Dermatología Rev Mex 2005;49:51-58

Artículo original Caracterización histoquímica de micetomas por Actinomadura madurae, Nocardia brasiliensis y Madurella mycetomatis Alejandro Palma Ramos,* Laura Castrillón Rivera,* Carmen Padilla Desgarennes,** Floridalba Reyes Fuentes* RESUMEN Antecedentes: los micetomas se dividen en dos grupos, según el agente causal: los que producen los hongos (eumicetomas) y los que generan las bacterias (actinomicetoma). Los géneros más comunes, responsables de los actinomicetomas en México, son: Nocardia y Actinomadura. El género más importante que produce eumicetomas pdf es Madurella. elaborado Estos pormicroorganismos medigraphic son saprófitos del suelo, causan infección cuando se introducen al organismo a través de pequeñas heridas, crecen lentamente y luego producen los granos y el micetoma. En 1977, Mariat publicó que en los actinomicetomas por Actinomadura no existía cemento de unión. Sin embargo, Palma, en 1999, mediante la técnica de inmunoperoxidasa con anticuerpos específicos contra Actinomadura, demostró que las bacterias del grano no se marcan, lo cual indica la existencia de un cemento que une a las bacterias y no permite el acceso a los anticuerpos. Objetivo: comparar, desde el punto de vista histoquímico, la constitución química del cemento de unión en los granos producidos por Actinomadura y Nocardia, y la búsqueda de la existencia de este cemento en granos causados por eumicetos. Material y métodos: se obtuvieron seis biopsias, una por cada paciente con diagnóstico de micetoma por Actinomadura, Nocardia y Madurella. Se incluyeron en parafina y se realizaron cuatro cortes para cada una, a los cuales se les aplicaron las técnicas de hematoxilinaeosina, PAS, azul alciano y Grocott. Resultados: todos los cortes dieron positiva la reacción de PAS y metenamina de plata; sin embrago, sólo los micetomas por Actinomadura resultaron positivos con la tinción de azul alciano. Conclusión: el grano de Actinomadura contiene cemento de unión, el cual se compone por un polisacárido ácido sulfatado. El grano de Nocardia contiene un cemento de unión compuesto por un polisacárido neutro. No se encontró cemento de unión en el grano de Madurella. La quitina, constituyente de la pared del hongo, provocó las reacciones positivas que se observaron en algunas técnicas histológicas. Palabras clave: micetoma, actinomicetoma, Actinomadura madurae, Nocardia brasiliensis, Madurella.

ABSTRACT Background: Mycetomas are classified according to the causative agent: those produced by fungi (eumycetomes) or bacteria (actinomycetoma). In Mexico, actinomycetoma is caused mainly by Actinomadura and Nocardia, and eumycetoma is produced byMadurella. These microorganisms are soil saprophytes and cause infection when they are introduced into small wounds, slowly they grow and produce grains in mycetoma. In 1977, Mariat reported that actinomycetoma caused byActinomadura lacked of matrix cement substance. However, Palma, in 1999, by immunoperoxidase technique with specific antibodies against Actinomadura, demonstrated that bacteria inside the grain were not labeled. These findings suggested the existence of a cement matrix that keep bacteria together and do not allow complete access of antibodies. Objective: To compare by histochemistry techniques the chemical nature of cement in grains produced by Actinomadura and Nocardia and search for the existence of this cement in grains caused by eumycetoma. Material and methods: Six cutaneous biopsies from patients with mycetoma due to Actinomadura, Nocardia, and Madurella were studied. They were included in paraffin, four slides were obtained from each biopsy and stained with HE, PAS, blue alcian and Grocott. Results: All slides were PAS and silver methenamine-positive, and only mycetomas caused by Actinomadura were alcian blue-positive. Conclusion: Red grain mycetoma caused by Actinomadura contains substance cement formed by sulphated acid mucopolysaccharide; in contrast, spots of Nocardia contains cement of neutral polysaccharide. Regarding Madurella grains, we did not find cement. Positive reactions observed in some stain techniques were due to quitin, a common component of the fungus cell wall. Key words: mycetoma, actinomycetoma, Actinomadura madurae, Nocardia brasiliensis, Madurella.

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l micetoma es un síndrome clínico que consiste en lesiones inflamatorias deformantes, no dolorosas y fístulas que afectan el tejido cutáneo y subcutáneo, la aponeurosis y el hueso.1 Por lo general, se manifiesta en el pie o en la mano. Asimismo, afecta las extremidades inferiores pues están directamente expuestas a la infección en 70 al 75% de los casos. Sin embargo, puede observarse en casi cualquier región del cuerpo, su evolución es muy lenta y, por tanto, poco invalidante durante los primeros meses o años de su aparición. La enfermedad es el resultado de la implantación traumática de un microorganismo del suelo dentro de los tejidos. Las lesiones se componen de abscesos que supuran, granulomas y fístulas que drenan, así como de granos que son característicos de los agentes causales. Dichos agentes son una amplia variedad de bacterias (actinomicetos) y hongos (eumicetos) del suelo.2 Los principales géneros responsables del actinomicetoma son Nocardia, Streptomyces y Actinomadura. El género más importante que produce eumicetomas es Madurella. Estos microorganismos son saprófitos del suelo y para causar infección se introducen en el organismo a través de pequeñas heridas, crecen lentamente y luego producen los granos y el micetoma. Independientemente del origen del micetoma, siempre se forman granos en la lesión; estos granos supuran a través de senos formados dentro de sí mismos. Las supuraciones indican, en gran medida, la reproducción del agente causal, ya que en ellas pueden localizarse granos filamentosos. 3 La coloración, forma y tamaño de los granos, permite hacer la diferenciación del agente causal, incluso desde las primeras descripciones del padecimiento. *

Profesor investigador del Laboratorio de Inmunopotenciadores, Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. ** Laboratorio de Micología, Centro Dermatológico Dr. Ladislao de la Pascua, Servicios de Salud Pública del Distrito Federal. Correspondencia: M en C Alejandro Palma Ramos. Laboratorio de Inmunopotenciadores, Departamento de Sistemas Biológicos, Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco. Calzada del Hueso 1100, Col. Villa Quietud, México, DF, 04960. E-mail: [email protected] Recibido: noviembre, 2004. Aceptado: diciembre, 2004.

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Dado que la tumoración y el grano pueden confundirse con otros padecimientos, se requiere efectuar un diagnóstico diferencial a fin de establecer la estrategia terapéutica específica. La tinción de un corte histopatológico es la herramienta más confiable entre los métodos frecuentes para el diagnóstico de los micetomas, pues no sólo se determina la especificidad de la lesión, sino también el agente causal. La enfermedad se observa principalmente en los hombres, en una proporción de 3 ó 4:1; esta diferencia es mucho menor en niños. Se observa con mayor frecuencia entre 31 y 45 años de edad y es menos frecuente a los 60 años. La enfermedad predomina en campesinos; sin embargo, también se aprecia en personas con diferentes pdf elaboradoestudiantes, por medigraphic ocupaciones: profesionistas, obreros, amas de casa, etc.4 Los agentes causales predominantes son los actinomicetos con 97.2%, de los cuales Nocardia ocupó 85.6% de los casos, Nocardia brasiliensis 71.9%, Actinomadura madurae 9.6%, Streptomyces somaliensis 11.6% y Actinomadura pellitieri sólo 0.12%.5 Los agentes más comunes aislados en países africanos son: Madurella mycetomatis, Streptomyces somaliensis y Actinomadura madurae. En los actinomicetomas por Actinomadura madurae pueden observarse granos grandes que miden de 1 a 10 mm, sus filamentos se tiñen intensamente con hematoxilina y se distinguen con claridad.3 Su forma es cartográfica o polilobulada, con un borde eosinófilo (pseudoclavas) que puede faltar en algunas áreas. La reacción inflamatoria que rodea a los granos es menos intensa que la observada en los actinomicetomas provocados por Nocardia . Al igual que en otras enfermedades infecciosas, la relación entre el huésped y el agente causal es una parte importante en el desencadenamiento de la enfermedad. En el caso de los micetomas, la unión del hongo o del actinomiceto al tejido no está totalmente dilucidada. En 1977, Mariat6 determinó las características de los micetomas y señaló que en las lesiones producidas por Actinomadura no existía cemento de unión; sin embargo, Palma,7 en 1999, mediante la técnica de inmunoperoxidasa con anticuerpos específicos contra Actinomadura, demostró que las bacterias del grano no se marcan, lo cual indica la existencia de un cemento que mantiene unidas a las bacterias y no permite el acceso a los anticuerpos.

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En ese mismo trabajo, Palma 7 utilizó las técnicas histoquímicas, estableció las características químicas del cemento y la existencia de una estructura que permite unir a las bacterias de Actinomadura en el interior del grano. El cemento es un polisacárido ácido sulfatado. El descubrimiento de dicho cemento de unión en la formación del grano, producido en la infección por Actinomadura, es un hallazgo que ofrece elementos especiales en la patogenia y fisiopatología del micetoma, ya que es posible que se encuentre en otras infecciones como Nocardia, Streptomyces y Madurella. En continuidad con estos trabajos, se realizó el estudio histoquímico del cemento de unión en micetomas causados por Actinomadura, Nocardia y Madurella. JUSTIFICACIÓN

Las estrategias terapéuticas para el tratamiento de micetomas implican la determinación del tipo de componentes que integran las estructuras de la lesión, así como del mismo patógeno. Otros trabajos determinaron las características de algunos fragmentos proteínicos antigénicos de valor diagnóstico, así como algunas secuencias génicas de un género como Nocardia. No obstante, la relación que se establece entre los agentes patógenos y el paciente también es importante para el desarrollo de una estrategia terapéutica efectiva. En este sentido, la caracterización química del cemento, que participa en la unión entre el agente patógeno y el paciente, es fundamental para el desarrollo posterior de tratamientos efectivos para este padecimiento. OBJETIVO

Comparar, desde el punto de vista histoquímico, la constitución química del cemento de unión en los granos producidos por Actinomadura y Nocardia, y la búsqueda de este cemento en granos causados por eumicetos. MATERIAL Y MÉTODOS

Se obtuvieron seis biopsias, una por cada paciente (proporcionadas por la Dra. J. Novales del Centro Dermatológico Ladislao de la Pascua), dos con

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micetoma por Actinomadura madurae, dos con micetoma por Nocardia brasiliensis y dos con micetoma por Madurella. Se incluyeron en parafina y se realizaron cuatro cortes para cada una, a los cuales se les aplicaron las técnicas de hematoxilina-eosina, PAS, azul alciano y Grocott. Técnicas citoquímicas

A continuación se describe el desarrollo de cada una de las técnicas citoquímicas manejadas en este estudio. Hematoxilina-eosina 8

Desparafinar, colorear con hematoxilina de Harris pdf elaborado por medigraphic durante un minuto y lavar. Diferenciar con alcoholácido, lavar y virar con agua amoniacal; lavar otra vez, colorear con eosina durante 30 segundos, deshidratar y montar. Se observan núcleos azules y citoplasma de color rosa o anaranjado. Ácido peryódico-Schiff (PAS)9

Desparafinar y tratar con ácido peryódico al 0.6% durante 10 minutos; lavar, secar, agregar reactivo de Schiff durante 15 minutos en la oscuridad, luego lavar con agua sulfurosa y con agua destilada. Colorear con hematoxilina de Harris uno o dos minutos y luego lavar. Adicionar amarillo de metilo durante tres minutos y lavar con agua acidulada y destilada. Deshidratar y montar. Las estructuras y compuestos PAS positivos (polisacáridos) se observan de color rosa, los núcleos, azules y el citoplasma, amarillo. Grocott10

Desparafinar, oxidar en ácido crómico al 1% durante una hora y lavar. Colocar en bisulfito de sodio durante un minuto; lavar y poner en metenamina de plata a 60 oC durante 45 a 60 minutos; lavar y dar tono con cloruro de oro al 0.2% de dos a cinco minutos; lavar y colocar en tiosulfato de sodio al 2% de dos a cinco minutos; lavar y contrastar con verde luz durante 30 segundos; deshidratar y montar. Con la técnica de Grocott se demostró que el método de Gomori es conveniente para estudiar hongos en cortes, ya que los grupos aldehídos quedan expuestos por oxidación con ácido crómico y pueden reducir la

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metenamina nitrato de plata en solución alcalina. Como resultado de esta reacción, el glucógeno, la mucina y la elastina aparecen en color negro pardusco o negro. Azul alciano11,12

Desparafinar, colocar en ácido acético al 3% durante dos minutos; colorear con azul alciano durante 45 minutos en ácido acético al 35%; lavar y colocar en rojo nuclear durante cinco minutos; lavar, deshidratar y montar. Los mucopolisacáridos ácidos con grupo sulfato se observan de color azul y los núcleos, en rojo. RESULTADOS

La epidermis mostró hiperqueratosis de leve a moderada, con paraqueratosis, costras serohemáticas e hiperplasia epitelial con patrón psoriasiforme. En la dermis superficial se observó un leve infiltrado difuso sin patrón definido; la mayor parte de los anexos estaban libres, a excepción de los localizados en la dermis media y profunda, que mostraban infiltrado inflamatorio de tipo mononuclear, predominantemente linfocitario y perianexial. En la dermis profunda se apreció una zona de inflamación de tipo agudo, con áreas de inflamación crónica (tejido de granulación). Los cortes provenientes del micetoma causado por Actinomadura, teñidos con las cuatro técnicas histoquímicas, generaron la siguiente información: Hematoxilina-eosina. En la figura 1 se observa hiperqueratosis con paraqueratosis y microabscesos de polimorfonucleares intraepidérmicos. Es importante notar la intensa coloración violeta en el contorno del grano, que se debe a la reacción de la hematoxilina con los compuestos constituyentes del grano. Ácido peryódico-Schiff (PAS). Se observa que la reacción con el ácido peryódico de Schiff es positiva. En la figura 2 resalta la coloración magenta del grano. La coloración indica la reacción de este reactivo con los azúcares en todo el grano. Metenamina de plata (Grocott). La impregnación del corte con metenamina de plata generó un color negro en el grano, es decir, los polisacáridos volvieron a identificarse en la lesión, los cuales reaccionaron con

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Figura 1. Se observa un actinomicetoma causado por Actinomadura madurae, con contorno cartográfico, bacterias de forma filamentosapor color violeta debido a la hematoxilina. Puede pdf elaborado medigraphic considerarse de naturaleza ácida por su reacción con la hematoxilina de naturaleza básica. Existen pseudoclavas que forman el fleco característico de este grano. 40X.

Figura 2. Corte de un actinomicetoma por Actinomadura madurae, en el que se observa la reacción positiva con el ácido peryódico de Schiff (PAS) y resalta claramente el contorno de color magenta. 40X.

los reductores del reactivo y quedaron impregnados con plata (figura 3). Azul alciano. Al utilizar la tinción de azul alciano se produjo un color azul intenso en el contorno y en el centro de la lesión. La intensidad del azul es mayor hacia el contorno y disminuye hacia el centro, lo que indica un polisacárido ácido en el cemento de unión del grano (figura 4). Los cortes provenientes del micetoma causado por Nocardia brasiliensis, teñidos con las cuatro técnicas histoquímicas, generaron la siguiente información:

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Figura 3. Corte de un actinomicetoma por Actinomadura madurae con impregnación de plata. El color negro indica la impregnación de plata, causada por la reacción del reductor sobre los compuestos polisacáridos constituyentes del cemento de unión en el grano. 40X.

Figura 5. Corte de un actinomicetoma causado por Nocardia pdf elaborado por medigraphic brasiliensis y teñido con hematoxilina-eosina. Muestra leve coloración de los granos pequeños con forma arriñonada y bilobulada. 40X.

Figura 4. Corte de un actinomicetoma por Actinomadura madurae, donde se observa la coloración azul intensa en el contorno del grano e indica la presencia de polisacáridos ácidos. 40X.

Figura 6. Corte de un actinomicetoma por Nocardia brasiliensis, donde se observa la reacción positiva con el ácido peryódico de Schiff (PAS), coloración magenta positiva a la oxidación de los polisacáridos contenidos en el cemento de unión del grano. 40X.

Hematoxilina-eosina. La figura 5 muestra hiperqueratosis paraqueratósica y acumulación de polimorfonucleares que forman abscesos, en los que se encuentran numerosos granos pálidamente teñidos con hematoxilina. Algunos tienen forma arriñonada y otros, forma bilobulada. En la periferia de estas lesiones se muestran clavas teñidas con la misma hematoxilina. Ácido peryódico-Schiff (PAS). En la reacción con el ácido peryódico de Schiff se produjo una coloración magenta, positiva, lo que indica la existencia de polisacáridos contenidos en el cemento de unión del grano (figura 6). Metenamina de plata. Con la metenamina de plata se observó la coloración negra, típica de la

impregnación del corte con plata. Se confirmó que la constitución del cemento de unión fue por polisacáridos (figura 7). Azul alciano. La tinción de azul alciano sobre el corte de un actinomicetoma causado por Nocardia brasiliensis fue negativa. Esto se debe a que el color del corte fue magenta y no el típico color azul intenso cuando hay compuestos polisacáridos ácidos. Por tanto, el cemento de unión en estos granos está constituido por polisacáridos neutros (figura 8). Los cortes provenientes de un micetoma causado por Madurella , teñidos con las cuatro técnicas histoquímicas, proporcionaron la siguiente información:

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Figura 7. Corte de un actinomicetoma por Nocardia brasiliensis con impregnación de plata. El color negro indica la impregnación de plata causada por la reacción del reductor sobre los compuestos polisacáridos constituyentes del cemento de unión en el grano. 40X.

Figura 8. Corte de un actinomicetoma causado por Nocardia brasiliensis, donde se observa coloración magenta homogénea en todo el corte, negativa a los polisacáridos ácidos. El cemento del grano posee polisacáridos neutros. 40X.

Hematoxilina-eosina. En la figura 9 se observa la epidermis acantósica con áreas de ulceración y dermis reticular con focos densos de linfocitos. Se observa un grano amarillo-ámbar a marrón claro, teñido pobremente. La coloración típica con hematoxilina es de color violeta intenso o claro. Ácido peryódico-Schiff (PAS). La figura 10 muestra que la coloración del grano fue de color vino; por ende, se trata de una respuesta positiva a la prueba. No obstante, el polisacárido que está reaccionando es de tipo estructural (quitina), constituyente de la pared de los hongos.

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Figura 9. Corte de un eumicetoma por Madurella con hematoxilinaeosina, se observa un grano de color amarillo-ámbar a marrón claro.elaborado 40X. pdf por medigraphic

Figura 10. Corte de un eumicetoma que muestra la reacción positiva al ácido peryódico de Schiff (PAS). La coloración vino se debe a los componentes de la pared del microorganismo, mas no a las secreciones. 40X.

Metenamina de plata. La impregnación de un corte con metenamina de plata mostró el color negro o marrón oscuro en el contorno del grano. Este resultado señala que los azúcares son constitutivos de la pared del microorganismo e indican que los polisacáridos no poseen grupos funcionales libres, susceptibles de reaccionar a la acidez, lo que muestra la característica estructural de los constituyentes del grano (figura 11). Azul alciano. En la figura 12 se observa que el contorno de la lesión es de color marrón, lo que indica la negatividad a los reactivos de esta técnica, mismos que originarían un color azul intenso. Dado que los

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Figura 11. Corte de eumicetoma por Madurella con impregnación de plata. El color negro indica la impregnación de plata causada por la reacción del reductor sobre los compuestos polisacáridos constituyentes de la pared del grano. 40X.

Figura 12. Corte de eumicetoma generado por Madurella. Se observa una coloración marrón que indica la ausencia de polisacáridos ácidos, los cuales generan la típica coloración azul intensa de esta tinción. 40X.

constituyentes de la pared son polisacáridos estructurales, no son de naturaleza ácida, lo que hubiese dado la típica coloración azul. DISCUSIÓN

En los micetomas se observa hiperqueratosis con paraqueratosis y microabscesos de polimorfonucleares intraepidérmicos, también un contorno cartográfico o arriñonado, bacterias de forma filamentosa o micelio y pseudoclavas que forman el fleco característico. El grano de Actinomadura se tiñe intensamente con hematoxilina-eosina; esto se debe a que la hematoxi-

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lina es un colorante básico, con alta capacidad oxidante. En este caso actúa oxidando los hidroxilos libres de los compuestos que constituyen el grano, mientras que la eosina funciona como un colorante de contraste (es un colorante ácido); esto, a su vez, facilita la identificación de las estructuras del corte. En la reacción de PAS se observó una coloración magenta en el área que ocupa el grano (figura 2), lo que indica una reacción positiva y confirma la presencia de polisacáridos. El ácido peryódico oxida los compuestos que poseen los grupos aldehídos, carboxilos e hidroxilos libres (que, con frecuencia, se encuentran en los azúcares). Cuando éstos reaccionan con el pdf elaborado medigraphic reactivo Schiffpor se genera la coloración antes mencionada. Por lo general, ocurre cuando hay azúcares como galactosa, manosa, fructosa, ribosa y hexosamina.12 En 1970, Lechevalier y Lechevalier13 encontraron azúcares como galactosa, glucosa, manosa, ribosa y madurosa en hidrolizados de granos de Actinomadura. Se sabe que la pared celular de este microorganismo contiene ácido meso-2,6-diaminopimélico y los azúcares que reaccionaron con el reactivo de Schiff.13 Al realizar la técnica de metenamina de plata en los cortes de micetoma, se observaron polisacáridos en el grano, pues cuando la plata los detecta genera una coloración negra (figura 3). La técnica de azul alciano produjo una coloración azul turquesa (figura 4), característica de esta tinción, lo que indica la presencia de polisacáridos ácidos. Los polisacáridos son sustancias polianiónicas que reaccionan de forma diferencial, según los reactivos y condiciones del medio donde se realice la reacción. El azul alciano es un reactivo que posee cobre, el cobre reacciona con los grupos ácidos de los polisacáridos ácidos y da como resultado una sal. Por lo general, el sulfato cuproso es el que confiere la coloración azul en el grano. El trabajo que realizaron Palma y colaboradores 7 confirma la presencia del cemento de unión, compuesto por un polisacárido ácido sulfatado en granos de Actinomadura madurae. En el micetoma causado por Nocardia se observan acumulaciones de polimorfonucleares, que forman abscesos en los que se encuentran granos de forma lobulada o arriñonada. El grano de Nocardia tiñe pálidamente con hematoxilina (figura 5). Al efectuar la reacción con el ácido peryódico de Schiff, se observó

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una coloración magenta que indica que los componentes del grano son de naturaleza polisacárida (figura 6). Se volvió a reafirmar la misma composición de polisacáridos mediante la impregnación con metenamina de plata (figura 7). Al realizar la técnica de azul alciano, se observó una coloración magenta en el micetoma y un color rosa tenue en el grano (figura 8); sin embargo, denotó la naturaleza polisacárida del grano. Estos polisacáridos son neutros, es decir, no poseen radicales ácidos susceptibles de reaccionar con los componentes del reactivo del azul alciano, los cuales originan una coloración azul turquesa como en los granos causados por Actinomadura madurae. Por ende, los polisacáridos del cemento de unión en los granos de Nocardia son polisacáridos neutros. En el eumicetoma causado por Madurella se aprecia la epidermis acantósica, con áreas de ulceración y dermis reticular con focos densos de linfocitos. La figura 9 muestra que, mediante hematoxilina-eosina, los componentes del grano no se tiñen y permanecen de color amarillo ámbar. En el caso de la reacción con el ácido peryódico de Schiff, se obtuvo una reacción positiva. Como lo muestra la figura 10, no se observa cemento de unión en los componentes del grano, sino reacción de los azúcares de la pared del hongo. El tipo de polisacáridos que poseen los hongos es de tipo estructural (quitina) y forma parte de la pared del microorganismo, el cual reacciona con el reactivo de Schiff. Con la metenamina de plata pudo corroborarse que, efectivamente, la pared del microorganismo fue la que dio la reacción positiva (figura 11). La tinción con azul alciano fue negativa (figura 12) y confirma que el tipo de polisacárido que posee es de tipo estructural, es decir, forma parte de la pared del microorganismo. El cemento de unión de los actinomicetomas es un polisacárido secretado por los microorganismo, ya que el polisacárido de los granos formados por Actinomadura madurae (polisacárido ácido sulfatado) es diferente al de los granos formados por Nocardia brasiliensis (polisacáridos neutros). No se encontró cemento de unión en los granos del eumicetoma.

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CONCLUSIONES

El grano de Actinomadura madurae contiene cemento de unión, compuesto por un polisacárido ácido sulfatado. El grano de Nocardia brasiliensis contiene un cemento de unión, compuesto por un polisacárido neutro. No se encontró cemento de unión en el grano de Madurella. La quitina, constituyente de la pared del hongo, provocó las reacciones positivas que se observaron en algunas técnicas histológicas. En el caso de los actinomicetomas, puede decirse que el cemento que une a los microorganismos lo producen los propios microorganismos. pdf elaborado por medigraphic REFERENCIAS 1.

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