CAPÍTULO 2.5.12.

ENCEFALOMIELITIS EQUINA VENEZOLANA

RESUMEN Los virus de la encefalomielitis equina venezolana (EEV), del género Alphavirus de la familia Togaviridae, causan una enfermedad cuyos síntomas varían desde reacciones febriles ligeras hasta zoonosis encefalítica mortal en équidos y humanos. Se transmiten mediante insectos hematófagos. En el hombre están documentadas unas tasas de infección elevadas tras la exposición a aerosoles procedentes de animales de laboratorio infectados o de accidentes de laboratorio. En humanos pueden aparecer diversas enfermedades clínicas o causar la muerte. Por consiguiente, los virus infectivos de la EEV o sus antígenos preparados a partir de tejidos infectados o de cultivos celulares nunca se deben manejar por personal que no posea una inmunidad demostrable en forma de anticuerpos neutralizantes. Todas las manipulaciones de laboratorio deben llevarse a cabo en cabinas de seguridad biológica certificada siguiendo los procedimientos de contención de nivel 3 (véase Capítulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de microbiología). Los virus de la EEV se clasifican en seis subtipos antigénicos (I–VI). Dentro del subtipo I hay cinco variantes antigénicas (variantes AB–F). Las variantes antigénicas I-AB y I-C se asocian con actividad epizoótica en équidos. Las otras tres variantes del subtipo I (I-D, I-E, I-F) y los otros cinco subtipos de la EEV se han relacionado con ciclos enzoóticos naturales. Estos subtipos y variantes se consideran no patogénicos para los équidos, aunque pueden provocar la enfermedad clínica en el hombre. Se conocen como virus enzoóticos de la EEV; desarrollan un ciclo de vida que abarca roedores, mosquitos y aves. Sin embargo, en México en los años 1993 y 1996 se observó que un brote de encefalitis en caballos se debía a virus enzoóticos de la EEV del subtipo I-E. Identificación del agente: El diagnóstico de la infección por el virus de la EEV se puede confirmar mediante el aislamiento, identificación y clasificación antigénica del virus aislado. Es posible realizar un diagnóstico presuntivo de la encefalomielitis equina en el momento en el que los animales susceptibles de zonas tropicales o subtropicales muestren signos clínicos de encefalomielitis en lugares donde estén activos los insectos hematófagos. El virus de la EEV puede aislarse en cultivos celulares o en animales de laboratorio empleando la sangre o el suero de animales febriles que han estado expuestos a casos clínicos de encefalitis por las picaduras de mosquitos infectados. Se recupera con menos frecuencia a partir de la sangre o los cerebros de animales con encefalitis. El virus de la EEV se puede identificar realizando pruebas de fijación del complemento, de inhibición de la hemaglutinación, de neutralización por reducción de placas (PRN) o mediante inmunofluorescencia con anticuerpos específicos de la EEV. La identificación específica de las variantes epizoóticas de la EEV se puede llevar a cabo mediante una prueba de inmunofluorescencia indirecta o una de PRN diferencial con anticuerpos monoclonales específicos de subtipo o variante o mediante la secuenciación de los ácidos nucleicos. Pruebas serológicas: Se puede demostrar la presencia de anticuerpos específicos mediante pruebas de PRN dirigidas contra las variantes epizoóticas del virus de la EEV o con un enzimoinmunoensayo de captura de IgM. También es posible comprobar la existencia de anticuerpos con pruebas de inhibición de la hemaglutinación o de fijación del complemento. Se debería considerar con cierta cautela cualquier diagnóstico de la EEV en un individuo que se base en la seroconversión en ausencia de una epizootia. A pesar de que normalmente los subtipos y variantes enzoóticos son de patogenicidad reducida para los équidos, la infección subclínica estimulará la producción de anticuerpos frente a las variantes epizoóticas del virus de la EEV.

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Capítulo 2.5.12. — Encefalomielitis equina venezolana

Habitualmente las infecciones de los équidos con los virus enzoóticos de la EEV provocarán una viremia de nivel bajo acompañada del desarrollo de anticuerpos, pero en la mayoría de los casos estos animales no manifestarán la enfermedad clínica. Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnóstico: Las únicas vacunas aceptables contra la EEV son una vacuna consistente en el virus atenuado, preparada con la cepa TC-83, o preparaciones inactivadas del virus logradas a partir de esta misma cepa. El virus atenuado es inmunogénico administrado por vía intramuscular, pero en ocasiones provoca reacciones adversas en el receptor de la vacuna. Las preparaciones del virus virulento de la EEV inactivado con formalina nunca se deberían utilizar en équidos ya que tras el tratamiento con formalina pueden permanecer activos algunos virus virulentos residuales y, por tanto, causarían una enfermedad grave tanto en los animales como en el hombre. Se han producido epizootias de EEV como consecuencia de la utilización de tales virus tratados con formalina.

A. INTRODUCCIÓN Los virus del complejo de la encefalomielitis equina venezolana (EEV), del género Alphavirus de la familia Togaviridae, son patógenos zoonósicos transmitidos por mosquitos, que producen desde una fiebre que varía de leve a grave hasta enfermedades encefalíticas, en ocasiones mortales, en equinos y humanos. Las infecciones provocadas por aerosoles tienen su origen en los residuos de las jaulas de los roedores de laboratorio infectados y en los accidentes de laboratorio. Las personas que manejen los virus infecciosos de la EEV o sus antígenos preparados a partir de tejidos infectados o cultivos celulares se tendrían que vacunar y comprobar que han desarrollado inmunidad en forma de anticuerpos neutralizantes específicos del virus de la EEV (1, 4). Todos los procedimientos que produzcan aerosoles a partir de los materiales que contengan el virus de la EEV se deberían llevar a cabo en cabinas de bioseguridad a un nivel de contención 3 (véase Capítulo I.1.6. Seguridad humana en el laboratorio veterinario de microbiología) (6, 7). El complejo del virus de la EEV está constituido por seis subtipos (I–VI). Dentro del subtipo I, hay cinco variantes antigénicas (AB–F) (2–4, 8, 10). En un principio, los subtipos I-A e I-B se consideraron como variantes distintas, pero hoy en día se consideran idénticas (I-AB). Dentro del subtipo III, existen tres variantes antigénicas (A-C). Las variantes antigénicas I-AB e I-C se asocian con epizootias de la EEV en équidos y epidemias concurrentes en humanos (3, 4, 8–10). Se conoce a estos patógenos equinos como variantes epizoóticas; se han aislado a partir de équidos, humanos e insectos (principalmente mosquitos) sólo durante epizootias equinas. El subtipo I-C se aisló en Venezuela en 1993 y en Venezuela y Colombia en 1995. El subtipo I-D se aisló en Perú en 1994 y 1995. Parece que estos aislados epizoóticos han evolucionado a partir del subtipo enzoótico I-D (5). Las variantes del subtipo I (I-D, I-E e I-F) y los otros cinco subtipos (II–VI) se asocian con ciclos que se presentan de forma natural. Normalmente, los virus enzoóticos de la EEV no producen encefalomielitis clínica en las especies equinas (9), pero en México en los años 1993 y 1996 un tipo enzoótico causó una epizootia limitada en caballos. Estos subtipos y variantes enzoóticos pueden desencadenar la enfermedad clínica en el hombre (3, 4, 8, 10). Se han adquirido infecciones con los subtipos y variantes epizoóticos y enzoóticos a través de los trabajadores de laboratorio (6). Históricamente, la EEV epizoótica se encontraba limitada al norte y oeste de Sudamérica (Venezuela, Colombia, Ecuador, Perú y Trinidad) (4). De 1969 a 1972, sin embargo, surgió una actividad epizoótica en Guatemala, El Salvador, Nicaragua, Honduras, Costa Rica, Belice, México, y los EE.UU. (Texas). No se han producido epizootias de EEV debidas a los virus I-AB o I-C en Norteamérica y México desde 1972. Los aislamientos recientes equinos y humanos del virus epizoótico de la EEV fueron de cepas del subtipo 1-C procedentes de Venezuela en 1993, 1995 y 1996 y de Colombia en 1995. Además, en 1993 en México una variante enzoótica (I-E) causó la enfermedad en caballos. Por el contrario, los subtipos y variantes enzoóticos de la EEV existen de forma permanente en focos enzoóticos de las zonas tropicales y subtropicales de América entre las que se encuentran las Everglades de Florida (subtipo II), México (variante I-E), los países de Centroamérica (variante I-E), Panamá (variantes I-D e I-E), Venezuela (variante I-D), Colombia (variante I-D), Perú (variante III-C), Guayana francesa (variante III-B y subtipo V), Ecuador (variante I-D), Surinam (variante IIIA), Trinidad (variante III-A), Brasil (variantes I-F e III-A y subtipo IV), y Argentina (subtipo VI). La variante III-B se ha aislado en los EE.UU. (Colorado y Dakota del Sur) a partir de un nicho ecológico atípico, en una asociación inusual con aves (3, 4, 8, 10). Los focos de los subtipos y variantes enzoóticos se localizan en áreas clasificadas como bosques húmedos tropicales, p.ej. áreas con índices pluviométricos elevados o áreas pantanosas abiertas con corrientes de agua amplias y sinuosas. Son zonas de América en las que las precipitaciones se distribuyen a lo largo de todo el año o zonas con suministro permanente de agua. Los virus enzoóticos establecen un ciclo en los roedores y quizás en las aves, que se alimenten de los mosquitos (3, 4, 8, 10).

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Capítulo 2.5.12. — Encefalomielitis equina venezolana

Un diagnóstico tentativo de la encefalomielitis vírica en los équidos se puede basar en la incidencia de la enfermedad neurológica aguda durante el verano en climas templados o durante la estación húmeda en los climas tropical o subtropical. Estas son las estaciones de actividad de los insectos hematófagos. La infección vírica causará la enfermedad clínica simultánea de muchos équidos más que la aparición de casos aislados. La actividad epizoótica puede recorrer en poco tiempo largas distancias a través de poblaciones susceptibles (3, 4, 8, 10).

B. TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO 1.

Identificación del agente

El diagnóstico confirmativo de la EEV se basa en el aislamiento e identificación del virus o en la demostración de seroconversión. El periodo de viremia coincide con el inicio de la pirexia dentro de las 12–24 horas de infección. La viremia termina a los 5–6 días después del comienzo de la infección y coincide con la producción de anticuerpos neutralizantes y la aparición de los signos neurológicos clínicos. Frecuentemente, los virus de la EEV no se pueden aislar a partir de los cerebros de los équidos infectados. Para aislar el virus se deberían recoger muestras de sangre procedentes de los animales febriles que estén estrechamente relacionados con los casos clínicos de encefalitis. El virus se puede aislar a partir de la sangre o los sueros de los animales infectados mediante la inoculación intracerebral de ratones o hámsteres de 1–4-días de vida o de otros animales de laboratorio, tales como cobayas y ratones destetados. También se pueden aislar inoculando diversos tipos de cultivos celulares entre los que cabe señalar el riñón de mono verde africano (Vero), el riñón de conejo (RK-13), el riñón de cría de hámster (BHK-21), o los fibroblastos de embrión de pollo o de pato, o mediante la inoculación de huevos de pollo embrionarios. Los detalles de las técnicas de identificación vírica se describen en el Capítulo 2.5.3. Encefalomielitis equina (del Este y del Oeste). Se pueden identificar los aislados como virus de la EEV mediante pruebas de fijación del complemento (FC), de inhibición de la hemaglutinación (HI), o de neutralización por reducción de placas (PRN), o mediante inmunofluorescencia tal y como se describe en el Capítulo 2.5.3. Los aislados del virus de la EEV se pueden caracterizar por pruebas de inmunofluorescencia indirecta o de PRN que emplean anticuerpos monoclonales o mediante la secuenciación de los ácidos nucleicos. La caracterización del virus de la EEV se debería llevar a cabo en un laboratorio de referencia (véase el Cuadro de la Parte 3 de este Manual para animales terrestres).

2.

Pruebas serológicas

El diagnóstico de la infección por el virus de la EEV requiere la demostración de la presencia de anticuerpos específicos en pares de muestras de suero recogidas en las fases aguda y convaleciente. Después de la infección, los anticuerpos detectados en la prueba de PRN aparecerán entre los días 5–7, los anticuerpos de la FC entre los días 6–9, y los anticuerpos de la HI entre los días 6–7. La segunda muestra de suero de la fase de convalecencia se debería tomar a los 4–7 días posteriores a la recogida de la primera muestra de la fase aguda o en el momento de la muerte. En el Capítulo 2.5.3 se describen con detalle los procedimientos serológicos que se deben seguir. Para interpretar cualquiera de los resultados de las pruebas serológicas de la EEV se tendría que tener en cuenta la historia de la vacunación. En el caso de caballos que no se han vacunado recientemente con una cepa del virus vivo atenuado, la demostración de la presencia de anticuerpos séricos del tipo IgM específicos de la EEV en una muestra simple de suero confirma una exposición reciente al virus. Se debería considerar con cierta cautela cualquier diagnóstico de la EEV en un individuo que se base en la seroconversión en ausencia de una epizootia. A pesar de que los subtipos y variantes enzoóticos no son patogénicos para los équidos, la infección estimulará la producción de anticuerpos frente a las variantes epizoóticas del virus de la EEV.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNÓSTICO Las vacunas aceptadas contra la infección de la EEV son una vacuna consistente en el virus atenuado, cepa TC83, y una preparación inactivada del virus lograda a partir de esta misma cepa (3, 4, 8, 10). En la actualidad la vacuna inactivada es la de mayor uso y se comercializa en las combinaciones EEE/EEV y EEE/WEE/EEV. La vacuna inactivada se debería administrar en dos dosis con un intervalo de 2–4 semanas entre dosis. Se recomienda la revacunación anual.

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Capítulo 2.5.12. — Encefalomielitis equina venezolana

La vacuna atenuada tendría que reconstituirse con solución salina fisiológica y ser usada de inmediato. Los viales se mantienen en hielo mientras se está utilizando la vacuna. Se debería desechar, sin correr riesgos, cualquier vacuna no empleada tras 4 horas desde la reconstitución. No se deberían vacunar los potros de menos de 2 semanas de vida ni las yeguas gestantes. Los animales se vacunarán por vía subcutánea en la región cervical con una dosis única. No se recomienda la revacunación. NOTA: En los équidos nunca se deberían usar preparaciones tratadas con formalina de los virus virulentos epizoóticos de la EEV. Pueden permanecer virus virulentos residuales después del tratamiento con formalina y provocar una enfermedad grave. Debido a la utilización de estas preparaciones se han producido epizootias de la EEV en el centro y sur de América (8, 11).

1.

Control del inóculo1

a)

Características del inóculo La cepa TC-83 de la vacuna del virus atenuado de la EEV se originó a partir de una cepa de asno de Trinidad (una variante de I-AB) del virus epizoótico de la EEV aislado en 1944. Esta cepa se obtuvo por pases seriados de la cepa de asno de Trinidad en células de corazón de cobaya fetal. Es segura e inmunogénica a los niveles de pase establecidos e induce inmunidad protectora en los équidos vacunados, aunque a veces se pueden producir reacciones adversas. En un principio la vacuna se desarrolló para ser empleada por el personal implicado en las investigaciones de alto riesgo del virus de la EEV. Los lotes de inóculo adecuados se deberían mantener a –70°C en estado liofilizado.

b)

Método de cultivo El virus se crece en cultivos celulares de corazón de cobaya fetal en un medio adecuado.

c)

Validación como vacuna Las células empleadas para la producción de la vacuna deben estar libres de contaminación por bacterias, hongos, micoplasmas y virus. El virus de la EEV se identifica en lotes de vacuna mediante pruebas de PRN contra suero hiperinmune. En el caso de las vacunas inactivadas originadas en cultivo celular, el virus de la cepa TC-83 se trata con formaldehído.

2.

Métodos de producción1

La vacuna se produce recogiendo los sobrenadantes procedentes de las monocapas de corazón de cobaya fetal en las que se ha producido la replicación del virus atenuado de la EEV. Las monocapas se mantienen aproximadamente a 37°C. El tiempo de recogida se determina por la aparición de cambios citopáticos característicos en el momento en el que aproximadamente el 70–100% de la capa de células esté afectada, lo que sucede tras 1–3 días después de la infección. Se clarifica el sobrenadante centrifugando a baja velocidad y se adicionan estabilizadores adecuados para proteger al virus durante la congelación y liofilización.

3.

Control del proceso1

Se deberían examinar diariamente los cultivos para detectar posibles cambios citopáticos. Tras la recogida, se debería comprobar que la suspensión vírica está libre de contaminantes microbianos. Las vacunas inactivadas derivadas de la cepa atenuada del virus TC-83 se tienen que revisar para excluir la presencia en ellas de virus viables después del tratamiento con formalina.

4.

Control de lotes1

a)

Esterilidad En el Capítulo I.1.5. se pueden encontrar las pruebas para determinar que los materiales biológicos están estériles y libres de contaminación.

b)

Inocuidad En el Capítulo 2.5.3. se describen las pruebas de inocuidad de la vacuna inactivada.

1

Las secciones de Control del inóculo, Producción, Control del proceso y Control de lotes se han extraído de la División de Biotecnología y Protección Biológica y Medioambiental del Servicio de Inspección de Salud de Plantas y Animales del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (APHIS).

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Las pruebas de inocuidad de la vacuna atenuada se llevan a cabo en ratones. Se inyecta por vía intraperitoneal o subcutánea una dosis de 0,5 ml en ocho ratones y los animales se mantienen en observación durante 7 días. Si a lo largo de este periodo se observan reacciones adversas atribuibles al producto, éste se considerará no satisfactorio.

c)

Potencia Las pruebas de potencia de la vacuna inactivada se describen en el Capítulo 2.5.3, salvo el título de anticuerpos en los cobayas inoculados que será ≥1/4. Se puede determinar la potencia de la vacuna atenuada realizando pruebas en los caballos. Se inoculan por vía subcutánea 20 caballos susceptibles con 1 ml de la vacuna liofilizada que tenga un título vírico reconstituido de al menos 2,5 log10 DICT50 (dosis infectiva 50% en cultivo celular) por ml. Para considerar una prueba válida, al menos 19 de los 20 caballos vacunados deben tener títulos de anticuerpos de HI no inferiores a 1/20 o títulos de anticuerpos de neutralización de suero no inferiores a 1/40 en el plazo de 21−28 días desde la vacunación. En cualquier momento en el que se realicen las pruebas dentro del periodo de expiración después de la liofilización, el producto debe tener un título vírico de 0,7 log10 mayor que los usados para las pruebas de los caballos que se han descrito más arriba, pero no inferior a 2.5 log10 DICT50/dosis. El producto final debe estar libre de contaminación por bacterias, hongos, micoplasmas y víricos extraños.

d)

Duración de la inmunidad No se dispone de estudios exhaustivos a cerca de la duración de la inmunidad. Para la vacuna inactivada se recomienda una revacunación anual. Los potros que se vacunen con menos de 1 año de vida deberían revacunarse antes de la próxima estación del vector. No es recomendable la revacunación con la vacuna atenuada.

e)

Estabilidad La vacuna liofilizada es estable e inmunogénica durante 3 años si se mantiene refrigerada a 2–7°C. A partir de los 3 años, se debería eliminar. Las vacunas tendrían que utilizarse inmediatamente después de la reconstitución. Es necesario que los viales multidosis de la vacuna atenuada se mantengan en hielo mientras están en uso. Todas las vacunas que no se empleen se deberían eliminar sin correr riesgos 4 horas después de la reconstitución.

f)

Conservantes Los conservantes utilizados son timerosal a una dilución 1/1.000 y antibióticos (neomicina, polimixina, anfotericina B y gentamicina).

g)

Precauciones (riesgos) No se deberían vacunar las yeguas gestantes ni los potros de menos de 2 semanas de vida. Todo el personal que maneje los virus infecciosos de la EEV o sus preparaciones antigénicas procedentes de cultivos celulares o tejidos infectados tendría que vacunarse y demostrar que poseen inmunidad en la forma de anticuerpos neutralizantes específicos del virus de la EEV. Todos los procedimientos que produzcan aerosoles a partir de los materiales con el virus de la EEV deberían llevarse a cabo en cabinas de bioseguridad con sistema de biocontención y de filtración eficaz del aire procedente del laboratorio (6, 7).

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad y potencia Las pruebas de inocuidad y potencia son como las expuestas más arriba bajo el epígrafe Control de lotes (Sección C.4.b. y C.4.c.). La vacuna atenuada debe tener un título vírico no inferior a 2,5 log10 DICT50/dosis.

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* * * NB: Existe un laboratorio de referencia de la OIE para la Encefalomielitis equina venezolana (véase Cuadro en la Parte 3 de este Manual de animales terrestres o consúltese la página Web de la OIE para conseguir la relación más actualizada: www.oie.int).

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