CARBAPENEMASAS

HIGA Pte Perón Sofia Abel Sergio Cutufia

Clasificación de los antibióticos β-lactámicos • PENICILINAS - Penicilinas naturales: Penicilina G, Penicilina G sódica, Penicilina V - Penicilinas resistentes a las penicilinasas: Meticilina, Nafcilina, Oxacilinas - Aminopenicilinas: Ampicilina, Amoxicilina - Carboxipenicilinas: Carbenicilina, Ticarcilina - Acilureídopenicilinas: Piperacilina, Mezlocilina, Azlocilina

Clasificación de los antibióticos β-lactámicos • CEFALOSPORINAS - Cefalosp. de 1º generación: Cefalotina, Cefaloridina, Cefalexina, Cefradina, Cefazolina - Cefalosp. de 2º generación: Cefaclor, Cefuroxima, Cefamandol - Cefalosp. de 3º generación: Cefotaxima, Ceftriaxona, Ceftacidima, Ceftizoxima, Cefoperazona - Cefalosp. de 4º generación: Cefepime, Cefpirome - Cefamicinas: Cefoxitina, Cefotetan

Clasificación de los antibióticos β-lactámicos

•MONOBACTAMAS

Aztreonam

•INHIBIDORES DE ß-LACTAMASAS

Ácido clavulánico Sulbactam Tazobactam

•CARBAPENEMES

Imipenem Meropenem Ertapenem

Carbapenemes Generalidades

• Derivados semisintéticos de la tienamicina, un carbapeneme natural • • • • •

químicamente inestable, producido por el Streptomyces cattleya. Su característica estructural más importante es la sustitución del átomo de azufre del anillo principal de la mayoría de los betalactámicos, por un grupo metileno (-CH2-), que aumenta su afinidad por las PBP (penicillin binding proteins) La cadena hidroxietílica unida al anillo betalactámico en posición trans lo protege efectivamente del ataque de las betalactamas bacterianas. El imipenem es metabolizado en riñón, por lo que, para que aparezca en orina, debe agregársele cistatina, que inhibe la enzima responsable. CH En el meropenem el metilo en C1 lo protege de la degradaci ón renal, mientras Imipenem que la alteración en la cadena lateral en C2 aumenta su actividad frente a Pseudomona spp. y otras BGN. En los BGN, los carbapenemes penetran fácilmente a través de los canales porínicos de su membrana externa gracias a su bajo peso molecular y estructura compacta, hidrófila. Meropenem 3

Acción de los carbapenemes OH

N •Como todos los betalactámicos, su acción se basa en la unión Ocovalente de su PBP ó molécula con las PBP bacterianas. Anillo Betalactá Betalactámico Betalactamasas •Las PBP son principalmente transpeptidasas y transcarboxilasas, necesarias para la síntesis del peptidoglicano de la pared bacteriana. •Existen muchas PBP, pero solo algunas son esenciales para la bacteria, como son N las PBP 1, 2 y 3. Estas son el blanco principal de los betalact O ámicos. O •La unión del ATB con las PBP produce unMolé efecto lítico sobre las bacterias por 2 écula acilada Mol mecanismos: •Inhibe la traspeptidación y entrecruzamiento de la pared bacteriana debilitandola y exponiendo a la bacteria al medio. •Desregulan a las autolisinas de la pared celular. Hidró Hidrólisis anillo

Ester estable

(betalactamasas)

(PBP)

Espectro de actividad antibacteriana • Son el principal tratamiento en infecciones nosocomiales por BGN multirresistentes y muchos veces el último recurso terapéutico disponible.

• ß-lactámico de amplio espectro y alta potencia. • Inhibe el desarrollo del 90% de las bacterias de importancia clínica. • Efecto inhibitorio postantibiótico ⇒ Dosificación

Espectro de actividad antibacteriana •Bacterias aerobias: – Gram (+) : a) Muy susceptibles: S. pneumoniae., estreptococos A y B, S. aureus b) Sensibilidad variable: E. faecium resistente, E. faecalis sensible c) Resistentes: S. aureus meticilino resistente. – Gram (-) : Neisseria meningitidis, gonorreae y H.influenzae Enterobacterias: Mayoria Sensibles Pseudomona aeruginosa Acinetobacter ⇒ resistencia en aumento (carbapenemasa) S. maltophilia y B. cepacia resistentes

•Anaerobios: Excelente actividad contra anaerobios estrictos Sensibles

Bacteroides fragilis y otros bacteroides Fusobacterium y cocos anaerobios Gram (+) C. perfringes

C. dificcile ⇒Resistente

Tipos de Resistencia a ATB • Resistencia Natural o intrínseca: Característico de genero y especie. Esta determinado por el genoma bacteriano – Resistencia natural en Enterobacterias: Penicilina, oxazoilpenicilinas, clindamicina, lincosamina, macrólidos – Resistencia natural de distintas especies a determinados tipos de ATB:

• Polimixina B y Colistina: Proteus spp, Morganella morganii, Providencia spp, Cedecea spp • Nitrofuranos: Proteus spp, Morganella morganii, Providencia spp, Serratia marcescens.

Tipos de Resistencia a ATB

• Resistencia Adquirida: – Mutación y selección: Se dan al azar y espontáneamente – Adquisición de genes de resistencia a partir de ADN foráneo Se transmite por:
Plásmidos
Transposones: Son secuencias de ADN capaces de moverse de un fragmento de ADN a otro.
Integrones: No se movilizan por si solos, poseen elementos claves, un sitio de recombinación, un sitio que codifica una integrasa y un promotor.

Tipos de Resistencia a ATB • Mecanismos de transferencia:

• Conjugación: Proceso por el cual ADN plasmídico se transfiere de una bacteria donante a una receptora. Implica contacto real entre ambas células.

• Transducción: Transferencia del material genético de una bacteria a otra usando como factor un bacteriófago.

• Transformación: Permite la adquisición e incorporación de ADN desnudo.

Tipos de Resistencia a ATB • Expresión: – Constitutiva: Producida por exposición al estimulo o sin él. – Inducible: Producida solo después de la exposición al estimulo. – Constitutiva-Inducible: Producida a bajo nivel sin estimulo, producción enormemente aumentada después del estímulo.

Mecanismos de Resistencia a ATB • Interferencia del transporte de drogas a través de la membrana o de su acumulación citoplasmática:
Impermeabilidad
Eflujo

Impermeabilidad

Bomba de Eflujo Antimicrobiano Porina abierta

Proteína accesoria de fusión Proteína transmembrana

Membrana Externa

Periplasma

Membrana bacteriana

Mecanismo de Resistencia a ATB • Cambios relacionados con sitio de acción de los antimicrobianos PBP: Pueden sufrir alteraciones que disminuyen su afinidad por los β-lactámicos y pueden sintetizar el peptidoglicano a concentraciones de droga tóxicas para PBP normales. – – – –

Remodelación Nuevas PBP Hiperproducción Cantidad Relativa

Resistencia mediada por PBP

β-lactamico Ác. lipoteicoico

Peptidoglicano

PBP 2a

PBP Normal

PBP Modif

Fosfolípidos

Mecanismos de resistencia a ATB

• Inactivación enzimática del antimicrobiano Betalactamasas

• Enzimas capaces de hidrolizar el anillo β-lactámico – Bacterias Gram - : Localizadas en espacio periplásmico – Bacterias Gram +: Secretadas al medio

• Codificadas por genes cromosómicos y plasmídicos. • Expresión constitutiva o inducible por exposición al ATB.

Detección y caracterización de β-lactamasas • Para su clasificación se estudia: – Patrón fenotípico de resistencia – Punto Isoeléctrico – Parámetros Cinéticos – Caracterización por PCR con primers específicos

Criterios para la clasificación de β-lactamasas • Actividad: Sustratos e Inhibidores • Propiedades físicas: pI, PM • Localización genética del gen codificante: •

Plasmidico, Cromosómico Características Inmunológicas

• Estructura

Clasificación de β-lactamasas • Ambler (1980): Clasifica las enzimas en cuatro clases según su estructura molecular (A, B, C, D)

– A, C y D son enzimas cuyo centro activo es una serina ⇒ Serinoproteasas – B son metaloenzimas, los átomos de Zn2+ interactúan con un residuo de cisteina y tres residuos de histidina en el sitio activo.

• Bush, Jacoby y Medeiros (1995): Tienen en cuenta la localización genética, perfil de sustratos, la sensibilidad a inhibidores y algunas características físicas como pI, PM y la clase molecular.

Betalactamasas Clasificación por sustrato • Penicilinasas: penicilinasa de Staphylococcus aureus • Cefalosporinasas: AMP-C de enterobacterias y Pseudomona aeruginosa • ßLEA: actividad sobre penicilinas y cefalo 1º g • ßLEE: hidrolizan también a las cefalo 3º y 4º g • Oxacilinasas: mayor actividad frente a oxacilinas • ßLact resistentes a Inhibidores • Carbapenemasas

Resistencia a carbapenemes en enterobacterias • Alteración de las PBP (Proteus mirabilis) • Disminución de la permeabilidad (alteración de porinas) en combinación con producción de βlactamasas

• Producción de carbapenemasas

Clasificación de las Carbapenemasas • Serinoenzimas: 1, 2d, 2f – – –

2d: OXA, ARI-2, SON-1 2f: IMI-1, GES-2, IMI-2, KPN Son carbapenemasas no estructurales, inhibibles por clavulánico y tazobactam, NO por EDTA.

• Metaloenzimas: 3a, 3b, 3c. – – – –

3a: IMP-1 a 16, VIM-1 a 11 3b: ASA-1, IMI-S 3c: FEZ-1, L1, GOB-1 Son inhibibles por EDTA y NO por clavulánico.

Detección del mecanismo de resistencia •

Búsqueda de carbapenemasas en enterobacterias: 1) 2) 3)

Probar Imipenem y Meropenem Aumento del punto de corte Prueba con PTZ (piperacilina-tazobactam) y/o AMC (amoxicilina-clavulanico), se busca efecto huevo 4) Pruebas confirmatorias

Carbapenemasas en Enterobacterias

IMP MER

22 mm

IMP PTZ MER

+ Informar/Alertar

Sensible

IMP

PTZ

MER

Búsqueda de carbapenemasas con AMC

IMP

AMC MER

Pruebas confirmatorias • Métodos microbiológicos • Método de Hodge: 1) Hisopar E. coli ATCC 25922 en MH 2) Realizar Estría con la cepa sospechosa desde el centro a la periferia 3) Colocar disco Imipenem en el centro. 4) Incubar ON e interpretar.

Pruebas confirmatorias • Métodos microbiológicos: • Método de Masuda: Técnica 1) Preparar un cultivo bacteriano de la cepa en estudio en 10 ml de caldo BHI/TSA. 2) Incubar 18 hs a 37º con agitación. 3) Centrifugar 20 min y resuspender en 300µl de buffer fosfato 10 mM, pH 7. 4) Someter a congelado-descongelado 10 veces o bien sonicar (2 pulsos durante 40 seg, potencia 40% separados por intervalos de 30 seg) 5) Centrifugar 10 min, separar el sobrenadante que se utilizará en el ensayo. 6) Gotear 10 µl del sobrenadante en discos de papel de filtro previamente esterilizados.

Pruebas confirmatorias • Métodos microbiológicos: • Método de Masuda: Ensayo 1) Hisopar E. coli ATCC 25922 en MH 2) Colocar disco de IMP en el centro. 3) Colocar discos con extracto por dentro de la zona de inhibición esperada. Usar control + y control 4) Incubar ON e interpretar.

Pruebas confirmatorias Hodge + Masuda ⇒ Hodsuda Hodsuda: 1) Hisopar E. coli ATCC 25922 en MH. 2) Colocar disco de IMP en el centro. 3) Estriar cepa problema dentro del halo de inhibición esperado. 4) Incubar ON e interpretar.

Hodsuda

IMP

Hodsuda

Carbapenemasas en Enterobacterias

IMP MER

22 mm

IMP PTZ MER

+ Informar/Alertar

Sensible

IMP AMC MER Pruebas confirmatorias Ensayos microbiológicos

Importancia de la detección de carbapenemasas • • • • • •

Gérmenes multiresistentes Limitadas opciones de tratamiento . Alta probabilidad de falla en el tratamiento con βlactámicos. Mayor mortalidad asociada a la infección Persistencia en el ambiente hospitalario Alta capacidad de diseminación entre BGN

Agradecimientos

☻Dra Adelaida Rossetti, Jefa del Sector de Bacteriologia del HIGA Pte Perón.

☻Dra Mabel Straccia, Bacterióloga del HIGA Pte Perón.

☻Dra Celia Sala Crist, Instructora de Residentes, Residencia del HIGA Pte Perón.

Muchas Gracias