U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

BIOFILM, UNA ESTRATEGIA DE LAS BACTERIAS QUE LES GARANTIZA SOBREVIVIR EN ACUICULTURA. Seminario Técnico: SANIDAD Y BIOSEGURIDAD EN LA INDUSTRIA DE LA ACUICULTURA Dr. Juan Battaglia Aljaro DMV AB&T, PERU SAC [email protected] +51 958 338 999 Neiva, Colombia

Marzo 2016.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Introducción:

Los Biofilm, corresponden a verdaderas ciudades (Slime cities) organizadas de bacterias asociadas que prosperan en presencia de humedad y nutrientes, están presentes en muchas superficies orgánicas e inorgánicas e inclusive pueden ser observados a simple vista (Coghlan 1996)

En la actualidad se han definido como agregaciones de bacterias con funciones especializadas, una verdadera organización social de bacterias que forman una biopelículas en la que las bacterias pueden incluso desarrollar nuevas capacidades. (Potera 1996).

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Fases del desarrollo del Biofilm: Acondicionamiento de la Superficie Adhesión de las bacterias “Pioneras” Formación del glicocalix o “slime”

Colonización secundaria “agregación”

Biofilm “consorcio de especies”

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Acondicionamiento de la Superficie: En un estanque o en las tuberías, redes y toda superficie de cultivo, trazas orgánicas son substancias asociadas a las superficies, incluso recién limpia una superficie, el solo contacto con agua hace que se establezca una interfase entre agua y solidos contenidos formando una capa condicionante. De no ser removida esta capa lo orgánico de adsorbe sirviendo como base de nutrientes a las bacterias.

Adhesión de las bacterias “Pioneras”: En la dinámica de un estanque, algunos individuos planctónicos de vida libre (bacterias, hongos)se aproximan a las paredes y se contactan con la capa anteriormente formada, cuando la velocidad del flujo se acerca a 0 algunas bacterias se adhieren por un tiempo finito y luego se sueltan (adsorción reversible) este proceso se relaciona con atracción electroestática y fuerzas físicas, en esta fase algunas bacterias desarrollan estructuras que les permiten quedar adheridas permanentemente a la superficie (Adsorción irreversible).

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Formación del glicocalix: Bacterias secretan EPS polímeros de adhesión (sustancias extracelulares poliméricas) que sirven de verdadero cemento manteniendo al biofilm fuertemente pegado a la superficie, además esos polímeros dan sustrato y protegen las bacterias de la acción de biocidas.

Colonización secundaria: La red de glicocalix atrapa nutrientes y da sostén a las nuevas células bacterianas que van apareciendo, agregando nuevas bacterias “renovación” y aumentan la resistencia física al flujo incrementando la atracción electrostática a mas bacterias. Estas segunda colonización, utiliza y metaboliza los desechos de la primera pudiendo aparecer nuevas especias bacterianas o de hongos asociadas.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Biofilm “consorcio de especies”: Establecido el Biofilm, este resulta ser como un tejido vivo, se habla de complejo o de comunidad metabólica cooperativa de varias especies viviendo en un micronicho delimitado claramente, entre ella incluso se protegen y desarrollan estrategias de protección contra antibióticos utilizando desechos como sustrato para las otras, inclusive enzimas de unas, sirven para que otras utilicen recursos que por si solo no podrían. Agua, desechos bacterianos, nutrientes, enzimas, metabolitos, oxígeno viajan entre y a través, generando gradientes químicas y iónicas que ayudan a fortalecer la asociación.

Biofilm , crecimiento y diseminación: La Biopelícula o Biofilm, crece y se expande liberando periódicamente nuevas células pioneras capaces de colonizar nuevas superficies inclusive pueden estos avanzar contra la corriente, el Biofilm crece y se establece dependiendo de condiciones en el plazo de unas pocas horas hasta semanas, en los estudios generalmente es Pseudomonas sp. la bacteria utilizada como modelo, la que se adhiere hasta en el acero inoxidable, inclusive micro pulido a los 30 segundos de exposición.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Biofilm , crecimiento y diseminación:

Biofilm Formation by the Fish Pathogen Flavobacterium columnare: Development and Parameters Affecting Surface Attachment Wenlong Cai,a Leonardo De La Fuente,b Covadonga R. Ariasa Aquatic Microbiology Laboratory, Department of Fisheries and Allied Aquaculture, Auburn University, Auburn, Alabama, USAa; September 2013 Volume 79 Number 18 Applied and Environmental Microbiology p. 5633–5642

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Biofilm , crecimiento y diseminación:

Biofilm, beneficio para las bacterias: Alimento y protección.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Biofilm , crecimiento y diseminación:

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Factores que influyen en el desarrollo del biofilm: • Las propiedades de las superficies de contacto • El tiempo de contacto • Las características de la superficie bacteriana • La disponibilidad de nutrientes • La composición de la comunidad microbiana • La disponibilidad de agua

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Factores que influyen en el desarrollo del biofilm:

Perfiles de Rugosidad en distintos acabados de acero inox. Metzler 1993.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Acero inox, vidrio, plástico en todo se adhieren las bacterias.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

1. Propiedades de las superficies de contacto El tipo de sustrato influye en las características de la unión. Las bacterias tienden a unirse a las superficies hidrófilas uniformemente en una capa, mientras que en el caso de las superficies hidrófobas tienden a unirse en grupos (Fuster y Valls, 2006).

2. Tiempo de contacto Un mayor tiempo en contacto (exposición) entre las células y el sustrato permite que se establezca un mayor número de uniones haciendo la adhesión irreversible, y por tanto, factores, como las condiciones ambientales, tipo de microorganismo, sustrato y presión en el caso de superficies de trabajo o utensilios, pueden también influir de manera importante en la mayor posibilidad de formación de biofilm (Pérez-Rodríguez et al., 2008).

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

3. Características de la superficie celular Las características de la superficie celular como los flagelos, pili, proteínas de adhesión y cápsulas ejercen también su influencia. Los pili actúan como un velcro para anclar las bacterias a algunas superficies y también actúan como quimiorreceptores, dirigiendo a la bacteria hacia a algunos sitios específicos. La pérdida de estos apéndices cambia las propiedades de superficie de la bacteria, lo que puede provocar una menor capacidad de adhesión. También se conoce que los esporas se adhieren mejor a la superficie que las células vegetativas debido al grado de hidrofobicidad de su superficie. (González, 2005). 4. Disponibilidad de nutrientes

La disponibilidad de nutrientes ejerce una influencia mayor sobre la estructura y composición de biofilm. Estudios realizados sobre biofilms de Listeria spp. han puesto de manifiesto que niveles bajos de fosfatos estimulan el desarrollo de biofilms, aunque el efecto se reducía después de varios días (Chmielewsky y Frank, 2003). Asimismo su desarrollo depende también del tipo de azúcar utilizado, siendo la trehalosa y manosa las que proporcionan un nivel más pobre de formación de biofilm.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

5. Composición y diversidad microbiana Los biofilms multiespecies son más gruesos y estables frente al estrés ambiental que los monoespecies. En una superficie, el grosor medio de los biofilms de Klebsiella pneumoniae y P. aeruginosa monoespecie son de 15 y 30 μm respectivamente, mientras que un biofilm formado por ambas especies bacterianas presenta un grosor de 40 μm (Kumar y Anand, 1998). Esto se atribuye a la secreción combinada de las distintas sustancias poliméricas extracelulares resultantes de los diferentes microorganismos (Chmielewsky y Frank, 2003).

6. Disponibilidad de agua La disponibilidad de agua es un factor crucial para la viabilidad del biofilm. Una humedad relativa en torno al 90-100% posibilita el desarrollo del biofilm, por ello la mayoría de los biofilms se encuentran en ambientes acuosos como pueden ser los sistemas de conducción o tuberías de las industrias lácteas (Pérez Rodríguez et al., 2008). Sin embargo, también se ha encontrado que valores en torno al 70-80% pueden ser suficientes para permitir el desarrollo del biofilm (Keskinen et al., 2008) indicando que ambientes con humedad relativa alta (por ejemplo: aerosoles) pueden incrementar significativamente el riesgo de su aparición. La temperatura es un factor también determinante y a la vez, relacionado con la humedad relativa, ya que se ha observado que valores en el rango 20-30 ºC incrementan la probabilidad de formación del biofilm, mientras que valores por encima de este rango inciden negativamente sobre ese proceso (Else et al., 2003).

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Control: 1. Retirada de residuos y limpieza en seco

2. Pre-lavado 3. Lavado (aplicación del agente detergente) 4. Enjuague y posterior eliminación del exceso de agua 5. Desinfección (aplicación del biocida o de agua a más de 80 ºC) y enjuague posterior si es recomendado por el fabricante 6. Secado higiénico 7. Verificación de la eficacia y monitorización del sistema

BYEFOULING (EC)

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Biocidas oxidantes: Cloro. No solo elimina las bacterias de biofilms, también destruye el polímero extracelular. Son necesarias concentraciones más elevadas de cloro para eliminar los biofilms que las bacterias libres. Altas concentraciones de cloro durante cortos periodos de tiempo son más efectivas que bajas concentraciones durante un tiempo elevado. Hay, sin embargo, una limitación al uso del cloro y la concentración empleada teniendo en cuenta que el cloro corroe el acero inoxidable.

Dióxido de cloro. Tiene una actividad similar al cloro. Presenta la dificultad de su inestabilidad, lo que le exige ser preparado in situ. Es también corrosivo de metales.

Ozono. Es aproximadamente dos veces más efectivo que el cloro a la misma concentración. Presenta el problema de su inestabilidad, debiéndose generar in situ, y el de su baja solubilidad en agua. Debe emplearse en materiales que sean resistentes al ozono.

Peróxido de hidrógeno. Es utilizado como biocida contra bacterias por su rápida degradación a agua y oxígeno.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Biocidas no oxidantes: Compuestos de amonio cuaternario. Son efectivos surfactantes que ayudan a remover los biofilms de la superficie. Presenta el inconveniente de que su eliminación requiere un exhaustivo aclarado.

Formaldehido. Se ha utilizado principalmente en la industria farmacéutica. Su efectividad contra los biofims es todavía cuestionada. No es corrosivo para el acero inoxidable. El hipoclorito sódico y los desinfectantes aniónicos han demostrado ser más efectivos que los compuestos de amonio cuaternario para la eliminación de las sustancias poliméricas extracelulares excretadas por Listeria y Salmonella en acero inoxidable. Existen métodos biológicos que han demostrado también un cierto éxito en la prevención y eliminación de biofilms, así la Nisina, un péptido antimicrobiano se ha utilizado, incluso se reprotan ensayos con bacterias para controlar a otras (Pseudomonas fluorescens FF48 v/s Flavobacterium psychrophilum.) Inhibition of Flavobacterium psychrophilum biofilm formation using a biofilm of the antagonist Pseudomonas fluorescens FF48 Mery De la Fuente1, José M Vidal1, Claudio D Miranda23, Gerardo González4 and Homero Urrutia1*

.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Otros mecanismos de desinfección:  Radiación UV. Se aprovecha la capacidad bactericida de las radiaciones ultravioletas C (ʎ254 nm) para realizar la desinfección de materiales. Sólo desinfecta las partes del objeto en los que inciden los rayos de forma perpendicular.  Desinfección solar fotocatalítica. El método SODIS (Desinfección Solar del Agua) usa la energía solar para destruir los microorganismos patógenos que causan enfermedades transmitidas por el agua. Los microorganismos patógenos son vulnerables a dos efectos de la luz solar: la radiación en el espectro de luz UVA (longitud de onda 320-400 nm) y el calor (incremento en la temperatura del agua). Se produce una sinergia entre estos dos efectos, ya que el efecto combinado de ambos es mucho mayor que la suma de cada uno de ellos independientemente.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

• Filtración. Este procedimiento es aplicable a la esterilización de líquidos mediante su paso a través de membranas porosas con diámetro de poro de 0,35 micras. (limitado para virus y micoplasmas). • Campos electromagnéticos. Método novedoso que se encuentra actualmente en desarrollo que permite la desinfección del agua mediante la exposición a campos electromagnéticos con frecuencias de entre 10 KHz y 8 GHz.

El diseño higiénico de las instalaciones y del equipo es la mejor medida preventiva, siendo además imprescindible el mantenimiento de las condiciones y de la correcta manipulación en todos los procesos.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Recomendaciones:

• Limpieza profunda • Uso de detergentes (Alcalino/básico)

• Uso de Hidrolavadora con temperatura • Aplicación de biocidas • Tiempos de acción de producto

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Recomendaciones

Detergentes Ácidos y Alcalinos

Desinfectantes

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Recomendaciones:

• Para combatir el biofilm y debido principalmente a su composición, en las plantas de proceso se recomienda el uso de un detergente alcalino e inmediatamente posterior al enjuague de este el uso de un detergente ácido, con la finalidad de limpiar/destruir diferentes componentes del biofilm (detergente/desinfectante). • Utilización de combinaciones y alternancia de desinfectantes(A.Cuaternarios y Glutaraldehidos), (dióxido de cloro y ácido peracético).

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

Prácticas habituales: • Desarmar todo lo que se pueda de las cañerías y aplicar los detergentes con hidrolavadora o robots que puedan ingresar dentro de las cañerías para este proceso junto con cámara para ver su efectividad y zonas que requieran mayor fuerza para la remoción del biofilm. • Utilización de soda para limpiar las cañerías por dentro (corrosión).

pero rompe todo

• Se utilizan otros detergentes, desinfectantes y algunos detergentes con desinfectantes incluido, lo cual no es recomendable por que la mezcla en si no es específica para limpiar ni para desinfectar.

• Algunas empresas también realizan inundación de las cañería en la piscicultura y dejan actuar al detergente biocida por 12 a 24 hrs , luego enjuagan y re inundan con desinfectante.

U.S. SOY FOR A GROWING WORLD

GRACIAS!