BIOQUIMICA DE PROTEINAS 2012-UNSAM

PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS

Julio Caramelo Laboratorio de Biología Estructural y Celular Fundación Instituto Leloir [email protected]

BIBLIOGRAFIA: 1) Fersht, A. Structure and mechanism in protein science (1999) Freeman Press. Capitulos 1, 11, 17 y 18 2) Advances in Protein Chemistry (1995) Vol. 46. Capitulo 3 (Free energy balance in protein folding) 3) Branden y Tooze. Introduction to Protein Structure (1999) Garland Publishing, Inc. 4) Whitford, D. Proteins. Structure and function (2005) Editorial John Wiley & Sons 5) Berg, Tymoczko y Stryer. Biochemistry (2006) Editorial Freeman and Company

ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS Biología Estructural: ciencia que estudia la estructura y función de las biomoléculas.

Biología

Biología Estructural

Física

Química

UNION PEPTÍDICA

H + 3HN

R1 COO-

H + 3HN

H

R2 COO-

3

HN+

R1 C O

H N

H R2 COO-

+ H2O

• Reacción endotérmica: ∆H > 0 • Las proteínas son químicamente metaestables respecto de la hidrólisis TYR

THR

N-terminal

C-terminal ALA LYS

1.33 Å (unión simple C-N: 1.45 Å) Las longitudes de enlace no son las esperadas:

R1

H H3

N+

H

H

N

C O

R2 COO-

1.23 Å (más largo que un carbonilo típico) R1

H

La unión peptídica es plana:

C

H3N+

H C

N

O

H C

Estos 6 átomos está en un plano R2

COOH

La unión peptídica tiene carácter de doble enlace: H3N+

R1 C O

H N

H H R2 COO-

H3

N+

R1 C

δ- O

H N

H

δ+

R2 COO-

¾ En la cadena solo dos enlaces pueden rotar: R1

H

H3

N+

C

H C O

H

R2

N

C

phi psi

H C

N

ϕ ψO Cα-CO

Cα-N

R3

H C

COO-

Cαi

C

¿Qué es un ángulo diédrico?

N

Cαi+1 La unión peptídica presenta solo dos posibles ángulos diédricos: Trans: ω= 180 ° H + 3HN

R1 C O

H N

Cαi C N

H R2 COO-

Cαi+1

Cis: ω= 0 ° H + 3HN

R1

H

C

N

O

H

R2 COO-

Cαi+1

Cαi C N

Por lo general la unión peptídica presenta configuración trans. Repulsión de las cadenas laterales (en dipéptidos la forma trans es 1000 veces más abundante que la cis)

El trazado de la cadena se puede hacer sabiendo tres ángulos diédricos para cada aminoácido H H C

N

O

ψ O

ϕ

H

3

HN+

ω

N

C

H N

O

R2 C

R1

H

O

ϕ

H R2

C

N

H H

COO- R3 H H + 3HN

R1 C O

H

H

N

ψ O

3

N

C

H

O

H H

COO- R3

H

N

O R2

C

HN+

R1

R2 C

ω

N

H H

COO- R3

Podemos graficar los pares de ángulos ψ,ϕ de las proteínas que están cristalizadas

Gráfico de Ramachandran

Hoja β

ϕ : entre - 80° y - 120° Ψ: entre 120° y 170°

α-helices ϕ: entre -40° y ~ -100° Ψ: entre -40° y -65°

Zona desfavorable

¾ La glicina posee una gran libertad conformacional:

Cisteína puede formar puentes disulfuro: CISTINA

CISTEINA

+

+ H2O

+ ½ O2 +

2

-

-

+

-OOC

H

2 3

HN+

+NH

3

SH

COO-

H + 3HN

S

S

H

+ 2 H+ + 2 e-

COO-

(OJO, esto es una reacción redox, NO una ácido/base)

¿Cómo se pliega una proteína que puede formar varios puentes disulfuro? Supongamos que tenemos una proteína con 3 cisteínas: SH 1

S-S (1-2)

SH 2

S

3

S

SH

SH

SH SH

S-S (2-3)

NATIVA

E0S-S(2-3) < E0S-S(2-3), E0S-S(2-3)

S S

S S S-S (1-3)

…Y A MEDIDA QUE AUMENTA EL NUMERO DE CYS LA PROBABILIDAD DE FORMAR LA COMBINACION ADECUADA DE PUENTES S-S ES MENOR.

• Prácticamente todas las uniones peptídicas son trans. • Repulsión estérica de las cadenas laterales.

Prolina: excepción LYS41-PRO42

Ribonucleasa: tiene 4 Prolinas

trans

ASN113-PRO114

cis

TYR92-PRO93

cis

VAL116-PRO117

trans

¿Porqué la prolina presenta más uniones cis que los demás aminoácidos? aa ≠ PRO

PRO

E

Ea ~ 80-100 kJ/mol t1/2 ~ 10-100 seg ¡ LENTO !

E cis

cis trans

trans

En la unión X-Pro la diferencia energética entre cis y trans es menor

~ 7% uniones X-PRO 43 % de las proteínas al menos tienen una cis PRO

Cα

Cα C

N Cα+1

O trans

Cα+1 C

N

O cis

¿Tiene alguna consecuencia? SI. Retarda mucho la velocidad de plegamiento. In vitro una proteína con una unión cis-PRO por presenta al menos dos fases cinéticas de pegamiento

Estructura terciaria Son las biomoléculas que presentan mayor variación estructural

colicina

barnasa fosfatasa

anticuerpo

colágeno

calnexina

hemaglutinina

porina

Virus del dengue

Rojo: hidrofílico Amarillo: hidrofóbico Naranja: P, G, H





¿Tienen algo en común todas estas estructuras?

Estructura terciaria: disposición espacial de los residuos

(si uno conoce la estructura terciaria con una resolución menor a 4-5 Å también sabe la secundaria) ¾ AL PLEGARSE UNA PROTEINA LOS RESIDUOS OCULTAN UNA PROPORCIÓN DIFERENTE DE SU SUPERFICIE: hidrofílicos

Área del residuo aislado

hidrofóbicos

Área oculta al plegarse la proteína

Plegamiento N

Proteína nativa

Conjunto discreto de confórmeros muy parecidos entre sí.

U

Proteína desnaturalizada Colección heterogénea de conformaciones con grado variable de compactación. Rápida velocidad de interconversión

¾ ¿Qué determina la estructura terciaria de una proteína? ¾ ¿Existe un “código de plegamiento”?

C26-C84

C58-C110

C64-C72

Christian Anfinsen Premio Nobel de Química 1972

C40-C95

Ribonucleasa A (pdb: 1AFK)

Experimento de Anfinsen: HO S

C H2

H2 Betamercaptoetanol C SH SH SH

S HO

C H2

H2 C

HS 26

72 65

95

110

Actividad enzimática

S

HS Urea 8 M 58 Betamercaptoetanol

C H2

OH

SH

HS

84 40

S

H2 C

HS

HS

Diálisis O2 40

SH

26

72 65

84 95

110

SH

NO hay actividad enzimática

58

Actividad enzimática

Conclusiones de Anfinsen: ¾ La información necesaria para especificar la estructura está en la secuencia (las chaperonas complicaron un poco, pero se sigue manteniendo) ¾ “Hipótesis termodinámica”: el estado nativo es la conformación de mínima energía libre (hay que considerar todo: solvente, ligandos, etc…)

G

Confórmero

Confomación nativa

¾ En principio se podría calcular cual es la conformación de mínima energía. Hay dos problemas: • No conocemos la función potencial con suficiente precisión • El número de conformaciones posibles es MUY grande ¾ Las predicciones con proteínas chicas están dando cada vez mejor

Desplegamiento de una proteína

N

U

El estado nativo es estable en un rango muy reducido de condiciones (temperatura, pH, co-solventes) ¿Como desnaturalizamos una proteína? ¾ Aumento de temperatura (desnaturalización térmica) ¾ Cambios de pH NH2 O ¾ Agentes químicos: + ClH2 N

C

UREA

NH2

H2 N

C

NH2

Cloruro de guanidinio

¾ Disminución de temperatura (suena raro, pero pasa)

Le estabilidad de una proteína se mide con el ∆G de unfolding: G

G U UREA

N

N

U

Coordenada de plegamiento

Coordenada de plegamiento

GN < GU

GN > GU

∆GU = GU – GN < 0

∆GU = GU – GN > 0

GU GN [UREA]

¾ La desnaturalización es un proceso cooperativo: Ku =

[D] [N]

Fracción desnaturalizada: fu =

N

U

Fracción nativa: fn = fu + fn = 1

En [UREA]50: fu = fn = 0.5

fu

[N] = [U]

Ku =

[D] [N] + [D]

[N] [N] + [D] fu fn

=

fu 1 - fu

GU GN

Ku = 1 ∆GU = -RT ln(Ku) = 0

[UREA]50 0

[UREA]

8

[UREA]50

∆GU = 0

• Químicamente una proteína es una entidad metaestable (hidrólisis) • Se puede usar el formalismo de la termodinámica de sistemas en equilibrio

¿Qué significa que una mutación desestabiliza un proteína?

N

Silvestre

K folding

U

N*

= Kf = [N] / [U]

K* folding

Mutante

U*

= Kf* = [N*] / [U*]

K unfolding = Ku = [U] / [N]

K* unfolding = Ku* = [U*] / [N*]

∆Gu = -RTln(Ku)

∆Gu* = -RTln(Ku*)

G

G

∆Gu‡ U

N* ∆Gu

∆Gu* U*

N Coordenada de plegamiento

Coordenada de plegamiento

En el estado nativo de una proteína se forman cientos interacciones

¿Cuan estable es el plegamiento de una proteínas? Los ∆Gu típicamente caen en el rango de 20-60 kJ/mol • Esto es muy bajo !!! Del orden de 3 a 10 puentes hidrógeno • El estado nativo es marginalmente estable

¿Como puede ser?

Durante el plegamiento hay que tomar en cuenta TODAS las interacciones: • Proteína – proteína (p-p) • Proteína – solvente (p-s) • Solvente – solvente (s-s) Y debemos tener en cuenta las contribuciones entálpicas y entrópicas al ∆G

Se forman: • intracatenarias (∆Hp-p < 0) • entre moléculas de solvente (∆Hs-s < 0)

ENTALPIA: ∆H Se rompen: • proteína-solvente (∆Hp-s > 0) Valores enormes (varios miles de kJ/mol), pero similares en magnitud y de signo opuesto. Los grupos que forman puentes hidrógeno intracatenarios en el estado N se encontraban formando puentes hidrógeno con el solvente en el estado U. El balance entálpico es ligeramente favorable.

Disminución de la movilidad de la cadena (∆Sp < 0)

ENTROPIA: ∆S Liberación de moléculas de solvente (∆Ss > 0)

¿Por qué una proteína se pliega? Por el mismo motivo que se forma una micela o una bicapa lipídica

Porque está rodeada de agua Si sumergimos una proteína en solvente orgánico lo más probable es que se desnaturalice

Polar No lineal

¿Por qué los compuestos no polares son hidrofóbicos?

?

EFECTO HIDROFOBICO • La interpretación ha generado fuertes controversias. Veamos la interpretación clásica: ¾ La presencia de una superficie no polar impide que las moléculas de agua formen todos los puentes hidrógenos ¾ El solvente se orientan formando clatratos ordenados (“icebergs”) ¾ Costo entrópico muy alto ¾ Al plegarse una proteína disminuye el área hidrofóbica expuesta, se liberan moléculas de agua. El aumento de entropía del solvente compensa por la pérdida de entropía al disminuir la movilidad la cadena

Acido graso en agua

Cluster de agua fluctuantes en el seno del solvente Moléculas de agua altamente ordenadas formando una “jaula” que rodea la cadena alquílica

Formación de bicapas y micelas

Disminuye el área hidrofóbica expuesta. El número de agua forzadas a ordenarse disminuye. Aumenta la entropía

¾ Una proteína en su estado nativo es como una micela muy venida a más. ¾ Al formarse el core hidrofóbico disminuye la superficie accesible al solvente (ASA), liberándo moléculas de agua -

-

+

Folding: ∆ASA < 0 OH

- +

-

OH

+ -

OH +

-

+ OH

HO

+

+

OH HO

-

OH

-

+

¾ El cambio de ASA (∆ASA) en el plegamiento explica porqué la capacidad calorífica del estado desplegado es mayor que la del estado nativo (CpU > CpN). En unfolding: ∆Cp = (CpU – CpN) es positivo ¾ Por esto las proteínas se pueden desnaturalizar a bajas temperaturas (“cold denaturation”)

¿Cómo medimos ∆Gu? ∆GN-U = -RT ln (KN-U) = -RT ln ([U]/[N]) •

Debemos cuantificar [U] y [N]

•

Usamos algún método que los diferencie: 1) Absorbancia 2) Fluorescencia 3) Dicroismo circular

PARA PODER RACIONALIZAR EL EFECTO DE UNA MUTACION HAY QUE VER COMO CAMBIA LA ESTABILIDAD RELATIVA DE N Y D EJEMPLOS: 1) GLICINA: EN GENERAL DISMINUYE LA ESTABILIDAD ¿PORQUE? AUMENTA LA ENTROPIA DEL ESTADO D (ver Ramachandran)

2) PUENTES S-S: EN GENERAL AUMENTAN LA ESTABILIDAD ¿PORQUE? DISMINUYE LA ENTROPIA DEL ESTADO D CADA PUENTE PUEDEN CONTRIBUIR HASTA 4 kcal/mol

¾ Se puede jugar mucho más con los loops y residuos expuestos que con el “core” hidrofóbico. En el caso de mutar residuos del core, se tolera la generacion de cavidades (ej ILE -> ALA), pero muy difícilmente lo inverso (ALA -> ILE)

¿PORQUE? El grado de empaquetamiento del core es muy alto, similar a un cristal orgánico. Muy probablemente se generen choques. ¿COMO PODRIAN EVITAR ESTO?

Realizando dos cambios que se compensen

Caminos de plegamiento y paisajes de energía Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar. ¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”? Apliquemos el método inductivo: • La mayor parte de las proteínas que conocemos adoptan una conformación nativa, entonces nuestra proteína debería plegarse correctamente. ¿Vale este razonamiento? • Las proteínas que hay en la naturaleza ¿Son una muestra representativa? ¿Cuántas posibles proteínas de 100 residuos se podrían hacer ?

20100 = 1.3 x 10130 (número de protones y neutrones del universo ∼1076) ¿Cuántas proteínas hay en la naturaleza? •Supongamos 10.000 x 106 especies y que cada genoma codifica para 30.000 genes (exageración supina). Entonces tendríamos 3 x 1020 proteínas (muchas están repetidas).

Secuencias posibles= 1.3 x10130 Secuencias en la naturaleza: como mucho 3 x 1020 Por cada secuencia seleccionada por la evolución hay 4.3 x 10109 secuencias que no aparecieron Volvamos a nuestra pregunta inicial: Sintetizamos una proteína de 100 aminoácidos con una secuencia al azar. ¿Cuan probable es que adopte una estructura “nativa”? En principio no podemos decir nada. Seguro que luego de miles de millones de años de evolución nos llegó un muestreo ínfimo de todas las proteínas posibles.

¿Cuáles fueron las proteínas que nos llegaron?

¡¡¡Casualmente aquellas que se plegaron correctamente!!!

Las proteínas que SI nos llegaron, ¿siguen un camino al “azar” al plegarse? Azar: la cadena va probando todas las conformaciones hasta llegar a N

¿Cuánto tiempo demandaría este proceso? • Imaginemos que cada aminoácido puede adoptar tres conformaciones posibles (α, β y L) • Cada conformación se puede interconvertir en 1 ps (10-12 seg) • Una cadena de 100 residuos puede adoptar 3100 = 5.2 x 1047 conformaciones EXPLORAR TODAS LAS CONFORMACIONES REQUERIRIA: 10-12 seg * 5.2 1047 = 5.2 1035 seg (1.7 1028 AÑOS !) (si supemos que en cada paso de busqueda los 100 residuos cambian, tardaría 1.7 1026 años)

PERO, LA MAYOR PARTE SE PLIEGA EN 0.1 - 1000 seg !!! PARADOJA DE LEVINTHAL (1968)

Entonces ¿Es el plegamiento un proceso al azar?

NO ¿COMO PUEDE SER? • No hace una busqueda al azar de la conformación de mínima G. • Necesariamente deben existir “caminos” favorecidos que restrigen la búsqueda. • La evolución cumplió un papel fundamental. • Se seleccionaron aquellas secuencias cuya velocidad de plegamiento es compatible con la vida.

Caminos de plegamiento Imaginemos que tenemos dos proteinas con los estos espacios conformacionales:

G U

G

U

N coordenada

N coordenada

¿Cuál creen que se pliega con más eficiencia? En el primer caso el plegamiento se verá “fustrado” mucho más veces (trampas cinéticas) La evolución seleccionó aquellas secuencias que presentan espacios conformacionales “lisos”, con pocos mínimos locales.

Tres modelos de plegamiento proteico

U

I

I

I

Colapso-hidrofóbico

Difusión-condensación

1) Estructura 2ria 2) Chocan entre si para formar la 3ria Ejemplo: barnasa

N Nucleación-condensación 1) Un elemento de estructura 2ria 2) La 3ria se propaga desde allí Ejemplo: CI2

1) Aglutinación del core hidrofóbico 2) La 3ria se propaga desde allí

El embudo de plegamiento (“folding funnel”)

¾El mecanismo de plegamiento no es análogo a una reacción de moléculas chicas (pocos enlaces de alta energía). ¾ Es una búsqueda sesgada en una superficie de energía chata (muchas conformaciones con energía similar). ¾ Superficie característica de un número muy grande de interacciones de baja energía.

Análisis de la superficie de energía libre

Lenta

“Chiche bombón”

“Lenta y peligrosa”

No tan mala

“¿ Funcional ?”

El sesgo proviene porque en promedio aquellas conformaciones que presentan más contactos “nativos” entre residuos son más estables. ¿Como “sabe” la proteína que un contacto es “correcto”? No lo sabe. Aquellas estructuras que no presentaban este comportamiento no fueron seleccionadas. ¿Que ocurriría si sintetizamos una proteína con una secuencia cualquiera? Que no fue “filtrada” por millones de años de evolución. ¿Se plegaría con una estructura “única”? Lo más probable es que no se pliegue.

Un mono secretario…

DESNATURALIZACION POR AGENTES QUIMICOS UREA o GUANIDINIO: ¾ ALTERAN LA ESTRUCTURA DEL AGUA

¾ INTERACCIONAN CON GRUPOS DE LA PROTEINA ( aromáticos, amidas) ∆G DE TRANSFERENCIA DE UN AMINOACIDO DESDE AGUA A UNA SOLUCION DE DESNATURALIZANTE ES PROPORCIONAL A LA CONCENTRACION DE DESNATURALIZANTE COMO EL ESTADO D ES MAS EXPUESTO QUE EL N, ENTONCES D ES ESTABILIZADO POR EL DESNATURALIZANTE

∆GD-N = ∆GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante]

1

O

fu

0.8 0.6

H2N

0.4

C UREA

0.2 0 0

2

4 [UREA]

6

8

NH2+ NH2

H2N

C

NH2

GUANIDINIO

DIFERENCIAS DE ESTABILIDAD

> estabilidad

∆GD-N = ∆GD-N(H2O) - mD-N [desnaturalizante] m: medida de ∆ASA (superficie accesible al solvente) durante el desplegado ∆ASA

m

Transiciones de dos estados

La transición medida por diversas técnicas debe ser idéntica (UV, fluorescencia, CD, etc) Idealmente debería haber puntos isosbésticos e isodicroicos (¿PORQUE?)

∆G = 0

G

nearUV CD

TRP señal

D

farUV CD

N [desnaturalizante] nearUV CD

[desnaturalizante]

TRP señal

D N

N

¿Qué ocurrió acá? farUV CD

D

[desnaturalizante]

¿Cómo seguimos el desplegado de una proteína? Gel con gradiente de urea: N

Migración

U

> tamaño

0 M

UREA

8 M

Dicroísmo circular (CD)

Espectroscopía de fluorescencia

Desplegada λEX 292 nm Desplegada λEX 275 nm Nativa λEX 292 nm

•Casi siempre el espectro de U aparece corrido hacia el rojo •La intensidad puede aumentar o disminuir

Atrapado de intermediarios de plegamiento ligados por puentes disulfuro: ¾La proteína completamente desplegada y reducida se vuelve a plegar si se elimina el desnaturalizante y los puentes disulfuro se forman por oxidación con O2. ¾ Se pueden atrapar los intermediarios con diferentes puentes disulfuro ya formados, de dos maneras principales: bajando el pH o por modificación covalente (Iodoacetato): SH

HS

SH

O2

SH

SH

ICH2COO-

SCH2COOSCH2COO-

SH S-S

¾ Una de las pocas técnicas para ver folding in vivo

S-S

Inhibidor de tripsina de páncreas bovino (BPTI)

¿COMO CALCULAMOS ∆GD-N? Partimos de una señal espectroscópica a distintas [UREA].

F > [UREA]

Mezcla de las señales de N y D, pesadas por su concentración: S =SN fN + SD fD = SN (1-fD) + SU fD Con esto podemos calcular fU: fD = (S – SN) / (SD-SN)

Long. Onda (nm)

El cual se relaciona con KD-N = [D]/[N] = fD / (1-fD)

Podemos calcular KD-N para cada [UREA] ¿Por qué KD-N depende de urea? ¿Cómo calculamos KD-N en ausencia de urea?

1

fu

0.8 0.6 0.4

Con KD-N podemos calcular ∆GD-N para cada [UREA] y podemos extrapolar los valores en ausencia de urea:

0.2 0 0

2

4 [UREA]

6

8

∆GD-N = ∆GD-N(H2O) + m [UREA]

Para el caso de oligómeros ∆GD-N depende de la concentración total de proteína

¿Porqué?

∆GD-N

∆G1

∆GD-N = ∆G1 + ∆G2 ∆G2

Depende de [PROT]

En las curvas de desnaturalización pueden observarse dos tipos de comportamiento:

fD

fD > [PROT]

[Desnaturalizante]

> [PROT] [Desnaturalizante]

¿Cómo están acopladas las estructuras terciaria y cuaternaria en cada caso?

La presencia de un ligando aumenta la estabilidad: Ejemplo: calreticulina ± Ca2+ ± Glc1Man9GlcNAc2 > Glc1Man9GlcNAc2

Estabilidad térmica seguida por far-UV CD:

> [Calcio] > Glc1Man9GlcNAc2

Glc1Man9GlcNAc2

calcio

Fluorescencia de TRP:

> [Calcio]

+ Glc1Man9GlcNAc2

+ Glc1Man9GlcNAc2

+ Glc1Man9GlcNAc2

∆GD-N

∆G1

∆G2

∆GD-N = ∆G1 + ∆G2

Binding Unfolding

Denaturalización de proteínas oligoméricas:

SOYBEAN AGGLUTININ (SBA)

Tratamiento de SBA con urea (en presencia de EDTA)

ANS

TRP TRP

ANS

SEC SEC

CD UV lejano

CD UV cercano

2 TRANSICIONES

ANS

¾La desnaturalización de una proteína oligomérica puede ser más de 1 estado:

Terciaria

La detección del monómero va a depender del grado de cooperación entre estructura terciaria y cuaternaria fu

fu

Urea

Urea

¾ El ∆Gu de una proteína oligomérica depende de la concentración total de proteína: fu

fu

> concentración

> concentración

Urea

Urea

PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS A1) Problemas a resolver: • interacciones hidrofóbicas • puentes disulfuro • isomerización de prolinas • adquisición de la estructura cuaternaria • traslocación de membranas A2) Familias de chaperonas:

A3) Acción secuencial de chaperonas

• HSP70 • HSP40 • HSP60 • HSP10 • HSP90 • small HSP (sHSP) • HSP100 • CRT/CNX • PPIases • PDI • chaperonas intramoleculares

PROBLEMAS A RESOLVER: INTERACCIONES HIDROFOBICAS

ESTRUCTURA 3D MUY BASICA DE UNA PROTEINA

HO

-

+

OH

-

+

UNA MICELA VENIDA MUY A MAS

+ HO

-

+

OH

-

PROBLEMA: • SINTESIS PROTEICA Y TRASLOCACION DE MEMBRANAS ES LINEAL •LOS RESIDUOS HIDROFÓBICOS INTERACTUAN INESPECIFICAMENTE • LA VELOCIDAD DE SINTESIS MUCHAS VECES ES MENOR QUE EL TIEMPO PARA EL PLEGAMIENTO + OH - OH+ -+ OH - OH +

PROBLEMAS A RESOLVER: PUENTES DISULFURO

SH 1

SH 2

S S

3

SH

SH SH

S S S-S (13)

S-S (12)

SH

S-S (23)

S S

NATIVA

E0S-S(2-3) < E0S-S(2-3), E0S-S(2-3)

PROBLEMAS A RESOLVER: ISOMERIZACION DE PROLINAS

TRANS

CIS

PROBLEMA ADICIONAL EL MEDIO INTRACELULAR TIENE UNA CONCENTRACION ESCANDALOSAMENTE ALTA DE PROTEINAS !!!

E.coli ~ 150 mg/ml Célula de mamífero ~ 180 mg/ml

PREVENIR LA SEGURA AGREGACION DE PROTEINAS, SU CORRECTO PLEGADO Y ENSAMBLADO

CHAPERONAS

PLEGAMIENTO IN VIVO DE PROTEINAS • • • • • •

Secundaria Terciaria Cuaternaria Puentes disulfuro Isomerizacion de prolinas Modificaciones postraduccionales

“VIA TERMODINAMICA”

“VIA CINETICA” Reacción de molecularidad alta. Velocidad muy dependiente de concentración

CHAPERONAS: proteínas que ayudan a otros polipéptidos a adquirir la conformación apropiada o la localización celular adecuada sin formar parte de la estructura final. CLASIFICACION FUNCIONAL:

1) INTERACCIONAN CON RESIDUOS HIDROFOBICOS (previniendo agregación inespecífica durante la síntesis y la traslocación de membranas): • HSP70 (DnaK) • HSP40 (DnaJ) • HSP60 (GroEL) • HSP10 (GroES) • HSP90 • small HSP (sHSP) • HSP100 • chaperonas intramoleculares 2) CATALIZAN LA CORRECTA FORMACION DE PUENTES DISULFURO: • PDI: protein disulfuro isomerasas 3) CATALIZAN LA ISOMERIZACION DE PROLINAS: • PPIases: peptidilprolil isomerasas 4) INTERACCIONAN CON HIDRATOS DE CARBONO (lectinas): • CRT/CNX: calreticulina / calnexina

CHAPERONAS Algunas cosas generales: ¾ EN GENERAL NO ACELERAN LA VELOCIDAD DE PLEGAMIENTO. AUMENTAN LA EFICIENCIA DEL PROCESO AL EVITAR LA AGREGACION INESPECIFICA Y RESCATAR PROTEINAS QUE ENTRARON A VIAS MUERTAS ¾ DURANTE EL PLEGAMIENTO IN VIVO SOLO UNA PEQUEÑA PROPORCION DE UNA PROTEINA PARTICULAR INTERACCIONA CON LOS SISTEMAS DE CHAPERONAS ¾ LAS PROTEINAS PUEDEN SEGUIR MAS DE UNA VIA DE PLEGAMIENTO IN VIVO. AL ELIMINARSE LA INTERACCION CON UNA CHAPERONA OTRAS TOMAN SU LUGAR

HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ) ¾ PRESENTES EN CITOSOL Y ORGANELAS FUNCIONES: ¾ PARTICIPAN EN LA SINTESIS PROTEICA (previenen agregación, ayudan en la adquisición de la estructura nativa, rompen agregados) ¾ TRANSLOCACION DE MEMBRANAS ¾ CONTROL DE PROTEINAS REGULATORIAS: receptores nucleares, quinasas (Raf, eIF2α-quinase), factores de transcripción (HSF, σ32, etc) ¾ RECONOCEN SEGMENTOS HIDROFOBICOS DE PROTEINAS EN CONFORMACIONES EXTENDIDAS.

HSP70 (DnaK) - HSP40 (DnaJ) DnaK

GrpE

ATP

ATP

DnaJ

ATP

ADP

+ Pi

ADP

ATP

+

GrpE

DnaK (ATP binding domain)

DnaK (substrate binding domain)

HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES) (CHAPERONINAS) Presente en Eubacteria, Cloroplasto y Mitocondria. Dominio apical: expone parches hidrofobicos Reconoce preferentemente intermediarios avanzados de plegamiento En E. coli aprox. 10-15 % de las proteinas sintetizadas inteactua con GroEL-GroES.

HSP60 (GroEL) - HSP10 (GroES) CICLO CATALITICO 7 ADP

: unfolded protein

: folded protein

7 ATP

ADP

ATP

ADP

ATP

ADP

ADP

ATP

ATP

7 ATP

7 ADP

UNION DEL POLIPEPTIDO

ENCAPSULAMIENT O DEL POLIPEPTIDO

UNION DEL

LIBERACION DE LA

POLIPEPTIDO TRANS

CAVIDAD CIS

Dominio apical: expone parches hidrofóbicos. Luego de unirse el sustrato y GroES este dominio gira 90 grados y se ocultan los residuos hidrofóbicos. Se genera una cavidad hidrofílica (caja de Anfinsen) capaz de contener ligandos de hasta 60 kDa.

FORMACION DE PUENTES DISULFURO: PDI MAQUINARIA DE RECICLADO

PDI

PDI

PDI

S

S

S

SH

SH

SH

SH

SH

S

SH

S

S

PROTEÍNA

PROTEÍNA

CITOSOL: [GSH] : [GSSG] = 30:1 A 100: RETICULO ENDOPLASMICO: [GSH] : [GSSG] = 1:1 A 1:3

PROTEÍNA

LA PDI “NO SABE” SI UN PUENTE DISULFURO ES CORRECTO. HAY U JUEGO ENTRE ESTABILIDAD Y CINETICA.

Las PDIs cumplen varias funciones: HS S

E

HS

S

S HS

OXIDO-REDUCCION

OXIDO-REDUCCION

SH HS

E

S

S

S

HS

S SH

E

SH

S HS

SH

S

E ISOMERIZACION

SH

HS S

S

S

Y están altamente especializadas a determinados sustratos. En el RE hay unas 18 PDIs distintas.

α7

β7

β7

α7

PROTEASOMA

2.5 Mda, PORO INTERNO 5 nm 26S: 20S (CATALITICA) + 19S (REGULATORIA) UBICUO Y ESENCIAL EN EUCARIOTAS. UBICUO Y NO ESENCIAL EN ARQUEA. RARO Y NO ESENCIAL EN BACTERIAS FUNCIONES: DEGRADACION DE PROTEINAS DAÑADAS O MAL PLEGADAS. CONTROL DE LA VIDA MEDIA DE PROTEINAS REGULATORIAS (Péptidos para MHC !!!)

β ES LA SUBUNIDAD CATALITICA. SE SINTETIZA CON UN PROPEPTIDO QUE SE CLIVA AUTOCATALTICAMENTE EN PARALELO CON EL ENSAMBLADO. ¿CUAL SERIA LA VENTAJA DE ESTO? MECANISMO PROCESIVO. GENERA PEPTIDOS DE 6-10 RESIDUOS. 80-90% DE LA DEGRADACION PROTEICA ES VIA PROTEASOMA

¿CUAN GENERAL ES LA DEGRADACION PROTEICA? DEPENDE DE CADA PROTEINA. Ej.: CFTR MAS DEL 90 % SE DEGRADA VIA PROTEASOMA, PARA EL CASO DE LA MUTANTE ∆F508 LA PROPORCION ES MUCHO MAYOR

ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS SINTESIS PROTEICA EN E. coli

TF: trigger factor. Miembro de la familia FκBP

TF DnaK

Dna J

+ GroEL + ATP + GroES PROTEINA NATIVA

ACCION SECUENCIAL DE CHAPERONAS SINTESIS PROTEICA EN EUCARIOTES

Sis1 p Ssb1p/ 2p

NAC Hdj1

+ TRiC + ATP PROTEINA NATIVA

EN EL RE TENEMOS DOS GRUPOS MEDIANAMENTE DEFINIDOS DE CHAPERONAS: BAP (Grep) BIP (Hsp70) EL CLAN DE BIP

GRP94 (Hsp90) PDI GRp170 ERp72 GT

LA PATOTA DE CNX/CRT

GII CNX CRT ERp57

ERdj3 (DnaJ)

IMPORTE Y PLEGADO DE PROTEINAS EN EL RE SRP: signal recognition particle (7S RNA + proteínas de 9, 14, 19, 54, 68 y 72 kDa). Frena la elongación si detecta un PS. SR: membrana ER. Reconoce SRP. Dos subunidades (SRα y SRβ). Libera SRP y forma un complejo entre el ribosoma y el traslocón. Existen homólogos bacterianos de SRP ySR para las proteínas periplásmicas.

SRP

ATP

OT Sec61

SR Sec63

BiP PEPTIDASA

péptido señal GRp94

CRT/CNX

Sec62

Sec71 Sec72

PROTEINA NATIVA

PLEGAMIENTO DE PROTEINAS EN EL RE BIP BIP

CNX/CRT

BIP/CNX/CRT CNX/CRT

OBSERVACIONES MÁS O MENOS GENERALES: • LOS SISTEMAS SON REDUNDANTES • AL ELIMINAR UNA CHAPERONA SE SOBREEXPRESAN OTRAS (ej. GT-/- tiene BiP aumentada 2-3 X) • AL AFECTAR LA UNIÓN A UNA CHAPERONA AUMENTA LA VELOCIDAD DE CIRCULACIÓN A TRAVES DE LA VÍA SECRETORIA PERO DISMINUYE LA EFICIENCIA

CNX/CRT BIP

CONTROL DE CALIDAD DE PLEGAMIENTO DE GLICOPROTEINAS EN EL RE GLUCOSIDADA II α-1,3

α-1,3 α-1,3 α-1,2 α-1,2 α-1,3 α-1,2

GLUCOSIDADA I

α-1,6 α-1,2

MANOSA

N-ACETILGLUCOSAMINA

β-1,4

ASN

α-1,3 α-1,6

MANOSIDASA

GLUCOSA

β-1,4

¿PORQUE LAS PROTEINAS SE GLICOSILAN? • DEBIDO A SU NATURALEZA HIDROFILICA AUMENTAN LA SOLUBILIDAD DE LAS PROTEINAS • POR SU GRAN VOLUMEN REDUCEN LA EXPOSICION SUPERFICIAL DE LA PROTEINA, DISMINUYENDO LOS CONTACTOS INESPECIFICOS ENTRE PROTEINAS • LOS OLIGOSACARIDOS POR LO GENERAL ESTABILIZAN EL BACKBONE • SE USAN COMO UN CODIGO DE BARRAS PARA INDICAR EL ESTADO CONFORMACIONAL DE LA PROTEINAS • los oligosacáridos participan en una gran variedad de procesos de reconocimiento

GT OT

GT

GI GII

GII

GII

SECRETORY PATHWAY

CNX

ERp57

ERp57

CNX

CALNEXINA - CALRETICULINA DOMINIO P LECTINA EXCLUSIVA PARA Glc1Man9NAcGlcN2 SE DESCONOCE SI RECONOCE LA PARTE PROTEICA

Que ocurre cuando la maquinaria de plegamiento es superada? En RE: 1) ATENUAR SINTESIS DE PROTEINAS

UPR

2) SINTETIZAR MAS CHAPERONAS 3) DEGRADAR PROTEINAS MAL PLEGADAS 4) APOPTOSIS

ERAD

ERAD: ER associated degradation MECANISMO GENERAL

proteína mal plegada

Ub

SEC61 BiP

BiP

PROTEASOMA 26S toxina

DEGRADACION DE GLICOPROTEINAS Man9NAcGlcN2

GT EDEM

MANOSIDASA

Man8NAcGlcN2

GII

ER 7 p5

X CN

PEPTIDIL N-GLICANASA

PROTEASOMA 26S

¿Qué ocurre cuando una proteína no puede plegarse correctamente y no es degradada? ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO MAL DE ALZHEIMER (2.000.000 EN USA) MAL DE PARKINSON (500.000 EN USA) ENFERMEDADES POR POLIGLUTAMINAS (HUNTINGTON, KENNEDY, ATAXIA, ETC) MAL DE LA VACA LOCA (BSE) OBSERVACION EN CEREBROS CON BSE:

DEPOSITOS FIBRILARES: AMILOIDES

ENFERMEDADES DE PLEGAMIENTO ENFERMEDAD

COMPONENTE PRINCIPAL DEL AGREGADO

Alzheimer’s disease

Aβ peptides (plaques); tau protein (tangles)

Spongiform encephalopathies

Prion (whole or fragments)

Parkinson’s disease

α-synuclein (wt or mutant)

Primary systemic amyloidosis

Ig light chains (whole or fragments)

Secondary systemic amyloidosis

Serum amyloid A (whole or 76-residue fragment)

Fronto-temporal dementias

Tau (wt or mutant)

Senile systemic amyloidosis

Transthyretin (whole or fragments)

Familial amyloid polyneuropathy I

Transthyretin (over 45 mutants)

Hereditary cerebral amyloid angiopathy

Cystatin C (minus a 10-residue fragment)

Haemodialysis-related amyloidosis

β2-microglobulin

Familial amyloid polyneuropathy III

Apolipoprotein AI (fragments)

Finnish hereditary systemic amyloidosis

Gelsolin (71 amino acid fragment)

Type II diabetes

Amylin (fragment)

Medullary carcinoma of the thyroid

Calcitonin (fragment)

Atrial amyloidosis

Atrial natriuretic factor

Hereditary non-neuropathic systemic amyloidosis

Lysozyme (whole or fragments)

Injection-localised amyloidosis Hereditary renal amyloidosis

Insulin Fibrinogen α-A chain, transthyretin, apolipoprotein AI, apolipoprotein AII, lysozyme, gelsolin, cystatin C

Amyotrophic lateral sclerosis

Superoxide dismutase 1 (wt or mutant)

Huntington’s disease

Huntingtin

Spinal and bulbar muscular atrophy

Androgen receptor [whole or poly(Q) fragments]

Spinocerebellar ataxias

Ataxins [whole or poly(Q) fragments]

Spinocerebellar ataxia 17

TATA box-binding protein [whole or poly(Q) fragments]

¿ QUE OCURRE CUANDO UNA PROTEINA MAL PLEGADA NO ES DEGRADADA ? EJEMPLO: MAL DE LA VACA LOCA (BSE) ….en los 80s CASOS BSE 40000 30000 20000 10000

94

93

92

91

90

89

88

87

86

85

0

AÑO

CASOS vCJD 12 10 8 4 2

AÑO

97

0 96

NUEVA VARIANTE DE LA ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB (vCJD)

6

95

….y a mediados de los 90s

PRION (PrP) • SE ENCUENTRA NORMALMENTE EN MUCHOS TEJIDOS • FUNCION: DESCONOCIDA (!) • LOCALIZACION: EN LA MEMBRANA CELULAR, DEL LADO EXTERNO

PROBLEMA: NO DA AMILOIDES !!!

(SIN EMBARGO NO ES TAN SIMPLE) LA DOBLE VIDA DE PrP (“El extraño caso del Dr. Jekyll y Mr. Hyde” R.L. Stevenson)

PrPC

PrPSc

AMILOIDE

UN MODELO POSIBLE PARA LA GENERACION DE AMILOIDES

Stanley Prusiner Premio Nobel de Medicina 1997

MODELO DE PRUSINER CONVERSION PrPC

INDUCCION

PrPSc

INFORMACION “NO GENETICA” INDUCCION CONFORMACIONAL

PROPAGACION

AMILOIDE

¿PORQUE APARECIO LA vCJD AHORA? ¿ES NUEVA? SIMILAR AL KURU GRUPO LINGUISTICO “FORE” DE PAPUA NUEVA GUINEA POR CANIBALISMO

OVEJA

SCRAPIE (200 años)

VACA

CARNIVORA !!!

HUMANO

ALGUNAS COSAS IMPORTANTES

AGREGACION

EVOLUCION TEMPORAL DE LA FORMACION DE AGREGADOS:

TIEMPO SIEMBRA

FASE LAG

FASE DE ELONGACION

CAMBIO CONFORMACIONAL

LENTO

RAPIDO

Y EN BASE A ESTO PODEMOS ENTENDER ALGUNAS COSAS: ¿POR QUE MUTACIONES QUE DISMINUYE LA ESTABILIDAD DE UNA PROTEINA PUEDEN FACILITAR LA FORMACION DE AMILOIDES? CJD ¿COMO SE PRODUJO LA vCJD?

Y ACA HAY DOS MODELOS CINETICOS MUY DIFICILES DE DISCRIMINAR: • EFECTO “INDUCTIVO” • EFECTO RESERVORIO Ambos dan cinéticas similares

MAS COSAS IMPORTANTES: •EN PRINCIPIO LA FORMACION DE AMILOIDES ES UNA PROPIEDAD INTRINSECA DE TODAS LAS PROTEÍNAS. ES UN PROCESO INEVITABLE DADA LAS CARACTERISTICAS FISICAS Y QUIMICAS DE UNA CADENA DE ALFA-AMINOACIDOS (Dobson) SIMPLIFICANDO LAS COSAS: LAS CADENAS LATERALES CODIFICAN LA INFORMACION PARA LA ESTRUCTURA TERCIARIA, Y EL BACKBONE CODIFICA LA INFORMACION PARA AMILOIDES • SI EN UN CULTIVO SE EXPRESA UNA PROTEINA QUE FORMA AMILOIDES NO RELACIONADA A NINGUNA PATOLOGIA CONOCIDA, POR LO COMUN RESULTA DELETEREA • HAY UNA RELACION BASTANTE DIRECTA ENTRE ESTABILIDAD CONFORMACIONAL Y TENDENCIA A FORMAR AMILOIDES

¿CUAL ES LA ESPECIE TOXICA? EN UN PRINCIPIO SE CREYO QUE LA ESPECIE TOXICA ERAN LOS AMILOIDES. SIN EMBARGO LUEGO SE VIO QUE NO HAY UNA CORRELACION ENTRE EL NIVE DE DAÑO CELULAR Y LA FORMACION DE AMILOIDES.

INTERMEDIARIOS AVANZADOS ENSAMBLADOS GLOBULARES

(HSP´)

AGREGADOS TEMPRANOS EN FORMA DE PORO

FIBRA MADURA PORO DE MEMBRANA

SI LAS ESPECIES TOXICAS SON LOS AGREGADOS PREVIOS AL AMILOIDE, ¿SE IMAGINAN QUE HUBIERA PASADO DE HABERSE APLICADO TERAPIAS TENDIENTES A DESTRUIR LOS AMILOIDES? DE HECHO HAY UN CONSENSO CADA VEZ MAYOR DE QUE EN ALGUNOS CASOS LOS AMILOIDES SERIAN UNA FORMA DE RESPUESTA PROTECTIVA

¿PORQUE ES TOXICA? ACA HAY DEMASIADAS TEORIAS Y POCAS RESPUESTAS: 1) 2) 3)

POROS TEORIA DE SECUESTRO INHIBICION DEL PROTEASOMA

CUERPOS DE INCLUSION (IB: INCLUSION BODIES) •Problema muy común al expresar proteínas recombinantes. •Al expresar proteínas humanas en E. coli: - SOLUBLES: 15-20 % - CUERPOS DE INCLUSION 20-40 % - el resto no se expresa!!! (se degradan)

• Masas amorfas densamente empaquetadas, formadas por proteína mal plegada (en general un 70 % o más corresponde a la proteína recombinante, siendo el resto proteínas bacterianas).

• En E. coli se observa en general uno solo por célula, con un tamaño en el orden de 0.2 a 1.5 µm. Pueden llegar a distorsionar la pared celular.

¿Porqué se forman?

•Maquinaria inadecuada o insuficiente de chaperonas •Falta de modificaciones postraduccionales (ej. glicosilación) •Síntesis demasiado rápida para la cinética de plegamiento de la proteína

¿Como lo evitamos? • Bajar la temperatura (28ºC) •Usar niveles de expresión más bajos: menos inductor, medios de cultivo menos ricos o cambio de vector. •A veces se puede co-expresar una chaperona ausente en el sistema heterólogo

¿Se puede recuperar la proteína de un IB de forma funcional? • Muchas veces sí: 1) Limpiar los IB (urea a baja cc, tritón X-100, NaCl, etc. Todo a baja T). A veces se puede tener la proteína con una pureza mayor del 90 %. 2) Resuspenderlos (urea 6-8 M, guanidinio-HCl 6 M, con o sin DTT) 3) Plegar la proteína:

-diálisis de a poco -dilución brusca -unida a una columna (ej. IMAC)

4) Caracterizar la proteína: dicroísmo far-UV y near-UV, actividad biológica, etc

UNA VISION GOBAL DEL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEINAS: AGREGADO DESORDENADO

HETEROCOMPLEJO

(IB)

INTERMEDIARIOS AVANZADOS SINTESIS

NATIVA

OLIGOMERO

INTERMEDIARIOS TEMPRANOS

(HSP) (HSP´)

DEGRADACION PROTEASOMAL

AGREGADO ORDENADO PREFIBRILAR

FIBRA AMILOIDE

DIMEROS TRIMEROS FIBRAS

CRISTAL