CAPÍTULO 2.5.5.

GRIPE EQUINA

RESUMEN La gripe o influenza equina es una enfermedad respiratoria aguda causada por dos subtipos distintos del virus de la influenza A (el H7N7, antes llamado equi–1, y el H3N8, antes llamado equí–2) dentro del género Influenzavirus A de la familia Ortomixoviridae. En animales muy susceptibles, los síntomas clínicos incluyen fiebre y una tos seca y dolorosa seguida de descarga nasal mucopurulenta. En animales vacunados con inmunidad parcial, puede estar ausente uno o más de estos síntomas. Normalmente, la gripe se extiende rápidamente en una población susceptible. El diagnóstico de las infecciones por el virus de la gripe se basa en el aislamiento del virus de caballos con la enfermedad respiratoria aguda, o en la detección de una respuesta serológica a la infección. Lo ideal es utilizar ambos métodos. También se puede demostrar la infección detectando el antígeno vírico en las secreciones respiratorias mediante un enzimoinmunoensayo. Se puede reducir la extensión de la infección y la gravedad de la enfermedad utilizando vacunas potentes inactivadas contra el virus de la gripe que contengan cepas del virus que sean relevantes desde el punto de vista epidemiológico. Identificación del agente: Para el aislamiento de los virus a partir de frotis nasofaríngeos o de lavados nasales y traqueales se pueden utilizar huevos embrionados de gallina y/o cultivos celulares. El crecimiento vírico se sigue mediante el uso de eritrocitos de pollo o cobaya por hemoaglutinación (HA) o, en cultivos celulares, por hemoadsorción (HAD). Los aislados se pueden caracterizar por inhibición de la hemoaglutinación (HI) utilizando antisueros específicos contra la cepa. Los aislados deben enviarse de inmediato a un Laboratorio Internacional de Referencia (OIE u Organización Mundial de la Salud). Las muestras que den resultados negativos deben ser re-cultivadas; se pueden necesitar hasta cinco pases para aislar los virus de caballos vacunados. Pruebas serológicas: El diagnóstico de las infecciones por el virus de la gripe se suele realizar solo por pruebas en sueros pareados; la primera muestra debe tomarse lo más pronto posible después de la aparición de los síntomas clínicos y la segunda unas dos semanas más tarde. Los títulos de anticuerpo se determinan por HI o por hemolisis radial simple (SRH). Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las vacunas inactivadas contra la gripe equina contienen virus completos o sus subunidades. Los virus vacunales se propagan en huevos embrionados de gallina o en cultivo de tejidos, se concentran, y se purifican antes de la inactivación con agentes como formalina o beta–propiolactona. Las vacunas confieren protección induciendo anticuerpos humorales contra la HA. Por lo general las respuestas son de corta duración y se requieren múltiples dosis para mantener un nivel protector de anticuerpos. Por lo general se necesita un adyuvante para estimular niveles protectores de anticuerpo de mayor duración. Recientemente, se ha autorizado en algunos países una vacuna viva atenuada. Las vacunas contra la gripe están muy extendidas y son de uso rutinario en caballos de competición en Europa, América y Asia. En algunos países la vacunación es obligatoria para caballos deportivos que compiten bajo reglas de organizaciones ecuestres. Las vacunas no son muy usadas en el subcontinente de la India, ni en China o Australia, y ésta última región, junto con Nueva Zelanda, ha permanecido libre de la infección. Después de un proceso inicial de tres dosis a intervalos de 0, 1 y 6 meses, el requisito mínimo es una dosis anual de refuerzo. En algunas regiones, se repiten las vacunaciones cada 3–6 meses. Los potros no deben ser vacunados si presentan anticuerpos maternos. Las vacunas han tenido mucho éxito para evitar la infección con los virus H7N7, pero durante los brotes de infección por H3N8 ocurren con frecuencia casos de fallos en la vacunación. Esto se ha

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atribuido a una potencia inadecuada de la vacuna, a calendarios de vacunación poco apropiados, y a vacunas que han quedado atrasadas por contener virus que son irrelevantes como consecuencia de la deriva antigénica. Se ha desarrollado una prueba mejorada de potencia in vitro (difusión radial simple) que puede utilizarse para ensayo interno del producto antes de la adición del adyuvante. Se han identificado los niveles de anticuerpos necesarios para la protección de los caballos. Está en marcha un programa de vigilancia para controlar la deriva antigénica de los virus de la gripe equina y para disponer de información sobre la selección de cepas para vacunas.

A. INTRODUCCIÓN La gripe o influenza equina está causada por dos subtipos: H7N/ (antes subtipo 1) y H3N8 (antes subtipo 2) del virus de la influenza A (género Influenzavirus A de la familia Ortomyxoviridae). Aunque no son patógenos humanos genuinos, el hombre puede infectarse con los subtipos de virus de la influenza equina. Tales infecciones son raras y subclínicas, pero pueden representar un riesgo biológico potencial para el personal del laboratorio. En animales muy susceptibles, los síntomas clínicos incluyen fiebre y una tos seca y dolorosa seguida de descarga nasal mucopurulenta. En animales vacunados con inmunidad parcial, uno o más de estos síntomas puede estar ausente. Normalmente, la gripe se extiende rápidamente en una población susceptible. El diagnóstico de las infecciones por el virus de la gripe se basa en el aislamiento del virus de caballos con la enfermedad respiratoria aguda, o en la detección de una respuesta serológica a la infección. Lo ideal es utilizar ambos métodos. También se puede demostrar la infección detectando el antígeno vírico en las secreciones respiratorias mediante un enzimoinmunoensayo (ELISA).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Todos los virus de la gripe son muy infecciosos para los hospedadores susceptibles, incluyendo los huevos embrionados de gallina y los cultivos celulares. Por tanto, se debe tener cuidado en evitar la contaminación accidental cruzada durante la manipulación de huevos o cultivos infectados (21). En el laboratorio de diagnóstico no se deben propagar las cepas estándar, al menos nunca de modo simultáneo o en el mismo lugar donde se procesan las muestras para diagnóstico. Todas las áreas de trabajo deben desinfectarse de forma eficaz antes y después de la manipulación de virus, lo que debería realizarse con preferencia en zonas de contención de riesgos biológicos. Es importante obtener muestras lo más pronto posible después de la aparición de los síntomas clínicos. Estas muestras incluyen frotis nasofaríngeos y lavados nasales o traqueales, los últimos, tomados por endoscopia. Los frotis se realizan con una esponja absorbente de lana de algodón en un alambre y debe ser pasada por el meato ventral hasta la nasofaringe, donde se mantiene durante cerca de 1 minuto para absorber las secreciones respiratorias. Inmediatamente después, los frotis deben pasarse a un vial con medio de transporte. Este medio está formado por solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 40% de glicerol, o por PBS que contiene 2% de caldo de triptosa con fosfato, 2% de una solución de antibióticos (penicilina [10.000 unidades], estreptomicina [10.000 unidades], en agua destilada estéril[100 ml], y 2% de fungizona (250 mg/ml en stock). Si las muestras se van a inocular en 1–2 días, se pueden mantener a 4°C, pero si se mantienen por más tiempo deben almacenarse a –70°C o menos. Las muestras deben transportarse preferentemente en hielo. Se procesa una muestra cada vez. El líquido se extrae de la torunda de raspado (frotis) , que luego se elimina de modo adecuado. Si la muestra parece estar muy contaminada, se pueden añadir más antibióticos. El líquido extraído se guarda a –70°C. Las muestras con antibióticos se dejan en hielo 30 minutos y luego se centrifugan a 1.500 g durante 15 minutos para eliminar las bacterias y los restos; para la inoculación se utilizan los sobrenadantes. No es aconsejable filtrar las muestras, ya que el virus de la gripe se puede adsorber al filtro y se pierde de la muestra.

1.

Identificación del agente

El aislamiento de virus infeccioso se puede hacer en huevos embrionados de gallina o en cultivos celulares. Tradicionalmente, para el aislamiento del virus de la gripe equina, se han preferido los huevos. Una comparación de virus H3N8 aislados en huevos y en células Madin–Darby de riñón canino (MDCK) indicó que las células MDCK son capaces de seleccionar variantes del virus que no son representativas del virus predominante en las muestras clínicas (6). Sin embargo, en los últimos años se han aislado con éxito algunos virus en células MDCK pero no en huevos, y ha ocurrido una selección de variantes debida al cultivo en huevos (18). Por consiguiente, debe intentarse el aislamiento en los dos substratos. Recientemente, se han descrito técnicas de reacción en

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cadena de la polimerasa para la identificación de virus de la gripe equina en muestras clínicas y para epidemiología molecular (4, 8, 18).

a)

Huevos embrionados de gallina Se colocan los huevos fértiles en un incubador con humedad a 37–38°C y se invierten dos veces diariamente; a los 10–12 días se examinan mediante observación con la ayuda de un foco de luz a través. Solo se seleccionan para uso los huevos con embriones vivos. Se limpia con alcohol el área por encima del saco aéreo y se perfora la cáscara con un pequeño agujero. Se inoculan (0,1 ml) tres huevos por muestra en la cavidad amniótica. Se retira la aguja aproximadamente 1 cm y se inoculan otros 0,1 ml en la cavidad alantoidea. Alternativamente, la muestra se puede inocular solo en la cavidad alantoidea. El agujero se sella con cera o con cinta adhesiva, y los huevos se incuban a 34–35°C durante 2–3 días. A continuación, los huevos se pasan a 4°C durante 4 horas o toda la noche para matar el embrión y reducir la hemorragia en la recogida. Las cáscaras se desinfectan y se recoge el líquido amniótico y el alantoideo con una pipeta, manteniendo separada cada recogida. Éstas se prueban para actividad hemoaglutinante (HA) mezclándolas, en placas para microtitulación de fondo en V o en U, a partes iguales (0,025 ml) con eritrocitos de pollo (RBCs) (0.5% [v/v] de células empaquetadas en PBS) o con eritrocitos de cobaya (0,4% [v/v] de células empaquetadas en PBS). Si se utilizan RBCs de pollo las placas pueden leerse inclinándolas 70° de modo que las células no aglutinadas “corran” al fondo del pocillo. Las células no aglutinadas de cobaya forman un botón en la parte inferior del pocillo y la sedimentación puede llevar más tiempo. Si no hay actividad HA, se juntan alícuotas de cada recogida y se pasan por otros huevos. Todas las muestras positivas para HA se dividen en alícuotas y se guardan a –70°C; una de ellas se titula inmediatamente por HA. Si el título es de 1/16 o más, el aislamiento se caracteriza de inmediato. Si la titulación es baja, las muestras positivas deben sufrir otro pase. Debe tenerse cuidado en evitar la generación de partículas defectivas que desarrollen interferencia mediante una predilución del inóculo, 1/10, 1/100, 1/1.000. Las muestras positivas que deriven de la dilución más alta deben seleccionarse como stock de almacenamiento. Puede ser necesario realizar hasta cinco pases para aislar en virus, particularmente en el caso de caballos vacunados. Si el virus no se recoge al quinto pase, es improbable que pases posteriores resulten eficaces.

b)

Cultivos celulares Para aislar los virus de la gripe equina se pueden utilizar cultivos de la línea celular MDCK (MDCK, ATCC CCL34). Las células se crecen en tubo hasta confluencia y luego se infectan por triplicado con 0,25–0,50 ml de cada muestra, procesada como se ha descrito anteriormente. Los cultivos se mantienen en medio sin suero que contenga 0,5–2 µg/ml de tripsina (tratada con TPCK [L–1–tosilamina–2–feniletil clorometil cetona] para eliminar la quimotripsina, o comprada en forma pretratada, por ejemplo, de Sigma), y se examinan diariamente para poner de manifiesto el efecto citopático (ECP). Si son positivas, o en cualquier caso después de 7 días, los sobrenadantes se prueban para HA. Los líquidos con títulos > 1/16 se caracterizan inmediatamente. Los negativos, y aquellos con título < 1/16 se someten a otros pases, hasta un total de cinco. Alternativamente, las células se analizan en cuanto a hemoadsorción (HAD). Este procedimiento detecta la expresión de antígenos víricos en la superficie celular. El medio se extrae de los cultivos y los tubos se lavan con PBS. Se añaden una o dos gotas de una suspensión de RBCs de pollo o cobaya al 50%, se rotan los tubos con cuidado, y se mantienen a 22°C (+ 2°C) por 30 minutos. Los RBCs no unidos se eliminan con lavados con PBS, y se examinan los cultivos microscópicamente para poner de manifiesto la HAD.

c)

Hemoaglutinina La mejor manera de determinar el subtipo HA de aislados nuevos de virus de la gripe equina es la inhibición de la hemoaglutinación (HI; Sección B.2.a) utilizando antisueros específicos contra H7N7 y H3N8. Los aislados se pueden tratar primero con Tween 80/éter, que destruye la infectividad viral y reduce el riego de contaminación cruzada. En el caso particular de los virus H3N8, este tratamiento aumenta la actividad HA (7). Sin embargo, el tratamiento con Tween 80/éter puede aumentar la variabilidad de los resultados obtenidos. Se deben titular en paralelo antígenos estándar con pruebas para identificar virus y se deberían incluir las cepas H7N7 (por ejemplo, A/eq/Praga/56, A/eq/Newmarket/77) y las cepas H3N8 (por ejemplo, A/eq/Miami/63, A/Eq/Fonainebleau/79, A/eq/Newmarket/2/93 y A/eq/Kentucky/94). Las cepas de virus se pueden obtener de Laboratorios de Referencia de la OIE (ver el Cuadro indicado en la Parte 3 de este Manual). Además, se deberían incluir aislados recientes de la misma área geográfica, si existen disponibles. Los antígenos estándares deben tratarse con Tween 80/éter para evitar contaminaciones cruzadas. Las pruebas con antígenos y con antígenos estándar son siempre tituladas de principio para confirmar su contenido antigénico. Los nuevos aislamientos de virus de gripe equina se pueden caracterizar mejor mediante HI utilizando antisueros específicos de cepa. Las especies en las que se obtienen los anticuerpos influenciará la

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reactividad cruzada del antisuero, siendo los hurones los que suministran los anticuerpos específicos en la mayor parte de las cepas (11). Todos los aislados deben enviarse inmediatamente a un Laboratorio Internacional de Referencia designado por la OIE o por la Organización Mundial de la Salud (OMS) para su inclusión en el programa de vigilancia de cepas que controla la deriva antigénica y la emergencia de nuevos virus.

d)

Neuraminidasa La tipificación de la neuraminidasa requiere anticuerpos específicos y no existe una técnica rutinaria. Por tanto, tal tipificación se realiza mejor en laboratorios de referencia.

e)

Detección de antígeno vírico por enzimoinmunoensayo En situaciones en que no existen servicios de laboratorio disponibles para aislar virus, se puede detectar directamente el antígeno del virus de la gripe en las secreciones nasales por un método ELISA de captura del antígeno para el virus H3N8 que emplea un anticuerpo monoclonal (MAb) contra la nucleoproteína (2, 9). Se pueden obtener los reactivos de la OIE (ver el Cuadro que aparece en la Parte 3 de este Manual). Se dispone de preparaciones comercializadas completas para detectar la gripe humana y se ha demostrado que presentan reacción cruzada con la gripe equina (1). Este enfoque permite un resultado rápido sobre el que tomar decisiones de control. No debe utilizarse con preferencia al aislamiento del virus, ya que es esencial el aislamiento de nuevos virus y su envío a laboratorios de referencia para su caracterización como parte del programa de vigilancia para controlar la deriva antigénica y la aparición de nuevos virus y para disponer de aislados e incluirlos en vacunas actualizadas. Los resultados positivos del ELISA son útiles en la selección de muestras si los recursos son limitados o si se deben enviar las muestras a un laboratorio de referencia para intentar el aislamiento del virus.

2.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Depositar 100 µl/pocillo del extracto de frotis nasal por triplicado en pocillos de microtiras recubiertos con anticuerpo policlonal de conejo anti–H3N8, e incubar durante 90 minutos a 22°C (+ 2°C). Lavar las microtiras tres veces con PBS que contenga 0,05% (v/v) de Tween 20 (PBST).

ii)

Añadir 100 µl/pocillo de MAb conjugado con peroxidasa de rábano diluido 1/150 en tampón de dilución e incubar 1 hora a 37°C. Lavar las microtiras seis veces con PBST.

iii)

Añadir 100 µl/pocillo de tetrametil benzidina e incubar 10 minutos a 22°C (+ 2°C). detener la reacción añadiendo 100 µl/pocillo de ácido sulfúrico 0,18 M, y medir la absorbancia a 450 nm.

Pruebas serológicas

Las infecciones se pueden detectar mediante pruebas serológicas con sueros pareados para demostrar un aumento en el título de anticuerpos. Estas pruebas se deben realizar tanto si se ha intentado, como si no, el aislamiento del virus. Existen dos métodos sencillos, la IH y la hemolisis radial simple (SRH), cada uno igualmente eficaz y de amplio uso. También se puede aplicar la prueba de fijación de complemento (FC), pero no es de uso general. Las muestras de ambos sueros pareados deben probarse juntas al mismo tiempo para minimizar la variabilidad. Los antígenos estándares se han descrito anteriormente (Sección B.1.c.). Se deberían incluir aislados de casos recientes, si estuvieran disponibles. En el Laboratorio de Referencia de la OIE, en Mewmarket (ver Cuadro de la Parte 3 de este Manual) se dispone de antisueros equinos liofilizados contra A/eq/Newmarkrt/77 (H7N7), A/eq/Newmarket/1/93 (H3N8 "Americano) y A/eq/Newmarket/2/93 (H3N8 "Europeo") y de un suero equino negativo para la gripe. Estos sueros tienen designación de valor SRH en estudios de colaboración internacional y se pueden utilizar como sueros de referencia en este ensayo.

a)

Prueba de la inhibición de la hemoaglutinación Para incrementar la sensibilidad de la prueba se trata primero el antígeno con Tween 80/éter, en particular para virus H3N8. Esta prueba se realiza mejor en placas de microtitulación con un equipo adecuado de dilución. Se puede utilizar una macroprueba, donde el antígeno se diluye a un título final de HA de 1/8 por pocillo y los volúmenes de PBS, sueros y antígeno son 0.5 ml. Los sueros se pretratan para eliminar hemoaglutininas no específicas y se inactivan a 56°C durante 30 minutos. Los pretratamientos incluyen la utilización de alguno de los siguientes procedimientos: (a) adsorción por caolín y eritrocitos, (b) periodato potásico, o (c) enzima de Vibrio cholerae destructor de receptores. Los tres procesos dan resultados similares. Los sueros tratados se diluyen con PBS, se añade una dosis estándar de antígeno (título HA de 1/4 por pocillo en el ensayo de microtitulación) y éstos se mantienen a 22°C (+ 2°C) durante 30 minutos. Después de mezclar ligeramente, se añaden eritrocitos y la prueba se lee a los 30 minutos. Los títulos HI

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son la dilución más alta de suero que produce una inhibición completa de la hemoaglutinación. Se pueden utilizar eritrocitos de pollo (1% [v/v] de células empaquetadas) en placas de microtitulación con pocillos de fondo en V, o eritrocito s de cobaya (0.5% [v/v] de células empaquetadas) en placas con pocillos de fondo en V o en U. Si se utilizan eritrocitos de pollo, las placas pueden leerse inclinándolas 70° de modo que las células no aglutinadas “corran” al fondo del pocillo. Las células no aglutinadas de cobaya forman un botón en la parte inferior del pocillo y la sedimentación puede llevar más tiempo. Los aumentos de cuatro veces o más en el título entre sueros pareados indican una infección reciente (21).

a)

•

Tratamiento del virus con Tween 80/éter

i)

Se añaden 0.5 ml de una suspensión de Tween 80 al 10% (v/v) en PBS a 40 ml de líquido alantoideo infectivo, para dar una concentración de Tween 80 del 0,125% (v/v).

ii)

Se mezcla ligeramente a temperatura ambiente durante 5 minutos y luego se añaden 20 ml de dietil éter para dar una concentración final del 33,3% por volumen, mezclando bien la suspensión a 4°C durante 15 minutos.

iii)

Después de dejar que se separen las capas en reposo, se extrae la capa acuosa que contiene las partículas virales rotas y se lleva a una botella de vidrio con el tapón flojo para permitir que el exceso de éter se evapore durante una noche (9).

iv)

El virus tratado se guarda en alícuotas a –70°C.

•

Titulación de la hemoaglutinación

i)

Añadir 25 µl de PBS a todos los pocillos de una fila de una placa de microtitulación.

ii)

Añadir 25 µl de virus al primer pocillo (dilución = 1/2) y titular seguidamente, dejando como control el último pocillo.

iii)

Añadir otros 25 µl de PBS a todos los pocillos.

iv)

Añadir 50 µl de eritrocitos a todos los pocillos. Dejar a 22°C (+ 2°C) durante 30 minutos. El título HA es la última dilución de virus que produce HA parcial.

•

Pretratamiento de sueros

i)

Mezclar un volumen de suero (150 µl) con dos volúmenes (300 µl) de 0.016 M de periodato potásico recién preparado (0,38 g en 100 ml de PBS), y dejar a 22°C (+ 2°C) durante 15 minutos.

ii)

Añadir un volumen de glicerol al 3% en PBS para neutralizar el exceso de solución de periodato, mezclar y dejar a 22°C (+ 2°C) durante 15 minutos.

iii)

Inactivar en un baño a 56°C durante 30 minutos

•

Procedimiento de la prueba

i)

Depositar 25 µl de PBS en todos los pocillos de una placa de microtitulación.

ii)

Añadir suero (25 µl) al primer pocillo de una fila de 12, y titular seguidamente, dejando el último pocillo como un control (1/8 a 1/512, a partir de la dilución 1/4 del tratamiento del suero).

iii)

Diluir el antígeno para dar una dosis de 4 unidades HA (4 x dosis aglutinante mínima, es decir, título/4).

iv)

Añadir 25 µl a cada pocillo e incubar a 22°C (+ 2°C) durante 30 minutos.

v)

Añadir 50 µl de eritrocitos a cada pocillo. Dejar a 22°C (+ 2°C) durante 30 minutos.

vi)

Las placas pueden leerse inclinándolas 70° de modo que las células no aglutinadas “corran” al fondo del pocillo. La falta de aglutinación se considera como un resultado positivo.

Hemolisis radial simple En esta prueba, los antígenos víricos se acoplan con eritrocitos fijados que se suspenden en agarosa que contiene complemento de cobaya (C´). Los pocillos se forman en la agarosa y se llenan con los sueros de ensayo. Los anticuerpos contra la gripe y el C´ lisan los RBCs recubiertos de antígeno, originando una zona

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hemolítica clara alrededor del pocillo; el tamaño de esta zona es directamente proporcional al nivel de anticuerpo específico contra la cepa en la muestra de suero (10, 19, 20). Para el ensayo se pueden utilizar placas especiales de inmunodifusión (Hyland, Miles Scientific), pero también son adecuadas las placas de Petri. Los eritrocitos de oveja recogidos en solución de Alsever se lavan tres veces. El C´ se puede obtener comercialmente, o se puede utilizar suero normal de cobaya. Los antígenos son líquidos alantoideos o preparaciones purificadas; las cepas usadas son las mismas que para las pruebas HI. Los virus se acoplan a los RBCs con periodato potásico o con cloruro crómico. Las preparaciones acopladas de antígeno/RBCs se mezclan con C´, junto con una solución de agarosa al 1% (de grado de fusión bajo) en PBS. Debe cuidarse que la temperatura no exceda de 42°C en ningún caso. La mezcla se vierte en placas y se dejan toda la noche a 4°C. Se perforan en la agarosa solidificada pocillos de 3 mm de diámetro separados durante 12 mm, por lo menos a 6 mm del borde de la placa. Estas placas se pueden guardar a 4°C por 12 semanas. Las placas se preparan para cada antígeno y se prueban previamente con antisueros positivos y negativos. Los sueros se inactivan a 56°C durante 30 minutos, pero no es necesario más tratamiento. Los sueros pareados deben ensayarse por duplicado en la misma placa. Como mínimo, debería incluirse un antisuero específico de subtipo como un control de suero en un pocillo de cada placa. Todos los sueros se ensayan en una placa control que contenga todos los componentes excepto virus para controlar la lisis inespecífica. Alternativamente, se puede utilizar en la placa control un virus no relacionado, tal como el A/PR/8/34 (H1N1). Los sueros que muestran actividad hemolítica con eritrocitos de oveja deben someterse a pre-absorción con eritrocitos de oveja. Las zonas de lisis deben ser claras y no difusas o traslúcidas. Se deben medir todas las zonas claras y calcular las áreas de hemolisis. •

Preparación de reactivos

i)

Solución salina/HEPES: 0,85% de NaCl (4.25 g/500 ml); 0.05 M de HEPES (N–2–hidroxietilpiperazina, N–2–ácido etanosulfónico; 5,95 g/500 ml); y 0,02% de azida sódica. Ajustar a pH 6.5 con NaOH.

ii)

Solución salina/HEPES/BSA: como la solución salina/HEPES con 0,2% (p/v) de seroalbúmina bovina (BSA).

iii)

Solución base de CrCl3 (2,25 M) 6 g/10 ml: Para cada ensayo hacer una dilución fresca 1/400 en 0,85% de NaCl.

iv)

PBS (London)/PBS "A": NaCl (10.00 g); KCl (0,25 g); Na2PO4 (1,45 g); KH2PO4 (0,25 g); y azida sódica (0,20 g). Llevar hasta 1 litro con agua destilada.

v)

Agarosa en PBS: Colocar en un agitador un recipiente con PBS "A". Añadir lentamente 10 g de agarosa a la solución en agitación. Fundir en una olla a presión. Depositar en botellas de vidrio para guardar a 22°C (+2°C).

vi)

Antígeno vírico: Se recoge el líquido alantoideo que contiene el virus infeccioso y se mantiene a –70°C. Para preparar eritrocitos de oveja sensibilizados, la relación óptima entre antígeno vírico y eritrocitos a utilizar se determina mediante una pequeña curva de titulación. Las cepas H7N7 siempre producen zonas claras; las cepas H3N8 a veces producen zonas difusas, en cuyo caso es necesario concentrar el virus por centrifugación.

vii)

Sangre de oveja: Recoger sangre en un volumen igual de solución de Alsever y mantener a 4°C. Puede ser necesario sangrar varias ovejas, debido a que varían las características de los eritrocitos de ovejas individuales. Mantener la sangre durante 2 días antes de su utilización, y luego puede utilizarse hasta 3 semanas, con tal de que se mantenga la esterilidad.

viii) Complemento: Utilizar complemento comercializado de cobaya o recoger suero de cobayas jóvenes de 300–359 g de peso y mantener en pequeños volúmenes a –70°C. Para uso, descongelar en agua fría y mantener a 4°C antes de empleo. ix)

Tratamiento de suero: Utilizar suero sin diluir inactivado por calor a 56°C durante 30 minutos. Evitar ciclos repetidos de congelación y descongelación.

•

Procedimiento de la prueba

i)

Lavar los eritrocitos de oveja al menos tres veces en solución salina /HEPES.

ii)

Preparar un volumen adecuado de eritrocitos al 8% (v/v, células empaquetadas) es solución salina /HEPES, habiendo calculado antes el número de placas que se necesitan y considerando 1 ml por cada placa de 6 x 11 cm y 1–2 ml extra.

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iii)

Añadir un volumen predeterminado1 de antígeno vírico a la solución de RBCs al 8%. Mantener la mezcla a 4°C durante 10 minutos. Se puede observar hemoaglutinación.

iv)

Añadir LENTAMENTE CrCl3 (1/400 en 0,85% de NaCl) a la mitad del volumen total de suspensión virus/eritrocitos. Mantener a 22°C (+ 2°C) durante 5 minutos mezclando ocasionalmente.

v)

Sedimentar los eritrocitos sensibilizados por centrifugación a 1.500 g durante 5 minutos.

vi)

Resuspender suavemente en solución salina/HEPES/BSA y centrifugar 1.500 g durante 5 minutos.

vii)

Resuspender los eritrocitos al 8% en PBS "A".

Durante el proceso de sensibilización, fundir la agarosa en una olla a presión. Poco antes de su uso, pipetear volúmenes de 7,8 ml a botellas Universal y mantenerlas a 42°C. Comprobar que el agar se ha enfriado hasta 42°C antes de utilizarlo. •

Preparación de placas

i)

Añadir 0,9 ml de eritrocitos de oveja sensibilizados con virus a 7,8 ml de agarosa (42°C). Mezclar con rapidez, pero suavemente.

ii)

Añadir 0,3 ml de suero de cobaya sin diluir. Mezclar de nuevo y verter en inmunoplacas en una mesa nivelada. Dejar reposar y secar al aire sin tapar unos 5 minutos.

iii)

Colocar las tapas sobre las placas y guardar a 4°C en una caja húmeda hasta uso.

iv)

Preparar placas control con células no sensibilizadas o con células sensibilizadas con un virus no relacionado. Los lotes de placas preparadas se pueden guardar varias semanas.

v)

Hacer agujeros de 3 mm en el juego de geles siguiendo un modelo preparado para 16 sueros de ensayo y para un suero positivo control. En las placas de control de antígeno, hacer cinco filas de ocho pocillos.

vi)

Pipetear en los pocillos adecuados 10 µl de los sueros de ensayo inactivados por calor (56°C por 30 minutos) y de un suero control positivo. Incubar a 34°C por 20 horas en una caja húmeda.

vii)

Medir los diámetros de las zonas y calcular las áreas de hemolisis después de restar el área del pocillo.

•

Interpretación de los resultados

Para que los resultados sean válidos, los sueros control positivos y negativos deben dar resultados conformes con los esperados sobre la base de la experiencia previa. Las áreas de hemolisis para los sueros control deben ser claras y no deben variar más del 20% del valor asignado al suero control. Los resultados se pueden expresar como mm2 o como una relación respecto al valor del suero control. Los sueros que den resultados positivos en la placa control deberían adsorberse con eritrocitos de oveja. A efectos diagnósticos, los sueros de enfermedad aguda y de fase convaleciente deben probarse por duplicado y en misma placa. El aumento en las áreas zonales producido por el suero de convaleciente en comparación con el suero de fase aguda es una evidencia de infección. El incremento del área que se considera significativo depende de la reproducibilidad de la prueba en el laboratorio, pero debería ser el equivalente a un incremento de dos veces o más en la concentración de anticuerpo. Esta área se puede calcular a partir de una curva estándar generada a partir de diluciones seriadas de un antisuero estándar.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Las vacunas contra el virus de la gripe equina contienen virus inactivados completos o sus subunidades, con o sin adyuvante. En algunos países se ha comercializado recientemente una vacuna viva atenuada contra la gripe de administración intranasal. Puede anticiparse que los requisitos para tal vacuna difieren en algunos aspectos de los que se indican a continuación, que se refieren a vacunas inactivadas. Las directrices para producción de vacunas veterinarias se presentan en el Capítulo I.1.7. Principios de producción de vacunas veterinarias. Las normas que se dan aquí y en el Capítulo I.1.7 son de carácter general y se pueden suplementar con requisitos nacionales y regionales.

1

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Preparar tres placas añadiendo 0.6, 1.2 o 1.8 ml de antígeno vírico a 2 ml de RBCs. Añadir 1.3, 1.6 y 1.9 ml de CrCl3 respectivamente y resuspender hasta 2 ml en PBS "A". El volumen óptimo de antígeno vírico es el que produce las zonas mayores y más claras con un suero de referencia apropiado.

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Capítulo 2.5.5. — Gripe equina

1.

Control del inóculo

a)

Características del inóculo El Laboratorio de Referencia de la OIE (Newmarket) coordina un programa de vigilancia puesto en marcha por Laboratorios de Referencia de la OIE y de la OMS (WHO) para suministrar información sobre cepas adecuadas para vacunas (15). Las recomendaciones sobre cepas vacunales hechas por el Panel de Expertos en Vigilancia se publicarán anualmente en el Boletín de la OIE. H7N7: Muchas vacunas aun contienen la cepa H7N7. Sin embargo, el Panel de Expertos en Vigilancia ha recomendado que se omita el componente H7N7 ya que no se han registrado infecciones con este subtipo en los últimos veinte años. H3N8: Las variantes antigénicas de virus H3N8 están en circulación (3). Es importante incluir aislamientos recientes que tengan importancia epidemiológica en la región en la que se va a utilizar la vacuna. Los aislados europeos típicos incluyen A/eq/Suffolk/89, A/eq/Borlange/91 y A/eq/Newmarket/9/23. Los aislados americanos típicos son A/eq/Kentucky/94 o A/eq/Newmarket/1/93. No obstante, se recomienda que las vacunas contengan representantes de ambas líneas (la americana y la europea), en particular donde se mezclan las poblaciones equinas de diferentes continentes. Algunas vacunas también contienen la cepa prototipo original de H3N8, A/eq/Miami/63. Sin embargo, esta cepa no induce una protección adecuada contra los virus predominantes que actualmente están en circulación y deberían omitirse de las vacunas.

b)

Método de cultivo Las cepas de virus se pueden obtener de Laboratorios de Referencia de la OIE (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual). Los virus que se seleccionan como cepas vacunales deben describirse en lo que respecta a su origen y a su historia de pases. Las cepas se propagan en la cavidad alantoidea de huevos embrionados de 10 días de gallina o en cultivos celulares, como los de células MDCK. Se deben de hacer todas las manipulaciones de cada especie por separado. El crecimiento viral se sigue por pruebas HA. El virus que se pasa se identifica por pruebas serológicas, como HI o SRH. Si el virus vacunal se crece en cultivo celular se deben hacer estudios con suero de hurón y MAbs para asegurarse de que no se seleccionan variantes de virus durante los pases para la preparación de los inóculos víricos primarios y de trabajo. Los inóculos primarios de virus y los de trabajo se dividen en alícuotas y se guardan en forma liofilizada a –20°C o a –70°C después de hacer pruebas para agentes extraños. Se debe mantener un registro escrito de las condiciones de almacenamiento. El lote de inóculo primario de cada cepa vacunal seleccionada debe procesarse de una sola vez para asegurar una composición uniforme, probarse para agentes extraños y caracterizarse por completo. Para caracterizar las cepas vacunales se pueden obtener antisueros o MAbs de los Laboratorios de Referencia de la OIE y la OMS (WHO) para su utilización en pruebas HI. Los lotes de inóculo de trabajo derivan de un lote de inóculo primario y deberían ser de composición uniforme, libres de agentes extraños y caracterizados por completo. Para la producción de vacunas se utilizan alícuotas del inóculo de trabajo. Tanto los lotes de inóculo primario como los de trabajo deben prepararse en huevos libres de patógenos específicos o, cuando menos, en huevos derivados de una población sana. Si se utilizan células MDCK para propagar al virus vacunal, se deberían establecer y guardar en nitrógeno líquido líneas celulares primarias, que deberían probarse en cuanto a ausencia de agentes extraños de acuerdo con las Normas de Control de la Autoridad Nacional. El examen de los inóculos víricos para agentes extraños, que incluyen micoplasmas y otros virus equinos, debe realizarse por técnicas apropiadas, como la inoculación de cultivos de tejidos susceptibles y el examen del efecto citopático, o la aplicación de anticuerpos fluorescentes para detección de antígeno. Se debe excluir específicamente la presencia de otros patógenos respiratorios comunes en équidos, como los herpesvirus equinos 1, 2 y 4, los picornavirus equinos, el virus de la arteritis equina y el adenovirus equinos. Se debería confirmar la ausencia de bacterias mediante pruebas estándar de esterilidad y pruebas de toxicidad en pequeños animales.

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Capítulo 2.5.5. — Gripe equina

c)

Validación como vacuna Para cada cepa vacunal, se debe preparar un lote como prototipo para establecer su adecuación como una cepa de vacuna, es decir, se debe confirmar mediante técnicas estándar su pureza e inocuidad. Se debería confirmar la capacidad de los virus de los lotes de inóculo para crecer a títulos elevados y para generar la suficiente masa antigénica que estimule una respuesta de anticuerpos adecuada en la especie de destino. Además, el virus vacunal derivado de células MDCK debe caracterizarse por completo para confirmar que durante el proceso de cultivo no han surgido variantes antigénicas, de modo que el virus vacunal ya no sea representativo del aislado original.

2.

Método de producción

La producción se basa en un sistema de inoculación por lotes que haya sido validado respecto a las características de las cepas vacunales. Cada cepa de virus se inocula por separado en la cavidad alantoidea de huevos embrionados de 9–11 días de gallinas procedentes de una población sana. Los huevos se incuban a una temperatura adecuada durante 2–3 días y se recoge el líquido alantoideo. Las suspensiones virales de cada cepa se recogen por separado y se inactivan. Si es necesario, se pueden purificar. Se pueden añadir adyuvantes apropiados y conservantes antimicrobianos. Los conjuntos de virus monovalente deben inactivarse lo antes posible mediante un método aprobado por la Autoridad Nacional de Control después de su preparación. Cuando se usa formalina (formaldehído al 40%) o beta–propiolactona (2–oxetanona), la concentración no debe exceder el 0,1% en volumen. Idealmente, los conjuntos de virus deben mantenerse a 4°C e inactivarse dentro de cinco días después de la recogida. Se debe demostrar la inactivación de la vacuna. Un método adecuado consiste en inocular 0,2 ml del conjunto monovalente no diluido, y de diluciones 1/10 y 1/100, a las cavidades alantoideas de grupos de huevos fértiles (10 huevos por grupo), e incubar los huevos a 33–37°C durante 3 días. A cada nivel de dosis, al menos ocho de cada diez huevos deben sobrevivir. De cada huevo superviviente, se toman 0,5 ml de líquido alantoideo. Los líquidos recogidos de cada uno de los grupos se juntan, y se inoculan sin diluir 0,2 ml de cada uno de los tres conjuntos en otro grupo de diez huevos fértiles. En estos nuevos grupos de huevos no de debería detectar actividad de hemoaglutinina. En algunos países, el requisito de que sobrevivan el 80% de los huevos durante la incubación puede resultar imposible, en cuyo caso la Autoridad Nacional de Control debería de especificar entonces un requisito modificado para ser satisfecho. Antes de la inactivación, se deben tomar muestras para pruebas de esterilidad bacteriana y fúngica. El material monovalente se puede concentrar y purificar mediante centrifugación a velocidad elevada u otros métodos adecuados aprobados por la Autoridad Nacional de Control, antes o después del proceso de inactivación. Es importante concentrar y purificar el virus bajo condiciones óptimas, por ejemplo a temperaturas que mantengan sus propiedades antigénicas. El conjunto de virus monovalente no debe contener virus de la gripe viable cuando se ensaye mediante inoculación de huevos embrionados de gallina, por un método aprobado por la Autoridad Nacional de Control.

3.

Control del proceso Se deben llevar a cabo importantes controles internos antes y después de la inactivación, y antes y después de la concentración y la purificación. Los controles internos comprenden: (a) identidad de las cepas de virus (probadas por HI); (b) esterilidad; (c) título de virus; (d) contenido de hemaglutinina (probado por unidades de hemoaglutinación de RBCs de pollo, CCA [aglutinación de células de pollo]); y (e) HA inmunológicamente activa (probada por difusión radial simple [SRD] u otro método inmunoquímico adecuado). •

Prueba de la difusión radial simple

La SRD es un método fiable para medir HA inmunológicamente activa en términos de µg de HA, y se utiliza de modo rutinario para determinar la potencia de las vacunas de la gripe humana (24). La potencia de la vacuna inactivada de la gripe equina depende de la concentración de hemaglutinina inmunológicamente activa (16, 22, 23). La determinación del contenido antigénico de la vacuna solamente por CCA puede ser errónea, ya que la sensibilidad de este ensayo refleja la capacidad de las cepas del virus para aglutinar eritrocitos. Una ruptura del virus puede ocasionar un aumento aparente de HA si se mide por CCA. El ensayo CCA no proporciona

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Capítulo 2.5.5. — Gripe equina

una medida de las propiedades antigénicas de la HA (HA puede mantener su propiedad de unirse a eritrocitos pero puede perder su capacidad para estimular la formación de anticuerpos). La composición de algunas vacunas contra la gripe equina es poco corriente porque los productos pueden contener más de una variante del subtipo H3N8. En tal situación, no es posible juzgar la potencia de componentes individuales de H3N8 en pruebas serológicas realizadas con sueros de caballos o de pequeños animales vacunados con el producto final, debido a la reacción cruzada entre dos aislados del mismo subtipo. Por lo tanto, es importante utilizar un método fiable, como el de la SRD, para medir la potencia de los componentes individuales antes y después de la inactivación y antes de mezclar y añadir el adyuvante. En la prueba SRD, las preparaciones de virus se comparan con una preparación de referencia calibrada cuyo contenido en HA es conocido. Los antígenos se dejan difundir a través de un gel que contiene un antisuero específico contra un antígeno HA particular. La distancia que el antígeno ha difundido antes de precipitar con el anticuerpo incorporado en el gel es directamente proporcional a la concentración de hemoaglutinina presente en las preparaciones de antígeno (13). Los reactivos estándares para la prueba SRD se pueden adquirir del Laboratorio Internacional de la OMS para Estándares Biológicos2. En la actualidad están disponibles los reactivos para A/eq/Praga/56 (H7N7) y las cepas de H3N8 A/eq/Miami/63, A/eq/Kentucky/81, A/eq/Newmarket/1/93 ("americana") y A/eq (Newmarket/2/93 ("europea").

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminación de los materiales biológicos se encuentran en el Capítulo I.1.5.

b)

c)

Inocuidad i)

Utilizando al menos tres caballos, se inocula cada uno intramuscularmente (en dos sitios diferentes) con la dosis de vacuna especificada por el fabricante; estas inoculaciones se repiten 2–4 semanas más tarde. Los animales se mantienen en observación durante 10 días después de la segunda serie de inyecciones. No deben aparecer reacciones anormales localizadas o sistémicas.

ii)

Si la vacuna es para uso en yeguas, debería demostrase la inocuidad dando dos dosis de vacuna al menos a dos yeguas preñadas, con el intervalo debido en el trimestre en que se recomienda la vacunación

Potencia Después de mezclar los antígenos virales y los adyuvantes, se debería probar in vivo la potencia utilizando caballos y cobayas o un ensayo alternativo de tipo inmunoquímico adecuado. Los adyuvantes causan interferencias en ensayos cuantitativos in vitro, como en CCA y SRD, aunque SRD se puede utilizar con el producto final como un ensayo cualitativo para demostrar la presencia de antígeno de cada cepa vacunal. Para pruebas repetitivas con lotes, solo se utilizan cobayas o un ensayo alternativo inmunoquímico adecuado, sujeto a acuerdo con la Autoridad Nacional de Control. i)

Respuestas serológicas en caballos Para que una prueba de potencia in vivo sea válida, se deben seleccionar para vacunación caballos seronegativos. Caballos jóvenes o ponies (no menores de 6 meses) deben analizarse para presencia de anticuerpo utilizando virus aislados recientemente en el área en que se criaron los caballos. Si se utilizan pruebas HI en el análisis, los virus H3N8 deberían tratarse con Tween 80/éter para aumentar la sensibilidad de la prueba. De modo alternativo, se puede utilizar SRH para establecer el estado seronegativo de los animales respecto a los virus H7N7 y H3N8. Para probar la eficacia de una vacuna en caballos, se inyecta el volumen correspondiente a una dosis en caballos susceptibles seronegativos por la ruta recomendada. Tras el período indicado como recomendado entre la primera y la segunda dosis, se inyecta a cada caballo un volumen de vacuna correspondiente a la segunda dosis.

2

National Institute for Biological Standards and Control, Blanche Lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire EN6 3QG, UK.

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Capítulo 2.5.5. — Gripe equina

Se toman tres muestras de sangre de cada animal; la primera en la primera vacunación, la segunda 1 semana después de la primera vacunación, y la tercera 2 semanas después de la segunda vacunación. El ensayo serológico utilizado para medir la respuesta de anticuerpos frente a los virus contenidos en la vacuna debe estar estandarizado por una prueba válida de potencia in vivo, por lo que se prefiere el ensayo SRH (ver Sección B.2.b.). Los sueros estándar para el control de calidad de las vacunas de la gripe equina están disponibles en la Farmacopea Europea3. Estos sueros deben ensayarse en paralelo con los sueros de ensayo para asegurarse de la validez de la prueba respecto a la sensibilidad; los valores obtenidos no deben variar más del 20%de los valores asignados por SRH en un estudio internacional en colaboración (12). Debido a la baja repetitividad y reproducibilidad de la prueba HI, a estos sueros no se les pudo asignar títulos de HI. El valor de anticuerpos medido por SRH no debe ser menor de 150 mm2. Esto es superior al título que se requiere en la Monografía de la Farmacopea Europea para las vacunas inactivadas contra la gripe equina (85 mm2) ya que se considera que este valor no proporciona protección. Si el título encontrado en algún caballo después de la primera vacunación indicara que ha habido una respuesta anamnésica, el resultado no se tiene en cuenta. Se realiza una prueba suplementaria, como se describió anteriormente, reemplazando los caballos que mostraron respuesta anamnésica por un número igual de animales nuevos. Si se usa la prueba HI, el título de anticuerpo de cada suero tomado después de la segunda vacunación no debe ser menor de 1/64 en cada prueba (calculado para el suero original, teniendo en cuenta la predilución de 1/8). Alternativamente, los niveles de anticuerpo estimulados por la vacuna ensayada deben ser al menos iguales a los niveles estimulados por una vacuna estándar ensayada en paralelo, que se haya demostrado antes que es capaz de proteger a los caballos contra una infección de desafío. ii)

Estudios de desafío en caballos En algunos casos puede ser deseable realizar estudios de desafío en caballos para demostrar la potencia, particularmente si las vacunas se están analizando en cuanto a capacidad de proteger contra virus que antigénicamente no son similares. Estos estudios se pueden hacer exponiendo seis caballos/ponies vacunados a un aerosol de virus de la gripe virulento, al menos 2 semanas después de la segunda vacunación. La comparación de signos clínicos, excreción de virus y respuestas serológicas se lleva a cabo con un grupo de por lo menos cuatro animales control no vacunados que se estimulan con la dosis de desafío al mismo tiempo (13, 14). El tiempo al que se hace el proceso de desafío debería reflejar los datos que obren en el registro respecto a la duración de la inmunidad. Si se han realizado satisfactoriamente las pruebas de potencia en caballos con un lote representativo de vacunas, se pueden omitir estas pruebas como controles rutinarios en otros lotes de vacuna que se han preparado utilizando el mismo sistema de inoculación por lotes, con tal de que se llegue a acuerdos con la Autoridad Nacional de Control.

iii)

Respuestas serológicas de cobayas Se inyecta con una dosis de vacuna cada uno de al menos cinco cobayas que carezcan de anticuerpos específicos. Se toman muestras de sangre 21 días después, y el suero se ensaya por SRH o HI (ver Secciones B.2.a. y B.2.b.). Realizar los ensayos de cada suero utilizando, respectivamente, los antígenos preparados de las cepas utilizadas en la producción de la vacuna. El título de anticuerpo de cada suero en cada prueba no debe ser inferior al título estimulado por una vacuna estándar que se haya demostrado que logra en caballos niveles de protección por anticuerpos.

d)

Duración de la inmunidad Cuando en el prospecto de la vacuna se indique la duración de la inmunidad, dichas indicaciones deben apoyarse en datos sobre la duración de los niveles de anticuerpos de protección que se mantienen en caballos vacunados de acuerdo con el calendario recomendado. Los niveles de anticuerpo considerados como protectores deben ser validados mediante estudios de desafío (ver Sección C.4.c.ii.) o por comparación con datos publicados.

e)

Estabilidad Las vacunas deben mantenerse a 5 + 3°C protegidas de la luz. La caducidad indicada en el prospecto debe demostrarse probando la potencia de alícuotas a lo largo del tiempo utilizando la prueba de potencia en cobayas (ver Sección C.4.c.iii.).

3

748

Suero contra A/eq/Newmarket/1/77 A/eq/Newmarket/2/93 (E0850022).

(Número

de

catálogo

E0850010),

A/eq/Newmarket/1/93

(E0850021)

y

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Capítulo 2.5.5. — Gripe equina

f)

Conservantes Normalmente no se incluyen conservantes

g)

Precauciones (riesgos) El contenido de cada vial abierto debe utilizarse en una hora desde la apertura. Durante la administración, deben observarse precauciones asépticas y solo se deben vacunar caballos sanos. Ocasionalmente se pueden presentar reacciones transitorias locales o generales, y se aconseja el descanso durante 24–48 horas después de la vacunación.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad Las pruebas se hacen como se indica en la sección C.4.b.i. Una vez que se ha demostrado la inocuidad en un lote prototipo, se puede omitir la prueba de inocuidad en yeguas preñadas de las pruebas rutinarias de otros lotes del producto final.

b)

Potencia Ver Sección C.4.c.iii. Como mínimo, debe realizarse una prueba serológica en cobayas de cada lote del producto final.

c)

Mantenimiento de cepas con relevancia epidemiológica en las vacunas Para facilitar que los productores de vacunas respondan con rapidez a las recomendaciones del Panel de Expertos en Vigilancia sobre la actualización de cepas, el Comité de Productos de Medicina Veterinaria de la Agencia Europea para la Elaboración de Productos Médicos ha desarrollado un sistema rápido de autorización para ser utilizado cuando las cepas vacunales se actualizan (5).

REFERENCIAS 1.

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5.

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9.

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* * *

NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la Gripe equina (ver Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consultar el sitio Web de la OIE para encontrar el listado más actualizado: www.oie.int).

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