Citometría de Flujo: Introducción, Aplicaciones, Clínica, Investigación y Cáncer T.M. MsSc (c) Juan Luis Castillo N. Centro de Diagnóstico Onco-inmunológicoLtda. Laboratorio de Citometría de Flujo Hospital del Trabajador, Concepción, Chile. Concepción, 16 de Agosto de 2004

¿Qué es la Citometría de Flujo?

Aplicaciones

Flow Cytometry Publications/year

3,483 3,479

1999: 4.256 1998: 3.889 1997: 3.613

2002: 5.323 2001: 5.025 2000: 4.771

2003: 5.588 2004: 3.205 (*)

3345

2899 2,713

Papers

2,445

2700 2,332

2400 2100

1,855

1800

1,494

1500

1,232 1,078

1200

940 811

900

611 480

600 223 300 300

0

13

28

79

113

00

1976 1977 1978 1979 1980 1981 1982 1983 1984 1985 1986 1987 1988 1989 1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996

YE A RS

(*) Data taken from Medline search using the keywords: “flow Cytometry” (Agost 15th: 20:30 hrs)

¿QUE ES LA CITO / METRIA DE FLUJO? La Citometría de Flujo es una tecnología que permite la “medición simultánea de múltiples características físicas y químicas de células en suspensión”

¿QUE INFORMACION ENTREGA UN CITOMETRO DE FLUJO SOBRE UNA CELULA?

1.- Su tamaño. 2.- Su granularidad o complejidad interna. 3.- Evaluación de características químicas: • Fluorocromos • Anticuerpos conjugados con fluorocromos

FACS: Fluorescence activated cell sorter

Relative Sizes of Biologicals 1 µm

S.aureus 5-8 µm 15-30 µm

Amoeba

Lymphocyte

Componentes • Sistema de Fluidos • Sistema Optico: • Fuente de luz • Separación espectral • Sistema Electrónico: • Control mecánico, de luz y detectores • Colección y análisis de pulsos • Sistema Informático: • Análisis y presentación de datos

Flow Cell Sheath fluid

Fluorescence signals Focused laser beam

Injector Tip

SISTEMAS DE UN CITOMETRO DE FLUJO Sistema Optico: • Consta de uno o varios láseres, filtros, lentes y fotomultiplicadores. • El láser produce una luz monocromática utilizada para la excitación de los fluorocromos.

Laser Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation

Flow Cytometry Optics PMT 4

Flow cell

Dichroic Filters

PMT 3

PMT 2

Bandpass Filters PMT 1

Laser

Lasers • Argon laser • He-Ne Laser

Optical Collection systems He-Cd Laser

2nd Argon Laser He-Ne Laser Argon Laser

Elite Cytometer with 4 Lasers He-Cd laser

Santa clause

Air-cooled argon laser

Water cooled argon laser

ANTICUERPOS MONOCLONALES • Gran disponibilidad comercial • Gran variedad de fluorocromos • Precios accesibles • Pedidos vía Internet • Gran Calidad

FLUOROCROMOS

Fluorescein (FITC) Excitation Emisson 300 nm

400 nm

500 nm 500 nm

Relative Intensity

400 nm

Wavelength

Protein

600 nm 600 nm

700 nm 700 nm

Phycoerytherin (PE) Excitation Emisson 300 nm

400 nm

500 nm

Protein

600 nm

700 nm

Propidium Iodide Emisson

Excitation 300 nm

500 nm 500 nm

600 nm 600 nm

Relative Intensity

400 nm

400 nm

DNA

700 nm 700 nm

Allophycocyanin (APC) Protein 300 nm

400 nm

500 nm

632.5 nm (HeNe)

600 nm

700 nm

Excitation

Emisson

CITOMETRIA DE FLUJO PREPARACION DE LA MUESTRA OBJETIVO: SUSPENSION CELULAR

CITOMETRIA DE FLUJO PREPARACION DE LA MUESTRA Procedimiento St.: • 100 µL de sangre total • 10 µL del Ac. conjugado • Incubar por 10-15 minutos RT • Añade el lisador • Leer en un citómetro de flujo

PROCESO DE ANALISIS DE UNA MUESTRA

• CALIBRACION • ADQUISICION • ANALISIS

CD45

CD8 leu11a

Mo1

CD20

FITC Fluorescence

Tu be ID

CD8

CD4

FORMA DE PRESENTACION DE DATOS • • • • •

Histograma Gráfico de Puntos (Dot Plot) Gráfico de Contorno (Countour Plot) Gráfico Isométrico (3D) Gráfico de Densidad (Density Plot)

Citometría de flujo: mediciones “GATE” SCATTER G M L

FLUORESCENCIA

IMAGEN

Density Dot Plot

Color of dots can give indication of frequency of events

Contour Plot

Identify subpopulations with proper contour lines

HISTOGRAMA (Un Parámetro)

counts

M1

Autofluorescencia y/o control isotipo

0

FL1

One parameter frequency histogram # of events for particular parameter

establish regions and calculate coefficient of variation (cv) cv = stdev/mean of half peak

FL2

ESTADISTICA DE CUADRANTES (Dos Parámetros)

Autofluorescencia y/o control isotipo

0

FL1

ESTADISTICA DE CUADRANTES (Dos Parámetros) 2

1

FL2

-,+

+,+

3

+,-

-,0

4

FL1

CITOMETRIA DE FLUJO: APLICACIONES • • • • • •

Hematología Inmunología Patología Transplantes Farmacología Biología

• • • • • •

Toxicología Microbiología Parasitología Citogenética Virología .........

EVOLUCION DE LA CITOMETRIA DE FLUJO Inmunología Celular

Anticuerpos Monoclonales

Aplicaciones en Patología

Citometría de Flujo

CITOMETRIA CLINICA

CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes • • • • • • • • • • •

Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Estudio de macrófagos intestinales (EII). Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio, fagocitosis, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.) Cuantificación de moléculas Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Citokinas Intracelulares

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS • • • • •

Linfocitos T totales Linfocitos T Helper Linfocitos T Sup/Citot Linfocitos B Linfocitos Natural Killer (NK)

• Relación Linfocitos T CD4/CD8

:CD3(+) :CD3(+)CD4(+) :CD3(+)CD8(+) :CD3(-)CD19(+) :CD3(-)CD16(+)CD56(+)

Infección VIH-SIDA

File: 111.003 Acquisition Date: 23-AprGate: G6 Gated Events: 12430 Total Events: 15000 Quad Events % Gated % Total UL 20 0.16 0.13 UR 1496 12.04 9.97 LL 2028 16.32 13.52 LR 8886 71.49 59.24

RELACION CD4/CD8 = 0.17 File: 111.004 Acquisition Date: 23-AprGate: G6 Gated Events: 12512 Total Events: 15000 Quad Events % Gated % Total UL 600 4.80 4.00 8866 70.86 59.11 UR LL 1499 11.98 9.99 LR 1547 12.36 10.31

EXAM EN

R E SU L T A D O

R A N G O R E F E R E N C IA

LE U C O C ITO S TO TA LE S

8.500 x m m

3

LIN FO C ITO S A B SO LU TO S

2.295 x m m

3

LIN FO C ITO S T (C D 3)

1.916 x m m 83.50 %

3

xm m %

3

LIN FO C ITO S B (C D 19)

LIN FO C ITO S T (C D 4)

LIN FO C ITO S T C IT/SU P (C D 8)

R E LA C IO N T C D 4 /C D 8 C E LU LA S LIN FO ID E S N K (N A TU R A L K ILLE R )

12.04 % 276 x m m 70.86 % 1.626 x m m

59.4 -84.6 %

6.4 -22.6 % 28.5 -60.5 % 3

11.1 -38.3 % 3

0.17

1.2 -2.1 xm m %

3

INFECCION VIH SIDA ACTIVACION DE LINFOCITOS T: CD38 • El aumento en la expresión de moléculas CD38 en LT CD8 es un fuerte indicador pronóstico de progresión hacia SIDA y muerte. • Superior a: • Rto. LT CD4 • Marcadores solubles • Combinación HLA-DR+ CD38+ J. Acquir Immune Defic Syndr Retrovirol 16:83-92, 1997 Cytometry 26:1-7, 1996 Cytometry 33:115-122, 1998

INFECCION VIH SIDA GIORGI et al. • Carcaterizaron el número de moléculas CD38 en LT CD8: 1.2.3.4.-

< 2.470 =======> PROGRESOR LENTO 2.470 - 3.899====> PROGRESOR BAJO 3.900 - 7.250====> PROGRESOR ALTO > 7.250 =======> PROGRESOR RAPIDO

• Basado en la probabilidad de desarrollar SIDA dentro de 3 años Cytometry 33:123-132, 1998 J. Acquir Immune Defic Syndr Hum Retrovirol 16:83-92, 1997

Copyright Dennis Kunkel

Copyright Dennis Kunkel

CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes • • • • • • • • • • •

Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Estudio de macrófagos intestinales (EII). Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio, fagocitosis, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.) Cuantificación de moléculas Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Citokinas Intracelulares

INMUNOFENOTIPIFICACION DE LEUCEMIAS “Los distintos tipos de leucemias son un grupo heterogéneo de patologías resultantes de una proliferación descontrolada de una o más tipos celulares hematopoyeticos tanto en médula ósea como sangre periférica”

HEMATOPOYESIS STEM CELL

CFU-GEMM

CFU-ML

CFU-GM CFU CFU CFU BASOFILO EOSINOFILO ERITROIDE MEGACARIOCITO

ERITROCITO PLAQUETAS

BASOFILO EOSINOFILO NEUTROFILO

CFU-L

LINFOCITO B

MONOCITO

LINFOCITO T

RETENCION DE ANTIGENOS • Células malignas frecuentemente conservan antígenos asociados con la célula normal a partir de la cual fueron derivados CD19

CD19

Transformación Maligna CELULA PRE-B NORMAL

CELULA LEUCEMICA

CLASIFICACION INMUNOFENOTIPICA (LA) •LLA-B : -BI-pro B: CD79a y/o CD22 Y/o CD19. -BII Común : CD10. -BIII Pre B: clg. -BIV Madura : slg •LLA-T : -TI-proT: CD7 -TII-pre T: CD2 y/o CD5 y/o CD8 -TIII-Cortical: CD1a -IIV-Madura: CD1a y CD3mb •LMA : -LMA-M6 -LMA-M7 -LMA-M3 -LMA-M4

: glicoforina A : CD61, CD41, CD42b : HLA-DR(-) : HLA-DR(+)

Características normales

• Paciente sexo masculino • 43 años • Dgto. Leucemia Aguda

Leucemia Linfoblástica De Línea B (B-II:Común)

CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes • • • • • • • • • • •

Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidia de ADN y Ciclo Celular Estudio de macrófagos intestinales (EII). Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio, fagocitosis, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.) Cuantificación de moléculas Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Citokinas Intracelulares

Cellular Function • • • • • •

Phagocytosis Killing index of phagocytes Intracellular cytokines Calcium flux Oxidative burst Membrane potential

Human Neutrophil Phospolipase A2 activity

Leukotrienes

Lipid Peroxidation OH.

Phagosome H2O2

O2-

+

Stimulant (PMA)

?

PCB

O2-

O2-

PKC

?

H2O2

SOD

O2

Oxidase

GR

NADP+

SOD

GP GSH

NADPH + H+

Catalase

H2O2

GSSG NADPH

H2O + O2

+

H

H2O

HMP

PCB PCB (Reduced GSH level)

DCFH-DA

DCFH

DCF

2’,7’-dichlorofluorescin diacetate

O

O

CH3-C-O

O

Cl

H

O-C-CH3 2’,7’-dichlorofluorescin

Cl COOH

O

HO

Cellular Esterases Cl

Hydrolysis

H

Fluorescent

OH Cl COOH

2’,7’-dichlorofluorescein

O

HO

H2O2

Cl

Cl

H

Oxidation

DCFH-DA

O

COOH

Neutrophils

DCFHDCFH-DA 80

Monocytes

DCFH H O 2 2 Lymphocytes

DCF

PMA-stimulated PMN

Control

counts

60

40

20

0 .1 1log

100 FITC 10 Fluorescence

1000

Estallido respiratorio en Granulocitos • Adulto normal • No estimulado : • Estimulado con PMA :

No estimulado

Estimulado

25.86 % 76.98 %

Estallido respiratorio Caso clínico: • • • • •

Paciente de sexo femenino 8 años Infecciones dérmicas recurrentes por S.aureus. Granulomas fríos en cara y piernas Déficit parcial de IgA.

• Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos. • Inicio de terapia antibiótica con claritromicina 250 mg/12 hrs por 30 días. • Evaluación de estallido respiratorio en granulocitos y monocitos, post terapia.

Estallido respiratorio en Granulocitos No estimulado: 33.35 %

DCFA

Estimulado: 42.66 %

Después de terapia antibióticaDCFA

No estimulado: 68.97 %

DCFA

Estimulado: 57.48 %

DCFA

Estallido respiratorio en Monocitos No estimulado: 25.97 %

DCFA

DCFA

Después de terapia antibiótica

No estimulado: 76.26 %

DCFA

Estimulado: 57.06 %

Estimulado: 76.81 %

DCFA

CITOMETRIA DE FLUJO: Aplicaciones Clínicas más Frecuentes • • • • • • • • • • •

Determinación de Subpoblaciones Linfocitarias Inmunofenotipificación de Leucemias y Linfomas Estudio de Ploidía de ADN y Ciclo Celular Estudio de macrófagos intestinales (EII). Estudio de Función Neutrofílica (estallido respiratorio, fagocitosis, etc.) Oncogenes (p53, PCNA, Ki67, k-ras, etc.) Cuantificación de moléculas Estudio de Células Progenitoras (CD34) Estudios de Función Plaquetaria Estudios de Resistencia a Drogas Estudio de Citokinas Intracelulares

Diagnóstico Serológico por Citometría de Flujo. Bacterias:

Uso de Microesferas (beads)

*

Ag

+ bead

+ Suero paciente

*

Anti Ig humana conjugada

* Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 J. Clin. Microbiol.. 1998;36:802-806 Cytometry 1994;18:103-108

Aplicaciones en Microbiología

Aplicaciones en Microbiología clínica Detección directa: • Bacterias • Hongos • Parásitos • Virus

Light Scatter of Bacterial Spores

B.anthracis SS

B.subtilis irradiated B.anthracis FS

Light scatter signals from a mixture of live B.anthracis spores, live B. subtilis spores and gamma irradiated B. anthracis spores.

Microbial Identification Using Antibodies Enumeration & identification of target organisms in mixed populations Examples include: • Legionella spp. in water cooling towers • Cryptosporidium & Giardia in water reservoirs • Listeria monocytogenes in milk • E.coli O157:H7 in contaminated meat • Bacillus anthracis & Yersinia pestis biowarfare agents

Agentes antibacterianos: • Microbiología tadicional (18-24 horas) • Citometría de flujo (pocas horas) • Evaluación de parámetros metábolicos: • Potencial de membrana • Tamaño celular • Cantidad de ADN • Pruebas de suceptibilidad: • Efecto bacteriostático • Efecto bactericida

Susceptibilidad bacteriana: FSC/SSC

Universidad de Concepción, Chile Hospital del Trabajador Concepción, Chile In vitro STUDIES OF pH EFFECT UPON MEMBRANE COMPONENTS, SHAPE AND SIZE OF Helicobacter pylori: EPIFLUORESCENCE AND FLOW CYTOMETRY STUDIES.

pH 3

pH 3

pH 7

pH 7

pH 10

pH 10

Strain ATCC43504

Strain 747 LO-Skolen, Helsingør, Denmark, July 4-7, 2002

Susceptibilidad bacteriana Combinación de: • Tamaño (FSC) • Granularidad (SSC) • Fluorescencia: • Fluorocromos para ADN y ARN • Fluorocromos para ensayos metabólicos: • Unión a proteínas • Potencial de membrana Clin. Microbiol. Rev 2000;13:167-195 Cytometry 1997;27:169-178

dep.

pol.

dep.

pol.

dep.

pol.

• S. aureus • Depolarización en 1 hora. • Potencial demembrana permanece disminuido.

Antimicrob Agents Chemother 2000:44;827-834

CITOMETRIA DE FLUJO: Gastroenterología y Cáncer • Inmunología y pólipos de colon. • Enfermedad Inflamatoria Intestinal. • Tumores sólidos: • Ciclo celular y Ploidía de ADN. • Proteínas del ciclo celular • Oncogenes • Cáncer de Esófago • Linfoma

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Espectro de presentación. Enfermedad de Crohn

Colitis ulcerosa

Alteración de la inmunoregulación de mucosa intestinal

Inflamación persistente y/o recurrente Congestión ulcerativa Cáncer

Granulomatosa

ENFERMEDAD INFLAMATORIA INTESTINAL Colitis ulcerosa

Enfermedad de Crohn

Estudios celulares de mucosa intestinal (CF): • Células epiteliales

C.P.A.

• Macrófagos

Moduladores

• Linfocitos: TCD4

Perpetuación

Induction and Modulation of Gastrointestinal Inflamation FALK Symposium 104, Amsterdam, 1999.

COLITIS ULCEROSA

ENFERMEDAD DE CROHN

Proceso inflamatorio difuso continuo, limitado al colon

Afecta a todo el tracto digestivo

Inflamación superficial de la mucosa

Proceso transmural y granulomatoso

Presencia de pseudopólipos

Compromiso de mucosa discontinuo

C.U. Colon normal

Crohn

Crohn

Macrófagos intestinales: • Están localizados en la región subepitelial de la mucosa. • Constituyen entre 10 a 20% de las células mononucleares de la lamina propia. • Detección de su fenotipo: • Inmunohistoquímica • Citometría de Flujo • Existe diferencia entre las poblaciones de macrófagos encontrados en mucosa de EII y en personas que no la presentan Fiocchi C. Am J Physiol.1997,273:G769-75 Young HE et al. Dev Dyn.1995;202:137-44

Pacientes:

UNIVERSO (n=70) SOSPECHA CLINICA (+) ENDOSCOPIA (+) (n = 52) EII POR BIOPSIA (n = 14)

HISTOLOGIA NO ESPECIFICA (n = 38)

GRUPO TESTIGO (n = 18)

Método Dgto. de EII: Clínico, endoscópico e histológico

Grupo de EII

Controles clínicos regulares

Grupo testigo

Consentimiento informado

Criterio de Exclusión

Materiales y Métodos Endoscopía

Biopsia 2 x 2 mm

Disgregación mecánica

30` oscuridad

HLA-DR CD16 CD33 CD33

FACSCalibur Software Cell-Quest v.3.3

Mínimo de 10000 eventos

Pacientes según fenotipo HLA-DR en MI y diagnóstico de EII Sospecha Clínica

Fenotipo MI HNC

HLA-DR(+) 78.94 (30)

EII-CH

Subtotal

Testigo

100 (14)

84.61 (44)

11.11 (2) 65.71 (46) 88.89 (16) 34.29 (24)

HLA-DR(-)

21.06 (8)

0 (0)

15.39 (8)

Total

100 (38)

100 (14)

100 (52)

p