XXVIII Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental Cancún, México, 27 al 31 de octubre, 2002

BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS CONTAMINADAS CON DERIVADOS DE HIDROCARBUROS UTILIZANDO CEPAS BACTERIANAS AUTÓCTONAS Ismenia Araujo Vílchez (*) Centro de Investigación del Agua (CIA). Coord. del Laboratorio de Microbiología Industrial del CIA de la Universidad del Zulia (LUZ). Secretaria Ejecutiva de la Fundación para el desarrollo de la Ciencia y la Tecnología. Asesora de los Proyectos sobre Microbiología de Petróleo en Convenio INTEVEP-LUZ, INPELUZ, y del Proyecto Lagunas de Estabilización, Convenio Fundación Polar-LUZ. Coordinadora de la Maestría en Microbiología. Gustavo Romero Estudiante Carmen Cárdenas Centro de Investigación del Agua Nancy Angulo Centro de Investigación del Agua Gustavo Morillo Centro de Investigación del Agua Judith Navarro Centro de Investigación del Agua María Méndez Centro de Investigación del Agua (*): Av. 21, Calle 67, Edificio Manatara, Apartamento 3B, Sector Indio Mara – Maracaibo - Estado Zulia Código Postal : 4005 -Venezuela. Telf.: 02617519022-02617597189 - FAX: 02617597181 - e-mail: [email protected]. RESUMEN Se tomaron muestras de agua de la ribera del Lago de Maracaibo, sector Capitán Chico, Edo. Zulia y se lograron aislar 16 cepas bacterianas, las cuales fueron probadas en su capacidad para degradar hidrocarburos, mediante un ensayo de factibilidad utilizando gasoil como única fuente de carbono. Se seleccionaron 07 de las cepas que lograron degradar entre 50 a 70% de los hidrocarburos presentes en el gasoil y se realizaron pruebas de identificación con el propósito de conocer algunas de sus características bioquímicas. Posteriormente, se preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se evaluó su capacidad para degradar hidrocarburos a través de un estudio de biotratabilidad en tanques plásticos de 25 L conteniendo: 2 L del cultivo mixto (10 % inóculo), un aceite lubricante en una concentración de 7000 mg/L y agua potable hasta un obtener un volumen de 20 L. En 04 de los tanques se instalaron sistemas de aireación inducidos desde el fondo y adicionalmente, se evaluó la incidencia del nitrógeno y fósforo (fertilización). Se determinaron mensualmente los contajes bacterianos, los hidrocarburos totales y el contenido de nitrógeno y fósforo total y las concentraciones de las fracciones de los hidrocarburos (SARA) se determinaron al inicio y al final del ensayo. Los resultados indicaron que en los tanques inoculados, fertilizados y aireados se lograron las mayores remociones, hasta un 89 % de los hidrocarburos totales y la transformación de todas las fracciones presentes en el aceite, demostrando la eficiencia del cultivo bacteriano en la biorremediación de agua contaminada con hidrocarburos. Palabras Claves: cepas bacterianas, hidrocarburos, biorremediación.

INTRODUCCIÓN A comienzos de los años 90, en Venezuela, importantes investigaciones han sido dirigidas al estudio de los microorganismos y sus actividades, con el propósito de ampliar su versatilidad metabólica para la degradación de contaminantes específicos principalmente los provenientes de las actividades petroleras. En tal sentido, se han desarrollado tecnologías fundamentadas en los procesos biológicos como alternativas viables en la eliminación parcial o total de diferentes compuestos orgánicos. Estos procesos utilizan principalmente bacterias que se encuentran en el mismo ambiente que se pretenda remediar, además se adicionan los macro y micro nutrientes necesarios para el mantenimiento de las cepas bacterianas. La etapa de selección de las cepas bacterianas es muy importante, ya que cuanto más específica sea su capacidad degradativa ante los distintos tipos de desechos, mayor será la capacidad de digerirlo y menor será el tiempo de permanencia en el ambiente. La biorremediación o saneamiento biológico es una tecnología basada en procesos naturales que utiliza la capacidad de algunos microorganismos, tales como bacterias y hongos, para transformar compuestos químicos con la finalidad de disminuir o eliminar su condición de peligrosidad (Cook & Westlake, 1972 ). La transformación es tal, que hay un completo rompimiento de las moléculas orgánicas en sustancias inorgánicas como dióxido de carbono y agua, proceso que se denomina mineralización (Scherer, 1996). Si ocurre sólo una degradación parcial de compuestos secundarios, los cuales pueden ser o no menos tóxicos, se dice entonces, que ocurrió una biotransformación (Eweis et al, 1999 y Levin & Gealt, 1997). La descarga de petróleo y sus productos derivados a las corrientes naturales de aguas superficiales y subterráneas ha planteado un problema que, en la mayoría de los casos, han adquirido bastante gravedad. En el caso de aguas superficiales la adición de nutrientes se realiza sin menor complicación en el área a tratar con el objeto de aumentar la población nativa para acelerar el proceso de biodegradación, y la adición de oxígeno muchas veces no es necesaria a menos que sea agua estancada sin movimiento pues el oleaje y el viento se encargan de proporcionar las condiciones óptimas para que el oxígeno atmosférico penetre en el reservorio (Metcalf & Hedí, 1996). El objetivo fundamental de esta investigación fue determinar la eficiencia de cepas bacterianas provenientes de aguas contaminadas con hidrocarburos en la degradación de los mismos. METODOLOGÍA El estudio del proceso de biorremediación en esta investigación se realizó en dos fases. La primera fase permitió aislar y seleccionar las cepas autóctonas de agua contaminada con hidrocarburos más eficientes en la utilización del gasoil como única fuente de carbono. En la segunda fase se preparó un cultivo mixto con las cepas previamente seleccionadas y se probó su eficiencia en la degradación de aceites lubricantes a escala piloto, con la adición de nutrientes y aireación. ESTUDIO DE FACTIBILIDAD El agua contaminada con hidrocarburo utilizada en este estudio fue obtenida de la ribera del Lago de Maracaibo, Sector capitán Chico, Maracaibo, Edo. Zulia, Venezuela. Los envases fueron trasladados al Laboratorio, donde se realizó el aislamiento de las cepas bacterianas presentes en las muestras de agua, utilizándose la técnica de siembra en placa por estría (Kerr, 1970; Seeley & Vandemark, 1973 y Pareja, 1993). Una vez aisladas las colonias, se registraron sus características morfológicas y cada una de las cepas fue guardada por duplicado en refrigeración en tubos con agar inclinado cerebro corazón (Finegold & Martin, 1983). Las cepas aisladas preservadas, se activaron por transferencia a un medio nutritivo fresco, infusión cerebro-corazón y se incubaron a 37 ºC hasta alcanzar un crecimiento superior a 1x108 UFC/ml. A partir de estos cultivos se prepararon los inóculos para el ensayo (APHA, 2000; Kerr, 1970). Los ensayos de factibilidad en el laboratorio se prepararon para cada cepa, utilizando medio mínimo mineral, modificación del propuesto por Jobson et al en 1975, 1ml de gas oil y 5 ml inóculo. Todas las fiolas fueron incubadas a 37ºC y 120 rpm de agitación en un Incubator Shaker, modelo 625, durante 60 días. Este ensayo permitió seleccionar las cepas más eficientes en la degradación del gasoil. Cada dos semanas durante dos meses, se tomaron muestras de cada fiola para la determinación de contajes bacterianos siguiendo la técnica de contaje en placa vertida, 9215-B (APHA, 2000). Al inicio y al final del ensayo, se realizó la determinación de hidrocarburos totales en todas las fiolas según el método 5520-F (APHA, 2000). A las cepas seleccionadas

se les realizó una serie de pruebas bioquímicas a saber: Tinción de Gram, Anaerobiosis, Ureasa, Citrato, Catalasa, Oxidasa, Motilidad y Triple Azúcar Hierro (Kerr, 1970; Seeley & Vandemark, 1973 y Pareja, 1993). ESTUDIO DE TRATABILIDAD Se realizó un estudio a escala piloto el cual consistió en diferentes tratamientos que permitieron evaluar la eficiencia del cultivo mixto conformado por las cepas previamente aisladas y seleccionadas por su eficiencia en la degradación de gasoil bajo distintos parámetros. Dentro de los tratamientos, se evaluó el proceso de biodegradación con la adición de nutrientes y la inyección de aire, con el propósito de comparar la eficiencia en la biodegradación del sustrato hidrocarbonado. Se seleccionaron las siete cepas más eficientes en la degradación de gasoil para conformar el cultivo mixto. Cada cepa seleccionada fue activada y posteriormente, transferida a caldo cerebro-corazón, se incubaron a 37 ºC hasta obtener una concentración superior a 1x108 UFC/ml. Para preparar el cultivo mixto se agregaron al tanque con la mezcla estudio (agua contaminada con aceite) fracciones equivalentes de cada cepa, hasta alcanzar una concentración de cultivo de 10%. La selección del hidrocarburo que se utilizó en el ensayo se realizó consultando a las empresas marítimas de la zona objeto de estudio, acerca del producto que se vertía con mayor frecuencia y cantidad en la zona seleccionada. La mayoría coincidió que se trataba del aceite de motor empleado como lubricante en las embarcaciones. Así quedó seleccionado el sustrato utilizado como única fuente de carbono. La mezcla estudio se preparó agregando al agua la cantidad de aceite equivalente al 35% p/v por cada litro de agua en cada tanque. Para este estudio se utilizaron tanques cilíndricos plásticos con una capacidad de 25 L cada uno. El diámetro fue de 0,3 m y la altura de 0,36 m. Con el fin de mejorar la eficiencia del proceso de biorremediación se adicionó un fertilizante compuesto, el fosfato diamónico. Se trabajó con tres concentraciones diferentes de nutrientes, lo que permitió evaluar y comparar su efecto sobre el crecimiento bacteriano y la degradación del aceite. Las concentraciones utilizadas fueron: 0,5; 0,75 y 1 gr/L de difosfato diamónico. El aire se suministró mediante un sistema de inyección en espiral de aire forzado, formado por una tubería plástica acoplada a un compresor que tuvo como función bombear el aire a través de toda la tubería. El sistema en espiral con espaciamiento calculado de los puntos de inyección de aire en el fondo, permitió crear zonas alternas de transferencia y mezclado, evitando así la formación de volúmenes muertos (sin movimiento). Todos los orificios fueron colocados en el fondo ya que la profundidad mejora el tiempo de contacto (Cookson, 1995; Baker, 1987; Capone & Bauer, 1988).

Compresor

Tubería Plástica Puntos de Inyección de aire (Orificios)

Figura 1. Corte transversal de un tanque con sistema de aireación.

Se prepararon tanques con las condiciones objeto de estudio (cultivo, adición de aire entre otras) y sus respectivos controles, Tabla 1. El estudio piloto de tratabilidad tuvo una duración de cinco meses y cada mes se tomó una muestra de cada tanque para la realización de los análisis microbiológicos y fisicoquímicos. Para los parámetros microbiológicos se utilizó el contaje de Heterótrofos Mesófilos por la técnica de placa vertida (9215-B). Los parámetros fisicoquímicos fueron realizados utilizando los métodos: SARA (ASTM D2007-75 Gravimétrico), Hidrocarburos Totales, 5520-F-Gravimétrico; Nitrógeno Total, 4500-NH3; Fósforo Total, 4500-C Ácido Ascórbico (APHA, 2000 y Finegold & Martin, 1983).

Tabla 1. Unidades Experimentales. CULTIVO NUTRIENTES MIXTO 0,5 0,75 1 (g/L)

TANQUE

ACEITE

Control 1

x

Control 2

x

3

x

x

4

x

x

5

x

x

6

x

x

7

x

x

8

x

x

9

x

x

10

x

x

AIREACIÓN

x x x x x x x x

x x x

RESULTADOS Y DISCUSIÓN El aislamiento microbiológico permitió la obtención de 18 tipos de colonias a partir de las muestras de agua contaminada con hidrocarburos. Las características macromorfológicas de las cepas fueron registradas según la descripción propuesta por Thomas J. Kerr. (1.981) Los valores de crecimiento de las cepas bacterianas al inicio del ensayo estuvieron entre 0,069 y 850x106 UFC/ml y al final entre 0,01 y 4.500 UFC/ml. Los primeros 15 días de incubación, las densidades poblacionales de la mayoría de las cepas disminuyeron y estuvieron por debajo de las obtenidas al inicio del ensayo. El crecimiento bacteriano de las cepas bacterianas aisladas mostró diferentes patrones a lo largo del tiempo. Para que un microorganismo sea recomendable de utilizar en procesos de biorremediación es necesario que sea capaz de degradar al sustrato con un eficiencia de 30-40% durante 4 a 6 semanas (Eweis et al, 1999 y Flathman et al, 1995). Cada una de las cepas bacterianas aisladas fue probada en su eficiencia para degradar hidrocarburos en un medio mínimo mineral, con gasoil como única fuente de carbono (Pareja, 1993 y Young & Gerniglia, 1995). Los resultados obtenidos en la determinación de los Hidrocarburos Totales, mostraron que al final del ensayo, los valores fueron inferiores a los valores obtenidos inicialmente, es decir, todas las cepas fueron capaces de degradar el gasoil. Las cepas MI 9 y MI 15 fueron las más eficientes en la remoción del hidrocarburo, 71,2% y 65,78% respectivamente, a los 60 días de tratamiento. Al comparar los resultados de crecimiento bacteriano en el medio con gasoil como fuente de carbono, con los valores de hidrocarburos, se pudo seleccionar las cepas que fueron utilizadas para integrar cultivos mixtos en el ensayo a escala piloto: MI 5, MI 7, MI 8, MI 9, MI 10, MI 11 Y MI 15. La micromorfología de las 07 cepas bacterianas seleccionadas se obtuvo por microscopía de frotis con Tinción de Gram y éstas presentaron las características que se enuncian: MI 5, MI 9, MI 10 y MI 11, bacilos delgados, aislados y en pares; MI 7, MI 8 y MI 15, cocos, aislados, agrupados o en pares. Todas las cepas seleccionadas presentaron reacción de Gram negativa. Las pruebas bioquímicas aplicadas a las cepas bacterianas seleccionadas se presentan en la Tabla 2. Tabla 2. Pruebas Bioquímicas de las Cepas Bacterianas CEPA MI 5 MI 7 MI 8 MI 9 MI 10 MI 11 MI 15

UREASA CITRATO + + + + + + -

CATALASA + + + + + + +

OXIDASA MOTILIDAD TSI ANAEROBIO M K/K + M A/A + N K/K + M K/K + N A/A + N A/A + M K/K +

-: Reacción Negativa +: Reacción Positiva K/K: Alcalino/Alcalino, sin gas , ni H2S A/A: Ácido/Ácido, sin gas ni H2S N: No Mótil M: Mótil

Los microorganismos alcanzaron densidades poblacionales durante los cinco meses del ensayo con diferentes tendencias. Las densidades poblacionales iniciales presentaron títulos de 1x106 UFC/ml, mientras que los controles fueron de 1x102 UFC/ml. Los primeros 30 días de estudio, los microorganismos aumentaron su densidad en todos los tratamientos al igual que los controles. A los 150 días de tratamiento, todos los títulos de crecimiento fueron superiores a los títulos iniciales. Wrenn (1993), utilizó un cultivo mixto conformado por cepas degradadoras de hidrocarburos y probaron su eficiencia en la degradación de crudo liviano en medio acuático, logrando valores de crecimiento hasta de 108 UFC/ml. En los tratamientos control, no inoculados, la densidad poblacional del control aireado fue ligeramente superior que en el control no aireado y esa diferencia se mantuvo durante todo el estudio. El crecimiento de microorganismos aerobios y el desarrollo de sus actividades metabólicas específicas dependen principalmente de la disponibilidad de oxígeno molecular (Levin y Gealt, 1997), lo que explica el comportamiento obtenido en estos tratamientos, el oxígeno estimuló las reacciones metabólicas de los organismos presentes (Martin, 1994). Las curvas de crecimiento para los tanques fertilizados con fosfato diamónico (1,0; 0,75 y 0,5 g/L). La bioestimulación con fertilizantes se ha utilizado con éxito en la recuperación de sitios contaminados con petróleo (Eweis et al, 1999), cuando las concentraciones apropiadas de nitrógeno y fósforo no están presentes, la adición de estos estimula el crecimiento microbiano facilitando la degradación de los sustratos carbonados (Martin, 1994 y Westlake, 1993). Wrenn (1993) utilizó el nitrógeno en forma de amoníaco y de nitrato y descubrieron que el proceso de biodegradación se aceleraba cuando el nitrógeno era suplido en forma de amonio, tal como ocurrió en estos tratamientos. Aggarwal et al (1991) encontraron que concentraciones muy altas de nitrógeno y fósforo pueden inhibir la actividad metabólica de los microorganismos, por ello, es importante determinar las concentraciones de estos compuestos que sean más apropiadas para estimular la actividad microbiana. A partir de los 30 días, los tratamientos con aireación y fertilizados con nitrógeno, fósforo presentaron los valores más altos de densidad poblacional (>1x109 UFC/ml). 1 ,E + 1 0 1

1 ,E + 0 9

UFC/ml

2

1 ,E + 0 8

3

1 ,E + 0 7

4 5

1 ,E + 0 6

6

1 ,E + 0 5

7

1 ,E + 0 4

8 9

1 ,E + 0 3

10

1 ,E + 0 2 0

30

60

90

120

150

T IE M P O (D ÍA S )

Figura 2 . Curvas de crecimiento para tratamientos inoculados y controles no inoculados. A final del estudio los valores de hidrocarburos totales remanentes (HCT) provenientes de los tanques inoculados resultaron muy por debajo a los obtenidos en los controles no inoculados, los cuales no presentaron cambios representativos durante todo el estudio. La concentración de los hidrocarburos disminuyó rápidamente durante los primeros 60 días de tratamiento en los tanques inoculados con el cultivo mixto y luego el proceso de degradación disminuyó progresivamente en los mismos tanques hasta el final del estudio como se observa en la Figura 3. Las curvas de pendientes más pronunciadas correspondieron a los tanques inoculados aireados y fertilizados (8, 9 y 10) con valores de hidrocarburos remanentes finales de 330,5; 935,7 y 490,12 mg/L respectivamente, lo que indicó que el tratamiento aplicado en estos tanques fue eficiente para la remoción del aceite. En la Figura 3, se puede distinguir que el proceso presentó dos fases durante la degradación: la primera probablemente correspondió a la degradación de la fracción lábil, fracción fácilmente degradable, y la segunda, a la degradación de una fracción más resistente al ataque microbiano y que por consiguiente fue más lenta. Mesa y Lugo (2000) realizaron un estudio de Biorremediación de suelos y encontraron una disminución rápida de los hidrocarburos presentes durante las primeras nueve semanas, y luego una disminución lenta de las concentraciones en las nueve semanas siguientes. Jamison y Hudson (1975), demostraron que el suministro de nutrientes y oxígeno estimuló el metabolismo de los organismos

incrementando la degradación de tal manera que se logró la eliminación de hasta 1000 barriles de gasolina mediante la actividad microbiana estimulada. TANQUES

8000

1

7000

2

HTC (mg/L)

6000

3

5000 4000

4

3000

5

2000

6

1000

7

0 0

30

60

90

120

150

TIEMPO (DÍAS)

8 9

Figura 3. Concentración de los HCT durante el estudio para cada tanque.

La remoción de aceite en cada tratamiento se muestra en la Figura 4. Los tanques 8, 9 y 10 que fueron inoculados, fertilizados y aireados mostraron los porcentajes más altos de remoción de 85,09; 76,24 y 82,75 % respectivamente. 90,00 80,00 70,00 60,00 50,00 40,00 30,00 20,00 10,00 0,00 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

T A N QU E

Figura 4. Porcentajes de remoción de los hidrocarburos totales.

Los altos porcentajes de remoción de aceite logrados en este estudio concuerdan con lo reportado por LaDausse et al (1987) quienes demostraron la importante mejora que se producía en la biodegradación de crudo en recipientes fertilizados, en los cuales lograron remover el 60 % de los hidrocarburos presentes. Adicionalmente, estos investigadores suministraron oxígeno a algunos recipientes y obtuvieron un incremento en la remoción superior al 70 % en el medio fertilizado. La Tabla 3 presenta los resultados de las fracciones de hidrocarburos remanentes. En todos los tratamientos se observó la remoción de hidrocarburos saturados y resinas, en los tratamientos fertilizados y aireados se encontraron los valores más altos. Con respecto a los aromáticos y asfaltenos la mayor remoción se observó en los tratamientos fertilizados y aireados. Baker (1987), demostró que niveles bajos de oxígeno limitaban la degradación de compuestos carbonados saturados, aromáticos y resinas; la biotratabilidad de hidrocarburos debe contar con la adición de oxígeno, nitrógeno y fósforo.

Tabla 3. Fracciones de los hidrocarburos Saturados, Aromáticos I y II, Resinas y Asfaltenos al inicio y al final del estudio.

Tanques 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Tiempo (Días) 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150 0 150

Saturados (mg/L) 6057 6030 6074 5447 6083 3254 6083 604 6134 1173 6083 1250 5997 995 6096 104 5997 589 6057 222

Aromáticos I (mg/L) 93,7 96,4 93,7 84,3 94,1 132,4 94,1 88,5 94,9 18,1 94,1 22,5 92,8 21,9 94,3 28,8 92,8 41,4 93,7 32,4

Aromáticos II (mg/L) 26,3 24,1 26,4 23,6 26,4 24,5 26,4 20,1 26,6 42,5 26,4 36,2 26 49 26,4 14,3 26 13,5 26,3 12,5

Resinas (mg/L) 905 816 907 814 909 675 909 675 916 785 909 660 896 572 910 180 896 288 905 220

Asfaltenos (mg/L) 17,1 15,2 17,1 15,3 17,1 14,2 17,1 4,4 17,2 12,4 17,1 10,8 16,9 12 17,2 2,9 16,9 3,2 17,1 3,4

Durante todo el estudio se observó una disminución de la concentración de nitrógeno y fósforo en cada tanque. Los primeros 60 días se lograron las mayores disminuciones en los tanques aireados, lo que concuerda con los resultados de Venosa (1990) quien reportó que las mayores disminuciones de nitrógeno y de fósforo en medios acuáticos contaminados con hidrocarburos tenían lugar en las primeras semanas de estudio; disminuyendo de manera secuencial pero en menor grado hasta el final del ensayo. La concentración de nitrógeno va disminuyendo en mayor proporción que la del fósforo durante los tratamientos, debido a que los microorganismos, necesitan una proporción 10:1 de estos componentes para la asimilación y la síntesis del nuevo material celular (Metcalf & Hedí, 1996).

CONCLUSIONES •

• • •

El cultivo mixto de las cepas bacterianas seleccionadas logró una remoción eficiente de los hidrocarburos presentes en el aceite en todos los tratamientos. El proceso fue optimizado al controlar las variables de aireación y fertilización, lográndose de esta manera la duplicación de la remoción, la cual alcanzó hasta un 85% en cinco meses de tratamiento. La aireación incrementó la remoción del aceite notablemente, lo que se tradujo en una disminución de todas las fracciones de hidrocarburos aromáticos, asfaltenos y principalmente los saturados y las resinas, tanto en los tratamientos fertilizados como en los no fertilizados. En todos los tratamientos la adición de nitrógeno y fósforo contribuyó a la reducción de las fracciones de resinas, asfaltenos, saturados y aromáticos I. La aplicación de fertilizante con aireación produjo valores más altos de remoción de los hidrocarburos que sin aireación, lo que se tradujo en una mayor disminución de todas las fracciones de hidrocarburos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aggarwal, P.; Means, J. and Hinchee, R. 1991. Formulation of nutrient solutions for in situ biodegradation. In R.E. Hinchee an R.F. Fen, In situ Biorremediation. 14 (3) : 607-610. American Public Health Association, American Water Works Association & Water environment Federation.1992. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 18th ed. American Public Health Assoc. Washington, D.C. Baker. 1987. Natural Attenuation of Aromatic Hydrocarbons in a Shallow Sand Aquifer. Groundwater Monit. Rev. 7: 64-71. Capone, D. & Bauer, J. 1988. Microbial Processes in Coastal Pollution. Department of Oceanography and Biological. Florida. Cook, J. & Westlake, B.W.S. 1972. Microbial Utilization of Crude Oil. Appl. Microbial. 23(6): 11082-1089. Cookson, Jr. 1995.Biorenediation Engineering. Design and Application. McGraw-Hill, Inc. USA. Eweis, J.; Ergas, S.; Chang, D. Y Schroeder, E. 1999. Principios de Biorrecuperación. McGrawHill/Interamericana de España, S.A. España. Finegold, S. & Martin, W. 1983. Diagnóstico Microbiológico. Médica Panamericana Buenos Aires. Flathman, P.; Jerger, D. and Exner, J. 1995. Bioremediation. Field Experience. Lewis Publisher. Jamison, R and Hudson, J. 1975. Biodegradation of high-octanogasoline in groundwater Dev. Ind. Microbial. 16: 305-312 Jobson, A.; Cook, F.; Westlake, D. 1.972. Microbial Utilization of Crude Oil. Appl. Microbiol., 23: 1082-1089. Kerr, T. 1970. Applications in General Microbiology.A Laboratory Manual. Hunter Publishing Company. Georgia. LaDausse, A. & Tramier, B. 1987. Progres in enhanced oil degradation. Paper present: Proceedings of the 1987 oil spill conference. Abstract. Washington. D.C. Levin, M. & Gealt, M. 1997. Biotratamiento de Residuos Tóxicos y Peligrosos. Selección, estimación, modificación de microorganismos y aplicaciones. McGraw-Hill. USA. Martín, A. 1994. Biodegradation and Bioremediation. Bioremediation Technologies. Academic Pres. New York. Mesa, Y. y Lugo, G. 2001. Biorremediación de Suelos Contaminados con Hidrocarburos Utilizando Lodos Residuales Domésticos Tratados. Tesis de Postgrado. Facultad de Ingeniería. Universidad del Zulia. Metcalf & Hedí. 1996. Ingeniería de las Aguas Residuales. Tratamiento, Vertido y reutilización. Tomo I. McGraw-Hill. México. Pareja, C. 1993. Aislamiento, caracterización y preservación de cepas bacterianas degradadoras de petróleo. Diseño del proyecto de creación del centro de distribución de cepas bacterianas degradadoras de petróleo. Tesis de Postgrado. Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia. Scherer, E. 1996. Biodegradación de crudos y lodos petrolizados por Pseudomonas aeruginosas USB-CSI y cepas autóctonas. Facultad de Ingeniería. Universidad Simón Bolívar. Seeley, H. & Vandemark, P. 1973. Manual de Laboratorio para Microbiología. Microbios en acción. Editorial Blume. Barcelona. Venosa, A. 1990. Bioremediation treatability trials using nitrient application to enhance cleanup of oil contaminated shorline. In proceedings 83rd. Air and waste management Association Annual Meeting in Pittsburg.: 90-92 Westlake, D. 1993. Report on the application of biotecnology to the oil industry. A review of the microbiological activities relative to the oil industry prepared for INTEVEP and University of Zulia. Wrenn, B. 1993. Effects of nitrogen source on crude oil biodegradation. Journal of Industrial Microbiology. 13: 279-286 Young, L. & Gerniglia, C. 1995. Microbial Transformation and degradation of toxic organic chemicals. Willey-liss. New Jersey. USA.