INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACION PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD MICHOACAN

“CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA” TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRO EN CIENCIAS EN PRODUCCION AGRICOLA SUSTENTABLE

PRESENTA:

Q.F.B. HUGO BARRERA CHAVEZ DIRECTORES DE TESIS:

M. en C. REBECA FLORES MAGALLON D.C. JOSE ALBERTO NARVAEZ ZAPATA

JIQUILPAN, MICHOACAN, ENERO DEL 2010

 

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL  SECRETARÍA DE INVESTIGACIÓN Y POSGRADO 

 

CARTA CESIÓN DE DERECHOS    En la Ciudad de Jiquilpan Michoacán el día 9 del mes Diciembre del año 2010, el (la) que suscribe Hugo Barrera Chávez alumno (a) del Programa de Maestría en Ciencias en Producción Agrícola Sustentable con número de registro B081033, adscrito a CIIDIRMichoacán, manifiesta que es autor (a) intelectual del presente trabajo de Tesis bajo la dirección de M. en C. Rebeca Flores Magallón y del Dr. José Alberto Narváez Zapata y cede los derechos del trabajo intitulado “Caracterización molecular de la microbiota asociada al queso Cotija”, al Instituto Politécnico Nacional para su difusión, con fines académicos y de investigación. Los usuarios de la información no deben reproducir el contenido textual, gráficas o datos del trabajo sin el permiso expreso del autor y/o director del trabajo. Este puede ser obtenido escribiendo a la siguiente dirección [email protected]. Si el permiso se otorga, el usuario deberá dar el agradecimiento correspondiente y citar la fuente del mismo.

Hugo Barrera Chávez

El presente trabajo se llevo a cabo en el Laboratorio de Microbiología de los Alimentos del Centro Interdisciplinario de Investigaciones para el Desarrollo Integral Regional Unidad Michoacán y en el Laboratorio de Biotecnología Industrial del Centro de Biotecnología Genómica, bajo la dirección de la M. en C. Rebeca Flores Magallón y del Dr. José Alberto Narváez Zapata.

CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA

 

INDICE

ABREVIATURAS DEDICATORIA AGRADECIMIENTOS RESUMEN ABSTRACT

VI VII VIII IX X

1. INTRODUCCION 2. ANTECEDENTES

1 3

2.1. Quesos mexicanos genuinos 2.2. Antecedentes histórico del queso Cotija 2.2.1 Región de origen 2.2.2. Proceso de elaboración 2.2.3. Características del queso Cotija 2.2.4. Marca colectiva queso Cotija Regio de Origen 2.2.5. Denominación de origen 2.3. El queso 2.3.1. Clasificación de los quesos 2.3.2. Obtención del queso 2.4. Microbiota causante de las características organolépticas en el queso 2.5. Bacterias Acido Lácticas (BAL) 2.5.1. Lactobacillus 2.5.2. Lactococcus 2.5.3. Streptococcus 2.5.4.Enterococcus 2.6. Microbiología de los quesos 2.7. Cultivos iniciadores 2.8. Bacterias Acido Lácticas no iniciadoras 2.9. Otros microorganismos presentes en los quesos 2.10. Caracterización de microorganismos presentes en los quesos 2.11. Identificación procariótica molecular 2.12.Acido Ribonucleico ribosomal 16S (ARNr 16S) 2.13. Identificación eucariótica mediante la región Interna Transcrita Espaciadora (ITS) 2.14.Principales técnicas moleculares para la identificación de microorganismos 2.14.1. Extracción de ADN 2.14.2. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 2.14.3. Secuenciación del producto de PCR 2.14.4. Análisis de la secuencia CIIDIR - MICHOACAN

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3 4 6 7 8 8 10 10 11 12 13 14 16 17 18 18 19 19 21 21 22 24 24 26 28 29 29 30 31 HBC

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2.15. Antecedentes en el uso de métodos fenotípicos y genotípicos para la caracterización de microorganismos en quesos

31

3. 4. 5. 6. 7.

JUSTIFICACION HIPOTESIS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS PARTICULARES MATERIALES Y METODOS

33 34 34 34 35

7.1. Recolección de muestras 7.2. Aislamiento de bacterias, mohos y levaduras 7.3. Identificación de Bacterias Acido Lácticas (BAL) 7.4. Identificación de mohos y levaduras 7.5. Aislamiento de microorganismos del queso para la identificación por métodos moleculares 7.5.1. Extracción de ADN de la fracción bacteriana 7.5.2. Extracción de ADN fúngico 7.5.3. Determinación de la integridad del material genético mediante electroforesis en gel de agarosa 7.5.4. Cuantificación del ADN obtenido 7.5.5. Reacción en Cadena de la Polimerasa 7.5.6. Secuenciación y análisis de los productos obtenidos por PCR 7.6. Determinación de la diversidad genética mediante REP-PCR y ERIC PCR

35 35 36 37 37

40 40 42 43 46

8. RESULTADOS Y DISCUSION 8.1. Recuento de bacterias mohos y levaduras del queso Cotija 8.2. Aislamiento e identificación de bacterias del queso Cotija 8.3. Aislamiento e identificación de levaduras y moho del queso Cotija 8.4. Utilización de las pruebas fenotípicas y genotípicas en la caracterización de microorganismos 8.5. Diversidad genética de la microbiota asociada al queso Cotija por ERICPCR y REP-PCR

46 48 55 61 63 67 68 75 79

9. CONCLUSIONES 10. BIBLIOGRAFIA 11. GLOSARIO 12. APENDICE

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38 38 39

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Listado de Figuras Figura 1. Región de origen del Queso Cotija. Figura 2. Signo distintivo de la Marca Colectiva Queso Cotija Región de Origen Figura 3.Ribosoma procariótico. Figura 4. Localización de los genes ITS. Figura 5. Ribosoma Eucariótico. Figura 6. Diagrama esquemático de la familia multigénica del ADN ribosomal. Figura 7. Amplificación del ADNr 16S Figura 8. Relaciones evolutivas de las muestras de bacterias, basadas en la secuencia de rADN 16S. Figura 9. Árbol filogenético de las levaduras implicadas en el proceso de elaboración del Queso Cotija, basado en las secuencias ITS1-5.8SITS2 Figura 10. Patrón obtenido utilizando la técnica REP-PCR para las bacterias del queso Cotija. Figura 11. Patrón obtenido utilizando la técnica ERIC-PCR para las bacterias del queso Cotija Figura 12. Patrón obtenido utilizando la técnica de REP-PCR para las levaduras del queso Cotija Figura 13. Patrón obtenido utilizando la técnica de ERIC-PCR para las levaduras del queso Cotija

7 9 25 27 26 41 48 52 59 64 64 65 65

Listado de Tablas Tabla 1. Diferenciación de los géneros de Bacterias Acido Lácticas Tabla 2. Composición microbiológica del queso Cotija. Tabla 3. Caracterización fenotípica de las bacterias aisladas y clasificación taxonómica de acuerdo con la secuencia del 16S rADN Tabla 4. Tabla de fermentación de carbohidratos por parte de las Bacterias Acido Lácticas. Tabla 5. Características fenotípicas de mohos y clasificación taxonómica de acuerdo a la secuencia ITS1-5.8S-ITS2. Tabla 6. Asignación de género de acuerdo a las características fisiológicas de las cepas aisladas de queso Cotija proceso de fabricación.

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36 46 49 53 55 56

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ABREVIATURAS

ADNr

Acido Desoxirribonucleico ribosomal

BAL

Bacterias Acido Lácticas

BMA

Bacterias Mesófilas Aerobias

dNTP

Deoxinucléotidotrifosfato

EDTA

Acido Dietilenaminotetraacetico

ERIC

Secuencias Repetitivas Intergénicas de Consenso de Enterobacterias

ITS

Internal Transcribed Spacer

LB

Medio Luria Bertani

MRS

Medio Rogosa-Sharpe

mg

Miligramo

ml

Militro

mM

Milimolar

NCBI

National Center for Biotechnology Information

nm

Nanometros

PDA

Agar Papa Dextrosa

pH

potencial de Hidrogeno

PCR

Reacción en Cadena de la Polimerasa

REP

Secuencias Repetitivas Extragénicas Palindrómicas

rpm

Revoluciones por minuto

ARN

Acido Ribonucleico

µg

Microgramos

µl

Microlitros

UFC

Unidad Formadora de Colonias por mililitro

UV

Luz ultra violeta

Taq

ADN polimerasa de Thermus acuaticus

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DEDICATORIA A Dios que si no fuera por el nada en este mundo tendría sentido. A mis padres Nicolás Hugo Barrera Guido y Obdulia Chávez Paniagua, por darme la vida, su amor, por ser mi modelo a seguir, mis pilares y las personas que más amo en la vida en fin por darme su apoyo incondicional en cada una de la empresas que me propuesto y que el mejor agradecimiento es culminarlas para verme realizado en la vida. A mi esposa, mi amiga, mi compañera, mi complemento, mi mor, en fin la mujer que más amo Ema Paulina Canela Torres que a lo largo de esta aventura llamada maestría, es la persona que me ha alentado a seguir hasta conseguir el objetivo, a pesar de mis ausencias, siempre me ha dado su amor incondicional y apoyo. A la M.C. Rebeca Flores Magallon, ya que en el recorrido de este camino dejo de ser mi directora de tesis para convertirse en amiga y que sin su confianza y apoyo no habría llegado a esta instancia. A mis hermanos René, Jesús, Rosy, Luis y Cesar (Churi) por su compañía y amistad que en esos momentos duros me hizo salir adelante para seguir en esta carrera de la vida dándome aliento y alegría en cada momento, así como a mis suegros; Rogelio Canela Canela y Rosa María Torres Canela, por abrirme las puertas de su casa, darme su confianza, su apoyo y preocuparse de mí, haciéndome sentir como un hijo más en su familia y así poder verlos como padres. A mi abuelo Jesús Chávez Tovar y a mi amigo Ulises Jasiel Contreras Núñez que se adelantaron en el camino, pero que su calidad como personas y su fascinación por la vida me sigue motivando, que esto seguro les llenaría de orgullo, como orgulloso estoy por haber vivido con ustedes.

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AGRADECIMIENTOS Al Dr. José Alberto Narváez Zapata por abrirme las puertas de su laboratorio, confiar en mí para la realización de este proyecto, por su dirección, por alentarme a seguir y lo más importante, su amistad la cual me ha brindado desde mi paso por Reynosa y hasta este instante lo cual significa mucho para mí. A la D.C. Patricia Larralde Corona, a Amanda Alejandra Oliva Hernández, Francisco de la Torre (Parejota), Rubén Carmona (El chiquitín), Manuel Arratia (El bebo), Elizabeth Hernández, Iván Rosas (El vecino), Leandro Paramo, que hicieron inolvidable mi estancia en el Centro de Biotecnología Genómica de Reynosa Tamaulipas, con su ayuda, consejos, comprensión, en fin brindándome algo que es muy importante en mi vida, su amistad y que eso es lo mejor que me pude haber traído de dicha estancia, no tengo palabras para decirles todo lo que les agradezco y los quiero. A Minerva (CIIDIR-Michoacán), Isabel y Erika (CBG-Reynosa) que cuando tropezaba en el laboratorio siempre tuvieron un minuto para brindarme una sonrisa, su ayuda y paciencia durante mi estancia en los laboratorios. A mis compañeros de la maestría, Vero, Ana, Alejandro, Eli, Octavio, que me bridaron su amistad y compañerismo durante estos dos años. Al comité tutorial, Dr. José Luis Montañez Soto, Dr. Carlos Víctor Muñoz Ruiz y M. en C. Marion Carrión Gutiérrez por su críticas constructivas hacia mi trabajo y apoyo Se agradece al IPN por el apoyo económico para la culminación del presente trabajo a través de la Beca Tesis y la beca del Programa Institucional de Formación de Investigadores (PIFI).

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RESUMEN

El queso Cotija es un queso mexicano, artesanal, madurado, producido en la región de Cotija Michoacán México desde hace 400 años. Posee gran aceptación en el mercado por sus características particulares de olor y sabor, las cuales provienen de su fermentación producida por los microorganismos presentes el proceso de su elaboración. Los microorganismos involucrados son homofermentadores (capaces de utilizar la lactosa de la leche y producir acido láctico) y heterofermentadores (que como resultado de su metabolismo producen etanol, acetato y CO2), principalmente. El presente trabajo contempla la caracterización fenotípica y molecular de la microbiota asociada al proceso de elaboración del queso Cotija. Para esto, se obtuvieron 27 aislamientos pertenecientes a bacterias (16) y a levaduras (11). Las bacterias se aislaron en medio MRS y para su caracterización se utilizaron pruebas de tinción de Gram, actividad catalasa, movilidad, producción de CO2, utilización de glucosa, desarrollo a 15°C y 45°C, así como a diferentes concentraciones de NaCl y pH (para su ubicación dentro de los géneros de BAL). El análisis fenotípico se complemento con el perfil de utilización de diferentes carbohidratos y el análisis de la secuencia del gen 16S ribosomal. La fracción fúngica presente en el queso se caracterizó por su capacidad de utilización de carbohidratos como fuente de carbono, el crecimiento a 48°C y, a pH de 8.0 y el análisis de la secuencia ITS1-ITS2 ribosomal. Los resultados mostraron que la flora bacteria está compuesta por Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei,

Lactobacillus sp.,

Bacterium sp., Lactobacillus casei,

Pediococcus sp., Lactobacillus brevis y la fracción fúngica por: Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Rhodotorula mucilaginosa, Galactomyces geotrichum y Pichia guillermondii.

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ABSTRACT

Ripened and artisanal Cotija cheese is produced in Cotija region (Michoacán, México) from 400 years ago. This cheese posses a high consumer acceptation by their organoleptic properties, which are provide by the microorganism that occurs during their manufacturing. The microorganisms involved mainly are homo-fermentative (they are able to use lactose as carbon source and of produces lactic acid), and hetero-fermentative (they are able to produce ethanol, acetate and CO2). Present study covers the phenotypic and molecular characterization of the micro-biota related with manufacturing process of the Cotija cheese. It was obtained 27 isolations belongs to bacteria (16) and yeast (11). The bacteria were isolated in MRS medium and phenotipically characterized by using gram test, catalase test, motilidad, glucose consumes, CO2 production, carbohydrate profile, and development at 15°C and 45°C, and at different pH and NaCl2. These analyses were supported by sequence analysis of the 16S rRNA region. Fungal fraction was characterized by carbohydrate consumer profile, grown at 48°C, and at pH de 8.0. These analyses also were supported by sequence analysis of the ITS1-ITS2- rRNA ribosomal region. Results showed that microflora is composed by Lactobacillus sp., Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Bacterium sp., Lactobacillus casei, Pediococcus sp., Lactobacillus brevis, Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Rodothorula mucilaginosa, Galactomyces geotrichum and Pichia guillermondii.

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1. INTRODUCCIÓN

El queso Cotija originario de la región del mismo nombre en el estado de Michoacán, posee gran aceptación en el mercado Mexicano por sus características organolépticas y su consumo va en aumento, incluso en el extranjero, donde ha llegado a recibir reconocimientos por su sabor característico. Este queso es un producto artesanal que se obtiene a partir de la leche cruda de vaca, presenta una textura friable, es de sabor fuerte y posee un alto contenido de sal. Es uno de los pocos quesos maduros que se consumen en el país. Con el fin de brindarle la posibilidad de ingresar a los mercados internacionales y aportar información de utilidad para el otorgamiento de la denominación de origen del queso Cotija, el objetivo del presente trabajo de investigación consiste en realizar la caracterización, microbiológica de este queso en el producto final. Lo anterior permitirá apoyar el proceso de su incorporación como producto con denominación de origen y también mejorar la calidad del mismo durante su proceso de elaboración. A la fecha, no existen reportes sobre la población microbiana presente durante el proceso de elaboración de este queso y que probablemente participen en la adquisición de las propiedades organolépticas tan características del mismo. Para lograr lo anterior el presente estudio contempla el aislamiento, identificación y caracterización de los microorganismos presentes en el queso ya madurado, a través del empleo de pruebas

fenotípicas,

así

como

técnicas

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1  

moleculares

de

análisis

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2. ANTECEDENTES

2.1. Quesos mexicanos genuinos Los quesos artesanales poseen gran aceptación y prestigio, sobre todo en Europa, donde se producen con un sello local, permitiendo la revaloración del territorio y la cultura de la comunidad que los fabrica. Estos quesos fueron los precursores de los industrializados y muchos de ellos son elaborados con leche cruda. Algunos quesos artesanales mexicanos son tan originales (por su forma, origen de la leche con que se elaboran, técnica de fabricación, maduración y propiedades organolépticas) que, en principio, pueden ser aspirantes a lograr una figura de protección jurídico-comercial como una marca colectiva (MC) o una denominación de origen (DO) (Villegas 2004). Este es el caso del queso de Poro de Tabasco, o el queso Chihuahua menonita. De hecho, desde el 2005, ya se reconoce un queso artesanal mexicano con marca colectiva: el Cotija Región de Origen (de la Sierra de Jal-Mich, Jalisco-Michoacán) que constituye un punto de referencia para estos productos nacionales (Chombo et., al. 2008). México posee un valioso patrimonio gastronómico y cultural constituido por sus quesos genuinos, artesanales e industriales, que constituyen un recurso para el desarrollo socioeconómico de distintas regiones donde se producen (Villegas 2004). Los quesos mexicanos genuinos, según Villegas (2004), deben cumplir con los siguientes rasgos • Son elaborados a partir de leche fluida, de vaca o de cabra, con el empleo mínimo de

aditivos tradicionalmente incorporados, permitidos por las normas vigentes, tales como cuajo, colorante de achiote, cloruro de calcio y sal común. No incluyen grasa vegetal, ni derivados proteicos de la leche, a excepción de pequeñas cantidades de estos últimos,

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solamente para estandarizar la proporción entre la grasa y la proteína de la leche de proceso (Villegas, 2004). •

Una fuerte raíz histórica nacional; se elaboran desde tiempos de la Colonia, o en

tiempos más recientes, pero al menos desde hace más de cuatro décadas. Sobre sus características y procesos de elaboración, aunque no se dispone de información escrita puntual, se considera muy válida la tradición oral recogida a lo largo y ancho del territorio nacional por diversos informantes, técnicos de diversas especialidades y gente del pueblo. Son elaborados dentro del territorio nacional. Muchos de estos productos han nacido regionalmente, y siguen siendo productos locales, otros se han difundido ampliamente en el país y poco en el extranjero, sobre todo por migrantes mexicanos hacia los Estados Unidos de Norteamérica (Villegas 2004).

2.2. Antecedentes históricos del queso Cotija En México, los quesos se comenzaron a elaborar con la llegada de los españoles en el siglo XVI quienes trajeron consigo diversos animales como vacas y cabras, a partir de las cuales obtenían leche para la elaboración de una amplia variedad de quesos con una gran diversidad sensorial (Cervantes et al., 2008).   El queso Cotija nació como consecuencia del asentamiento de los españoles en el valle de Cotija y sus alrededores quienes, en búsqueda de oro y espacios libres para sus animales, transformaron a esta región en una zona ganadera. Según los productores de la región, el origen de la nombre “Cotija” surge de la costumbre de comercializar el queso elaborado en la región de Jal-Mich, en la ciudad de Cotija, Michoacán donde anteriormente existía una estación de tren (Briones et al., 2009). El pueblo de Cotija se caracteriza por ser un pueblo de arrieros, la producción de queso se realiza en toda la región pero particularmente se concentra en las zonas serranas, aisladas, donde es una necesidad procesar la leche en queso maduro para posponer su venta (Barragán et., al. 1998). CIIDIR-MICHOACAN

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La zona se caracteriza por movimientos de migración importantes: la sierra expulsa gente, pero al mismo tiempo arriba de áreas vecinas en búsqueda de tierras para vivir. A finales de siglo XIX, se realizaron agrupamientos voluntarios de las explotaciones lecheras, a menudo encabezado por sacerdotes (de las mismas familias), formando incipientes pueblos (Barragán, 1997).   La ganadería se mantiene a la periferia de esos agrupamientos, ya que requiere de grandes espacios (Barragán et., al., 1998). El queso Cotija alcanza su auge en la primera mitad del siglo XX. Según los ancianos, “se vivía muy bien” del queso Cotija en aquella época. Pero el desarrollo de las infraestructuras públicas, carreteras y electricidad en particular, han llevado a la decadencia progresiva del queso Cotija. Más exactamente, las carreteras favorecen un acceso más amplio al mercado que va incentivar nuevas formas de producción. La producción pasa de ser estacional a anual, con la introducción de razas mejoradas criadas de manera semi-intensiva (Barragán, 1990). El queso solo se conserva unos días hasta su venta, ya no se madura. Además, la llegada de la electricidad incentiva la introducción de innovaciones técnicas, como el uso de descremadora. El ejemplo más obvio es la evolución que conoció la producción de queso en San José de Gracia, un pueblo cercano de la zona de producción. Pasó de la producción artesanal de queso Cotija, madurado, a una producción industrial de quesos, primero con leche bronca y luego quesos rellenos y análogos (Barragán, 1997). Baisnée (1989) señala que, la baja disponibilidad en mano de obra, es importante para entender la transformación de los sistemas de producción agropecuarios y queseros. Frente a la producción de quesos de forma semi-industrial o industrial, los productores artesanales no pueden competir. Se especializan unos en la producción de leche y otros se vuelven queseros “de tiempo completo”. Pero la tradición del queso Cotija, como producto estacional, artesanal y madurado, va a mantenerse en las zonas más aisladas de la región, que no se benefician del mejoramiento de las infraestructuras. Razón por la cual, se menciona a la Sierra de Jal-Mich (Jalisco – Michoacán) como la zona de refugio del auténtico queso Cotija. La razón de esa continuidad es muy sencilla: los productores, si quieren permanecer en sus ranchos, no tienen otra alternativa que de seguir CIIDIR-MICHOACAN

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con el sistema de producción tradicional que vincula la producción de queso Cotija, la crianza de becerros y el cultivo itinerante del maíz. Pero aun así, la supervivencia es difícil, ya que la venta del queso debe ajustarse al precio de los quesos industriales, vendidos a bajos precios. Además, la presión demográfica interna genera un fraccionamiento excesivo de la propiedad, debilitando la viabilidad económica de los ranchos (Barragán, 1997). Los productores comenzaron a desarrollar otra estrategia, la emigración. De tal forma, que muchos ranchos desaparecieron o abandonaron la producción de leche y los ranchos de ordeña. Por lo cual concluyen Barragán y Chávez (1998) que “el queso Cotija se nos va de las manos” y que está en peligro de desaparición, trayendo consigo la desaparición de la sociedad ranchera de la sierra de Jal - Mich.

2.2.1. Región de origen Primero es importante especificar que la zona de producción de la materia prima, la leche, y la zona de elaboración del queso Cotija es la misma. De hecho, el queso se caracteriza por ser producidos por los mismos ganaderos, únicamente a partir de su propia producción de leche. La zona, con una forma de herradura orientada al norte, abarca una superficie de aproximadamente 2 400 km², de los 19°15’ a los 19°40’ de latitud norte y de los 102°30’ a los 103°05 de longitud oeste (Figura 1.). Es una zona continua, ubicada en la sierra JalMich, entre los estados de Jalisco y de Michoacán, incluyendo principalmente los municipios de Santa María del Oro (Jalisco) y la parte sur de los municipios de Cotija y de Tocumbo (Michoacán). Además se extiende a territorio de los municipios siguientes: norte de Jilotlan de los Dolores, oriente de Tamazula, sur de Valle de Juárez y de Quitupán (Jalisco); suroeste de los Reyes, Peribán y Tancítaro, y norte de Buena Vista Tomatlán (Michoacán). En realidad, los municipios que cuentan con productores de queso Cotija son seis: Santa María del Oro, Jilotlan de los Dolores y Quitupán (Jalisco); Cotija, Tocumbo y Buena Vista Tomatlán (Michoacán).

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Figura 1: Región de origen del queso Cotija. Tomado de Álvarez et al., 2005.

2.2.2 Proceso de elaboración En el proceso de elaboración del queso Cotija se utiliza leche entera y fresca, a la cual se le adiciona únicamente cuajo y sal. La pasta que se obtiene y se deposita sobre dos mantas de henequén contenidas dentro del aro que le da su forma cilíndrica y de gran formato de 20 kilogramos en promedio, derivados de los 200 litros de leche que contiene cada pieza de este tradicional queso. Durante los primeros tres meses de vida de anaquel, las piezas de queso permanecen en los ranchos de la región, bajo el cuidado y atención de los productores, lo que le da al queso su corteza rugosa y gruesa, de color que varia del amarillo paja al ocre; textura firme, su sabor pronunciado y aroma refinado. Al tacto la pasta es dura y homogénea; al corte presenta una estructura que puede ir de compacta a granulosa; al paladar es cremoso y de buen sabor (Chombo, 2003).

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2.2.3. Características del queso Cotija El queso se produce de manera natural, es decir, a partir de leche entera, sin la adición de compuestos químicos o análogos de leche u otros ingredientes que no sean sal y cuajo. Su composición básica será: Humedad máxima de 36%, grasa mínima 23% y proteína mínima 25%, y el Queso Cotija Región de Origen, deberá: tener un mínimo de tres meses de vida dentro del área geográfica de origen, considerando el inicio de su vida a partir del retiro de la prensa. Este mantendrá su presentación de gran formato, cuyas dimensiones en promedio son 40cm de diámetro y 18 cm de altura (Álvarez et al., 2004).

2.2.4. Marca colectiva queso Cotija región de origen La marca colectiva es un signo distintivo que sirve para diferenciar en el mercado los productos o servicios de los miembros de una asociación o sociedad con respecto de los productos o servicios de terceros. Dicha marca o signo se coloca en el producto para identificar especialmente que ha sido elaborado por un grupo específico de personas de una región determinada (IMPI, 2006). La Marca Representa una protección oficial y con ella una ventaja competitiva del producto en el mercado, dando garantía de autenticidad y calidad a los consumidores y un sobreprecio justificado por la especificaciones geográficas y culturales incorporadas en el producto por las condiciones precarias en que estos producen y por el apego a determinadas normas de calidad y por la preservación del medio ambiente (IMPI, 2006). Pero proteger un nombre no es suficiente, eso debe ir de la mano con innovaciones técnicas que garantizan la calidad sin perder la tipicidad. También deben mejorar las condiciones generales de vida de los productores. Se trata entonces de un proceso integral de desarrollo y de calificación.

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El queso Cotija de la sierra de Jal - Mich obtuvo la MC “Cotija Región de origen” en el 2005 (Figura 2). Esto bajo la figura legal de Sociedad de Producción Rural (SPR-RI), de la Asociación Regional de productores de queso Cotija el 7 de marzo del año antes mencionado, por medio del Instituto Mexicano de la Propiedad Intelectual (IMPI) bajo los números 86758 y 867586 (IMPI 2006). Pero no se logró a cumplir con la meta de conseguir la Denominación de Origen (DO), la más adecuada para este tipo de producto, por el conflicto de interés creado por la existencia de un queso tipo Cotija muy difundido en todo México (Chombo, 2005). En la actualidad solo un reducido número de productores dispersos en un santuario ranchero al sur de la ciudad de Cotija, donde confluyen los estados de Jalisco y Michoacán, mas por la tenacidad que les impone su aislamiento que por las ganancias que les arroja su actividad agropecuaria, siguen recreando la tradición que permite contar aun con un producto artesanal de alta calidad y con las características que desde hace más de cuatro siglos le han dado su buena fama en todo el país.

Figura 2. Signo distintivo de la Marca Colectiva Queso Cotija Región de Origen

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2.2.5. Denominación de origen

La Denominación de origen es la denominación geográfica de un país, una región o de una localidad que sirva para designar a un producto originario del mismo y cuya calidad o características se deben exclusiva o esencialmente al medio geográfico, comprendidos los factores humanos y naturales (Lisboa 1966) y estos deben cumplir con los siguientes requisitos para que se les otorgue: •

Haber sido elaborado en la región, comarca, localidad o lugar determinados materias primas procedente de los mismos

•

Disfrutar de un elevado prestigio en el tráfico comercial en atención a su origen.

•

Que su calidad y características se deban fundamental o exclusivamente al medio geográfico que incluye los factores naturales y humanos.

•

Además, haber transcurrido, al menos, cinco años desde su reconocimiento como calidad con indicación geográfica.

2.3.

El queso

El queso es una alimento muy apreciado por el hombre debido a sus cualidades nutritivas y sensoriales; ha sido elaborado desde hace varios siglos a partir de leche de cabra, oveja, vaca y otros rumiantes. Se cree que los quesos tienen su origen en la observación accidental de la fermentación de la leche cuando era transportada en estómagos de animales, lo que ocasionaba la separación del suero y cuajada; el secado o salado parcial de esta última, se aproxima a una forma primitiva de elaboración de queso que tribus nómadas preparaban así muchos años atrás (Fernández, 2000). El queso es el producto resultante de la coagulación de la leche de ciertos mamíferos mediante la renina, presente en el cuajo, o por enzimas similares; del coágulo (cuajada) se elimina el agua por corte, agitación de los fragmentos resultantes y por el subsiguiente CIIDIR-MICHOACAN

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moldeado, prensado y madurado en condiciones adecuadas (Kosikowski, 1977). La FAO (1966) definió el queso como aquel "producto fresco o madurado obtenido por coagulación de la leche entera u otros productos lácteos como nata, leche parcial o totalmente desnatada, suero de mazada o de sus mezclas, y posterior separación del suero". Para Alais (1985), el queso es "una forma de conservación de la caseína y de la materia grasa de la leche, que se obtiene por coagulación de la misma seguida del desuerado, donde se separan, por un lado, el suero constituido por la mayor parte del agua y de los componentes solubles de la leche y, por otro, la cuajada que aún retiene una pequeña fracción del suero. En la actualidad se producen una gran diversidad (ICMSF, 1998) de quesos dependiendo de condiciones tecnológicas que con el tiempo introdujeron países o regiones de todos los continentes. Estas incluyen principalmente: la fuente y composición de la leche, el tipo de agente coagulante, las condiciones de coagulación, el corte, tipo de cultivos microbianos, el tratamiento que reciba la cuajada, las condiciones de maduración y la eventual adición de diversos ingredientes (Fernández, 2000).

2.3.1. Clasificación de los quesos Se pueden clasificar primariamente en quesos madurado o no madurados. Los primeros tienen consistencia blanda y bajo (Cottage) o alto (Neufchetel) contenido de grasa. Son madurados aquellos que se someten aún proceso de fermentación, breve (horas) o prolongado (meses). Por su contenido en humedad se agrupan en muy duros, duros, semiblandos y blandos: 26-34% (Parmesano), 35-45% (Gruyere), 45-55% (Limburger) respectivamente. Hay que agregar los quesos fundidos y los requesones, estos últimos (como el Ricotta) preparados a partir del suero láctico. En nuestro país se producen algunas variedades de quesos que no son comunes en los países industrializados. Pueden mencionarse: el Panela, el Oaxaca, el Cotija y el Chihuahua. Únicamente estos dos últimos son madurados, pero a partir de su flora natural (Fernández ,2000). CIIDIR-MICHOACAN

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2.3.2. Obtención del queso El proceso de elaboración de un queso implica, tres grandes pasos: 1.

La coagulación de la leche. Este proceso implica actuar sobre la caseína de la leche,

usando renina o cuajo (enzima obtenida de la mucosa del cuarto estomago de los rumiantes) (Fox et al., 2000). La caseína (principal proteína de la leche) se encuentra combinada con el calcio formando pequeñas partículas; estas se mantienen estables en suspensión coloidal. En presencia de renina se forma paracaseinato de calcio. Cuando este reacciona con iones libres de calcio se produce un coagulo cuya firmeza y dureza son afectadas por la cantidad de cuajo agregada, la concentración de iones calcio en la leche, la temperatura, la acidez de la leche, y el tratamiento que esta haya recibido. En la actualidad existen preparados comerciales de enzima coagulantes obtenidas de bacterias seleccionadas (Mucor miehei, M. pusillus, Endothia parasítica). (Fernández, 2000). 2.

Separación de la cuajada y el suero. Esta separación se acelera por calentamiento,

disminución del pH y manipulación del coagulo. La cantidad de sólidos que se separan del suero difiere entre los quesos. Los microorganismos, incluidos, Bacterias Acido Lácticas (BAL) y microorganismos patógenos si existieran se concentran 1-2 log10, en la cuajada con respeto a los presentes en la leches. La actividad fermentativa por tanto, se genera más intensamente dentro de la cuajada (Fernández, 2000). 3.

La maduración o afinación de la pasta, por lapsos que van desde unos días hasta varios

meses, en condiciones ambientales apropiadas. Durante este proceso la masa del queso experimenta fenómenos bioquímicos complejos que se traducen en nuevos atributos sensoriales del producto, por ejemplo: firmeza, elasticidad, plasticidad y cohesión (Fox et al., 2000), esto como consecuencia de la actividad de los cultivos adicionados o los inherentes a la leche. La perdida de la firmeza se relaciona con la digestión de la caseína. Si el contenido de la humedad es bajo se torna friable, lo que también se favorece por un exceso en la acidez. Es un defecto en quesos como el Cheddar, pero una cualidad deseable en el Roquefort. La fermentación de la lactosa por cultivos iniciadores en el interior de los coágulos contribuye a su contracción y a la expulsión de más suero (quesos menos blandos), el proceso confiere aromas al producto e inhibe el desarrollo de bacterias CIIDIR-MICHOACAN

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patógenas. La mayor parte de la lactosa desaparece por la fermentación generándose principalmente acido láctico, acético, etanol, CO2, acetaldehído, algunos acidos volátiles y otras sustancias. En quesos como el Emmental, la fermentación es propionica; se acompaña de producción de acido acético y CO2. Agotada la lactosa, se restringe la actividad de bacterias indeseables, contribuyendo así a la estabilidad de los quesos madurados. La actividad enzimática (inherente a ala maduración) es de una complejidad singular. Las proteínas son hidrolizadas en grado variable; intensamente en blandos como el Camenbert y Limburger. Participan en el proceso la renina y más activamente exoproteasas bacterianas. Cocos y bacilos lácticos liberan endoenzimas cuando mueren y se autolizan. El proceso de maduración puede ser menor de una semana (Manchego), alrededor de un mes (Limburger), dos (Brick), 4-6 (Camembert), hasta 12 (Cheddar). Para acelerarlo en algunos quesos, se puede hacer uso de enzimas (proteasas, péptidas y lipasas) (Fernández 2000). La maduración de algunos quesos alcanza proporciones sorprendentes. El queso Roquefort sufre un proceso de putrefacción, enranciamiento y fermentación que en poco se distingue de los que ocurre en un alimento que se considera claramente descompuesto; la biomasa microbiana (vivos o muertos), representa mas del 90% de su peso en producto desecado. Algunos quesos maduran a través del desarrollo superficial de bacterias, las cuales no se incorporan en cultivos puros. Son bacterias que suelen estar presentes en las materias primas y ambiente de los sitios de maduración, y proliferan dadas las condiciones favorables que naturalmente se presentan. Puede apreciarse un desarrollo metabólico de levadura halotolerantes, bacterias fermentadoras de lactosa y Brevibacterium linens, que comunica con irregularidad aromas deseables en los quesos (Fernández, 2000).

2.4.

Microbiota causante de la producción de características de los quesos

Las bacterias acido lácticas, así como las levaduras y mohos juegan un papel muy importante en la producción de las características sensoriales de los diferentes tipos de quesos, principalmente la maduración comprende una serie de cambios de las propiedades físicas y químicas adquiriendo el queso su aspecto, textura y consistencia, así como su CIIDIR-MICHOACAN

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aroma y sabor característicos, producto entre otras cosas de los microorganismos presentes en el queso (Cabeza, 2006). Estos microorganismos llevan al cabo el proceso de la fermentación o glucólisis, en la que se realiza el proceso de conversión de la lactosa a ácido láctico, pequeñas cantidades de ácido acético y propiónico, CO2 y diacetilo. Es realizada fundamentalmente por las bacterias lácticas. Comienza durante la coagulación y el desuerado y se prolonga hasta la desaparición casi completa de la lactosa. El ácido láctico procedente de la degradación de la lactosa no se acumula en la cuajada sino que sufre distintas transformaciones de naturaleza diversa. En quesos blandos madurados por mohos, es metabolizado por éstos. En queso tipo Gruyere se transforma en propiónico, acético y CO2 (Cabeza, 2006). La proteólisis es otro proceso, este es el fenómeno más importante de la maduración, ya que afecta a la vez a la textura y al sabor (Alais, 1981). Como resultado de la proteólisis se acumulan una gran variedad de productos en el queso durante la maduración (Cabeza, 2006). Las proteasas de las bacterias acido lácticas intervienen, en gran parte en la maduración de los quesos de pasta dura (Alais, 1981). Finalmente la lipólisis, o hidrólisis de las grasas afecta a una pequeña proporción de éstas. Sin embargo, los ácidos grasos liberados y sus productos de transformación, aunque aparecen en pequeñas cantidades, influyen decididamente en el aroma y sabor del queso (Cabeza, 2006).

2.5.

Bacterias acido lácticas (BAL)

En 1919 Orla-Jensen elaboró una monografía en la que apunta que las verdaderas bacterias del acido láctico constituyen un gran grupo natural de bacilos y cocos gram positivos, inmóviles, no esporulados, que al fermentar azucares forman principalmente acido láctico. La definición propuesta por Axelsson (1993) para la típica bacteria láctica las describe como gram positivas, no esporuladas, catalasa negativas, sin citocromos, no aeróbicas pero tolerantes, de no fácil cultivo, acidúricas y estrictamente fermentativas con el acido láctico como principal producto final. Con esta descripción parecería que el grupo queda claramente definido. Los límites sin embargo, requieren en la actualidad de pruebas más CIIDIR-MICHOACAN

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refinadas (Fernández, 2000). El grupo es manifiestamente fermentativo. Existen al respecto dos rutas principales: el esquema de Embden Meyerhof con generación casi exclusiva de acido láctico, propio de los homofermentadores y la de la 6-fosfogluconato/fosfocetolasa, del que resultan productos finales como etanol, acetato, y CO2, que caracterizan a los heterofermentadores (Fernández, 2000). Las BAL poseen una notable capacidad de diversificación metabólica del piruvato y el uso de aceptores externos de electrones tales como el oxigeno y compuestos orgánicos. Las consecuencias de este comportamiento se traducen en el mejoramiento de las características sensoriales de alimento, o su deterioro. Los géneros más importantes de BAL son Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissela, Carnobacterium, Tetragenococcus e Bifidobacterium (Klein et al., 1998). Así pues la identificación e inclusión de las BAL en los diferentes genero se basa en la tradicional fenotípica morfológica, rutas de fermentación de la glucosa, desarrollo a diferentes temperaturas, configuración del acido láctico producido, desarrollo a diferentes concentraciones salinas y tolerancia a pH acido y alcalino, composición de ácidos grasos, homología ADN-ADN, secuencia del ARNr y patrones de proteínas solubles (Fernández, 2000). Las BAL se suelen encontrar en tanto en suelos, aguas, y sobre todo asociadas a plantas y animales. Muchas de ellas forman parte la microbiota habitual del tracto gastrointestinal y genitourinario de humanos y animales, donde desempeñan un papel beneficioso en el mantenimiento del la integridad intestinal y en procesos de inmunomodulacion y resistencia a patógenos (Klaenhammer et al., 2005). También se suelen encontrar en multitud de alimentos, teniendo especial importancia en la producción de alimentos fermentados. La contribución más importante de estos microorganismos es la de conservar sus cualidades nutritivas, aumentan por lo general la vida media de estos e inhiben el crecimiento de microorganismo patógenos (O´Sullivan et al., 2002). Esto se debe a la competencia por los nutrientes presentes en el alimento entre los distintos microorganismos, así como la producción de sustancias inhibitorias por las BAL, tales como ácidos orgánicos, peróxido de hidrogeno, y bacteriocinas (Ray, 1992; Budde et al., 2003; Vermeiren et al., 2004).

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Entre los microorganismos que con más frecuencia se aíslan de derivados lácteos, destacan lactobacilos y lactococos. Ambos tienen una gran capacidad acidificante y muchas especies son proteolíticas. Además, en los quesos elaborados en la cuenca europea Mediterránea, también es frecuente aislar enterococos, sobre todo en aquellos que han sido elaborados con leche cruda (Martin, 2008). Por lo tanto es necesario describir las características diferenciales de los principales géneros.

2.5.1. Lactobacillus Bacilos o cocobacilos no esporulados, aerotolerantes o anaeróbicos, acidúricos o acidófilos, con requerimientos nutricionales complejos. Incluye especies homofermentativas obligadas, facultativas heterofermentativas y heterofermentativas obligadas. Alrededor de 50 especies conforman el género. Microaerófilico; el desarrollo superficial generalmente mejora

ante una baja condición de oxigeno (5-10%). Es común la producción de

bacteriocinas. Ocasionalmente forman pigmento; amarillo, rosa o rojo ladrillo. Los límites de temperatura para desarrollar van de 2 a 53°C con óptima de 30-40°C. Se aíslan fácilmente de productos cárnicos, lácteos , de pescadería, agua, frutas, verduras y ensilaje. De acuerdo con Fox et al., (2000), los lactobacilos pueden ser divididos en tres grupos basados en el producto final de su fermentación. Orla-Jensen, en 1919, denomino al primer grupo Thermobacteria, al segundo Streptobacteria el último Betabacteria (Carr et al., 2002; Hammes y Volgel, 1995). El primer grupo está formado por lactobacilos termofílicos homofermentativos que utilizan hexosas como fuente de carbono para producir ácido láctico (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis y Lactobacillus helveticus). En el segundo grupo están los lactobacilos mesofílicos heterofermentativos facultativos, que utilizan otras fuentes de carbono (Hassan et al., 2001), siendo capaces de producir ácidos orgánicos, CO2, alcohol y peróxido de hidrogeno (H2O2). Este grupo incluye Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei y Lactobacillus plantarum que no son comúnmente encontrados como cultivos iniciadores, mas bien están involucrados en la fermentación secundaria, benéfica durante la maduración de los quesos CIIDIR-MICHOACAN

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(Beresford et al., 2004). Estos lactobacilos son llamados Non Starter Acid Lactic Bacteria (NSLAB), bacterias ácido-lácticas no iniciadoras, generalmente encontrados en fermentos lácticos artesanales (Crow et al., 2001; Fox et al., 2000). El tercer grupo, esta formado por los lactobacilos mesofílicos heterofermentativas que utilizan, obligatoriamente, hexosas y pentosas como fuente de carbono. Estos microorganismos pueden producir sabores indeseables y gas durante la maduración de los quesos (Hassan et al., 2001). En este grupo están incluidos Lactobacillus brevis y Lactobacillus fermentum, que también no son encontrados como fermento láctico (Fox et al., 2000). Los lactobacilos heterofermentadores obligados, son detectados con menor frecuencia en quesos (Beresford et al., 2004).

2.5.2. Lactococcus El primer cultivo puro bacteriano obtenido sobre la tierra y descrito científicamente fue Lactococcus lactis, en 1873 por Joseph Lister. Se pueden reconocer como las bacteriass lácticas por excelencia de la leche. Es la BAL más frecuentemente utilizada como cultivo iniciador en la obtención de productos lácteos cultivados, en particular quesos y leches diversas. Consiste en células ovoides que aparecen aisladas, en pares o en cadenas. Algunas cepas forman material gelatinoso que las rodea a manera de capsula. Recuperables de leche cruda y algunas plantas (Fernández, 2000). Los lactococos son los microorganismos mesofílicos mas usados para la producción de ácido en las fermentaciones lácteas, ya que son capaces de convertir rápidamente la lactosa en ácido láctico. Tienen la capacidad de crecer a 10- 45°C en pH óptimo de 6,0–6,5, que son las características más importantes usadas para su identificación. A temperaturas entre 20 ºC e 30 °C, los lactococos se toman de 10 horas a 20 horas para fermentar la leche cruda. El número aproximado de células viables necesarias para realizar la coagulación ácida de leche es de 108 UFC/ ml (Teuber, 1995). Entre las especies conocidas de lactococos, se encuentra, Lactococcus lactis, que es utilizado en la fermentación de productos lácteos, destacándose, como la mas importantes, las subespecies Lactococcus lactis subsp. lactis y Lactococcus lactis subsp. cremoris (Fox et al., 2000). CIIDIR-MICHOACAN

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2.5.3. Streptococcus Son cocos esféricos u ovoides de 0.8-1.2µm, típicamente dispuestos en cadenas hasta con más de 50 células o en pares. Anaerobios facultativos. La especie Streptococcus thermophilus es un termófilo, con cepas especificas que se utilizan en la fermentación de productos lácteos, sobre todo en combinación simbiótica con otras BAL. Lacbacillus bulgaricus estimula al estreptococo liberando aminoácidos mientras que este forma compuestos relacionados con el acido fórmico, que promueven el desarrollo del lactobacilo. Esta especie presenta la habilidad de fermentar un pequeño número de carbohidratos (Hassan et al., 2001), soporta una concentración máxima de NaCl de 2,5% (Fox et al., 2000) y posee actividad proteolítica limitada. Crece a un pH óptimo de 6.5 (Hassan et al., 2001). Streptococcus thermophilus ha sido usado tradicionalmente utilizado para la fabricación de yogurt y de varios quesos, como, por ejemplo el queso Emmental, Gruyère, Parmigiano, Grana, Mozzarella y Cheddar.

2.5.4. Enterococcus Las bacterias del genero enterococo consisten en células esféricas u ovoides. Son inmóviles y carecen de capsula. Catalasa negativos y anaerobios facultativos. El pH final al fermentar carbohidratos es 4.2-4.6. Desarrollan a 10 y a 45°C, a pH de 9.6 y en presencia de bilis al 40%, o de NaCl2 al 6.5%. Los enterococos no son muy comunes en los quesos. Se les detecta en mas del 96% de diferentes variedades de quesos italianos; su número depende de la etapa del proceso muestreada y de los periodos de maduración. En muchos quesos se utilizan como iniciadores, o las células que sobreviven a la pasteurización se muestran muy activas y participan en la generación de aromas (Fernández, 2000).

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2.6.

Microbiología de los quesos

Como hemos visto y mencionado anteriormente los microorganismos responsables de la fermentación láctica son fundamentalmente las BAL, aunque también se pueden encontrar otros microorganismos pertenecientes a otros grupos como micrococos, estafilococos, bifidobacterias, propionibacterias, mohos y levaduras. El crecimiento de estos microorganismos va a estar controlado por algunos factores físico-químicos, como la actividad del agua (aw), concentración de la sal, pH, ácidos orgánicos, temperatura de maduración, potencial de oxido reducción, y presencia de nitratos entre otros factores (Beresford et al., 2001). La importancia de cada uno de estos factores puede venir determinada en muchos casos por el propio proceso de elaboración del queso. Se ha descrito también que la producción de algunas sustancias antagonistas por parte de las bacterias lácticas, como lo son las bacteriocinas, podrían contribuir en el control de determinadas poblaciones microbianas (Cogan, 2002). Los microorganismos que mayormente aparecen en los quesos se ha divido en dos grandes grupos: Cultivos iniciadores y cultivos no iniciadores (Beresford et al., 2001). Los cultivos iniciadores intervienen fundamentalmente en la producción de acido láctico durante la primera etapa de fabricación, la coagulación de la leche y pudiendo formar parte en la maduración del mismo en forma secundaria. Estos pueden presentarse de manera natural o ser añadidos de manera intencional. Los cultivos no iniciadores son microorganismos que no van a intervenir en la acidificación (al menos de forma directa), pero van a desempeñar un papel muy importante durante la maduración del queso (Martin, 2008).

2.7.

Cultivos iniciadores

El principal papel de los cultivos iniciadores es la producción de acido láctico a partir de la lactosa con la disminución del pH. Beresford y colaboradores (2001) definieron a los cultivos iniciadores como aquellos aislados capaces de producir acido láctico hasta reducir el pH por debajo de 5.3 en 6 horas y a una temperatura de 30-37°C. Esta reducción del pH va a afectar la actividad enzimática y la solubilidad de los diferentes minerales CIIDIR-MICHOACAN

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(principalmente calcio y fosfatos). Los cultivos iniciadores también pueden tener un papel importante durante la maduración, debido fundamentalmente

a la producción de

compuestos aromáticos a partir de la lactosa, el citrato, proteínas y los péptidos de la leche, además de contribuir en la textura, como consecuencia de la degradación de las proteínas y grasas. Así los aminoácidos originados por la degradación de las proteínas, servirán como precursores para la formación de compuestos volátiles responsables en gran parte de la características organolépticas del queso (Martin, 2008). Estos cultivos crecen desde el comienzo de la coagulación, hasta alcanzar densidades celulares muy altas en las primeras horas de fermentación (108-109 UFC/g). Posteriormente hay una disminución gradual a lo largo de la maduración del queso. Entre la cepas que se utilizan para este fin destacan las especies de Lactococcus, Leuconostoc y Enterococcus en el caso de los cultivos mesofílicos (crecimiento optimo a 30-37°C), y Streptococcus thermophilus y especies de Lactobacillus como lo son Lactobacillus delbrueeckii y Lactobacillus helveticus en el caso de los termófilos (Crecimiento a 42°C) (Beresford et al., 2001). En el caso de los quesos artesanales que se suelen fabricar sin la adición de cultivos iniciadores, los lactococos presentes en la leche suelen ser los que predominan en la maduración del queso (Martin, 2008). Además de los cultivos iniciadores primarios, se diferencian de estos lo cultivos iniciadores secundarios, que se definen como aquellos cultivos empleados en la producción del queso destinados a desarrollar y controlar el aroma, color y textura del queso (Rattray, 2002). Estos cultivos están conformados por diferentes tipos de bacterias, mohos y levaduras. Se emplean principalmente debido a las propiedades fisiológicas y bioquímicas únicas que poseen y que suelen estar ausentes en los cultivos iniciadores primarios como los son la halotolerancia, crecimiento a bajo pH, utilización del lactato, formación de CO2, o propiedades particulares de proteólisis y lipolisis. Entre estos cultivos destacan Geotrichum candidum que suele encontrarse en quesos con maduración de superficie tanto bacteriana como de levaduras (Martin, 2008).

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2.8.

BAL no iniciadoras

La microbiota láctica secundaria o adventicia, llamada NSLAB por sus siglas en ingles (Non Starter Lactic Acid Bacteria), se desarrolla espontáneamente en todos los quesos independientemente de la manera de producirlos (industrial o artesanal). Este grupo de microorganismos

se

compone

fundamentalmente

de

lactobacilos

mesófilos

heterofermentadores facultativos y obligados como lo son Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus curvatus,

Lactobacillus

brevis,

aunque

también

incluyen

otros

lactobacilos

homofermentadores, Pediococcuos y Leuconostoc (Beresford et al., 2001; De Angelis et al., 2001: Fox et al., 1998). Algunos autores atribuyen hasta el 80% de los defectos detectados en quesos a las NSLAB, mientras que otros han señalado que tienen una importancia menor, y finalmente otros consideran que esta flora adventicia puede jugar un rol positivo en la generación de sabor y aroma, por lo que se puede considerar en estos casos una contaminación deseable (Crow et al., 2001).

2.9.

Otros microorganismos presentes en los quesos.

Además de los grupos bacterianos que se acaban de señalar en los apartados anteriores es conveniente destacar la presencia de otros microorganismos que participan en la elaboración de los quesos, como la bacterias del acido propiónico, bacterias de superficie, mohos y levaduras. Las bacterias del acido propiónico están presentes en muchas variedades de quesos al final de su maduración. Estas son las principales responsables de la características de los quesos suizos como el Emmental o el Gruyere, que aparecen como consecuencia de la acumulación de de gas durante de azúcares y lactato a propionato, acetato, agua y CO2. Se dividen en dos grandes grupos: Las bacteria propiónicas cutáneas y las clásicas. Las clásicas son las importantes en la microbiología de los quesos, como lo son las siguientes especies: Propionibacterium freundenreiheii, Propioniobacterium thoenii, Propioniobacterium jenseii y Propionibacterium acidiopropionici. En quesos elaborado CIIDIR-MICHOACAN

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con leche cruda pueden aparecer de forma, natural, pero en aquellos que en su elaboración se pasteuriza la leche las propionibacterias se añaden durante la elaboración del queso (Beresford et al., 2001). Los quesos madurados en superficie suelen estar inoculados con una o con la combinación de Brevibacterium linens, Geotrichum candidum o Debaryomyces hanseii, tras el salado. En estos quesos, la inoculación en la superficie es mediante salmueras con la que se han lavado previamente los quesos ya madurados. La microbiología de la superficie no esta muy clara pero es necesario el crecimiento previo de levaduras que permitan la desaminación de los aminoácidos a sus correspondientes cetoácidos y amonio con la subsecuente elevación de pH, de tal forma que se favorece el crecimiento de estos microorganismos de superficie (Beresford et al., 2001). Finalmente otro grupo importante de microorganismos en los quesos son las levaduras y hongos. Las levaduras se encuentran presentes en la superficie de una gran mayoría de quesos, aunque su papel en la maduración de los quesos se desconoce. Las levaduras que se aíslan con mayor frecuencia de la superficie de los quesos son, entre otras especies: Debaryomyces hanseii, Kluyveromyces lactis, Yarrowia lipolytica y Trichospora beigelii (Beresford et al., 2001). Los hongos son de especial importancia en dos grupos de quesos, los madurados en presencia de Penicillium roqueforti (por ejemplo el queso Roquefort, Gorgonzola) responsable de las venas azules de estos quesos, y aquellos madurados en presencia de Penicillium camemberti (queso Camembert, Brie), que crecen en la superficie de los mismos (Beresford et al., 2001)

2.10. Caracterización de microorganismos presentes en el queso. En los estudios microbiológicos más actuales, la combinación de técnicas clásicas y técnicas independientes de cultivo están dando resultados sorprendentes, tanto por el número como por los tipos microbianos que se detectan (Amann et al., 1995). Rara vez un método cumple satisfactoriamente con todos los criterios utilizados para su evaluación, por CIIDIR-MICHOACAN

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lo cual, es frecuente y recomendable el uso combinado de diversas técnicas. Usualmente en primera instancia, se utiliza un método de tipificación que arroje resultados rápidamente, seguido de procedimientos que ofrezcan información más precisa (Vilches et al., 2009). Los métodos para la caracterización de microorganismos pueden clasificarse en fenotípicos y genotípicos. Los fenotípicos se basan en la determinación de características bioquímicas y/o fisiológicas e históricamente, constituyen la primera herramienta que permitió la comparación de microorganismos (Zaidi et al., 2003). Estas incluyen la determinación actividades enzimáticas, determinantes antigénicos entre otros. Las técnicas de tipificación genotípica involucran el estudio del genoma del microorganismo lo que nos permite analizar propiedades, características o polimorfismos presentes en los microorganismo en estudio (Pfaller, 1999). Los método fenotípicos constituyen una herramienta muy importante para la tipificación de muchos microorganismos, no obstante el alcance de estos procedimientos puede verse afectado por varios factores (influencia del ambiente y poco poder discriminatorio) (Vilches et al., 2009). Además, resultan poco prácticos para el análisis de microorganismos de crecimiento lento, difíciles de cultivar o no cultivables y que, generalmente, requieren la multiplicación de los mismos, y resultan poco apropiados para determinar las relaciones de clonalidad entre microorganismos presentando una limitada capacidad de identificación a nivel de subespecie, subtipo o cepa (Pfaller, 1999). Los métodos genotípicos están basados en la detección del material genético del organismo, por lo tanto son independientes de los cambios en el patrón de expresión genética y de las influencias

ambientales,

ofreciendo

una

alternativa

con

mayor

estabilidad

y

reproductibilidad. No requieren necesariamente el aislamiento y cultivo de los microorganismos, siendo posible obtener los resultados en tiempos mas cortos y, usualmente con mayor poder de resolución, sensibilidad y especificidad que los métodos fenotípicos (Vilches et al., 2009). Esto métodos basados en la detección del material genético se han constituido como una herramienta que complementa a los procedimientos fenotípicos extendiendo los alcances de la microbiología y permitiendo el entendimiento del rol que juegan los microorganismos en los diversos ambientes.

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En los últimos años, diversos métodos genotípicos se han comenzado a aplicar a las fermentaciones tradicionales, puesto que con ellos es posible identificar la microbiota que dirige los procesos y estudiar la dinámica de poblaciones a lo largo de la elaboración y maduración de los quesos (Giraffa y Neviani, 2001).

2.11. Identificación procariota molecular. La comparación de las secuencias de los ARNr 16S (o de los genes que los codifican) permite establecer las relaciones filogenéticas existentes entre los organismos procariotas. Este hecho ha tenido una enorme repercusión en taxonomía bacteriana, dando lugar al sistema de clasificación vigente y permitiendo la identificación rápida y precisa de las bacterias. La amplificación del gen, para su posterior secuenciación, parte preferentemente de ADN extraído de un cultivo puro de la bacteria, pero también puede conseguirse directamente de una muestra. Esto último ha conducido al descubrimiento de nuevos microorganismos (Rodicio et., al., 2004).

2.12. Acido Ribonucleico ribosomal 16S (ARNr 16S) Es un polirribonucleótido de aproximadamente 1.500 nt, codificado por el gen rrs, también denominado ADN ribosomal 16S (ADNr 16S), a partir de cuya secuencia se puede obtener información filogenética y taxonómica. Como cualquier secuencia de nucleótidos de cadena sencilla, el ARNr 16S se pliega en una estructura secundaria, caracterizada por la presencia de segmentos de doble cadena, alternando con regiones de cadena sencilla. En eucariotas el ARNr 18S es la macromolécula equivalente. Este se encuentra en el ribosoma bacteriano (Figura 3), el cual tiene un coeficiente de sedimentación de 70S (expresado en unidades Svedberg), y puede disociarse en dos subunidades, la subunidad grande (50S) y la subunidad pequeña (30S). Cada subunidad es un complejo ribonucleoproteico constituido por proteínas ribosómicas y moléculas de ARNr específicas (Rodicio et., al., 2004). Dado CIIDIR-MICHOACAN

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que los ARNr 16S y 18S proceden de las subunidades pequeñas de los ribosomas, el acrónimo ARNr SSU (del inglés, small subunit) se utiliza para ambos. Los ARNr SSU se encuentran altamente conservados, presentando regiones comunes a todos los organismos, pero contienen además variaciones que se concentran en zonas específicas. El análisis de la secuencia de los ARNr 16S de distintos grupos filogenéticos reveló un hecho adicional de gran importancia práctica: la presencia de una o más secuencias características que se denominan oligonucleótidos firma (Woese et., al., 1985). Se trata de secuencias específicas cortas que aparecen en todos o en la mayor parte de los miembros de un determinado grupo filogenético, y nunca (o sólo raramente) están presentes en otros grupos, incluidos los más próximos.

Figura 3. Ribosoma procariotico. En esta figura se pueden visualizar las subunidades ribosómicas y las moléculas que lo conforman.

Aunque existen cronómetros moleculares alternativos al ARNr 16S, hasta el momento ninguno ha conseguido desplazarle. De hecho, esta macromolécula presenta una serie de características, en base a las cuales fue considerado por Woese (1987), como cronómetro molecular definitivo: • Se trata de una molécula muy antigua, presente en todas las bacterias actuales. Constituye, por tanto, una diana universal para su identificación. CIIDIR-MICHOACAN

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• Su estructura y función han permanecido constantes durante un tiempo muy prolongado, de modo que las alteraciones en la secuencia reflejan probablemente cambios aleatorios. • Los cambios ocurren de manera suficientemente lenta, como para aportar información acerca de todos los procariotas y, junto con las variaciones en los ARNr 18S, a lo largo de toda la escala evolutiva. Los ARNr SSU contienen, sin embargo, suficiente variabilidad para diferenciar no sólo los organismos más alejados, sino también los más próximos. • El tamaño relativamente largo de los ARNr 16S (1.500 nt) minimiza las fluctuaciones estadísticas. • La conservación en estructura secundaria puede servir de ayuda en las comparaciones, aportando una base para el alineamiento preciso. • Dado que resulta relativamente fácil secuenciar los ADNr 16S existen bases de datos amplias, en continuo crecimiento. Una vez determinada la secuencia de nucleótidos y establecidas las comparaciones, será el grado de similitud entre las secuencias de los ADNr 16S de dos bacterias lo que indique su relación evolutiva (Rodicio et al., 2004).

2.13. Identificación eucariótica mediante la región espaciadora ITS. El estudio de regiones específicas del genoma resulta ser muy útil para la realización de análisis moleculares. Una de estas regiones es la de la familia multigénica del ADN ribosomal (ADNr), la cual está conformada por muchas copias de genes que codifican para tres componentes ribosomales: 28S, 5.8S y 18S (Figura 5). En la mayoría de los eucariotas, la organización 5' a 3' de esta familia de genes consiste en un espaciador transcrito externo (ITS, por sus siglas en ingles), el gen 18S (SSU), un espaciador transcrito interno (ITS1), el gen 5.8S, un ITS2, el gen 28S (LSU) y el espaciador intergénico (IGS) (Devran et al., 2002), la cual se puede observar en la Figura 4.

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Figura 4: Localización de los genes ITS

El gen 18S consiste en la subunidad ribosomal pequeña, mientras que el gen 28S consiste en la subunidad ribosomal grande (figura 5).

Figura 5: Ribosoma eucariotico. En esta figura se pueden visualizar las subunidades ribosómicas y las moléculas que lo conforman.

Las regiones espaciadoras del ADNr nuclear evolucionan mucho más rápido que las regiones codificantes, ya que las sustituciones en las regiones espaciadores no muestran CIIDIR-MICHOACAN

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efectos letales para los organismos.

Por otro lado, las variaciones en las regiones

codificantes del ARNr son mucho más conservadas, ya que una mutación en alguna de estas regiones podría evitar la construcción efectiva de los ribosomas (García, 2006). Este arreglo de genes muy conservados y regiones espaciadoras menos conservadas es lo que ha hecho de estos genes un objetivo muy popular, ya que permite el diseño de imprimadores universales en secciones de secuencias conservadas, y estos imprimadores pueden utilizarse para amplificar fragmentos homólogos, tanto de especies distantes como de especies estrechamente relacionadas. El estudio de las regiones ITS ha permitido la identificación de muchos organismos eucariotas tales como levaduras, hongos y nematodos.

2.14. Principales técnicas moleculares para la identificación de microorganismos. Despues de la implementacion de las pruebas fenotipicas de identifiacion microbiana, la implementacion de las tecnicas moleculares de analisis, vienen a complementar la identificacion y con ello una mayor informacion. Los metodos moleculares de indentificacin microbiana mediante el analisis de el ARNr 16S (bacterias) y de los genes ITS (hongos), incluyen cuatro etapas: a)

Extraccion del ADN de la muestra.

b)

Amplificación del gen a partir de la muestra apropiada por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)

c)

Determinación de la secuencia nucleotidica.

d)

Análisis de la secuencia.

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2.14.1. Extracción del ADN. La aplicación de las técnicas de biología molecular para el análisis e identificación microbiana, depende de la habilidad de manipular el ADN, lo que requiere de su aislamiento y purificación. Se han establecido gran variedad de protocolos para la extracción del ADN, sin embargo la mayoría de estos tienen etapas en común, consistiendo generalmente en dos partes: una técnica para romper las paredes celulares y solubilizar el ADN, seguido por un método enzimático o químico para remover la contaminación por proteínas y otras macromoléculas (Ausubel et al., 2002).

2.14.2. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La amplificación de gen para su estudio, se lleva a cabo mediante la técnica desarrollada por Kary Mullis en 1983: La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual es un método in vitro de síntesis de ADN con el que un segmento particular de éste es específicamente amplificado al ser delimitado por un par de cebadores o iniciadores que lo flanquean. Su copiado se logra en forma exponencial a través de repetidos ciclos de diferentes periodos y temperaturas de incubación en presencia de una enzima ADN polimerasa termoestable (Rodríguez et., al. 2004). Los reactivos requeridos para la PCR incluyen

la

enzima

Taq

ADN

Polimerasa,

los

eslabones

de

la

cadena

o

desoxirribonucleosidos trifosfatos (dNTP´s), amortiguador para la enzima, la cual es optimizado con diferentes concentraciones de magnesio, el cual es un cofactor de la reacción y un elemento crítico en la reacción, ya que no solo afecta a la enzima, sino también al ensamblaje de los oligonucleótidos (gen que se va a amplificar) (Walker et., al. 2000). Dado que en la reacción ambas cadenas de ADN pueden servir de molde para la síntesis de de su cadena complementaria, el numero de eventos de replicación esta dado por la expresión 2n, donde n es el numero de ciclos de amplificación, Puede notarse que después de 20 ciclos se tendrán más de un millón de copias del ADN original (Rojas et., al. 2006).

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Este método se fundamenta en tres pasos: • Desnaturalización del ADN para dar hebras sencillas. La desnaturalización se da por calor a una temperatura de 90°C, para hacer más accesible la región que se quiere amplificar. • Hibridación especifica de la hebra sencilla con un oligonucleótido. La mezcla de reacción es enfriada a una temperatura de entre 40-60°C permitiendo las hebras de ADN se mantengan separadas y así la hibridación de las secuencias con los oligonucleótidos presentes en la reacción. Esta es la etapa que explica porque se debe de conocer parte de la secuencia • Replicación de la hebra sencilla por una ADN polimerasa a partir del oligonucleótido anterior como cebador, a una temperatura de 72°C, mediante la acción de la enzima Taq ADN polimerasa (Luque et., al., 2006).  

2.14.3. Secuenciación del producto de PCR. En esta etapa se llevan a cabo las reacciones de secuenciación y el análisis de los productos por electroforesis. Actualmente, se emplea la secuenciación cíclica, en una reacción similar a la de amplificación, que utiliza un único iniciador por reacción y terminadores marcados con fluorocromos adecuados, que interrumpirán la síntesis de manera aleatoria, y facilitarán la detección posterior de los fragmentos interrumpidos. La disponibilidad de secuenciadores automáticos facilita enormemente la etapa de detección. El número de bases generadas por un secuenciador automático es de 500 a 900, dependiendo del capilar utilizado en la electroforesis. Sin embargo, la secuencia obtenida podrá contener errores y/o presentar posiciones ambiguas (indicadas por N). Por ello, la obtención de la secuencia definitiva requiere la evaluación de los electroferogramas y la alineación de la cadena directa con la reversa, para resolver las posibles discrepancias. Así, aunque la secuenciación de una cadena del amplicón puede conducir a una correcta identificación, la calidad de la secuencia será óptima cuando la comparación de ambas cadenas se utiliza para la corrección de errores (Rodicio et al., 2004). CIIDIR-MICHOACAN

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2.14.4. Análisis de la secuencia. La última etapa será la comparación de la secuencia con las depositadas en bases de datos. Actualmente existen distintas bases de datos, algunas públicas, cuyo acceso es libre a través de internet, como GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), EMBL (European Molecular Biology Laboratory), RDP (Ribosomal Database Project), RIDOM (Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms), y otras privadas, como MicroSeq (Applied Biosystems) y SmartGene IDNS (Integrated Database Network System).

2.15. Antecedentes en el uso de métodos fenotípicos y genotípicos para la caracterización de microorganismos en quesos. En la actualidad existen antecedentes que describen la microbiota encontrada en quesos artesanales durante el proceso de elaboración y maduración de estos , utilizando métodos fenotípicos y genotípicos de análisis, tal es el caso de el estudio realizado por Duthoit en el 2003, en el queso artesanal francés Salers, el cual se analizó mediante el estudio del ARN ribosomal 16S, encontrando varias especies de bacterias lácticas (Lactococcus lactis, Streptococcus

thermophilus,

Enterococcus

faecium,

Leuconostoc

mesenteroides,

Leuconostoc pseudomesenteroides, Lactobacillus plantarum, y Lactobacillus pentosus). Ercolini y cols. en el 2003 aplicaron esta misma técnica molecular y la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante en el queso italiano Stilton encontrando también especies de bacterias lácticas (Lactococcus lactis, Enterococcus faecalis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus curvatus, Leuconostoc mesenteroides, y Staphylococcus equorum). Mayo y Flores caracterizaron también la microbiota (bacterias, mohos y levaduras) del queso con denominación de origen Cabrales habiendo ellos hallado géneros y especies tales como: Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Lactococcus raffinolactis, Streptococcus parauberis, Lactococcus lactis, Lactobacills kefiri, Lactobacillus buchneri Lactobacillus parabuchneri, Bifidobacterium psychroaerophilum, Geotrichum candidum,

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Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis K. marxianus, Penicillium roqueforti, Chrysogenum, y P. griseofulvum. Ramos et., al. (2009),

aislaron, identificaron

y caracterización empleando métodos

fenotípicos y genotípicos, las bacterias acido lácticas utilizadas en la elaboración de un queso crema tropical, habiendo identificado cinco especies de Lactobacillus fermentum y una especie de Lactobacillus pentosus. Coppola y colaboradores en el 2000 describieron los microorganismos involucrados en la maduración del queso italiano Parmigiano Reggiano (Lactobacillus helveticus, L. delbrueckii ssp. lactis,, L. delbrueckii ssp. bulgaricus,

L. casei, L. paracasei ssp.

paracasei, L. paracasei ssp. tolerans, L. rhamnosus y Pediococcus), utilizando diferentes medios de cultivo y pruebas bioquímicas para su caracterización. Por último mencionaré el estudio realizado por Terzic-Vidojevic y colaboradores (2006) en el queso Zlatar, para lo cual utilizaron el sistema API 50 CH y el análisis de los patrones obtenidos mediante la técnica REP-PCR, habiendo encontrado: Lactobacillus paracasei subsp. paracasei, Lactobacillus brevis, Lactococcus lactis subsp. lactis, Enterococcuus faecium y Enterococcus faecalis durante la maduración de este queso.

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3.

JUSTIFICACION

El queso Cotija originario de la región del mismo nombre en el estado de Michoacán, posee gran aceptación en el mercado Mexicano por sus características organolépticas y su consumo va en aumento, incluso en el extranjero, donde ha llegado a recibir reconocimientos por su sabor característico (Cremona Italia 2005). Este queso es un producto artesanal que se obtiene a partir de la leche cruda de vaca, presenta una textura frágil, es de sabor fuerte y posee un alto contenido de sal. Es uno de los pocos quesos maduros que se consumen en el país. Como lo describe la literatura, la microbiota asociada a diferentes tipos de quesos es la responsable de la adquisición de las propiedades organolépticas tan características de este tipo de alimento. A la fecha, no existen reportes sobre la población microbiana (hongos o bacterias) presente durante el proceso de elaboración de este queso. Para lograr lo anterior el presente estudio contempla el aislamiento e identificación de los

microorganismos

presentes durante el proceso de elaboración de este queso hasta el producto final ya madurado, utilizando técnicas fenotípicas y genotípicas de análisis. Esto ccon el fin de brindarle la posibilidad de ingresar a los mercados internacionales y aportar información de utilidad para el otorgamiento de la denominación de origen del queso Cotija.

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4.

HIPOTESIS

La caracterización de la microbiota asociada al queso permitirá obtener información de los principales microorganismos involucrados, así como la de aportar datos que contribuyan a la obtención de la denominación de origen este queso.

5.

OBJETIVO GENERAL

Caracterizar la microbiota presente durante el proceso de elaboración y maduración del queso Cotija.

6.

•

OBJETIVOS PARTICULARES

Caracterizar los microorganismos involucrados en la elaboración del queso Cotija

mediante métodos fenotípicos. •

Caracterizar los microorganismos involucrados en la elaboración del queso Cotija por

métodos moleculares.

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7. MATERIALES Y METODOS

7.1. Recolección de muestras. Los muestreos se realizaron en la sierra Jal-Mich, donde se eligieron dos productores: uno con características rusticas, perteneciente a la población de Lourdes del municipio de Cotija Michoacán y el segundo productor con características semitecnificadas, ubicado en la Troja municipio de Quitipan Jalisco. Se obtuvieron muestras de queso en cuatro etapas de elaboración (cuajada, cuajada más sal, un mes de maduración y tres meses de maduración), de cada una de las etapas en estudio se pesaron 25 g de queso, en las etapas de uno y tres meses de maduración se tomo muestra de la parte central con un bisturí previamente flameado, al cual se le retiro las partes externas.

7.2. Aislamiento de bacterias, mohos y levaduras. Se colocaron 10 gramos de muestra en bolsas estériles que contenían 90 mL de agua peptonada al 1%, se tomaron alícuotas de diluciones seriadas. Estas fueron sembradas por duplicado para el aislamiento y el recuento de bacterias, mohos y levaduras, en los diferentes estadios de producción y maduración del queso Cotija (cuajada, cuajada más sal, un mes de maduración y tres meses de maduración), en placas de agar Man Rogosa Sharpe (MRS) (BD Difco)  para Bacterias Acido Lácticas (BAL), Agar Papa Dextrosa (PDA) (Bioxon) para el aislamiento de mohos y levaduras, así como en Agar cuenta estándar para el recuento de Bacterias Mesófilas Aerobias (BMA) Se seleccionó la dilución 104 de los medios MRS y PDA donde se desarrollaron aproximadamente 100 colonias aisladas, de las cuales se tomaron 10 de cada medio con un palillo estéril, posteriormente fueron cultivadas en caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) y conservadas a -10ºC.

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7.3. Identificación Bacterias Acido Lácticas (BAL). Una vez aisladas las bacterias se realizaron las siguientes pruebas bioquímicas: Tinción de Gram, Catalasa, Movilidad, CO2 glucosa, desarrollo a 10º y 45º, desarrollo en NaCl 6.5 y 1.8, pH 4.0 y 9.6, principalmente para bacterias ácido lácticas (géneros Lactobacillus, Lactococcus y Leuconostoc Carnobacterium, Vagococcus, Aerococcus, Pediococcus, Enterococcus, Streptococcus, Tetragenococcus) (Tabla 1). Tabla

1.-

Diferenciación

de

los

géneros

de

bacterias

lácticas.

Car=

Carnobacterium

Vag=Vagococcus, Ltob= Lactobacillus, Leuc= Leuconostoc, Aer= Aerococcus, Ped= Pediococcus. Ent= Enterococcus, Str= Streptococcus Lcoc= Lactococcus, Tetr= Tetragenococcus.

Car

Ltob

Aer

Ent

Lcoc

Vag

Leuc

Ped

Str

Tetr

Bacilos

+

+

-

-

-

-

-

-

-

-

Cocos

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

Tetradas

-

-

+

-

-

-

-

-

-

+

Movilidad

-

-

-

-

-

+

-

-

-

-

CO2 Glucosa

-

+/-

-

-

-

-

+

-

-

-

Desarrollo a 10º C

+

+/

+

+

+

+

+

+/

-

+

Desarrollo a 45º C

-

+/

-

+

-

-

-

+/

+/-

-

NaCl 1.8

-

+/

+

+

-

-

+/-

+/

-

+

NaCl 6.5

-

-

--

-

-

-

-

-

-

+

pH 6.4

-

+/-

-

+

+/-

+/-

+/

+

-

-

pH 8.6

-

-

+

+

+/-

+/-

+/

+

-

-

Características

Después de la caracterización preliminar por géneros se procedió a realizar pruebas de fermentación de carbohidratos, para lo cual se utilizaron los siguientes: Arabinosa, Galactosa, Lactosa, Maltosa, Mannitol, Melobiosa, Ramnosa, Sorbitol, Sucrosa, Trehalosa

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y Xilosa. Así como el crecimiento a diferentes temperaturas, las cuales fueron: 15 ºC y 45 ºC para la identificación de la especie de acuerdo al manual de Bergey (2001).

7.4. Identificación de géneros mohos y levaduras. Para la identificación de mohos y Lavaduras, se realizaron pruebas distintivas de ambos géneros: características macro y micro morfológicas, producción de ureasa, asimilación de nitrato, asimilación de inositol, rafinosa, altosa, xilosa, manitol, glucosa, galactosa, ramnosa, trealosa, crecimiento a 48 °C y a pH de 8.0.

7.5. Aislamiento de microorganismos del queso para la identificación por métodos moleculares. Una porción de 10 g de queso obtenido en las cuatro etapas de elaboración (cuajada, cuajada más sal, un mes de maduración y tres meses de maduración) se coloco en una bolsa estéril que contenía 90 mL de agua peptonada al 1% y se homogenizó en el Stomacher. Una dilución fue inoculada en placas de agar MRS (Difco) por duplicado para Bacterias Acido Lácticas (BAL) y Agar Papa Dextrosa (PDA) (Bioxon) para la identificación de mohos y levaduras. Una vez habiendo obtenido los aislados del medio, se tomó una asada del cultivo en medio MRS para BAL, de cada una de las muestra y se colocó en 10 ml de medio Luria-Bertani (LB), para posteriormente incubarla a 37°C durante 24 horas en una incubadora rotatoria a 100 rpm. Posteriormente para los aislados de mohos y levaduras se procedió de la misma forma, la asada tomada del medio PDA sólido fue depositada en 100 ml de medio PDA por cinco días a 25°C en una incubadora rotatoria a 250 rpm. Posteriormente, de los cultivos en medio liquido (LB y PDA), se tomó 1 ml del caldo de cultivo, el cual se depositó en un tubo Eppendorf de 1.5 ml, previamente pesado, posteriormente se centrifugó por 2 minutos a 13,000 rpm descartándose el sobrenadante, se repitió la operación hasta tener la cantidad requerida de muestra (gr muestra = peso del CIIDIR-MICHOACAN

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tubo con muestra-peso del tubo sin muestra). Se agregó 800-1000μl de agua estéril miliQ, posteriormente se agitó vigorosamente en el vortex, asegurándose que la pastilla estuviera completamente disuelta, seguido de centrifugación por 2 minutos a 13,000 rpm, descartándose el sobrenadante.

7.5.1. Extracción ADN de la fracción bacteriana. La extracción Del ADN total se llevo a cabo mediante la metodologia descrita por Raeder y Broda (1985). Se depositaron de 40 a 50 mg de muestra en nitrógeno líquido por 20 min en tubos eppendorf estériles seguidos de una maceración por 5 minutos con pistilo estéril. Se agregaron inmediatamente 500μl de buffer de extracción (temperatura ambiente) (200mM Tris HCL pH 8.5, 250mM NaCl 25mM EDTA, 0.5% SDS), y se homogenizo la muestra, para su posterior incubación por 10 min. Después se añadió 500μl de fenol-cloroformo (50/50)(4°C) y se mezclaron en vortex a máxima velocidad durante 5 min y se centrifugo a 13000 rpm durante 30min. La fase acuosa se transfirió a otro tubo eppendorf, donde se le adicionaron 400μl de cloroformo frío (4°C). Se mezclo durante 1min, y se coloco en vortex para homogenizar la muestra y se centrifugo durante 5min a 13000 rpm. Se le añadió 8ul de RNAsa (lOmg/ml) (Invitrogen, US). Se incuba durante 30min a 37°C en block caliente. Se le adicionan 500μl de isopropanol frío (4°C) y se mezcla por inversión ligera y se incuba a -20°C durante 15min. Se centrifuga durante 5min. El sobrenadante se desecha, se añaden 500μl de etanol al 70% a 4°C, se mezcla por inversión ligera, se centrifuga durante 5min a 13000 rpm. El sobrenadante se desecho y la pastilla se seco en papel secante durante 30min, esta se resuspendió en 30 μl agua estéril miliQ y se conservó -20°C.

7.5.2. Extracción ADN fúngico. Se extrajo el ADN genómico presente, empleando el protocolo propuesto por Rojas y Herrera (2008), el cual fue desarrollado para la extracción de ADN a partir de comunidades bacterianas con altas cantidades de polisacáridos. La metodología utilizada se describe a continuación: el ADN en la solución contaminada es mezclado con 20 μl de solución de CIIDIR-MICHOACAN

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incubación (5 ml del precipitado obtenido a partir de 1 g de dióxido de silicio). Posteriormente es agitada suavemente esta solución por 5 min. y se centrifuga a 12,000 g por 20 seg. La pastilla resultante se lava en 200 μl de solución de lavado (95% alcohol, 5% [0.2 M NaCl, 2 mM EDTA, 20 mM Tris HCl pH 7.0]) y se centrífuga a 12,000 g por 20 segundos. La pastilla se deja secar a temperatura ambiente. Los fragmentos de ADN son recuperados de la solución adicionando de 20 a 30 μl de amortiguador TE (10 mM Tris HCl, pH 7.4, 1 mM EDTA) e incubados a 37º C por 5 minutos. A continuación, la solución es centrifugada a 11,500 g por 1 minuto. La solución de ADN se transfiere a un nuevo tubo para su uso posterior y la pastilla es descartada.

7.5.3. Determinación de la integridad del material genético mediante electroforesis en gel de agarosa. Se preparó una solución de agarosa 1% (BIO Basic Inc.) p/v (la concentración depende del tamaño de la amplificación esperada); disolviéndola en buffer TBE 1x (108 gr Trisma Base; 55 gr Acido Bórico; 40 ml EDTA 0.5M pH 8). (1gr de agarosa + 100 ml de amortiguador). Se disolvió esta solución de agarosa en amortiguador calentando en un horno microondas (para fundir). La agarosa ya disuelta se colocó en un soporte para el gel, sellando con cinta adhesiva esperando a que gelifique. Se coloco el peine de acuerdo a los pocillos que se necesitaron. Se retiro la cinta adhesiva con la que se selló el soporte del gel y se coloco en la cubeta de electroforesis. Los pocillos quedaron cerca del cátodo (polo negativo, color negro). Se añadió amortiguador de electroforesis TBE 1X, de forma que cubriera bien el gel de agarosa. Se aplicó la muestra preparada de la siguiente manera: 2µl de colorante y 3 µl de muestra, teñido con Syber GoldTM (Invitrogen US), colocando el marcador de peso molecular 100 bp DNA Ladder (PROMEGA Corp. US) como referencia. Se programó la fuente a 100 voltios y el gel de electroforesis se corrió durante 45 minutos. Una vez acabada la electroforesis se visualizo el DNA mediante luz UV y se tomó

una fotografía de la imagen en el

fotodocumentador (KODAK Gel Logic 112).

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7.5.4. Cuantificación del ADN obtenido.  

La estimación de la cantidad de ácidos nucléicos en las preparaciones se realizó por espectrofotometría, en la cual se realiza una estimación de la cantidad de radiación UV absorbida por las bases nitrogenadas. Para cuantificar la cantidad de ADN, se registraron las longitudes de onda a 260 nm y 280 nm. La lectura a 260 nm se utilizó para calcular la concentración de ácidos nucléicos en la muestra. En el caso de los ácidos nucléicos una densidad óptica (OD) de 1 corresponde a ~50 μg/ml de doble hebra de ADN, 40 μg/ml de hebra simple de ADN ó ARN, y a ~33 μg/ml de hebra simple de oligonucleótidos. La relación entre las lecturas de 260nm y 280nm provee una estimación de la pureza de los ácidos nucleícos, de esta forma una relación menor a 1.8 indica que la muestra se encuentra libre de proteínas (Sambrook y Russell, 2001). El proceso de cuantificación fue el siguiente: 10 μl de muestra serán diluidos en un tubo de 1.5 ml de agua estéril, se realizaron las lecturas de las longitudes de onda: 260 y 280 nm, y se calcularon con la siguiente fórmula: Concentración de ADN (μg/ml) = (A 260 x 40) x Factor de Dilución (Sambrook y Rusell, 2001). Donde 40 es el grado de corrección relativa a la naturaleza de la doble hebra de ADN.

7.5.5. Reacción en Cadena de La Polimerasa (PCR). a)

Amplificación del gen 16S ARN ribosomal de bactérias

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingles), fue utilizada para amplificar regiones utilizadas para identificar a nivel de especie los aislados obtenidos del queso Cotija. Se utilizan dos oligonucleótidos reportados previamente para la hibridación con las regiones filogenéticas conservadas de la subunidad 16S ribosomal de eubacterias. Para la región 16S se usaron los cebadores descritos por Strom y colaboradores, (2002) (16S-for 5´AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3´ y 16S-rev 5´CGGGAACGTATTCACCG 3’). Las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 µl, utilizando 1 µl del ADN, 2.5 µl de Buffer 10X, 0.75 µl de cloruro de magnesio 50 mM, 0.2 µl de dNTPs 10 mM, 1 µl de CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTER RIZACION MOLECULAR M DE LA MICR ROBIOTA ASO OCIADA AL Q QUESO COTIIJA   

cada uno de loss iniciadores (16S Forw ward y 16 S Reverse) 0.5 mM y 0.2 µl de laa enzima Taq DNA polim MD),  0.5 dde BSA (A merasa 5 U/5 U µl (Gib bco-BRL, Rockville, R Albumina bovinna) al 10% %  y complettando el vollumen a 25 µl con aguaa milliQ estteril. El prog grama de ampllificación consistió c de 1 ciclo de desnaturalizzación por 5 min a 95°°C y 30 cicllos de 30 seg a 94°C, 50 seg a 59°C C, 1 min a 72°C, 7 por uultimo se diio un paso de extensióón final a 72°C C por siete minutos. m Loos productoss de PCR fuueron visuaalizados en uun gel de agarosa al 1% mezclando m 5 µl del prooducto de PCR con 3 µl µ de Syber GoldTM y ddepositándoolos en el mism mo, el cual se corrió enn una cámaara de electrroforesis dee la marca B Bio-Rad a 100 1 volts por 30 3 minutos.. De igual manera m los productos de PCR fueeron visualizados en un u gel de agaroosa al 1.0% % teñido coon Syber GoldTM 10X,, grabando la imagen del en el programa p Kodaak digital SccienceTM 1D D. Los prodductos de PC CR fueron purificados p c el Kit comercial con c Wizaard SV and PCR clean up System de Promegaa, para su poosterior seccuenciación..

b) Amp plificación de d la región n ITS preseente en euccariotas Los mohos y levaduras fueron detterminados empleandoo las regióónes ITS del d ADN ribossomal ya quue como se menciono anteriormennte estas reegiones espaaciadoras del d ADNr evoluucionan muucho más ráppido que lass regiones codificantes c s, ya que lass sustitucion nes en las regioones espaciaadores no muestran m effectos letalees para los organismoss (Figura 6)), para lo cual

se

u utilizaron

los

olligonucleótiidos

en

sentidoo

ó

ITS I

1

(5’TC CCGTAGG GTGAACCT TGCGG3’) y el oliigonucleótiddo en anttisentido ó ITS 4 (5´TC CCGTAGG GTGAACCT TGCGG3´) (White et aal., 1990).

Figurra 6.

Diaggrama esqu uemático dee la familia multigénicca del ADN N ribosomall (ADNr)

(Mod dificado de: Jobes y Thiien, 1997) CIID DIR-MICHO OACAN

41  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

La reacción se llevo a cabo en un termociclador (Perkin Elmer GeneApm PCR system 9700, Applied Biosystems). Las reacciones se realizaron en un volumen final de 25 µl, utilizando 1 µl del ADN, 2.5 µl de Buffer 10X, 0.75 µl de cloruro de magnesio 50 mM, 0.2 µl de dNTPs 10 mM, 1 µl de cada uno de los iniciadores 0.5 mM y 0.2 µl de la enzima Taq DNA polimerasa (Gibco-BRL, Rockville, MD), 5 U/5 µl y completando el volumen a 25 µl con agua milliQ esteril. El programa que se utilizo consistió de 1 ciclo de desnaturalización por 5 min a 94°C y 30 ciclos de 30 seg a 94°C, 50 seg a 58°C, 72°C durante 1 min y 72°C por siete minutos como paso de extensión final. Posteriormente los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1% mezclando 5 µl del producto de PCR con 3 µl de Syber GoldTM y depositándolos en este, el cual se corrió en una cámara de electroforesis de la marca Bio-Rad a 100 volts por 30 minutos. De igual manera los productos de PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 1.0% teñido con Syber GoldTM 10X, grabando la imagen del en el programa Kodak digital ScienceTM 1D. Los productos de PCR fueron purificados con el Kit comercial Wizard SV and PCR clean up System de Promega para su posterior secuenciación.

7.5.6. Secuenciación y análisis de los productos de PCR obtenidos. Una vez que fueron purificados las fragmentos amplificados por PCR tanto para el gen 16S y de la región ITS se procedió a su secuenciación utilizando el secuenciador automático de capilaridad ABI Prism (Applied Biosystem Modelo 3130). Con los siguientes cebadores: 16S forward y el ITS1 (5´TCCGTAGGTGAACCTGCGG3´) forward para la región ITS. Las reacciones de secuenciación para ambos casos se realizaron de la siguiente manera: los productos de PCR purificados fueron nuevamente amplificados utilizando las siguientes condiciones de reacción: 4 µl de buffer Big dye v 3.1 5X, 1 µl de iniciador, 4 µl de Big dye v 3.1 Ready Mix, 2 µl del producto de PCR, 9 µl de agua estéril milliQ par un volumen final de 20 µl. Las condiciones de PCR fueron: 1 ciclo de 96 °C por un minuto, seguido de 25 ciclos a 96°C 10 segundos, 59°C durante 4 minutos. Posteriormente la reacción de secuenciación fue purificada mediante el kit comercial Big dye X Terminator (Applied Biosystems, U.S.), procediendo de la siguiente manera: se coloco en un tubo de PCR 2.5 µl del producto de secuenciación, 2.5 µl del reactivo X-Terminator, 11.25 µl del reactivo CIIDIR-MICHOACAN

42  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

SAM, se homogenizo la mezcla en vortex por 15 segundos, se incubo en un Thermomixer (Eppendorf) por 30 minutos a 25°C a 13 000 rpm, se homogenizo en vortex por 15 segundos seguido por una centrifugación por 2 minutos a 13 000 rpm, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo. Los productos de PCR purificados fueron secuenciados en el Departamento de Biotecnología del CBG-Reynosa Tamaulipas. La secuencia nucleotidica obtenida fue alineada y comparada con las encontradas en la base de datos BLAST del Banco mundial de genes del NCBI (National Center for Biotechnology Information), para compararlas e identificarlas, se seleccionaron las secuencia de referencia con las cuales se tenia similitud usando el programa BioEdit Sequence Alignment Editor 5.0.6 (Hall, 1999) y CLUSTAL W 1.82 pro-grames (Thompson et, al., 1994). Los dendogramas fueron construidos por un programa analítico (MEGA versión 3.1) (Kumar et al., 2001) usando los métodos neighbor-joining (Saitou et al., 1987), y máxima parsimonia, la “P” de distancia usada fue calculada para calcular las distancias entre los pares de bases de las secuencias. La confiabilidad de los grupos fue evaluada por “bootstrapping” con 1000 replicas.

7.6. Determinación de la diversidad genética mediante REP-PCR y ERIC-PCR. Para la obtención de las huellas genéticas de las levaduras y bacterias asociadas al queso por la técnica de REP-PCR (secuencias repetitivas palindrómicas extragénicas), estas son secuencias de DNA extragénicas, cortas, repetidas y esparcidas en el genoma REP son elementos palindrómicos de 21-65 pb. Es una técnica utilizada para determinar la diversidad genética de un población, la cual se basa en la utilización de oligonucleótidos degenerados universales, los cuales amplifican regiones repetidas del genoma, las cuales corresponden a los segmentos que separan dichas secuencias (Tobes et, al., 2006). Así, el polimorfismo generado dependerá de la variedad en la distribución de las repeticiones y de la distancia entre las secuencias REP. La técnica ERIC-PCR (secuencias repetitivas intergénicas de consenso), al igual que las secuencias REP son secuencias de ADN extragénicas, cortas, repetidas y esparcidas en el CIIDIR-MICHOACAN

43  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

genoma (Figura 7). Las secuencias ERIC constan de 126 pb, con un repetido invertido central conservado (Tobes et., al., 2006). Estas técnicas resultan sumamente sencillas, no dependen del uso de enzimas de restricción, ni de técnicas electroforéticas especiales, son rápidas, de relativo bajo costo, fáciles de analizar y de excelente reproducibilidad; todo lo cual las coloca en una posición privilegiada a la hora de seleccionar una técnica de tipificación genética (Fernández 2004) Se utilizaron los cebadores universales REP, que son oligonucleótidos degenerados que se alinean a diferentes regiones del ADN tanto levaduras como bacterias. Los oligonucleótidos empleados

fueron:

REPIR-1(5’

IIIICGICGICATCIGGC

3’)

y

REP2-I

(5’

ICGICTTATCIGGCCTAC 3’) (Hierro et al., 2004). Las condiciones de reacción fueron: 2.5 µl de buffer 10X, 1 µl de MgCl 50mM, 2.5 µl de cada uno de los oligonucleotidos 5 µM, 0.5 µl de dNTPs 10 mM, 0.5 µl de Taq ADN polimerasa 5u/5 µl, 0.5 de BSA al 10% y 1 µl de ADN para un volumen final de 25 µl (tanto para bacterias como para hongos) Las condiciones de amplificación generales fueron: un ciclo de desnaturalización a 94 ºC por 5 min, 30 ciclos con temperaturas de 94ºC por 30 segundos, 45 ºC (para bacterias) por un minuto ó 50 ºC (para hongos) y 65ºC por 4 min, y una extensión final a 72 ºC por 7 minutos.. Los productos de PCR mezclados con Syber-GoldTM fueron corridos en un gel de agarosa al 2%

en una cámara de electroforesis Bio-Rad durante 40 horas a 90V y

visualizados en un transiluminador, tomando y grabando la imagen en el programa Kodak digital ScienceTM 1D  

Para el ERIC-PCR, se utilizaron los cebadores universales ERIC, los oligonucleótidos empleados fueron: ERIC forward (5’ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3’) y ERIC reverse (5’AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3) (Jersek et al., 1999). Las condiciones de reacción fueron: 2.5 µl de buffer 10X, 1 µl de MgCl 50mM (0.75 µl para hongos), 2.5 µl de cada uno de los oligonucleotidos 5 µM, 0.5 µl de dNTPs 10 mM, 0.5 µl de Taq ADN polimerasa 5u/5 µl, 0.5 de BSA al 10% y 1 µl de ADN para un volumen final de 25 µl. Las condiciones de amplificación generales fueron: un ciclo de desnaturalización a 95 ºC por 5 CIIDIR-MICHOACAN

44  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

min, 30 ciclos con temperaturas de 94ºC por 30 segundos, 52 ºC (para bacterias) por un minuto ó 55 ºC (para hongos) y 65ºC por 8 min, y una extensión final a 65ºC por 15 minutos. Los productos de PCR mezclados con Syber-GoldTM fueron corridos en un gel de agarosa al 2%

en una cámara de electroforesis Bio-Rad durante 40 horas a 90V y

visualizados en un transiluminador, tomando y grabando la imagen en el programa Kodak digital ScienceTM 1D.   

CIIDIR-MICHOACAN

45  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

8. RESULTADOS Y DISCUSION.  

8.1.

Recuento de bacterias, mohos y levaduras del queso Cotija.

Se obtuvieron los recuento de bacterias mohos y levaduras durante el proceso de elaboración del queso Cotija tanto en condiciones rusticas y semitecnificadas, además de los recuentos de Bacterias mesófilas aerobias (BMA), como lo indica en la tabla 2.

Composición microbiana (UFC log10)

Queso Cotija

Etapa de elaboración

Bacterias Aeróbicas

Rustico

Cuajada

5.9±0.00

Bacterias Acido Lácticas 4.0±0.01

Cuajada mas salado

2.4±0.07

Un mes de maduración

Industrial

Mohos

Levaduras

n.d.a

5.0±0.04

4.1±0.21

n.d.

2.3±0.00

5.3±0.07

2.6±0.06

1.5±0.07

4.1±0.24

Tres meses de maduración

1.8±0.07

2.9±0.09

2.3±0.00

2.3±0.00

Cuajada

3.2±0.14

2.5±0.00

7.8±0.06

1.8±0.07

Cuajada mas salado Un mes de maduración

5.1±0.14 2.8±0.05

1.8±0.14 1.7±0.00

2.1±0.24 3.3±0.10

8.7±0.03 3.5±0.07

Tres meses de maduración

7.1±0.07

3.4±0.05

2.7±0.07

1.3±0.06

Tabla 2. Composición microbiana del queso Cotija. Se encontró que la elevada presencia de BAL y levaduras en las etapas iníciales de elaboración del queso Cotija tradicional puede promover la disminución de hongos y bacterias mesófilas aerobias (BMA) en este queso, hecho que ha sido reportado por varios autores como Alvarado y colaboradores (2006) que aislaron 94 cepas de de BAL, de las cuales 25 mostraron actividad antimicrobiana debido principalmente a la disminución del pH en alimentos tradicionales mexicanos, por la producción de acidos orgánicos principalmente contra Staphylococcus aureus y Escherichia coli durante la fermentación CIIDIR-MICHOACAN

46  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

de estos, así mismo se tienen reportes de la producción de compuestos antimicrobianos por la BAL (peróxido de hidrogeno, bacteriocinas, exopolisacárido) efectivos contra microorganismos gram positivos y gram negativos (Oslon et. al, 2008; Lin et. al, 2007; Rodríguez et. al, 2003.) . Estos organismos contaminantes en cambio fueron abundantes en el queso Cotija producido de forma industrial. Fernández (2000) señala que el conocimiento de un incremento en el contenido de BMA de un alimento, permite establecer que se ha violado un norma de trabajo considerada de antemano como inaceptable (utilización de materia prima contaminada, utensilios para la producción etc.). Un ejemplo de ello es una cuenta elevada de estos microorganismos en la leche cruda recién ordeñada, bajo condiciones de insalubridad (equipo no higienizado, animales sucios etc.). Por otra parte expone que los microorganismo que forman parte de este grupo (BMA) son muy heterogéneos, ya que se incluyen en el a todos aquellos que muestran capacidad para formar colonias visibles en medios de cultivo y temperaturas de crecimiento adecuadas. L. E. Barber y Deibel, (1972) indicaron que en determinados tipos de alimentos (por ejemplo, embutidos fermentados, col ácida, queso y otros derivados lácteos) es natural y deseable una gran multiplicación bacteriana, con una fermentación o maduración paralela del alimento. En estos productos, un recuento elevado, como tal, carece prácticamente de significado, ya que los microorganismos impropios no pueden diferenciarse generalmente de la microflora propia o normal del alimento. Los recuentos altos de levaduras en los quesos son atribuibles a su tolerancia a desarrollar a bajo pH, a actividades bajas de agua y en presencia de altas concentraciones de sal (Ferreira et. al., 2003). Se puede explicar también su aparición en los quesos ya que son capaces de asimilar y fermentar la lactosa y la galactosa, así como del acido succínico, cítrico y láctico. Además se distribuyen ampliamente en los entornos de la producción de lácteos y surgen como contaminantes naturales en leche cruda, aire, productos lácteos utensilios, salmuera y agua (Wyder y Puhan 1999).

CIIDIR-MICHOACAN

47  

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CARACTER RIZACION MOLECULAR M DE LA MICR ROBIOTA ASO OCIADA AL Q QUESO COTIIJA   

8.2.

Aislamieento e identificación de d bacterias del quesoo Cotija.

t de 200 aislamienntos y se iddentificaronn por sus Se seeleccionaroon 16 colonnias de un total caraccterísticas fenotípicas f y la secuuencia del ADNr 16S S,

dichos aislamiento o fueron

identtificados meediante las sigla s BCOT T y enumeraados del 1 all 16. Los aislamientoos mostraron actividadd de catalassa excepto BCOT B 7 y 13 (Tabla 3), estas mas no pressentaron desarrollo a 10°C 1 y 45°°C, así com mo a las conncentracion nes dadas mism NaCll (1.8 mM y 6.5 mM)) pH de 4.44, estas carracterísticas nos permitieron posiccionarlos dentrro del Geneero Pediococccus. El crrecimiento a 10ºC fuee la caracteerística máss frecuente, aunque allgunos aislamientos comoo BCOT 9-14 tambiénn pueden deesarrollarse en 45 º C. Cinco cepaas (BCOT 3, 4, 9, 10 y 11)) puede creecer a altas concentraciiones salinaas (NaCl 6,55 mM) com mo se podríaa esperar debiddo a la alta salinidad quue presenta el queso Cootija. mplificó por PCR el geen ADNr 166S (Figura 7) 7 para todaas las cepas y posteriorrmente el Se am fragm mento obtennido fue seccuenciado y comparadoo en la base de datos deel Banco Mu undial de Genees del NCB BI, para la construcción c n de los arbboles filogennéticos en eel Programaa MEGA 3.1 (K Kumar et. al., a 2001).

Figu ura 7. Ampliificación del ADNr 16S. Muestras de d bacterias del 1-16.

CIID DIR-MICHO OACAN

48  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

Desarrollo a Cepa

Obtención Identificación Catalasa Gram

Forma

Movilidad

Glucosa 10ºC

celular BCOT-1

Cuajo

Lactobacillus

CO2

NaCl

NaCl

1.8

6.5

pH

pH

mM

mM

4.4

9.6

45ºC

+

+

Bacilos

-

+

+/-

+/-

-

+

+/-

-

+

+

Bacilos

-

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

+

+

Bacillos

-

-

+/-

+/-

-

+

+/-

-

+

+

Bacilos

-

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

+

+

Bacilos

-

+

+/-

+/-

-

+

+/-

-

-

-

-

-

+

+

sp BCOT-2

Cuajo

Lactobacillus sp

BCOT-3 BCOT-4 BCOT-5 BCOT-6

Cuajo

Lactobacillus

más sal

plantarum

1 mes

Lactobacillus

Maduración

plantarum.

1 mes

Lactobacillus

Maduración

casei.

3 meses

Bacterium sp.

+

+

Bacilos

-

-

+

-

Pediococcus sp.

-

+

Cocos

-

-

-

-

Maduración BCOT-7

3 meses

-

Maduración

Tabla 3. Características fenotípicas de las bacterias aisladas y clasificación taxonómica de acuerdo a la secuencia16S rADN

CIIDIR-MICHOACAN

49  

HBC

CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

BCOT-8 BCOT-9

BCOT-10

BCOT-11

Cuajo Cuajo Cuajo más sal 1 mes maduración

Lactobacillus casei

+

+

Bacilos

-

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

Bacterium sp.

+

+

Cocos

-

+

+

+

-

+

-

+

Lactobacillus sp.

+

+

Bacillos

-

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

Lactobacillus sp.

+

+

Bacilos

-

-

+/-

+/-

-

+

+/-

-

Lactobacillus sp.

+

+

Bacilos

-

-

+/-

+/-

-

+

+/-

-

Pediococcussp.

-

+

Cocos

-

-

-

-

-

-

+

+

Lactobacillus sp.

+

+

Bacilos

-

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

Bacterium sp

+

+

Bacilos

-

-

+

-

-

-

-

-

+

+

Bacillos

-

+

+/-

+/-

-

-

+/-

-

1 mes BCOT-12

maduración 1 mes

BCOT-13

BCOT-14

BCOT-15

BCOT-16

maduración

1 mes maduración 1 mes Maduración 1 mes

Lactobacillus

Maduración

brevis.

Continuación tabla 3. Características fenotípicas de las bacterias aisladas y clasificación taxonómica de acuerdo a la secuencia 16S rADN

CIIDIR-MICHOACAN

50  

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

La comparación de las secuencias de ADNr 16S en la base de datos mostró que todas las cepas aisladas pertenecían al filo Firmicutes el cual comprende alrededor de 20 géneros (Lactococcus, Lactobacillus,

Pediococcus,

Aerococcus,

Leuconostoc,

Carnobacterium,

Oenococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella) siendo el genero Lactobacillus el mas grande (Bouzar et. al., 1997; Galvez et. al., 2007. La disposición filogenética mostró varias ramas (figura 6). El organismo incluido en la rama más separada del árbol filogenético esta relacionado con Pediococcus pentosaceus (BCOT-7 y 13), encontrado al mes (BCOT-13) y a los tres meses de maduración (BCOT-7) Lactobacillus plantarum (BCOT-4 y 3), en la etapa de cuajado mas salado (BCOT.-3) y un mes de maduración, Bacterium sp. (BCOT-15, 6, 9), se encontró en la etapa de cuajado (BCOT-9), uno (BCOT-15) y tres meses de maduración (BCOT-6), estos microorganismos, están presentes en la segunda y tercera rama respectivamente. Las ramas restantes del árbol engloban a la especies del genero Lactobacillus, Lactobacillus casei (BCOT-5 y 8), habiéndose aislado en la cuajada (BCOT-8) y al mes de maduración (BOT-5), Lactobacillus sp (BCOT-1, 2, 10, 11, 12 y 14), estuvo presente en todo el proceso de elaboración del queso, cuajada (BCOT-1 y 2), cuajo y sal (BCOT-10) y un mes de maduración (BCOT-11, 12, 14) Lactobacillus brevis (BCOT-16) solo se encontró al mes de madurado el queso (figura 8). En términos generales, las bacterias de ácido láctico fueron las bacterias predominantes en el queso Cotija. Se obtuvieron también los patrones de fermentación de carbohidratos para cada uno de los diferentes aislamientos de BAL del queso Cotija (Tabla 4)

CIIDIR-MICHOACAN

51  

HBC

CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

100 4 4

69

96

97 26

100 77

99 39

94 85

100 93

99 95 78

80

60

40

20

BCOT-2 Lactobacillus sp. (EU552040) BCOT-11 BCOT-10 BCOT-14 BCOT-1 Lactobacillus sp.(EU552042) BCOT-12 Lactobacillus sp.(EU552041) BCOT-16 Lactobacillus brevis (GQ289390) Lactobacillus brevis (EF412983) Lactobacillus brevis (FJ532366) Lactobacillus casei (GU344732) BCOT-5 BCOT-8 Lactobacillus casei (HM058597) Lactobacillus casei (GU177634) Bacterium (GU458351) Bacterium (EF202993) BCOT-9 BCOT-15 BCOT-6 Bacterium (FJ976576) BCOT-3 Lactobacillus plantarum (EU273821) Lactobacillus plantarum (FJ640996) Lactobacillus plantarum (GQ922601) BCOT-4 BCOT-7 BCOT-13 Pediococcus pentosaceus (AB481102) Pediococcus sp. (FJ892738) Pediococcus pentosaceus (FJ538564)

0

Figura 8. Relaciones evolucionarias de las muestras de bacterias basadas en las secuencias 16S ADNr. Método de máxima parsimonia. Los números de acceso se muestran en paréntesis

CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

Aislamiento

Crecimiento a: 15ºC 45ºC

Fermentación de carbohidratos

BCOT-1

-

+

Arabino sa -

Galactosa

Lactosa

Maltosa

Manitol

Melobiosa

Sorbitol

Sucrosa

Trehalosa

Xylosa

d

Ramnos e -

+

-

-

-

d

-

-

-

BCOT-2

+

-

+

+

-

d

+

+

-

+

+

-

-

BCOT-3

+

-

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

-

BCOT-4

+

-

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

-

BCOT-5

+

+

-

+

-

+

+

+

-

-

+

+

-

BCOT-8

-

+

+

+

-

+

-

+

+

-

+

-

-

BCOT-10

+

-

+

+

-

d

+

+

-

+

+

-

-

BCOT-11

-

+

-

+

-

-

-

d

-

d

-

-

-

BCOT-12

+

-

+

+

-

d

+

+

-

+

+

-

-

BCOT-14

+

-

+

+

-

d

+

+

-

+

+

-

-

BCOT-16

+

-

+

-

-

+

+

+

-

+

+

-

-

Tabla 4. Tabla de fermentación de carbohidratos por parte de las BAL

CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei y, Lactobacillus sp., pertenecen al grupo de los lactobacilos mesofílicos heterofermentativos facultativos (Hassan et., al. 2001) , estas a su vez pueden ser subclasificadas en hetero lácticas ya que metabolizan hexosas a través de la ruta de Embden-Meyerhoff, pero pentosas y algunas otras sustancias son metabolizadas vía fosfocetolasa para producir acido láctico y otros productos como, ácidos orgánicos, CO2, alcohol y peróxido de hidrogeno (Parra 2010). Lactobacillus brevis es un lactobacilo mesófilo heterofermentativo, que utiliza obligatoriamente hexosas y pentosas como fuente de carbono. Estas especies se han encontrado como flora benéfica durante la maduración de los quesos (Beresford et., al. 2004). En un estudio realizado por Coppola y colaboradores (2000) en el queso italiano Parmigiano Reggiano, encontraron que la población bacteriana de este queso esta constituida principalmente por bacterias del acido láctico y particularmente ellos aislaron Lactobacillus casei a los cuatro meses de maduración de dicho queso, lo que concuerda con el presente estudio, pero no fue aislado este en la cuajada. En otro estudio en el queso serbio Zlatar, Veljovic y colaboradores (2007) encontraron como flora predominante en dicho queso a BAL mesofílicos, habiendo hallado a Lactobacillus brevis y Lactobacillus plantarum, entre otras especie y géneros de BAL. Durante la maduración de los quesos los productos del metabolismo de las BAL como los que producen Lactobacillus plantarum y Lactobacillus casei (ácidos orgánicos, CO2, alcohol y peróxido de hidrogeno), intervienen en la aparición de las características organolépticas como el sabor y aroma en los quesos (Tempel et. al, 1998). Perry (2004) señala que las BAL son las primeras responsables, por la transformación de la lactosa, en acido láctico, durante la producción de los quesos, así mismo la proteólisis esta involucrada en la conversión de los aminoácido en compuestos volátiles así como los resultantes del metabolismo de la lactosa que son las responsables de la maduración de los quesos. Sin embargo algunos autores señalan que los lactobacilos mesófilos heterofermentativos obligados como Lactobacillus brevis, producir sabores indeseables y gases durante la maduración de los quesos (Hassan et., al. 2001; Bruno et, al., 2009).

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El hecho de también haber encontrado a Lactobacillus casei en la cuajada del queso Cotija, se debe a que en dicha etapa se genera más intensamente la actividad fermentativa (Fernández 2000). Por otro lado los lactobacilos mesófilos heterofermentativos son detectado con menor frecuencia en quesos (Beresford et., al. 2004). El género Pediococcus se encuentra dentro de la familia Streptococaceae, cocos gram positivos, microaerofilicos, homofermentativos. El género consiste de siete especies: Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidolactici, Pediococcus damnosus, Pediococcus halophiles, Pediococcus parvulus, Pediococcus urinaee-equi (Bhowmik et., al. 1989). Este género se ha reportado como flora dominante en el queso Cheddar canadiense (Fryer et., al. 1966) y que mejora el sabor de este dentro de las primeras etapas de maduración. En este trabajo se encontró la presencia de Pediococcus pentasaceus en el estado de un mes de maduración, el cual como ha informado Thomas (1986) contribuye mediante la oxidación de la lactosa, la producción de péptidos y de lactato al desarrollo del sabor en los quesos durante la maduración de estos.

8.3.

Aislamiento e identificación de levaduras y mohos del queso Cotija.

Se seleccionaron 11 colonias y se identificaron por sus características fenotípicas y la secuencia de la región ITS, dichos aislamiento fueron identificados mediante las siglas FCOT. Las características fenotípicas evaluadas fueron: plasma coagulado, producción de acido acético, desarrollo a 37°C, producción de ureasa, tubo germinativo y leche fluida (Tabla 5). Así mismo se determinó para cada uno de los aislamientos su desarrollo a pH de 8.0, temperatura de 48°C y la utilización de diferentes carbohidratos como fuente de carbono (Tabla 6).

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Características fenotípicas Obtención

Identificación

Plasma

Acido

coagulado

Acetico

Desarrollo 37ºC

Ureasa

Tubo

Leche

Germinado

Fluida

FCOT-4

Cuajada

Kluyveromices marxianus

+

−

+

−

−

+

FCOT-20

Cuajada

Rodothorula mucilaginosa

+

−

+

−

+

+

Galactomyces geotrichum

+

−

+

−

−

−

Pichia guillermondi

+

−

+

−

−

+

Kluyveromyces lactis

−

+

+

−

+

+

Galactomyces geotricum

+

−

+

−

−

−

Kluyveromyces marxianus

+

−

−

−

+

−

mas sal FCOT-21

Un mes maduración

FCOT-22

Un mes maduración

FCOT-27

Cuajada mas sal

FCOT-28

Cuajada mas sal

FCOT-30

Un mes maduración

FCOT-36

Cuajada

Kluyveromyces lactis

+

+

−

−

−

−

FCOT-37

Cuajada

Galactomyces geotrichum

+

−

+

−

−

+

FCOT-43

Un mes

Kluyveromyces marxianus

+

+

−

+

−

−

Galactomyces geotrichum

−

+

−

+

−

−

maduracion FCOT-45

Un mes maduracion

Tabla 5. .- Características fenotípicas de aislados de Mohos y clasificación taxonómica de acuerdo a la secuencia ITS1–5.8S–ITS2

rDNA CIIDIR-MICHOACAN

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Aislamiento

Desarrollo a

Fermentacion de carbohidratos

48ºC

pH 8.0

Celobiosa

Galactosa

Glucosa

Inositol

Maltosa

Manitol

Ramnosa

Trehalos a

Xylosa

Ureasa

Nitritos

FCOT-4

-

-

+

-

+

-

-

-

+

-

+

-

+

FCOT-20

-

+

-

+

+

+

+

-

+

+

-

+

-

FCOT-21

-

-

-

+

+

-

-

+

-

+

-

-

+

FCOT-22

-

-

+

+

+

-

+

-

+

-

+

-

+

FCOT-27

-

-

+

-

+

+

+

-

-

-

+

-

+

FCOT-28

-

-

-

+

-

+

+

+

+

+

-

-

-

FCOT-30

+

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

-

FCOT-36

+

-

+

+

+

-

+

+

+

+

+

-

-

FCOT-37

-

-

-

+

-

-

-

-

+

-

+

-

+

FCOT-43

-

-

+

-

+

-

+

-

+

-

-

-

-

FCOT-45

-

-

+

-

-

+

+

-

+

-

+

-

+

Tabla 6. Asignación de género de acuerdo a las características fisiológicas de las cepas aisladas de queso Cotija proceso de fabricación

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Para la identificación molecular se amplificó la región ITS mediante PCR. En este paso se obtuvieron todas amplificaciones mediante las condiciones de reacción anteriormente citadas (Figura 6). Una vez amplificadas todas las muestras se secuenciaron y los datos obtenidos se compararon en la base de datos del NCBI, mediante el algoritmo blast, se elaboró el árbol de distancias génicas (Figura 9), para la región ITS, donde las levaduras se agruparon por genero y especie, obteniéndose 5 grupos, así mismo se elaboró la tabla 5, para la identificación de la etapa del proceso de elaboración del queso Cotija. Los grupos formados en el árbol filogenético fueron (arriba hacia abajo): Kluyveromyces lactis (FCOT -27Cuajada mas sal; FCOT-36-Cuajada), Pichia guilliemondii (FCOT-22-Un mes de maduración), Rhodotorula mucilaginosa (FCOT-20-Cuajada mas sal), Galactomyces geotrichum (FCOT-21-Un mes de maduración; FCOT-28-Cuajada mas sal; FCOT-37Cuajada; FCOT-45-Un mes de maduración), Kluyveromyces marxianus (FCOT-4-Cuajada; FCOT-30-Un mes de maduración; FCOT-43 un mes de maduración).

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Kluyveromyces lactis (GQ376079) Kluyveromyces lactis (DQ646686) Kluyveromyces lactis (AY338967)

88 55

Kluyveromyces lactis (GQ376077) FCOT 36

100

FCOT 27 FCOT 22

97

Pichia guilliermondii (EF568004) 100

Pichia guilliermondii (FJ969194) 68 Pichia guilliermondii (FJ662408)

86

Pichia guilliermondii (EU568993) Rhodotorula mucilaginosa (AM117825) Rhodotorula mucilaginosa (AB038074) 100 FCOT 20 18

Rhodotorula mucilaginosa (AF321544) FCOT 37 Galactomyces geotrichum (FJ499444) FCOT 21 FCOT 28

100 46

Galactomyces geotrichum (HM210837) FCOT 45

15

Galactomyces geotrichum (EF192177)

10

Galactomyces reessii (FJ219595) Galactomyces reessii (GRU40111) Galactomyces reessii (AB436431)

26 97

Galactomyces sp. (AB563187) FCOT 43

100

FCOT 4 67

Kluyveromyces marxianus (FJ644707) 46

Kluyveromyces marxianus (EU019219) Kluyveromyces marxianus (FJ644705) 95 FCOT 30 Kluyveromyces marxianus (AY894822)

80

60

40

20

0

Figura 9. Árbol filogenético de las levaduras implicadas en el proceso de elaboración del queso Cotija. Basado en las secuencias ITS1-5.8SrDNA. Método de máxima parsimonia. Los números de acceso se muestran en paréntesis.

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Las levaduras poseen determinadas características particulares que les permiten crecer y contaminar en alimentos de origen lácteo, entre ellas, la fermentación/asimilación de la lactosa, producción de enzimas proteolíticas extracelulares, por ejemplo: lipasa, asimilación de acido láctico y cítrico, crecimiento a bajas temperaturas y halo tolerancia (Orbera 2004). La levaduras del genero Kluyveromyces, (Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marxianus, caracterizadas en este estudio) se le reconoce por su habilidad de fermentar la lactosa (Lima et. al., 2009). Kluyveromyces marxianus sido aislada de fruta, queso, yogurt (Maubis 1989), leche (Roostita 1996), y se ha utilizado en el procesamiento del lactosuero; fermenta galactosa, sacarosa, rafinosa, lactosa, crece a temperaturas entre 20-30ºC y pH 4,5-5, y con ella se obtienen etanol, glicerol, enzimas y proteína unicelular (Padín et., al. 2009). La capacidad de fermentar la lactosa y los productos que se obtienen a partir de esta, se acumulan en la etapa de maduración del queso, las especies del genero Kluyveromyces halladas en este estudio, fueron aisladas en la etapa de maduración, estos datos coinciden con lo encontrado por Kaminarides et., al. (1989) en su estudio de la evolución de la microflora del queso Kopanisti durante la maduración de este, ya que aislaron e identificaron a Kluyveromyces lactis y Kluyveromyces marxianus, al inicio y al final de la maduración.

Por otro lado, el recuperar estos microorganismos dentro de las etapas

tempranas del proceso producción del queso (Cuajada y cuajada-salado), tiene su explicación ya que en estas etapas se registra la mayor actividad metabólica. La microflora es muy específica en cada quesería esta contribuye al bouquet especifico del producto. En los quesos predominan especies del género Rhodotorula, Debaryomyces y Yarrowia. Es en estos productos lácteos la levaduras actúan mediante producción de fructificaciones, sabores indeseables y una textura desagradable para la apariencia del producto (Orbera 2004). En el caso del queso Cotija (en este estudio), los géneros y especies de levaduras que se lograron caracterizar (Pichia guillermondii, Galactomyces geotrichum, Rdhodotorula mucilaginosa), tiene una influencia negativa en los alimentos. Especies del género Pichia CIIDIR-MICHOACAN

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se ha aislado de salmuera de aceitunas y otros alimentos. Rhodotorula, es un aerobio estricto que forma película en algunos productos, forma pigmento rosa a rojo, que causa deterioro en quesos, crema, mantequilla y yogurt. Roostita et., al. (1996) sostienen que las enzimas proteolíticas y lipolíticas producidas por levaduras contribuyen al desarrollo del sabor y olor característico del queso durante la maduración, Sin embargo la proteólisis y la lipolisis de los componentes de la leche podrían tener un impacto significativo sobre su calidad, como la promoción de sabor rancio y alteraciones en la textura del producto El hallazgo de levaduras como las que se presentan este trabajo, son las que habitualmente se presentan en los quesos como, lo muestran en sus trabajo Prillinger et., al. (1999) en donde identificaron 76 aislamientos de levaduras y dentro de los cuales se identificaron hasta el nivel de especie con mayor frecuencia a Debaryomyces hansenii, Geotrichum candidum, Galactomyces geotrichum, Issatchenkia orientalis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lipolytica. Lopandic et., al.(2006) aislaron de queso fresco Debaryomyces hanseii, Kluyveromyces marxianus, Yarrowia lipolytica y Geotrichum candidum encontradas en la cuajada de este tipo de queso. Mayo et., al. (2004) caracterizaron Kluyveromyces lactis y K. marxianus en el queso español con denominación de origen Cabrales. Yalcin et., al. (2009) en quesos blancos turcos identificaron levaduras de los géneros Debaryomyces, Pichia (Pichia guillermondii), Torulaspora, Candida, Wiliopsis, Galactomyces, Kluyveromyces (K. marxianus) y Yarrowia, causando alteraciones en este tipo de quesos. 8.4. Utilización de las pruebas fenotípicas y genotípicas en la caracterización de microorganismos.

Los métodos fenotípicos constituyen una herramienta de suma importancia para la tipificación de muchos microorganismos, no obstante, el alcance de estos procedimientos puede encontrar serias restricciones (Vilchez et., al. 2009), entre las cuales encontramos que los rasgos fenotípicos son susceptibles a la influencia del ambiente, que pueden provocar variaciones en la expresión genética, por lo cual, el resultado obtenido a través de la detección de este tipo de caracteres puede presentar poca estabilidad, reproducibilidad o CIIDIR-MICHOACAN

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poder discriminatorio. Adicionalmente, presentan la desventaja de encontrarse, en algunos casos, limitados a unas pocas especies. Resultan además, poco prácticos para el análisis de microorganismos de crecimiento lento, dificultoso o no cultivables ya que generalmente, requieren la multiplicación de los mismos y resultan poco apropiados para determinar las relaciones de clonalidad entre microorganismos, presentando una limitada capacidad de identificación a nivel de subespecie, subtipo o cepa (Pfaller 1999), por otro lado, los métodos genotípicos están basados en la detección del material genético del organismo, por lo tanto son independientes de los cambios en el patrón de expresión genética y de las influencias

ambientales,

ofreciendo

una

alternativa

con

mayor

estabilidad

y

reproducibilidad. No requieren necesariamente el aislamiento y cultivo de los microorganismos, siendo posible obtener los resultados en tiempos más cortos y, usualmente con mayor poder de resolución, sensibilidad y especificidad que los métodos fenotípicos. Los métodos de genotipificación se han constituido en una herramienta que complementa a los procedimientos fenotípicos (Pfaller 1999; Versalovic et., al. 2002). En estudio se emplearon las técnicas basadas en el fenotipo de los aislamientos de bacterias, mohos y levaduras del queso Cotija, además de la utilización de método moleculares de análisis con base en la secuencia del ADNr 16S, para el caso de bacterias y de la secuencia de los genes ITS para la identificación de mohos y levaduras, teniendo como resultado la caracterización de la microbiota responsable de las características del queso Cotija, en la mayoría de los casos hasta el nivel de especie, solo en el caso de Lactobacillus sp y Bacterium sp la identificación mediante el empleo de ambas técnicas nos permitió llegar hasta del genero de estas. Varios autores has realizado la caracterización de diferentes productos mediante el empleo de estos tipos de análisis (fenotípico y genotípico) un ejemplo son las investigaciones de Kunene y cols (2000), utilizaron métodos fisiológicos y moleculares para caracterizar la microbiota láctica de un alimento de destete a base de sorgo fermentado. Determinaron el origen de las cepas predominantes mediante el análisis de los resultados de AFLP (Polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados), encontrando que Lactobacillus plantarum provenía del polvo de sorgo usado como ingrediente y como las cepas de CIIDIR-MICHOACAN

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Leuconostoc mesenteroides no mostraban un origen común, se presumió que provenían de las casas donde se preparó el alimento. El uso de los espaciadores transcritos internos ITS 1 e ITS 2 (5,8S – ITS) (Kurtzman et., al. 1998.) La región 5.8S es codificadora y conservada y muestra una baja variabilidad intraespecífica que no permite la delimitación entre cepas de una misma especie, sin embargo la zona de los ITS, que es una región no codificadora e hipervariable, permite el reconocimiento a nivel interespecífico. Ésta ha sido empleada para la identificación de especies del género Kluyveromyces (Belloch et., al., 1998). Lopandic y colaboradores (2006), identificaron mediante el uso combinado de técnicas tradicionales microbiológicas y técnicas moleculares, las levaduras de productos lácteos, donde ellos hicieron una comparación de los resultado obtenidos por la investigación génica y fenotípica, donde observaron que el empleo de métodos moleculares apoyo en solo 54% la identificación fenotípica. Con esto afirman que la identificación molecular es una buena herramienta de apoyo para las técnicas fenotípicas en la identificación de levaduras.

8.5. Diversidad genética de la microbiota asociada al queso Cotija por ERIC-PCR y REP-PCR. Las bacterias, mohos y levaduras, se clasificaron de acuerdo al patrón de bandas obtenidas utilizando las técnicas ERIC y REP-PCR. En las fotos obtenidas a partir de la amplificación se pueden observar bandas comunes a uno o más microorganismos. Sin embargo en algunas cepas no se observo amplificación. Las cepas BCOT 1.2.5 y 14 no fueron responsivas para los iniciadores REP. Mientras que las cepas BCOT 1, 2 y 16 no lo fueron para los iniciadores ERIC (Figuras 10 y 12).

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CARACTER RIZACION MOLECULAR M DE LA MICR ROBIOTA ASO OCIADA AL Q QUESO COTIIJA   

  Figurra 10. Patróón obtenido utilizando laa técnica de REP-PCR para las baccterias del queso q Cotijaa

  Figurra 11. Patrón n obtenido utilizando u la a técnica la técnica t de ERIC-PCR E p para las baccterias del queso q Cotijja   

Para el caso dee los mohoss y levadurras del queso se pudieeron obteneer los patro ones de baandas tambbién por estaas técnicas (Fig. 12-13). Solamentte la cepa 36 no ampliffico mediannte la utilizaación de loos iniciadorees ERIC.  

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CARACTER RIZACION MOLECULAR M DE LA MICR ROBIOTA ASO OCIADA AL Q QUESO COTIIJA   

  Figurra 12. Patróón obtenido utilizando la l técnica dee REP-PCR R para los m mohos y levaaduras del queso q Cotijja. 

             

 

Figurra 13. Patróón obtenido utilizando la técnica la técnica de ERIC-PCR E para los mo ohos y levad duras del queso q Cotija..

Estoss métodos (ERIC ( Y REP), R basad do en la PCR R generan huellas gennéticas de ADN A que siirven para identificar cepas espeecificas den ntro de una especie baccteriana (V Versalovic et. al., 1991). El PCR se reefiere a la l metodollogía general que im mplica la aplicación n de termiino REP-P oligo onucleótidoss basados en e familias de d secuenciia repetitivaas extragéniicas cortas de d DNA, qu ue se encu uentran disp persas en to odo el crom mosoma prrocariótico y que pareecen estar conservadaas en CIIDIR-MICHOA ACAN

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muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae como otros géneros y especies bacterianas (Lupski et., al., 1992; Versalovic et., al., 1991; Stern et., al., 1984; Sharples et., al., 1990), así como en hongos (Hierro et., al., 2004). Esta técnica permite observar un polimorfismo, por medio de un gel de agarosa, que resulta de la variabilidad en la repetición de dichas secuencia REP y de la distancia entre copias contiguas causadas por inserciones o deleciones de ADN (Versalovic et., al., 1991). Las secuencias ERIC son u palíndromo imperfecto de 127 pb, se describen como unidades repetitivas intergenicas distribuidas en una amplia gama de bacterias y hongos. Estas secuencia fueron descritas primeramente en Escherichia coli, Salmonella typhimorium, otros miembro de la familia Enterobacteriaceae así como en algunas especies del genero Vibrio (Sharples et., al., 1990).

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9. CONCLUSIONES

Se aislaron 16 bacterias pertenecen a las Bacterias Acido Lácticas, las cuales están asociadas a los productos lácteos como el queso. Las bacterias caracterizadas en este estudio fueron: Lactobacillus sp., Lactobacillus plantarum, Lactobacillus casei, Bacterium sp., Lactobacillus casei, Pediococcus sp., Lactobacillus brevis. Las levaduras aisladas, se le ha relacionada con alteraciones indeseables en los alimentos. Las levaduras asociadas al queso Cotija en este trabajo fueron: Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis, Rhodotorula mucilaginosa, Galactomyces geotrichum y Pichia guillermondii. Mediante el empleo de las técnicas de ERIC Y REP-PCR, se lograron obtener las huellas genómicas de la microflora del queso Cotija. Estas técnicas nos permitieron observar una gran diversidad genética entre bacterias y levaduras del mismo género así como entre especies de un mismo género, se que se encuentran en las diferentes etapas del queso Cotija y que en buena medida contribuyen con la producción de las características organolépticas tan particulares de este producto lácteo. Los métodos genotípicos se han convertido en elementos esenciales para la identificación de microorganismos ya que son herramientas que facilitan y complementarlas los métodos de fenotipificación. El éxito de estas herramientas moleculares de análisis dependerá de una adecuada utilización y selección de las técnicas a utilizar, además de la aplicación combinada de otros procedimientos. Se debe de tomar en cuenta que estas metodologías no son un sustituto de las fenotípicas, si no que se plantean que sean herramientas que ayuden a cubrir las limitaciones de las técnicas tradicionales de identificación de microorganismo.

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10. BIBLIOGRAFIA

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11. GLOSARIO ACIDO NUCLEICO: Biomolecula formada por macropolimeros de nucleótidos, o polinucleotidos. Esta presente en todas las células y constituye la base material de herencia que se transmite de una generación a otra.

ADN: Acido Desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN (y también DNA, del inglés deoxyribonucleic acid), es un tipo de ácido nucleico, una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria. Desde el punto de vista químico, el ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido.

ADN Taq polimerasa: Es una enzima que se extrae de la bacteria Thermus aquaticus para la replicación del ADN, la Taq ADN polimerasa, es ampliamente utilizada por sus propiedades de termorresistencia en la reacción en cadena de la polimerasa. ARBOL FILOGENETICO: Es una árbol que muestra las relaciones de evolución entre varias especies u otras entidades que se cree que tuvieron una descendencia común.

ARN: Acido Ribonucleico (ARN o RNA, de RiboNucleic Acid, su nombre en inglés) es un ácido nucleico formado por una cadena de ribonucleótidos. Está presente tanto en las células procariotas como en las eucariotas, y es el único material genético de ciertos virus (virus ARN). El ARN celular es lineal y de hebra sencilla, pero en el genoma de algunos virus es de doble hebra.

BLAST: Programa bioinformatico que emplea un algoritmo heurístico lleva a cabo un alineamiento de secuencias de tipo local, ya sea de ADN o proteínas. El programa es capaz CIIDIR-MICHOACAN

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de comparar una secuencia problema contra otra una gran cantidad de secuencia que se encuentra en una base de datos. CATALASA: Enzima que se encuentra en organismos vivos y cataliza la descomposición del peróxido de hidrógeno (H202) en oxígeno y agua. ELECTROFORESIS: Migración de partículas a través de una matriz (usualmente polimérica) debido a diferencial de campo eléctrico. ENZIMA: Moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones químicas, siempre que sea termodinámicamente posible. EUCARIOTA: Células que tienen su material hereditario fundamental (su información genética) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un núcleo celular. Igualmente estas células vienen a ser microscópicas pero de tamaño grande y variado comparado con las otras células. GEN: Un gen es una secuencia lineal organizada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN en el caso de algunos virus), que contiene la información necesaria para la síntesis de una macromolécula con función celular específica, normalmente proteínas. HALOTOLERANTE: Organismo que puede soportar concentraciones altas de sal. LACTOSA:La lactosa (β-D-galactopiranosil-α-D-glucopiranosa) es un disacárido formado por la unión de una molécula de glucosa y otra de galactosa. LIPASAS: Enzima segregada, principalmente, por el páncreas. Se encarga de la digestión de las grasas al catalizar la hidrólisis de los enlaces estéricos de los ácidos grasos y el glicerol de triglicéridos y fosfolípidos.

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MEGA 3.1: Herramienta bioinformatica para trabajar con alineamiento de secuencias manual y automáticamente para la realización de arboles filogenéticos empleando secuencia de las bases de datos, estima rangos de evolución molecular. NUCLEOTIDO:

moléculas

orgánicas formadas

por

la

unión covalente de

un monosacárido de cinco carbonos (pentosa), una base nitrogenada y un grupo fosfato. El nucleósido es la parte del nucleótido formado únicamente por la base nitrogenada y la pentosa.

OLIGONUCLEOTIDO: Un oligonucleótido es una secuencia corta de acido deoxyrribonucleico (ADN o del inglés DNA) o acido ribonucleico (ARN o del inglés RNA), de diez a cien bases. En la biología molecular y biotecnología tienen varias diferentes funciones: Antisenso como bloque de la expresión génica, cebadores en reacciones de amplificación, sondas de hibridación, en microarreglos.

PCR: La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction),

es

una

técnica

de

biología

molecular desarrollada

en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde. pH: El pH es una medida de la acidez o alcalinidad de una solución. El pH indica la concentración de iones hidronio [H3O+] presentes en determinadas sustancias. La sigla significa "potencial de hidrógeno PROCARIOTA: Se llama procariotas (del griego πρό, pro = antes de y κάρυον, karion = núcleo) a las células sin núcleo celular diferenciado, es decir, cuyo material genético se encuentra disperso en el citoplasma, reunido en una zona denominada, Nucleoide.

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PROTEASAS: enzima que provoca la proteólisis, es decir, la hidrólisis de los enlaces peptídicos que enlazan los aminoácidos PROTEOLISIS: Fragmentación o hidrólisis de una proteína en sus respectivos aminoácidos. RENINA: La quimosina o rennina es una proteasa aspártica encontrada en el cuajo. Es producida por las vacas en el abomaso (la cuarta y última cámara del estómago). Se utiliza en la industria lechera para producir queso. RIBOSOMAS: Son orgánulos complejos, altamente especializados, que utilizan los organismos para el complicado proceso de síntesis de proteínas. El ribosoma bacteriano tiene un coeficiente de sedimentación de 70S (expresado en unidades Svedberg), y puede disociarse en dos subunidades, la subunidad grande (50S) y la subunidad pequeña (30S). Cada Subunidad es un complejo ribonucleoproteico constituido por proteínas ribosómicas y moléculas de ARNr específicas. TERMOFILICO: organismos vivos que pueden soportar condiciones extremas de temperatura relativamente altas, por encima de los 45ºC, o relativamente baja.

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12. APENDICE

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Apéndice A. Secuencias de las bacterias del queso Cotija

>seq1 [organism=Lactobacillus sp.] BCOT1 TGGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAAGAGTG GCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACT TGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTG AAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTT GGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCTACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGA TCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAA GAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGT AACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTTTCCGGGTTTATTGGGCGTA AGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAG GAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTC CATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGC GGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAG GATTA >seq2 [organism=Lactobacillus sp.] BCOT2 TGCAGTCGTACGCTTCTTTTTCCCCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAAGAGT GGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACA CTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGCTTTTGATTT GAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGT TGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCTACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTG ATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGT AGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGA CIIDIR-MICHOACAN

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AGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAG TAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGT AAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACC GGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAA TTCCTTGTGTTGCGGTGAAATGCGTAGATTTTTGGAGGAACACCAGTGGCGAAG GCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAAA AGGATAA >seq3 [organism=Lactobacillus plantarum.] BCOT3 GGAAMYGTWTCGGATTATTGGGCGTAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCT GATGTGAAAGCCCACGGCTAAAGAGGGGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTG AGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT ATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAG GCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGT AAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAAC GCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAA TTGACGG >seq4 [organism=Lactobacillus plantarum] BCOT4 GCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAA GTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGGAAACTGGGAA ACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTA GATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACG CTGAGGCTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAT ACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTGCAGTGCTGCA GCTAACGCATTAAGTCATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGGTGAAACTCA GGAATTGACGGTATTTAACCAGAAA

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>seq5 [organism=Lactobacillus casei] BCOT5 GTCGACGAGTTCTCGTTGATGATCGGTGCTTGCACCGAGATTCAACATGGAACG AGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCTTAAGTGGGGGATAA CATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTG GCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCT AGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGG TTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGC AGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAG TGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCA GAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAAGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGG GCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGAGTGGAAGCCCTCGGCTTA ACCGAAGAAAGCCCATCGGAAACTGGGAAACTTGATTGCAAAAAAGGACGTG GAACTCCCGGTGTAGGGGTGAAATGGT >seq6 [organism=Bacterium sp.] BCOT6 TGCGGTCGAGCGACAGACGAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGAGCG GTGAGAAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATCACTTCGGGAAACC GGAGCTAATACCGGATAATATTTCGAACCGCATGGTTCGATAGTGAAAGATGG CTTTGCTATCACTTATAGATGGACCTGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAA CGGCTTACCAAGGCAACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACAC TGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC CGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTC GGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAACTGTGCAC GTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCG TAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTC ATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTA GCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTT CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

>seq7 [organism=Pediococcus pentosaceus] BCOT7 CGTTATCGGGATTTATTGGGCGTATAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAA TGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGA GTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATA TGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGG CTCGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCGGTA AACGATGATTACTAGTTGGTGGAGGGTTTCAGCCCTGCAGTGCTGCAGCTAAC GCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAGGAAAA TTGACCGAAGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTC CCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTG AGATGTTGGGTTAAG >seq8 [organism=Lactobacillus casei] BCOT8 TAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTC TTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAG CTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGA GGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCA GCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTG AGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGG CAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATT GGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGG CTTAACCCGAGGGAACGCAATCGGAACCTGGGAAACTTGGATGGCAAAAGAA GGACAGTGGGAACTCCCTGTGTAGCGGTGAAATGGTAAATATATGGAAAAAAC CCACTGGGAAGGGGGC

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83

HBC

CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

>seq9 [organism=Bacterium sp.] BCOT9 CGTTACGTCTGAGGATTTGTTAGCCTCGGTAATTACCTATCGACTGGTATACCT TGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTCGAACCGCATGGATCGCTAGT GAAAGATGGCTTTGCTATCCCTTATAGATGGACCTGCACCGCATTAGCTAGTTG GTAAGGTAACGCCTTACCAAGGCAACCATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGAT CGGACACGCTGGAACTGACACACGGTCCACACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAG GGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATG AAGGTCTTCCGATCTTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTA ACTGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCACAAAGCCACGGCTAACTACGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTCGGCGTA AAGCGCGCGTAACGCCCTTTTTAAAGTCTGATGTGATAAGCCCACGGCTCAACC GTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGGAGAAGAGGAAAGTGCAA TTCCATGTGTACGCGTGAAATGCG >seq10 [organism=Lactobacillus sp.] BCOT10 GCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAGAAGAGTGGCAAACGG GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGGAAACA GGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCT TTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTA ACGGCTCACCAAGGCTACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACA TTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTT CGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTT CGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGGTCA TCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCACCAGCGC GGTAATACGTAAGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCG AGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGGAACCCCCCGGCTCACCGGGGAGGTCTTGGA AACTGGAGACTGATTGCAAAAAGAAAGGGAATTCC

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

>seq11 [organism=Lactobacillus sp.] BCOT11 GTCCTACGCTTCTTTTTCCCCCGGACTTGCTCCACCGGAAAAAGAAGAGTGGCG AACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGGATAACACTTGG AAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAA GGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGG CCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA ATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAG GTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACT GTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAG CGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGG AGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCC ATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAGTGG >seq12 [organism=Lactobacillus sp.] BCOT12 TATCATGCAGTCGTACGCTTCTTTTTCCACCGGAGCTTGCTCCACCGGAAAAAG AAKAGCCGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCAGAAGGGG ATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTT TTGATTTGAAAGGCGCTTTCGGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTA GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCYACGATGCATAGCCGACCTGAG AGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGC AGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGT GAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGA TGAGAGTAACTGTTCATCCCTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACT ACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATT GGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGC TCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGA

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

GTGGAATTTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCAG TGGCGAAGCGGC >seq13 [organism=Pediococcus pentosaceus] BCOT13 TGTACGTGGAACATGGGCGTATAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATG TGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTACATTGGAAACTGGGAGACTTGCAT GCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATG GAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCT CGAAAGCGTGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCGGTAAA CGATGATTACTAGTTGGTGGAGGGTTTCAGCCCTGCAGTGCTGCAGCTAACGCA TTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAGGAGAATTG ACCGGAGCCCGCAGATCAGATACCGTCGTAGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAA GAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGTCTAAGAGATTAGAGGTTCCCT TCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGA TGTTGGGTTAAGT >seq14 [organism=Lactobacillus sp.] BCOT14 GCTTCTTTTTCCCCGGACTTGCTCCCCGGAAAAAGAGGAGGGGCGAACGGGTG AGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATCCGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGT GCTAATACCGTATAACAATCGAAACCGCATGGTTTTGATTTGAAAGGCGCTTTC GGGTGTCGCTGATGGATGGACCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACG GCTCACCAAGGCCACGATGCATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTG GGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGG CAATGGACGAAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGG ATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACAAGGATGAGAGTAACTGTTCATCC CTTGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGG TAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCA GGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCAT

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

TGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGC GGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACCCCAGTG

>seq15 [organism=Bacterium sp.] BCOT15 TCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTCGAACCGCATGGTTCGATAG TGAAAGATGGCTTTGCTATCACTTATAGATGGACCTGCGCCGTATTAGCTAGTT GGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGA TCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA GGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGT AACTGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC CAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGT AAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAACCCACGGCTCAACC GTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAAAAGAAGAAAATGGAA TTCCCTGTGTACCGGTGAAATGCCCAAGAATTGGAGGAACCCCAGTGGGGAAA G >seq16 [organism=Lactobacillus brevis] BCOT16 TTCCGTTGAATGACGTGCTTGCACTGATTTTAACAATGAAGCGAGTGGCGAACT GGTGAGTAACACGTGGAAAGTCTGCCCGAAAGCAGAGGGTAACACTTGGAAG CAGGTACTATTACCGTATAACAACAAAGTCCGCATGGATTTTGTTTGAAAGGTG GCTTCGGCTATGACGGCTGGATAATCCCGCGGCGTATTAGTTAGTTGGTGAGGT AAAGGCCCACCAAGACGATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCAC AGTTGGAACTAAGGCACGCCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC TTCCACAATGGACGGAAGTCTGATGGAGCAATGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGT TTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTAAAGGAGAGCACCTTTGAGAGTAACTGTTC AAGGGTTGACGGGATTTAACCAGAAAGCCACGGGCATCTACGTGCCAGCCACC GCGGTAATACGTAGGTGGCAAAGGTTGTCCGAATTTATTGGGCGTAAAGCGAG CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

GCGCACGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAGGGCCTTCGGCTGATCCGAGAAACTGC ATCCGAAACGGGGAGACTTGGGTGCCGAAGAAGACGGTGTAACCCCATGTGTA GCGGTGTGAATGCGTAGATGTATGGAAAAACAGCAGTGGCGAGGGC

Apendice B. Secuencias de las levaduras del queso Cotija

>Seq1[organism=Rodothorula mucilaginosa isolate] FCOT 20 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence TCTCACTTTCTAACCCTGTGCATTTGTTTGGGATAGTAACTCTCGCAAGAGAGC GAACTCCTATTCACTTATAAACACAAAGTCTATGAATGTATTTAATTTTATAAC AAAATAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGC AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCT TTGAACGCACCTTGCGCTCCATGGTATTCCGTGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTC ATGAATACTTCAACCCTCCTCTTTCTTAATGATTGAAGAGGTGTTTGGATTCTG AGCGCTGCTGGCCTTACGGTCTAGCTCGTTCGTAATGCATTAGCATCCGCAATC GAACTTCGGATTGACTTGGCGTAATAGACTATTCGCTGARGAATTCTAATCTTC GGATTAGAGCCGGGTTAGGTTAAAGGAAGCTTCTAATCAGAATGTCTACATTTT AAGATTAGATCTCAAATCAGGTAGGACTACCCG >Seq2[organism=Galactomyces geotrichum isolate] FCOT 21 isolate internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence TGAAATTTCCACAGCAAACAATAATTTTATCTCAAAACAAAAATAATCAAATT AAACGCTGGATCTCTTGGTTCTCGTATCGATGAAGAATGCACCGAAACGCGAT ATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATTGCACTT CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

TGGGGTATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAATTGCA TTGCTTTTCTAAAATTTCGAATCAAATTCGTTTGAAAAACAACACTATTCAACC TCAGATCAAGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA AGATCATTAAGAATTTATAATATTTGTGAAATTTACACAGCAAACAATAATTTT ATAGTCAAAACATTAAAAGCAAAACTTTTAACAATGGATCTCTT >Seq3[organism=Pichia guilliermondii isolate] FCOT 22 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence ACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGT TGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATT TTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATG AAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCA TCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTT TGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGT CGGACTAGGTGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTGGATAGTGCTG TCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATA TTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTAAAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAAT CAGGGAGGGAATTCCCG >Seq4[organism=Kluyveromyces lactis] FCOT 27 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence (518 pb) TCTCATCGAGGCGAGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGCTCGTC TCTCCAGTGGACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTATTATAC TATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCG ATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCGTGAAT CATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTG TTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATACTCGTC CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

TCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCATCTGCGTGAGCAGGGCTGCGT GTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGCCAATT CGTGGTAAGCTTGGGTCATAGAGACTCATAGGTGTTATAAAGACTCGCTGGTGT TTGTCTCCTTGAGGCATACGGCTTTAACCAA >Seq5[organism=Kluyveromyces lactis] LCOT 36 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence (522pb) TCTCATCCTAAACACGATGGAGTTTTTTCTCTATGAACTACTTCCCTGGAGAGC TCGTCTCTCCAGTGGACATAAACACAAACAATATTTTGTATTATGAAAAACTAT TATACTATAAAATTTAATATTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCG CATCGATGAAGAACGCAGCGAATTGCGATATGTATTGTGAATTGCAGATTTTCG TGAATCATCAAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGGGGGCAT GCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCTTTGGGTTTGGTAGTGAGTGATAC TCTTCTCGGGTTAACTTGAAAGTGGCTAGCCGTTGCCTTCTGCGTGAGCAGGGC TGCGTGTCAAGTCTATGGACTCGACTCTTGCACATCTACGTCTTAGGTTTGCGC CAATTCGTGGTAAGATTGGGTCAAAGAGACTTATAGGTTGTATAAAGACTCGC TGGTGTTTGTCTCTTTGAGGCATACCGGTTAACCAA >Seq6[organism=Galactomyces sp] FCOT 43 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence ATTTTGTGATTTACACAGCAAACAATAATTTTATAGTCAAAACAAAAATAATCA AAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGTATCGATGAAGAACGCAGCGAAA CGCGATATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATT GCACTTTGGGGTATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGA ATTGCATTGCTTTTCTAAAAAATCGAATCAAATTCGTTTGAAAAACAACACTAT TCAACCTCAGATCAAGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG GAGGAAAGATATTAAGAATTGATAATATTTGTGAAATTTACACAGCAAACAAT CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

AATTTTATAGTCAAAACATAAAAAGCAAAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTT CTC

>Seq7[organism=Galactomyces geotrichum] LCOT 28 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence TTGTGGAATTTACACAGCAACAATAATTTTATAGTCAAAACAAAAATAATCAA CACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGTATCAATGAAGAACGCAGCGAAAC GCGATATTTCTTGTGAATTGCAAAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATTG CACTTTGGGGTATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAA TTGCATTGCTTTTCTAAAATTTCGAATCAAATTCGTTTGAAAAACAACACTATT CAACCTCAGATCAAGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGG AGGAAGAATCATTAAGAATGGATCGAACTAGACTTTTGAAAAGGGACGCTTGG GGCCGAGAGCGAGTGTTGCGAGACAACAAAAAGCTCGACCTCAAATCAGGTA GGAATA >Seq8[organism=Galactomyces geotrichum] FCOT 37 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence GGGCCGGAGCTTTTTGGGATAATGAAATTTGTGAATTGCCCGCATCAATAATTT TTCCTCAAAACAAAAATAATCAAAACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGT ATCGATGAAGAACGCAGCGAAACGCGATATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAA TCATCAGTTTTTGAACGCACATTGCACTTTGGGGTATCCCCCACAGTATACTTG TTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAATTGCATTGCTTTTCTAAAATATCGAATCAA ATTCGTTTGAAAAACAACACTATTCAACCTCAGATCAAGTAGGATTACCCGCTG AACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA

CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTERIZACION MOLECULAR DE LA MICROBIOTA ASOCIADA AL QUESO COTIJA   

>Seq9[organism=Galactomyces geotrichum] FCOT 45 internal transcribed spacer 1, partial sequence; 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2, complete sequence; and 28S ribosomal RNA gene, partial sequence TTTGTGAATTTCACAGCAAACAATAATTTTATAGTCAAAACAAAAATAATCAA AACTTTTAACAATGGATCTCTTGGTTCTCGTATCGATGAAGAACGCAGCGAAAC GCGATATTTCTTGTGAATTGCAGAAGTGAATCATCAGTTTTTGAACGCACATTG CACTTTGGGGTATCCCCCAAAGTATACTTGTTTGAGCGTTGTTTCTCTCTTGGAA TTGCATTGCTTTTCTAAAATTTCGAATCAAATTCGTTTGAAAAACAACACTATT CAACCTCAGATCAAGTAGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGG AGGAA

CIIDIR-MICHOACAN

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CARACTER RIZACION MOLECULAR M DE LA MICR ROBIOTA ASO OCIADA AL Q QUESO COTIIJA   

Apen ndice C. Prroceso de ellaboración del queso Cotija

Lech he reciéén ordeeñada

°Tem m. Optima Cu uajada

Cuajada de la leche l

Am masado

Mad duración

 

CIIDIR-MICHOA ACAN

1 mes dee maduracioon

3 meses de  uracion  madu

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