CITOMETRIA DE  FLUJO  Y  LMA  Jos Jos é Á Á ngel D ngel D íí az Arias  C.H.U.S. C.H.U.S. 

INTRODUCCI INTRODUCCI Ó Ó N  – ¿ ¿ Qu Qu é es la citometr es la citometr íí a de flujo (CMF)?  §  § Es una tecnolog Es una tecnolog íí a para caracterizaci a para caracterizaci ó ó n y el an n y el an á á lisis  de c de c é é lulas que mide y analiza simult lulas que mide y analiza simult á á neamente  m m ú ú ltiples caracter ltiples caracter íí sticas f sticas f íí sicas de part sicas de part íí culas que se  mueven en un fluido a traves de un haz de luz  §  § Un cit Un cit ó ó metro tiene 3 partes fundamentales:  –  Flu Flu íí dica  –  Ó Ó ptica  –  Electr Electr ó ó nica nica 

INTRODUCCI INTRODUCCI Ó Ó N  –  Puede analizar part Puede analizar part íí culas de 0.2 a 50 micras  –  Nos indica el tama Nos indica el tama ñ ñ o relativo, complejidad interna  (granularidad) e intensidad de fluorescencia  –  De forma general un n De forma general un n ú ú mero conocido de c mero conocido de c é é lulas  (generalmente 2 x 10e6) se incuba con los  monoclonales elegidos tras lo cual se somete a un  proceso de lisado de hematies y posterior lavado proceso de lisado de hematies y posterior lavado 

INTRODUCCI INTRODUCCI Ó Ó N  §  §¿ ¿ Para que sirve la CMF?  §  § Se ha convertido en una herramienta indispensable  para el diagnostico, clasificaci para el diagnostico, clasificaci ó ó n, estadiaje y  monitorizaci monitorizaci ó ó n de neoplasias hematol n de neoplasias hematol ó ó gicas  –  Identifica c Identifica c é é lulas de diferentes l lulas de diferentes l íí neas, as neas, as í como su  maduraci maduraci ó ó n  –  Detecta c Detecta c é é lulas ““ anormales anormales ”  –  Nos indica el fenotipo de las c Nos indica el fenotipo de las c é é lulas ““ anormales anormales ”” , sobre lo  que podemos emitir una diagnostico/sospecha diagnostica  –  Identificaci Identificaci ó ó n pronostica n pronostica 

¿ ¿ Existe una poblaci Existe una poblaci ó ó n ““ at at íí pica pica ”” ?  §  § Una vez recibida una muestra con sospecha de LA se  realiza un panel de screening para:  –  Determinar si existen c Determinar si existen c é é lulas ““ at at íí picas picas ”  –  Saber si estas c Saber si estas c é é lulas son inmaduras  –  Identificar la l Identificar la l íí nea celular (mieloide, linfoide, bifenotipica, bilineal) nea celular (mieloide, linfoide, bifenotipica, bilineal) ‫‏‬

MARCADORES A ESTUDIAR  §  EGIL:  § Screening y posterior panel orientado  § Marcadores en screening:  – CD34, CD33, CD13, CD10, CD19, CD45, CD7, CD14,  MPOcito, CD3cito, CD3s, HLA DR 

§ Posteriormente para serie mieloide,  monocitica,megacariocítica y eritroide:  – CD15, CD11b, CD16, CD10, CD33, CD13, CD56, CD64,  CD65,  CD117, CD19, Tdt, CD2, CD7, CD3, CD4, CD14,  CD61, CD41a, CD42b, CD71, CD36, Glicoforina A, CD45  Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)

Woods. Cytometry Part B (Clinical Cytometry)  72B:S14–S22 (2007)  Sumeet Gujral Indian J Pathol Microbiol 2008 

J.J.M. van Dongen. Euroflow consortium

SERIE  GRANULOCÍTICA

MONOCITOS 

LINFOCITOS +  ERITROBLASTOS 

CD45

¿ ¿ Como sabemos que es mieloide?  §  § EGIL 

EGIL, Catovsky et al EGIL, Catovsky et al 

Definici Definici ó ó n de l n de l íí nea  §  § Se precisa una puntuaci Se precisa una puntuaci ó ó n >2 en esa l n >2 en esa l íí nea seg nea seg ú ú n  EGIL. Para definir una L.A. Bifenot EGIL. Para definir una L.A. Bifenot íí pica (BAL) se  precisan m precisan m á á s de 2 puntos en 2 lineas diferente.  §  § Esto es ú ú til para diferenciar las aberrancias de  ll íí nea y no confundirlas con BAL nea y no confundirlas con BAL 

Definici Definici ó ó n de l n de l íí nea  §  § En la nueva clasificaci En la nueva clasificaci ó ó n OMS las BAL se han  ““ renombrado renombrado ” y se ha hecho una definici y se ha hecho una definici ó ó n m n m á á s  estricta:  –  “ Leucemias agudas de fenotipo mixto ”    Leucemias agudas de fenotipo mixto  –  Linea mieloide: MPO, o en diferenciaci Linea mieloide: MPO, o en diferenciaci ó ó n monoc n monoc íí tica  al menos dos  de los siguientes CD11c, CD14, CD64, lisozima, o bien esterasas  inespecificas (citolog inespecificas (citolog íí a) a) ‫‏‬  –  L L íí nea linfoide T: CD3 citopl nea linfoide T: CD3 citopl á á smico o de superficie (m smico o de superficie (m á á s raro) s raro) ‫‏‬  –  L L íí nea linfoide B: requiere de varios marcadores.  §  § Si CD19 es fuerte uno de los siguientes CD79a, CD22, CD10  §  § Si CD19 es d Si CD19 es d é é bil se precisan 2 de los anteriormente mencionados bil se precisan 2 de los anteriormente mencionados 

MADURACIÓN 

Loken MR. Et al Leukemia Research 32 (2008) 5­17

MADURACIÓN 

Kussick SJ Arch Pathol Lab Med 127, 2003

Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004

Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004

Brent W. Methos in Cell Biology Vol 75. 2004

CFM CFM ­­ FAB 

Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)

GENOTIPO GENOTIPO ­­ FENOTIPO 

Ortuño J, Orafo A. Medicina Clinica 2002, 118(11)

GENOTIPO GENOTIPO ­­ FENOTIPO FENOTIPO 

M3 – t(15;17)‫‏‬

M4/M5 ­­ MLL MLL 

EMR  §  § La detecci La detecci ó ó n de EMR por CMF presenta algunas dificultadas debido a  la heterogeneidad de los fenotipos leuc la heterogeneidad de los fenotipos leuc é é micos.  §  § Para su detecci Para su detecci ó ó n se precisa la localizaci n se precisa la localizaci ó ó n previa de LAP (fenotipos  asociados a leucemia) en los blastos al asociados a leucemia) en los blastos al  diagn diagn óó stico stico .  §  § Estos LAP s Estos LAP s ó ó lo se pueden detectar en un 50 lo se pueden detectar en un 50 ­­ 80% de las LAM y se basan  en:  –  Asincronismos antigé  nicos  Asincronismos antig énicos  –  Infidelidad de lí  nea  Infidelidad de l ínea  –  Sobreexpresió  n de antí  ígenos  genos  Sobreexpresi ón de ant  –  Ausencia de antí  genos especí  íficos de l  ficos de lí  ínea  nea  Ausencia de ant ígenos espec  –  Alteraciones evidentes en FSC/SSC 

§  § La sensibilidad alcanzable habitualmente es de 10e La sensibilidad alcanzable habitualmente es de 10e ­­ 3 / 10e 3 / 10e ­­ 4 y hasta  10 10 ­­ 6 6 

EMR  §  § Diversos estudios han mostrado que la detecci Diversos estudios han mostrado que la detecci ó ó n de EMR, as n de EMR, as í como  su cuant su cuant íí a se asocia a distintos riesgos de reca a se asocia a distintos riesgos de reca íí da  §  § San Miguel et al Post inducci San Miguel et al Post inducci ó ó n 0.5% (recaida 67% vs 20%),  Postintensificaci Postintensificaci ó ó n 0.2% (69% vs 32%) n 0.2% (69% vs 32%) ‫‏‬ §  § Venditti et al Postconsolidaci Venditti et al Postconsolidaci ó ó n 0.035% (77% vs 17%) n 0.035% (77% vs 17%) ‫‏‬ §  § Al Mawali et al 0.15% postinducci Al Mawali et al 0.15% postinducci ó ó n  §  § San Miguel et al 2001 4 categorias:  –  –  –  – 

1)Muy bajo riesgo recaida: 10 ­2 

FENOTIPOS LEUCEMICOS  (LAP) (LAP) ‫‏‬ 

Al­Mawali et al  Am J Clin Pathol  2009;131:16­26

San Miguel  et al 2002  Best Practice &  Research Clinical  Hematology 105­118  Vol 15 No 1

CITOMETRIA DE  FLUJO  Y  LMA  Jos Jos é Á Á ngel D ngel D íí az Arias  C.H.U.S. C.H.U.S. 

POBLACIONES NORMALES