larvas de Phthorimaea operculella en plantas transgénicas de Nicotiana tabacum A

278 Control no Bt

9Aa2

G7

Control Bt

G10

G14

Versiones modificadas

C

B

Tomado de: Gleave et al., Mol. Breed., 1998.

9Aa2

G14

9Aa2

G14

Transformación de Solanum tuberosum con el gen cry3A Ensayos de infestación de papa en cámaras de crecimiento con Leptinotarsa decemlineata

Colorado potato beetle

Tomado de: Perlak et al., Plant Mol. Biol., 1993.

Plantas de Solanum tuberosum transformadas con el gen cry3A expresado bajo un promotor 35S de CaMV. Las modificaciones en el uso de codones permitieron aumentar la acumulación de la endotoxina unas 300 veces respecto de la versión no modificada. La infestación se realizó exponiendo a las plantas 50-100 neonatos del coleóptero. La fotografía fue tomada a los 7 día de comenzado el ensayo

Transformación de Solanum tuberosum con el gen cry3A

Ensayos de campo de Solanum tuberosum Bt infestadas con Leptinotarsa decemlineata

Adaptado de: Perlak et al., Plant Mol. Biol. 1993.

Fotografía satelital de un ensayo de infestación de Solanum tuberosum transformadas con el gen cry3A. Las parcelas claras corresponden a plantas control no transgénicas. La ausencia de color denota una severa infestación. Las parcelas sembradas con plantas transgénicas no han sido afectadas y exhiben una coloración roja que corresponde a la clorofila

Optimización de la expresión del gen cry1Ab en tabaco y maíz Promotor/gen

Tabaco

Maíz

Estable (hojas)

Transitoria (células en suspensión)

Transitoria (mesófilo)

Estable (hojas)

35S/Cry nativo

50

ND

NT

ND

171

35S/Cry sintético

364

5100

6500

160

176

PEPC-polen/Cry sintético

NT

560

3700

370

Los datos están expresados como ng de proteína Cry por mg de proteína total. ND: No detectado. NT: No ensayado PEPC: Promotor del gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa de maíz. 35S: Promotor del transcripto 35S del Cauliflower mosaic virus. Polen: promotor específico de polen obtenido de maíz Tomado de: http://www.extension.umn.edu/distribution/cropsystems/DC7055.html#ch4

Los genes optimizados se utilizaron para transformar plantas de maíz. Se obtuvieron los eventos registrados comercialmente como 171 (promotor 35S) y 176 (promotor PEPC y promotor específico de polen).

Longitud del túnel en cm

Indice del daño

Ensayos de campo con maíz resistente a lepidópteros. Tasa de daño promedio ocasionado por Ostrinia nubilalis

Adaptado de: Koziel et al., BioTechnology, 1993.

El rango de daño foliar se establece según una escala arbitraria de los síntomas observados (1-7). En el caso de los tallos, se mide el daño como largo (cm) del túnel producido por la larva. Las plantas fueron infestadas con 300 larvas/planta/semana durante 8 semanas

Ensayos de campo en U.S.A. con maíz Bt infestado con Ostrinia nubilalis Ostrinia nubilalis

Maíz Bt

Maíz no transgénico

Bioensayos con Helicoverpa zea en algodón Bt Izquierda: capullo de una planta de algodón control Derecha: capullo de una planta de algodón que expresa el gen Btk (B.t. kurstaki)

Tomado de: Dempsey et al., Trends in Microbiology,1998.

Transformación de plantas ornamentales con genes el gen cry1C

Plantas de crisantemo transformadas con un gen sintético cry1C. Los ensayos de infestación se realizaron con Helicoverpa armígena

Tomado de: de Maagd et al., Trends in Plant Sci., 1999.

Transgénica

Control

Liberaciones comerciales de cultivos transformados con genes cry

Papa Variedad New LeafTM (Monsanto, USA, 1995) Expresa el gen de la -endotoxina Cry3A para protección contra Leptinotarsa decemlineata. Fue liberada en Canadá, Japón, Georgia, México y USA.

Algodón Variedad BollgardTM (Monsanto, USA, 1996)

Expresa -endotoxina Cry1Ac para protección contra Heliothis virescens, Heliocoverpa zea y Pectinophora gossypiella Liberado en Australia, China, México, Sudáfrica y USA.

Maíz Variedades YieldGardTM, KnockoutTM, (Novartis, Suiza, 1996) Variedad YieldGardTM (Monsanto, USA, 1996) Variedad NatureGardTM (Micogen, USA, 1996) Variedad Bt-XtraTM (Dekalb, USA, 1996) Las variedades expresan -endotoxina Cry1Ab para protección contra Ostrinia nubilata. Fueron liberadas en Argentina, Canadá, Japón, USA y algunos países de la Unión Europea

Algunos cultivos transformados con genes de -endotoxinas de Bacillus thuringiensis Proteínas Bt

Insectos diana

Especies transformadas

Cry1Aa

Lepidóptera

Alamo, arándano, nabo

Cry1Ab

Lepidóptera

Alamo, abeto blanco, algodón, arroz, maíz, manzano, papa, tabaco, tomate, trébol blanco

Cry1Ac

Lepidóptera

Algodonero, arroz, colza, brocoli, maní, manzano, repollo, soja, tabaco, tomate, vid, nogal

Cry1Ba

Lepidóptera

Trébol blanco

Cry1Ca

Lepidóptera

Alfalfa, Arabidopis, tabaco

Cry1H

Lepidóptera

Maíz

Cry2Aa

Lepidóptera

Algodonero

Cry3A

Coleóptera

Berenjena, papa, tabaco

Cry6A

Coleóptera

Alfalfa

Cry9C

Lepidóptera

Maíz Fuente: Schuler et al., Trends in Biotechnology 16:168-175, 1998.

Impacto sobre insectos benéficos: la mariposa Monarca

Mariposa Monarca

Oruga alimentándose de algodoncillo tratado con polen de maíz Bt (evento 176)

Millones de Ha

Tomado de: http://www.isaaa.org/kc/Bin/gstats/index.htm

Evolución del área sembrada con cultivos Bt (1996-2010)

Datos a nivel mundial (millones de ha)

Tomado de: Clive James, ISAAA Brief #42, 2010.

Diferencia de insecticida aplicado (millones de kg)

Reducción en la aplicación de insecticidas en el cultivo de maíz en USA

-1 -2 -3 -4

Técnicas de manejo agronómico para impedir el desarrollo de resistencia en los insectos blanco

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

El manejo agronómico apropiado permite retrasar la aparición de resistencia en los insectos

• Resistencia de los insectos a los bioinsecticidas - Los genes de resistencia están presentes en el pool genético de las poblaciones afectadas; se ha reportado aparición localizada de resistencia al uso de Bt como insecticida convencional. - El mecanismo de resistencia actúa a través de la pérdida o modificación de los receptores Bt en la membrana intestinal; generalmente se expresa en forma de mutaciones recesivas o semidominantes.

• Estrategias para el manejo de resistencia a Bt - Uso de combinaciones múltiples de genes cry - Combinaciones de genes cry con otros genes insecticidas - Uso de promotores inducibles o tejido-específicos - Uso de refugios espaciales o temporales - Combinación altos nivel de expresión de proteínas Cry con refugios espaciales

La expresión combinada de toxinas Cry provee una resistencia incrementada

Apilamiento de genes cry1Ac y cry2Ab en plantas transgénicas de algodón

Tomado de: Perlak et al., The Plant Journal, 2001.

Modelo propuesto para la unión de toxinas Cry a sitios de unión del intestino de Plutella xylostella A

Insectos susceptibles

B

Insectos resistentes (cepa PHI, Filipinas)

C Insectos resistentes (Hawai y Pensilvania)

Tomado de: Ballester et al., Appl. Environ. Microbiol, 1999.

El manejo agronómico apropiado permite retrasar la aparición de resistencia en los insectos

Evolución de la resistencia a los insecticidas

Posibles mecanismos de resistencia a toxinas Cry: - Solubilización intestinal disminuida - Activación proteolítica de la toxina disminuida - Digestión proteolítica del fragmento activo aumentada - Afinidad del sitio activo por la toxina disminuida

Estrategia combinada de alto nivel de producción de proteína Cry con refugios espaciales Refugio

ss

Cultivo Bt

Cultivo no Bt

El alto nivel de expresión del cultivo Bt permite controlar a los insectos susceptibles SS y a los heterocigotas Ss. La aparición de fenotipos ss se “diluye” por cruzamiento con individuos SS en los refugios espaciales sembrados con semilla no transgénica

Ss

SS

El manejo agronómico apropiado permite retrasar la aparición de resistencia en los insectos

Simulación de una estrategia de manejo de resistencia basada en refugios espaciales

Tomado de: Gould Nature Biotechnology, 2000.

La frecuencia de aparición de resistencia a la toxina Cry es más alta en ausencia del refugio. El modelo teórico asume que la toxina es expresada a un nivel capaz de eliminar el 99,9% de los insectos homocigotas o heterocigotas susceptibles.

Casos reportados de resistencia

Tomado de: Tabashnik et al., Nat. Biotechnol., 2013.

Otras proteínas con actividad insecticida: inhibidores de proteasas

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Genes de inhibidores de proteasas de origen vegetal introducidos en especies heterólogas Inhibidores de proteasas C-II (inhibidor de serin-proteasas de soja) CMe (inhibidor de tripsina de cebada)

Insectos diana Coleóptera, Lepidóptera Lepidóptera

CMTI (inhibidor de tripsina de calabaza) CpTI (inhibidor de tripsina de caupi)

Especies transformadas Alamo, colza, papa, tabaco Tabaco Tabaco

Coleóptera, Lepidóptera

14K CI (inhibidor bifuncional de serinproteasas y -amilasas de cereales)

Arroz, batata, colza, frutilla, girasol, lechuga, manzano, papa, tabaco, tomate Tabaco

MTI-2 (inhibidor de serin-proteasas de mostaza)

Lepidóptera

Arabidopsis, tabaco

OC-1 (inhibidor de cisteín-proteasas de arroz)

Coleóptera, Homóptera

Alamo, colza, tabaco

PI-IV (inhibidor de serin-proteasas de soja)

Lepidóptera

Papa, tabaco

Pot PI-I (inhibidor de proteasas I de papa)

Lepidóptera, Ortóptera

Petunia, tabaco

Pot-PI-II (inhibidor de proteasas II de papa)

Lepidóptera, Ortóptera

Abedul, arroz, lechuga, tabaco

Inhibidor de proteasa I (no especificado)

Lepidóptera

Colza

Kti3, SKTI (inhibidor de tripsina de Kunitz de soja)

Lepidóptera

Papa, tabaco

Inhibidor de proteasas I de tomate

Lepidóptera

Alfalfa, tabaco, tomate

Inhibidor de proteasas II de tomate

Lepidóptera

Tabaco, tomate Adaptado de: Schuler et al., Trends in Biotechnol., 1998.

Plantas de arroz que expresan el inhibidor de tripsina de caupi desafiadas con Chilo supressalis y Sesamia inferens Espigas blancas producidas por el barrenador del arroz. Se observan espigas blancas y erectas ya que el tejido ha muerto y no contiene granos. Chilo supressalis

Sesamia inferens

Construcciones utilizadas

Ensayos con plantas de arroz que expresan el inhibidor de tripsina de caupi con Chilo supressalis y Sesamia inferens

Niveles de expresión del inhibidor de tripsina de caupi (CpTI)

Resultados de ensayos de campo Línea Número de plantas Número de plantas Plantas con espigas transgénica R1 R2 analizadas con espigas blancas blancas (%) 1 2 3 4 5 Total Promedio Control N.T.

26 34 29 15 24 128 42

15 27 6 6 17 71 42

58 79 21 40 71 55 100

Tomado de: Duan et. al. Nature Biotechnology, 1996.

Otros genes de resistencia a insectos de origen vegetal transferidos a cultivos Productos génicos

Insectos blanco

Especies transformadas

Inhibidores de -amilasa Inhibidor de -amilasa de frijol (AIPv)

Coleóptera

Arveja, haba Azuki, tabaco

Inhibidor de -amilasa de cereales (WMAI-1)

Lepidóptera

Tabaco

Inhinidor bifuncional de -amilasa y de serin-proteasas (14K-CI)

Tabaco

Lectinas Lectina de campanilla blanca (GNA)

Homóptera, Lepidóptera

Arroz, batata, caña de azúcar, colza, girasol, papa, tabaco, tomate, vid

Lectina de arveja (p-lec)

Homóptera, Lepidóptera

Papa, tabaco

Aglutinina de germen de trigo (WGA)

Coleóptera, Lepidóptera

Maíz

Jacalina (Artocarpus heterophyllus)

Coleóptera, Lepidóptera

Maíz

Lectina de arroz

Coleóptera, Lepidóptera

Maíz

Quitinasa de haba (BCH)

Homóptera, Lepidóptera

Papa

Peroxidasa aniónica de tabaco

Coleóptera, Homóptera, Lepidóptera

Ocozol, tabaco, tomate

(Galanthus nivalis)

Otros

Quitinasa de tomate Triptofano decarboxilasa de Catharantus roseus (TDC)

Colza Homóptera

Tabaco Adaptado de: Schuler et al., Trends in Biotechnol., 1998.

Inhibidores de -amilasa

Resistencia mediada por expresión de un inhibidor de -amilasa de Phaseolus vulgaris

Semillas de arveja que expresan el inhibidor de -amilasa de Phaseolus vulgaris (izquierda) y semillas control no transgénicas (derecha) infestadas con Callosobruchus maculatus. Las cavidades en las semillas muestran el sitio por el que los brúchidos adultos emergen de las mismas. El transgen fue puesto bajo la dirección del promotor de fitohemaglutinina de Phaseolus.

Expresión de la secuencia codificante de la lectina ASAL de Allium sativum en plantas de tabaco

• Los áfidos (Homóptera) son insectos chupadores que causan . pérdidas económicas importantes en muchos cultivos, ya sea . por su propia actividad o como vectores de enfermedades . virales. • La lectina de hojas de Allium sativum (ASAL) es una proteína . homodimérica de 25 Kda que se une a residuos de manosa. Se . demostró que posee actividad tóxica para varios áfidos

• Se expreso la secuencia codificante de ASAL en plantas de . tabaco bajo un promotor constitutivo mediante una . construcción que también permite la expresión de los genes . uidA (GUS) y hpt (resistencia a higromicina) • Los áfidos alimentados en estas plantas se vieron afectados . en supervivencia y fecundidad. Se observó que la lectina se . une a tres glicoproteínas localizadas en las membranas de las . células del tracto digestivo. Tomado de: Dutta et al., Plant Biotechnology Journal, 2005.

Esquema de la construcción genética utilizada

Efectos de la lectina ASAL de Allium sativum sobre la supervivencia de ninfas de Myzus persicae

Supervivencia de ninfas en plantas de tabaco que producen la lectina ASAL (AS11) y plantas controles (con). Se inocularon 30 ninfas por plantas. Cada ensayo comprende 5 plantas de cada tipo

Supervivencia de ninfas en dos plantas de la progenie de AS11, T1(2) y T1(3) y en plantas controles. Se inocularon 30 ninfas por plantas. Cada ensayo comprende 5 plantas de cada tipo

Tomado de: Dutta et al., Plant Biotechnology Journal, 2005.

Plantas de papa que expresan el gen de concanavalina A Desafío con Lacanobia oleareacea (Lepidóptera)

Desafío con Myzus persicae (Homóptera)

Tomado de: Gatehouse et al. Molecular Breeding, 1999.

Efecto la ingesta de plantas transgénicas de papa Efecto de de la ingesta de plantas transgénicas de papa (ConA) sobre el el desarrollo de Lacanobia Lacanobiaolearacea. olearaceae. sobre desarrollode delarvas larvasde

EfectoEfecto de la de ingesta de plantas transgénicas de papa la ingesta de plantas transgénicas sobresobre la fecundidad del áfido Myzus persicae de papa la fecundidad del áfido Myzus persicae.

Promotores usados con genes de resistencia a insectos Origen del promotor

Sitio de expresión

Proteína insecticida

Planta

Manopina sintasa bacteriana TR (mas)

Mayoría de los tejidos

Cry1Ab

Tabaco, papa

Semilla

-AI-Pv

Arveja, haba Azuki, tabaco

Mayoría de los tejidos

Casi todas las proteínas indicadas en tablas anteriores

Casi todas las plantas indicadas en tablas anteriores

Floema

GNA

Tabaco

Preferentemente raíz

Cry1Ab

Maíz

Fosfoenolpiruvato-carboxilasa de maíz (PEPC)

Tejidos verdes

Cry1Ab

Arroz, maíz

Promotor específico de polen de maíz

Polen

Cry1Ab

Maíz

Preferentemente médula

Cry1Ab

Maíz

Todos los órganos

Cry1Ac

Arroz

Inducible por heridas

Pot PI-II, ipt

Arroz, tabaco, tomate

Cloroplastos

Cry1Ac

Tabaco

Inducible químicamente

Cry1Ac

Tabaco

Fitohemoaglutinina de haba (PHA-L ) 35S de CaMV (CaMV 35S) y derivados Sacarosa sintasa de arroz (RSs1) Metalotioneína de maíz

Subunidad a triptofano sintasa de maíz (trp A) Ubiquitina 1 de maíz (Ubi-1) Inhibidor de proteasas II de papa (Pot PT-IIK) Operón RNA ribosomal (Prm)

Proteína relacionada a patogénesis 1A de tabaco (PR-1A)

Adaptado de: Schuler et al., Trends in Biotechnology, 1998.

Silenciamiento génico

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Tomado de: Price &Gatehouse. Trends in Biotechnology, 2008.

Silenciamiento postranscripcional mediado por dsRNA en animales inferiores

Esquema de las vías de RNAi

Tomado de: Zotti y Smagghe, Neotrop. Entomol., 20152015

Definiciones sobre RNAi en insectos

Tomado de: Huvenne y Smagghe, J. Insect Physiol, 2011, 2010

Factors influencing the efficiency of RNAi

 Concentration of dsRNA  Nucleotide sequence  Length of the dsRNA fragment

 Persistence of the silencing effect  Life stage of the target organism

Control de coleópteros mediante RNAi

Tomado de: Baum et al, Nat. Biotechnol., 2007

Control de lepidópteros mediante RNAi

Tomado de: Mao et al, Nat. Biotechnol., 2007

RNAi ventajas y desventajas

Tomado de: Zotti y Smagghe, Neotrop. Entomol., 20152015

Control Microbiano

Agrobiotecnología Biocontrol de insectos

Familia Baculoviridae 

Ácido nucleico: DNA de doble cadena, circular, 89 a 180 kpb



Morfología: Viriones envueltos conteniendo 1 ó más nucleocápsides . Viriones ocluidos en una matriz proteica.

 Parásitos de invertebrados

ODV ODV: viriones derivados de cuerpos de oclusión OB

BV: viriones brotados

Ciclo de infección de baculovirus

Tomado de: Ferrelli et al, 2012. En: Viral genomes, InTech Open Access Publisher [http://www.intechweb.org]

Sintomatología

Anagrapha falcifera MNPV

Heliothis NPV

Anticarsia gemmatalis MNPV- Experiencia en Brasil PRODUCCIÓN IN VIVO EN CAMPO LARVAS MUERTAS POR AgMNPV

AGREGADO DE AGUA

MACERADO Y FILTRADO

MEZCLA EN TANQUE DE PULVERIZADORA

PRODUCCIÓN CONTROLADA - FORMULACIÓN Transferencia tecnológica de la EMBRAPA Productos comerciales Baculovirus Nitral, Coopervirus, Baculo Soja, Protege

APLICACIÓN EN MÁS DE 2.000.000 ha/año ÉXITO DEL USO DE AgMNPV EN BRASIL 

Plaga principal de soja



Apoyo oficial. Servicio de Extensión



Eficiente transmisión horizontal



El cultivo soporta defoliación sin daño económico

Soja tratada con AgMNPV

Soja sin tratar Fuente: Dr. F. Moscardi, EMBRAPA

Cydia pomonella GV En Argentina: primer baculovirus registrado (uso comercial)

Hongos entomopatógenos Beauveria bassiana

Metarhizium anisopliae

Ciclo de vida de B. bassiana 10. Diseminación 4. Multiplicación 3. Penetración

5. Liberación de toxinas

1. Adhesión 2. Germinación

6. Muerte del insecto

9. Esporulación

8. Salida al exterior

7. Colonización total Momificación del cadáver Fase levaduriforme

1d

2d

Fase micelial

5d

Penetración de la cutícula del insecto

No infectado

Infectado

Utilización de hongos entomopatógenos

Características distintivas con respecto a otros entomopatógenos: - Amplio espectro potencial de aplicación - Infección del hospedante a través del tegumento, no limitada a su ingestión - Baja probabilidad de aparición de resistencia

Factores intervinientes en el desarrollo de productos: - Selección de cepas en base a criterios de virulencia, rendimiento de producción, compatibilidad con agroquímicos, mantenimiento de viabilidad en el producto formulado - Producción masiva a bajos costos

Referencias

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Agrobiotecnología Biocontrol de insectos