“Botrytis en uva de mesa de exportación: PCR en Tiempo Real una innovadora herramienta tecnológica para la detección oportuna de resistencia a fungicidas. (Proyecto InnovaChile de CORFO, Código Innova: 07CN13IBM-14)

Marcela Esterio G., Ing. Agr. M.Sc. Jaime Auger S., Ing. Agr. Ph.D. Cecilia Ramos B., Ing. Agr. M. Sc. M. José Araneda R., Lic. Cs. Agr. Laboratorio de Fitopatología Frutal y Molecular Fac. de Ciencias Agronómicas UNIVERSIDAD DE CHILE En Chile Botrytis cinerea es el principal problema de índole fitopatológico que afecta a la uva de mesa de exportación, provocando en algunas temporadas importantes pérdidas las que se visualizan durante la poscosecha y al arribo a los mercados de destino de la producción. Su control comprende un manejo integrado de prácticas culturales y un control químico preventivo mediante el uso de botryticidas en los estadios más susceptibles a la infección: floración, envero y precosecha y, en poscosecha, mediante el uso de anhídrido sulfuroso. Sin embargo, aunque se realicen todas estás prácticas, muchas veces su control ha resultado no del todo satisfactorio (Esterio et al., 2006). Entre las principales factores que favorecen el desarrollo de pudriciones por botrytis se encuentran en primer lugar algunas características varietales que le otorgan en algunos casos una mayor susceptibilidad a la baya a la infección, tales como grosor de la cutícula de las bayas, presencia de compuestos fenólicos, arquitectura del racimo (racimos apretados); como también el uso de manejos culturales inadecuados de la canopia, fertilizaciones nitrogenadas no balanceadas, mantención de fuentes de inoculo potenciales al interior del racimo (restos florales), como en el parral (restos de material de poda y peciolos con esclerocios) y el desconocimiento de las características genéticas y fenotípicas de las poblaciones locales predominantes previo al diseño de los programas de control. En relación a esto último gran importancia tiene el efectuar monitoreos periódicos del nivel de sensibilidad de las poblaciones a los fungicidas actualmente disponibles en el mercado para su uso y que cuentan con registro en los principales mercados de destino, con el fin de optimizar el uso de los fungicidas y obtener un resultado final económicamente aceptable y medioambientalmente sustentable en el tiempo. En el presente artículo se presentan en forma resumida algunos aspectos básicos del conocimiento de Botrytis en uva de mesa (ciclo infectivo, poblaciones predominantes, botryticidas actualmente permitidos), niveles de sensibilidad a algunos de los fungicidas utilizados como base en los programas de control y los resultados obtenidos en el Proyecto InnovaChile de CORFO realizado durante los últimos tres años y que dice relación con el diagnóstico de resistencia a fungicidas de acción botryticida mediante la implementación de la técnica de PCR en Tiempo Real, disponible a nivel de usuario, a partir de esta temporada, para el análisis de la sensibilidad de botrytis a iprodione y fenhexamid.

Aspectos básicos de la biología de Botrytis en Vides La Pudrición Gris comúnmente conocida como “botrytis”, causada por el hongo Botrytis cinerea principal enfermedad que afecta a la vid en Chile, se caracteriza por provocar pudriciones o atizonamientos de las partes florales, brotes y bayas. Los períodos críticos de infección son floración y precosecha, desde envero a cosecha, coincidiendo con la disminución en las bayas de compuestos antifúngicos (ácido glicólico, taninos y fitoalexinas como el resveratrol).

Posterior a la floración el hongo permanecería sobre los restos florales contaminados, los cuales constituyen excelentes fuentes de inoculo para infecciones posteriores cuando las bayas adquieren mayor madurez (botrytis latente). Las infecciones al interior de las bayas ocurridas en floración se mantienen inactivas hasta que los compuestos antifúngicos disminuyen en las bayas, lo que generalmente ocurre desde envero en adelante (botrytis endógena). Como ya se ha mencionado en la introducción, el manejo de la enfermedad se basa en la combinación de ciertas prácticas culturales, tales como un buen arreglo del racimo (racimos apretados son siempre problemáticos de manejar), un manejo de la canopia que asegure una adecuada ventilación y luminosidad al interior del parronal, programas balanceados de fertilización, ... etc.), y junto a estas prácticas el uso de programas de control la aplicación de botryticidas durante los estadios fenológicos más susceptibles a la infección. Por otro lado es importante señalar que la zona de infección preferencial de botrytis en el racimo es variable según cultivar; en la mayoría de los cultivares la infección se ha encontrado más asociada a la zona de la base del receptáculo floral y a la caliptra (Thompson Seedless y Crimson Seedless), no así en Red Globe en donde las infecciones ocurren desde distintas zonas de la baya (Figura 1). Independientemente del programa fungicida de campo o precosecha, cuyo resultado se visualizará posterior al tiempo de almacenamiento refrigerado y/o transporte a mercado de destino, para permitir una mantención de la calidad de la uva después de la cosecha es indispensable el uso de SO2, ya sea como gasificaciones de pre o post-embalaje (gasificaciones en cámara o Dosigas), y como generadores del gas, cuyo objetivo fundamental es proteger la uva de procesos oxidativos, especialmente en lo que respecta a escobajos, e inhibir el desarrollo de infecciones de botrytis durante el almacenamiento refrigerado y transporte. Posteriormente, durante el receso invernal (ausencia de condiciones favorables), el hongo sobrevive formando esclerocios sobre sarmientos y pecíolos de vid, y también sobre malezas, y también en forma saprofítica como micelio en restos de tejidos vegetales en descomposición. Los esclerocios son estructuras de consistencia dura, ligeramente levantadas de color negro brillante, de forma y tamaño variables, constituyen la principal forma de supervivencia de este patógeno en el caso de la vid en Chile. No obstante esto, el hongo también puede mantenerse como micelio.

Poblaciones predominantes de B. cinerea La incorporación de herramientas biotecnológicas en el área de la fitopatología ha mostrado que los patógenos son poblaciones, compuestas por individuos de diversa variabilidad genética. Estás poblaciones son dinámicas, responden y se adaptan a las condiciones medioambientales. En la actualidad, la fitopatología moderna toma en cuenta la estructura de las poblaciones de patógenos de modo de tener una mejor comprensión del sistema patógeno – planta hospedera, permitiendo con ello elaborar estrategias más adecuadas de control. Así el estudio de poblaciones realizados en B. cinerea ha permitido obtener antecedentes que han cambiado la tradicional percepción que se tenía de este patógeno. A fines de la década del 90s los resultados obtenidos en estudios moleculares del hongo realizados en Francia señalaban a botrytis como a un complejo de dos especies solamente reconocibles mediante análisis moleculares y distinguibles entre sí en base a la presencia o no de dos secuencias génicas transponibles, los transposones Boty y Flipper (Diolez et al, 1994; Levis, et al., 1997). Con el fin de comprender la presencia de estas secuencias transponibles en botrytis y su implicancia en el desarrollo de infecciones en vides es importante señalar que éstas corresponden a segmentos de ADN que pueden saltar desde una posición del genoma a otra. La primera descripción de este tipo de elemento en un genoma vegetal se efectuó en maíz. Este tipo de elementos pueden encontrarse tanto en procariontes como eucariontes, y generalmente producen cambios genéticos espontáneos, produciendo con ello efectos en la biología y evolución de las especies.

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En vides, los aislados de botrytis que corresponden al genotipo transposa presentan ambos transposones y vacuma la ausencia de éstos. Posteriormente, se detectaron aislados del hongo que solo presentaban en su genoma una de estas secuencias, el genotipo boty, y el genotipo flipper. De estos 4 genotipos el que se encuentra más asociado a la vid y presente durante toda la fenología de la vid es el transposa, y se caracteriza por ser más estable y homogéneo, más asociado a infecciones en bayas y presentar un carácter más parasítico que el genotipo vacuma. Vacuma es menos estable, se asocia más a follaje, presenta un carácter más saprofítico y en Chile generalmente, se ha detectado asociado a plantas no sometidas a una alta presión de fungicidas. Boty, en cambio se presenta en menor proporción que los dos primeros pero se presenta preferentemente en plantas sometidas a una mayor presión de fungicidas (Esterio et al., 2007 a). Respecto a los aislados flipper, es importante señalar que en estudios recientes, aún no publicados, se ha detectado su presencia en proporción diferente según cultivares; en Thompson Seedless y Crimson Seedless mayor frecuencia de estos aislados en los periodos de floración y pre-envero (asociado a restos florales senescentes). Es importante también señalar que en estos cultivares se ha determinado que los niveles de infección presentes en floración se traducen en similares niveles finales a la cosecha; pero en Red Globe y en Sugraone, en los que niveles iniciales de infección en floración no se asocian directamente con niveles finales a cosecha, los aislados flipper se presentan solo en trazas y más desplazados hacia la cosecha (Auger et al, 2010). También se ha detectado que los genotipos presentarían niveles de virulencia diferenciales y algo variables según condición de infección; es así que en bayas no heridas a 20ºC transposa sensible a dicarboximidas y boty presentarían n niveles similares de virulencia, y vacuma levemente inferior a éstos, pero con herida los tres genotipos presentan una agresividad similar (Figura 2). En otros estudios además se ha determinado que transposa es el único genotipo en que no se afecta la capacidad de virulencia a 0º, diferenciándose significativamente de vacuma y boty (Esterio et al., 2006) (Figura 3). En relación a los aislados flipper, pruebas preliminares efectuadas sobre bayas cv. Thompson Seedless con y sin heridas, señalarían que son significativamente más virulentos que transposa a 20ºC, desconociéndose hasta el momento si presentarían o no igual agresividad a bajas temperaturas (Esterio, 2005; Auger et al., 2010). Por otro lado, además se ha determinado que los genotipos de botrytis presentarían una respuesta diferencial de sensibilidad a algunos botryticidas, por ejemplo sólo los aislados transposa y los flipper presentan algún nivel de resistencia a iprodione (dicarboximida), vacuma y boty se han comportado siempre sensibles a este fungicida (Giraud et al., 1999; Ramos y Salinas, 2003; Esterio, 2005). Por otro lado la resistencia natural a hydroxyanilidas sólo se presenta en aislados vacuma pertenecientes según marcadores moleculares (gen Bc-hch1) a Botrytis seudocinerea o Botrytis cinerea Grupo 1 (Fournier et al., 2005). Además se ha detectado también cambios en el comportamiento de sensibilidad de los genotipos de botrytis en zonas distintas; en Chile todos los aislados que han presentado resistencia adquirida a las hydroxyanilidas han correspondido a aislados transposa; en cambio en California (USA), los pocos aislados resistentes a hydroxyanilidas detectados han correspondido al tipo boty (Zhonghua y Michailides, 2005). En relación a anilinopyrimidinas (pyrimethanil, cyprodinil) y carboxamidas (boscalid), resultados parciales aún no indican un efecto diferencial muy marcado hacia un determinado genotipo (Esterio et al., 2006b). También, tanto en estudios efectuados en Francia en la zona de Champagne, como en la zona central de Chile, se ha podido establecer una cierta diferenciación genética ligada al hospedero; aislamientos provenientes de uva, tomate, kiwi y arándano se diferencian entre ellos, siendo mas similares los provenientes de un mismo hospedero (Muñoz et al., 2002). La variabilidad genética detectada en poblaciones del patógeno, podría ser una de las razones del porque iguales estrategias de control no otorgan idénticos resultados esperables. Para resolver esta problemática se hace necesario seguir estudiando esta temática con mayor profundidad de manera tal de conocer más a las poblaciones locales predominantes de botrytis y así lograr manejarlas más eficazmente.

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Botryticidas, niveles actuales de sensibilidad en Chile Los fungicidas y bactericidas son esenciales para una producción agrícola de calidad, libre de enfermedades tanto de pre como de poscosecha, y corresponden junto a las prácticas culturales a la principal forma de control de Botrytis en uva de mesa de exportación. En la actualidad los botryticidas que se encuentran disponibles en el mercado nacional para su uso en uva de mesa de exportación y con registro en los principales mercados de destino los siguientes fungicidas: hydroxyanilidas (fenhexamid), anilinopyrimidinas (cyprodinil y pyrimethanil), dicarboximidas (iprodione), carboxamidas (boscalid), estrobilurinas, phenylpirroles (fludioxonil) y algunos inhibidores de la biosíntesis del ergosterol como tebuconazole, algunas más que se encuentran en etapa de desarrollo, y otras que hasta el momento sólo se pueden utilizarse en viníferas (fluazinam). A estas deben adicionárseles las formulaciones en mezclas de activos tales como cyprodinil & fludioxonil, fenhexamid & tebuconazole, boscalid & pyraclostrobin, pyrimethanil & trifloxystrobin, las cuales inicialmente se introdujeron con la finalidad de evitar el desarrollo de resistencias específicas a algunas de la moléculas botryticidas base de los programas de control (anilinopyrimidinas, hydroxyanilidas, dicarboximidas y carboxamidas), pero que actualmente por las exigencias de los mercados de destino que limitan a 5 y en algunos casos a 4 el número máximo de activos residuales en la fruta, dificultan su uso. Finalmente, se cuenta con fungicidas alternativos como los orgánicos naturales formulados en base a extractos cítricos y los biológicos formulados en base a cepas mejoradas de Bacillus subtilis (Serenade) y de Trichoderma spp. (Trichonativa) Sin embargo, aún disponiéndose de esta amplia gama de alternativas fungicidas en el mercado, el control de botrytis sigue siendo dificultoso, y una de las principales razones de ello es el incremento de pérdidas de sensibilidad del patógeno a las moléculas fungicidas (Benzimidazoles, dicarboximidas, anilinopyrimidinas, hydroxyanilidas) y desarrollo de nuevas resistencias (resistencias del tipo multidroga), todas las cuales han sido gatilladas por un uso reiterativo de determinadas moléculas en épocas y dosis a veces inadecuadas, y por no considerar monitoreos de sensibilidad de las poblaciones locales a los fungicidas previo al diseño de los programas de control. Si se ordenara cronológicamente en el tiempo el desarrollo de resistencia de Botrytis cinerea a los fungicidas, a nivel mundial como en Chile esta comenzaría con los benzimidazoles (Leroux y Clerjeau, 1985), luego por la resistencia desarrollada al grupo de las dicarboximidas (Auger, 1981; Auger y Esterio, 1997; Carreño y Álvarez, 1990; Fourie y Holz, 1998; Johnson et al., 1994; Latorre et al., 1994), posteriormente con la resistencia detectada en anilinopyrimidinas (Latorre et al., 2002), y a hydroxyanilidas (Esterio et al., 2007b), y finalmente, terminaría con la recientemente detectada resistencia multidroga del grupo 1 (MDR1) la cual está estrechamente asociada con una pérdida en sensibilidad a phenylpirroles (fludioxonil) (Esterio et al., 2009), y con un incremento en algunas zonas (VI Región), de los niveles mínimos necesarios de IBES para controlar las poblaciones del patógeno (data aún no publicada).

Situación actual de sensibilidad de las poblaciones de Botrytis a algunas de las moléculas base de los programas de control Desde su detección a la fecha la resistencia a benzimidazoles se ha mantenido bastante estable, superando el 50 y 80% de frecuencia y más de aislados resistentes en poblaciones analizadas (V, VI y Región Metropolitana), comportamiento que difiere de lo recientemente reportado por Bertetti et al. (2008), quienes han detectado una recuperación de los niveles de sensibilidad a esta familia de fungicidas, en aislados de botrytis recuperados desde viñedos comerciales y experimentales localizados en el Nor-Oeste de Italia. En el caso de las dicarboximidas (iprodione), la primera referencia de pérdida en sensibilidad a esta familia de fungicidas en Chile data de 1989 (Carreño y Álvarez, 1990); se consideran aislados resistentes cuando presentan crecimiento miceliar a concentraciones iguales o superiores a 1ppm., y hasta el momento este fenómeno ha sido asociado a un único gen (bos1) (Leroux et al., 2002; Cui et al., 2002; Faretra y Pollastro, 1991. Se puede indicar que al igual que la resistencia a benzimidazoles, la resistencia a las dicarboximidas también se presenta

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ampliamente distribuida en las zonas productoras de uva de mesa y viníferas, y aunque generalmente las cepas resistentes a iprodione son menos estables que las resistentes a benzimidazoles, en algunos casos, incluso después de varias temporadas de no considerar la inclusión de iprodione en los programas de control, los niveles de resistencia se mantienen estables a través del tiempo (Figura 5). Por otro lado, aunque la frecuencia de los aislados resistente es alta (> 80%), la relación entre aislados resistentes respecto de los sensibles es baja (índice de resistencia (IR) 1ppm

Figura 5. Niveles promedios de sensibilidad a iprodione; frecuencia de aislados resistentes e índices de resistencia (IR) regionales en muestreos realizados en vides de mesa durante la temporada 2009 – 2010. En relación a las anilinopyrimidinas (cyprodinil y pyrimethanil), moléculas que afectarían la síntesis de metionina y otros aminoácidos y que previenen la secreción de enzimas hidrolíticas, que tienen un importante rol en la patogénesis del hongo (Williamson et al., 2007), la primera referencia de resistencia en Chile data de 2002 (Latorre et al., 2002). Sí bien este tipo de moléculas desde hace varios años se aplica en mezcla (cyprodinil + fludioxonil), con el fin de disminuir el riesgo de incrementos sostenidos en el tiempo de aislados resistentes a cyprodinil, los últimos resultados obtenidos sobre aislados recuperados en la temporada 2006 - 2007, (n=93) desde flores de vides Thompson Seedless y Crimson Seedless, señalan que la frecuencia de los aislados resistentes es bastante estable y superaba en esa temporada al 70%; además en la misma población la proporción de aislados resistentes respecto de los sensibles superaba con creces el índice de resistencia 100 (IR: 350). Según Walker, 2009, cuando la frecuencia de aislados resistentes al interior de una población supera el 50% y el índice de resistencia calculado a partir de los promedios de los aislados resistentes respecto de los sensibles, es mayor a 100, la pérdida de la sensibilidad al fungicida se asocia a pérdida de eficacia en campo. Por otro lado, los resultados obtenidos por Cáceres (2010), en la Región Metropolitana, señalarían que los niveles de sensibilidad a cyprodinil serían variables y estarían en estrecha relación con el número de aplicaciones realizadas de cyprodinil & fludioxonil durante la misma temporada y las precedentes. Con más de 2 aplicaciones por temporada, los niveles de cepas resistentes a cyprodinil superarían al 60 % del total de la población analizada. También, es importante señalar que no obstante se ha observado a nivel mundial pérdida en la eficacia a esta molécula, en Chile como su uso ha estado siempre asociado a fludioxonil (phenylpirrol), la pérdida en eficacia de la mezcla a nivel de campo no ha sido tan notoria.

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Con respecto a la pérdida de sensibilidad a fenhexamid (hydroxyanilida), se consideran aislados resistentes cuando el crecimiento miceliar no se inhibe a concentraciones mayores o iguales a 2 ppm del fungicida. Este fungicida es altamente específico en el control de Botrytis cinerea, y los primeros aislados resistentes fueron detectados en Chile en 2006 (Esterio et al., 2007b); la resistencia a fenhexamid en el hongo se encuentra asociada a mutaciones en el gen erg27 que codifica para la enzima 3-keto reductasa (Debieu et al., 2001; Albertini y Leroux, 2004; Fillinger et al., 2008). Aunque los niveles actuales de resistencia a este fungicida en las zonas productoras de uva de mesa han ido aumentando durante las últimas temporadas, la frecuencia e índices de resistencia calculados por el momento no implicarían una pérdida de eficacia a nivel de campo (Figura 5)

Frecuencia de R (%)

EC50 aislados resistentes fenhexamid (crec. miceliar) > 0,2 ppm

Figura 5. Niveles promedios de sensibilidad a fenhexamid; frecuencia de aislados resistentes e índices de resistencia regionales en muestreos realizados en vides de mesa durante la temporada 2009 – 2010. En el caso de la resistencia detectada en las poblaciones locales de botrytis a anilinopyrimidinas (cyprodinil y pyrimethanil) e hydroxyanilidas (fenhexamid), el desarrollo de pérdida en sensibilidad ha sido generalmente consecuencia de programas inadecuados de control o a un excesivo número de aplicaciones en precosecha, respectivamente. En relación a resistencia a fungicidas, lo último que se ha detectado en Chile y de manera totalmente al azar, ha correspondido a la resistencia multidroga fenotipo 1 (MDR1), este tipo de resistencia esta asociada a pérdida en sensibilidad hacia phenylpirroles (fludioxonil), resistencia leve a moderada a anilinopyrimidinas y a dicarboximidas y una alta sensibilidad a hydroxyanilidas (Esterio et al., 2009). Al respecto es importante señalar que la resistencia multidroga esta asociada a una sobrexpresión de ciertas proteínas de membrana del hongo que permiten detoxificar y / o impedir el ingreso de moléculas externas y entre éstas los fungicidas, produciendo con ello un efecto de menor dosis y en los aislados del hongo un nivel de resistencia leve a moderada a moléculas fungicidas no relacionadas. En el país, en un estudio actualmente en ejecución, se ha detectado una mayor frecuencia de aislados MDR1, en la VI Región, lo cual concuerda con los programas de control más intensivos a los que son sometidas las poblaciones del hongo por las condiciones climáticas imperantes que favorecen el desarrollo de infecciones por botrytis (Pablo Cid, Tesis de Magíster, U. de Chile). Es importante, sin embargo, destacar que para evitar este tipo de resistencia, la que ha sido gatillada por una excesiva presión de aplicación de fungicidas de distinto modo de acción “estrategia anti-resistencia específica”, y por un desconocimiento de la

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constitución de las poblaciones predominantes del patógeno y sus niveles de sensibilidad, es importante considerar como una práctica habitual en el manejo fitosanitario del predio, el realizar monitoreos periódicos del nivel de sensibilidad de las poblaciones locales del hongo a las moléculas base en el control de botrytis en Chile. Al conocer en forma oportuna esta información se podrían detectar tempranamente los cambios en el comportamiento de las poblaciones, y en el caso de la resistencia multidroga evaluar el efecto incremento de dosis a aplicar. Monitoreos de sensibilidad a fungicidas, una excelente herramienta de ayuda en el diseño de programas efectivos de control de Botrytis Como ya se ha indicado, debido a la gran variabilidad genética y fenotípica que presenta el patógeno, para controlar las infecciones por botrytis en uva de mesa como en otros cultivos, se debe necesariamente conocer la composición de las poblaciones predominantes del hongo a nivel local (predial), y una vez determinados sus principales caracteres (genotipos y niveles de sensibilidad), diseñar los programas de control considerando en éstos a los fungicidas que presenten la mayor sensibilidad a las poblaciones locales, teniendo también en cuenta, las exigencias impuestas por los mercados recibidores de la fruta (límites máximos de residuos y número de activos residuales totales permitidos). Desafortunadamente, las técnicas convencionalmente utilizadas con este propósito (comportamiento del crecimiento miceliar, germinación conidial y elongación del tubo germinativo del patógeno, como otras pruebas in vivo (virulencia en frutos u hojas)), presentan algunos inconvenientes: son demorosas, ya que requieren la realización de una serie de etapas (recuperación de aislados, incremento en condiciones puras, someter a estudio en condiciones controladas y medios específicos = 2 – 3 semanas), no obteniéndose los resultados en forma oportuna, y evaluándose solo un número limitado de aislados por unidad de tiempo que pueden no representar de manera real la situación de sensibilidad del cuartel o predio determinado (universo muestral por cuartel de 5 ha no debe ser inferior a 20 o 25 aislados).

Diagnóstico de resistencia a iprodione y fenhexamid mediante PCR-Tiempo Real. En la actualidad, en algunas moléculas fungicidas en las que cambios en la sensibilidad están asociados a cambios genéticos (mutaciones en posiciones específicas de genes), como es el caso de iprodione y fenhexamid, los avances obtenidos en los últimos años en biología molecular han permitido desarrollar métodos de detección confiables y rápidos de los genotipos resistentes, al basarse la determinación en los cambios moleculares generados en el microorganismo frente a excesivas exposiciones a determinadas moléculas. En esta línea de trabajo el Laboratorio de Fitopatología Frutal y Molecular de la Universidad de Chile en el marco del proyecto InnovaChile de CORFO: “Diagnóstico de resistencia a fungicidas de acción botryticida mediante la implementación de técnicas moleculares”, desarrollado durante los últimos tres años y del cual FEDEFRUTA F.G. fue una de las entidades asociadas, implementó la técnica molecular PCR-Tiempo Real para el diagnóstico de de sensibilidad a dos moléculas fungicidas: iprodione y fenhexamid. Para desarrollar la técnica de PCR en Tiempo Real fue necesario primero prospectar aislados de distinto nivel de sensibilidad a ambos fungicidas en al menos tres zonas-predios por dos temporadas, caracterizarlos genética y fenotípicamente (determinaciones de los niveles de sensibilidad según técnicas convencionales; pruebas de virulencia, niveles de esporulación y capacidad formadora de esclerocios, entre otras ...). Posteriormente los aislados de botrytis virulentos ya categorizados como sensibles, resistentes y altamente resistentes fueron secuenciados, determinándose la ausencia y presencia respectivamente, de los cambios en las secuencias génicas ya reportados tanto para aislados resistentes a iprodione como los descritos para fenhexamid. En ambos casos se detectaron también nuevas mutaciones no reportadas antes a nivel mundial y cuya implicancia en el comportamiento de los aislados está actualmente en estudio.

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Utilizándose las diferencias genéticas detectadas en los aislados de botrytis resistentes a iprodione y fenhexamid, se diseñaron partidores y sondas específicas para cada una de las moléculas y nivel de sensibilidad de los aislados (sensibles y resistentes) las cuales en una reacción de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) en presencia de ADN muestra de botrytis, permiten detectar y diferenciar los aislados resistentes de los sensibles. Actualmente el tiempo de reacción de la técnica implementada, a partir de micelio del hongo, es de 1 hora 40 minutos, y su respuesta de sensibilidad en la detección de aislados de B. cinerea resistentes y sensibles a iprodione como a fenhexanid en base a la presencia de los cambios genéticos asociados al desarrollo de resistencia en el hongo es cercana al 100%. Es importante señalar que la técnica molecular de PCR en Tiempo Real implementada es una herramienta de diagnóstico confiable y de más rápida respuesta que las técnicas convencionales. Por otro lado, la estimación de riesgo de resistencia en forma oportuna, permitirá al productor-exportador diseñar las estrategias de control según las poblaciones locales predominantes, y de esta forma se optimizará el uso de los fungicidas de manera real y efectiva (menores pérdidas por pudriciones de Botrytis). Finalmente, esta innovación tecnológica se traducirá en una rentabilidad más sustentable de la producción de uva de mesa de exportación a través del tiempo.

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Auger - Esterio, 2005

Auger - Esterio 2005 Figura 1. Bayas con Botrytis: A) Red Globe: diversos puntos de infección y B) Thompson Seedless, infecciones generalmente asociadas a la unión baya-pedicelo.

A 4

5

t v

2

1

Diámetro de la lesión (mm)

Diámetro de la lesión (mm)

b 3

Virulencia diferencial Genotipos Botrytis sobre bayas Thompson Seedless con heridas a 20ºC

B

Virulencia diferencial Genotipos Botrytis sobre bayas Thompson Seedless sin heridas a 20ºC

t b

4

v

3 2 1 0

0

t

b

v

t

b

v

Figura 2. Virulencia diferencial de Botrytis cinerea presentada según genotipo y condición de sensibilidad a dicarboximidas (iprodione) en bayas Thompson Seedless inoculadas sin y con herida (A y B, respectivamente), incubadas a 20ºC ( = transposa sensible a 10 ppm de iprodione ( = genotipo boty y = vacuma). (Esterio et al., Aconex, 92: 17-24, 2006)

Nivel de Virulencia (%)

30 25

a

20 bc

b 15

bc c

10 d 5 0

0°C transposa

18°C boty

vacuma

Figura 3. Virulencia diferencial de Botrytis cinerea presentada según genotipo (transposa, boty y vacuma sensibles a iprodione), en bayas Thompson Seedless, inoculadas sin herida e incubadas a 0 y 18ºC. (Esterio, 2005).