Índice de Trabajos en Extenso

IIIV V C O N G R E S O N T E R N A C O N A L X V C O N G R E S O N A C O N A L VC CO ON NG GR RE ES SO O IIIN NT TE ER RN NA AC CIIIO ON NA AL L X XV VC CO ON NG GR RE ES SO ON NA AC CIIIO ON NA AL L O N G R E S S X V N A T I O N A L C O N G R E S S IIIV I N T E R N A T I O N A L C O N G R E S S X V N A T I O N A L C O N G R E S S V I N T E R N A T I O N A L C V INTERNATIONAL CONGRESS XV NATIONAL CONGRESS D N G E N E R A B O Q U M C A D E NG GE EN NIIIE ER RIIIA AB BIIIO OQ QU UÍÍÍM MIIIC CA A DE E IIIN A L E N G I N E E R I N O F B I O C H E M I C G O AL LE EN NG GIIN NE EE ER RIIN NG G OF FB BIIO OC CH HE EM MIIC CA Del 4 al 7 de abril del 2006 en la ciudad de Morelia Mich. México. 

EXPRESIÓN GENÉTICA DIRIGIDA POR UN PROMOTOR ÓRGANO-ESPECÍFICO DE PLACENTA PARA LA TRANSFERENCIA DE GENES Alcántara-Farfán V., Mendoza-Almanza G., Baeza-Ramírez., Ibáñez-Hernández M. Depto. de Bioquímica-Laboratorio de Biomembranas, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas-IPN. Prol. Carpio y Plan de Ayala s/n Colonia Casco de Santo Tomás. C.P. 11340, México, D. F. Tél/Fax 5729 6000 Ext. 62326 e-mail [email protected]

INTRODUCCIÓN:

La terapia génica es el proceso por el cual un nuevo gen,

denominado transgen o gen terapéutico, se introduce, por métodos moleculares, en las células de un individuo para producir un efecto terapéutico (Hoogerbrugge et al.,1996). Dicho efecto puede ser una activación o supresión de alguna función fisiológica incorrecta que se produzca en el individuo a tratar, o bien, producir modificaciones genéticas que puedan ser beneficiosas en el tratamiento de enfermedades (Rochlitz, 2000). La introducción del gen terapéutico a una célula o transfección, requiere de un vehículo genético que se encargue de transportar el transgen hasta introducirlo a la célula blanco, para posteriormente, expresarse con la ayuda de la maquinaria transcripcional de la célula. Se han diseñado una gran variedad de vehículos para transferir genes, debido a que no se ha podido obtener, hasta ahora, un sistema general seguro y eficaz. Se han utilizado vehículos virales, que son virus modificados a los que se les inserta el gen terapéutico en su genoma, eliminando previamente los genes víricos. También, se han utilizado vehículos no virales, que pueden ser físicos, en donde el transgen se introduce a las células por procedimientos físicos, o químicos, en donde el gen terapéutico se combina con otras moléculas para formar complejos y poder ser captado por las células. En estos últimos encontramos a los liposomas catiónicos, que son vehículos formados por lípidos sintéticos que poseen cargas positivas que pueden interaccionar fácilmente con el DNA que posee cargas negativas y formar así los denominados lipocomplejos, que han sido utilizados en la terapia génica con resultados alentadores. Una vez que el vehículo genético y el transgén, que se pretende utilizar con fines terapéuticos, han interaccionado, lo siguiente es realizar la introducción de este complejo a las células, en cultivo o a un organismo integro ya que pueden administrarse por numerosas vías

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para su liberación (Templeton, 2002). Sin embargo, los lípidos catiónicos resultan ser en su mayoría citotóxicos debido a que la estructura de estos es diferente a los lípidos que se encuentran de manera normal en la célula, debido a esto en el Laboratorio de Biomembranas se han sintetizado varios lípidos catiónicos, como el oleoil-espermina, el estearil-espermina y el estearil-espermidina. De ellos, el estearil-espermina resultó ser altamente eficiente en la transfección genética, con una baja toxicidad. La forma de explicar esta baja toxicidad, en relación a los lípidos comerciales, es que están formados por dos moléculas propias de la célula, el ácido esteárico y la espermina. Estos lipocomplejos resultan ser buenos vehículos genéticos, sin embargo, es necesario dirigir el material genético a las células de interés, es decir, se requiere de una terapia génica dirigida, que se logra con la utilización de un promotor órganoespecífico. Se han descrito diversos promotores que se expresan preferencialmente en: hígado, células colinérgicas, corazón, intestino, tejido adiposo, placenta y células cancerosas entre otros. El estudio de los promotores, en donde los factores que se acoplan en el proceso transcripcional pueden hacer específica la expresión de un gen terapéutico, unido al promotor órgano-específico, adquiere importancia en la medida en que estos procesos sean bien conocidos y entendidos. El estudio de un promotor que sea específico para placenta, dentro de la terapia génica, tendría gran utilidad en el tratamiento de trastornos en el embarazo, como en el caso de la producción de Fibronectina Oncofetal, sintetizada por tumores y tejido fetal, incluyendo la placenta. Por lo tanto en este trabajo se utilizó el promotor CYP19 específico para placenta para dirigir la expresión genética en la transferencia de genes mediada por liposomas. OBJETIVO: Dirigir la expresión genética con un promotor específico de placenta en la transferencia de genes mediada por liposomas catiónicos. MATERIALES

Y

MÉTODOS:

Aislamiento

y

purificación

del

plásmido

pACCYP19GH. Se utilizó E. coli DH5α transformada con el plásmido pACPYC19GH de un cultivo de 12h en medio Luria-ampicilina. Se utilizó el Kit Ultra Clean de los laboratorios MoBio, para aislar y purificar el plásmido. El DNA se identificó por

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electroforesis en agarosa al 1% y se determinó el espectro de absorción en la región ultravioleta de 200 a 300 nm, para determinar su pureza y concentración. Formación de lipocomplejos. Los liposomas catiónicos se formaron por el método de Felgner et. al. (1987) modificado por Ibáñez et. al. (1996). Se empleó como lípido catiónico el estearil- espermina y como lípido ayudador al colesterol. Se mezclaron los lípidos en relación 1:1 (p/p), en una cantidad de 50μg de lípidos totales, disueltos en 50 μl de cloroformo. Posteriormente, se les adicionaron 10 μg de DNA plasmídico en 200 μl de medio DMEM-F12 incompleto. Los lipocomplejos se incubaron a temperatura ambiente por 30 min, antes de realizar la transfección.

Preñez de los ratones hembras.

Diariamente se pesaron y se les realizaron frotis vaginalis, para verificar la regularidad del ciclo estral. Las diferentes etapas del ciclo se identificaron según los tipos celulares presentes en la citología vaginal. Los ratones hembras en etapa de estro, se aparearon por el sistema de trío (2 hembras y un macho), considerando como día cero de preñez el día en que se detectaron los espermatozoides en el frotis vaginal o cuando se observó el “tapón vaginal”. Transfección in vivo por vía sistémica e in situ mediada por lipocomplejos en ratones hembra preñadas. Se formaron grupos de 10 ratones hembras preñadas, a los 8, 15 y 17 días de gestación, para la transfección por vía sistémica se le inyectaron, por la vena dorsal, 100 µl de lipocomplejos (con 2 µg del plásmido pACCYP19GH). Para la transfección in situ se hizo una incisión en la región central del vientre, se expuso el cuerno uterino derecho con los embriones y se inyectaron 5μl de lipocomplejos (con 0.1 µg del plásmido pACCYP19GH),

y como

controles en ambos casos se administraron liposomas con PBS o solamente DNA plasmídico, en cantidades equivalentes a los lipocomplejos. Identificación de la expresión

del

gen

reportero

(hGH)

por

inmunohistoquímica.

A 48h

postransfección, se sacrificaron los ratones hembras transfectadas por vía sistémica o in situ, por dislocación cervical y se perfundieron con solución fijadora de formaldehído al 2% y glutaraldehído al 0.2%. Se tomaron muestras de la placenta, cerebro, hígado, bazo, pulmón y a los embriones. Se fijaron las muestras por 24 h más y se incluyeron

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en Tissue-Tek para hacer cortes por congelación. Se hicieron microcortes de 10μm de espesor y se realizó la técnica de inmunohistoquímica. Se utilizó primeramente un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra la hGH y como segundo anticuerpo un anti IgG de ratón, proveniente de cabra, acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FIAC: fluorocromo verde). Se guardaron en oscuridad a 4°C hasta su revisión en el microscopio de epifluorescencia. Los controles se procesaron de la misma manera que los ratones hembras transfectadas con los lipocomplejos. RESULTADOS. Aislamiento y purificación del DNA plasmídico. El espectro de absorción del DNA plasmídico presentó un pico de absorción máximo a 259 nm y un mínimo a 228nm. La relación de absorción fue de 2, lo cual indicó que el DNA se encontraba libre de proteínas bacterianas. También, el DNA purificado se analizó por su perfil electroforético en geles de agarosa al 1%, observándose la isoforma I o súperenrollada siempre en mayor proporción hasta en un 70%, en comparación con la isoforma II o circular relajada (30%) y no se observó la isoforma III o lineal. La isoforma I es la que presenta la mayor actividad biológica, esto indica que el DNA, con el que se trabajó, era confiable por estar íntegro en una gran proporción (Fig. 1). Preñez de los ratones hembras. Cuando en el frotis vaginal se observaron células epiteliales escamosas solamente (etapa de estro), o inclusive una etapa anterior a esta (proestro), caracterizada por la presencia de células epiteliales nucleadas, se aparean los ratones con el macho por el método de trio. Cuando se observaron espermatozoides en el frotis vaginal ó se observó el tapón vaginal, al siguiente día del apareamiento, se inició el conteo de la etapa de gestación, considerando ese día como cero.

Forma I Forma II

Fig. 1 Electroferograma del plásmido pACCYP19GH. Perfil electroforético en gel de agarosa al 1%. Se observan las bandas de las isoformas moleculares del DNA: superenrrollada (I) y circular relagada (II).

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Identificación de la expresión del gen reportero (hGH) por inmunohistoquímica. Cuando se realizó la transfección por vía sistémica, la expresión del gen reportero (hGH) se observó claramente en las muestras de placenta, a los diferentes tiempos de preñez. Se observaron zonas de expresión (fluorescentes) diseminadas en todo el tejido (Fig. 2), siendo a los 10 días de gestación cuando se obtuvo la expresión máxima, aunque a los 17 y 19 días de preñez también se obtuvo una buena expresión del gen reportero. Además, cuando se realizaron los microcortes de los fetos, se observaron claramente zonas de expresión del gen reportero en la región abdominal, probablemente en el hígado, a los diferentes tiempos de gestación. Esto nos indica que los lipocomplejos pueden atravesar la barrera placentaria, pero también indica que en esa región del feto y a los tiempos de desarrollo estudiados, existen los factores de transcripción que reconocen al promotor específico de placenta, por lo que se puede obtener la expresión del gen reportero en estas etapas embrionarias. Sin embargo, cuando se realizó la inmunohistoquímica, para observar la expresión del gen de la hGH (gen reportero), en las muestras de los órganos de los ratones hembras transfectadas por vía sistémica, no se observaron zonas de expresión del gen reportero, en ninguna de las muestras de bazo, cerebro, hígado, pulmón y riñón, y a ningún tiempo de la gestación. Esto nos indica que la especificidad del promotor hacia la placenta es muy clara. Por otra parte, cuando se observaron los microcortes de las placentas, transfectadas in situ, se encontraron zonas bien delimitadas de expresión del gen reportero, posiblemente en las zonas de aplicación, obteniendose mayor expresión a los 10 días de gestación. Además, cuando se observaron los microcortes de los embriones, también se encontraron zonas de expresión genética diseminadas, lo que significa que los lipocomplejos se pueden difundir, desde el punto de aplicación en la placenta, hacia el feto, atravesando la barrera placentaria. En los controles no se observó expresión del gen reportero.

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a

b

c

d

e

f

g

h

Fig. 2 Microfotografías de microcortes de placenta de ratones transfectados por vía sistémica. a y b) A los 8 días de gestación. c y d) A los 15 días de gestación. e y f) A los 17 días de gestación. g y h) A los 15 días de gestación transfectados con liposomas sin DNA (control). a, c, e y g) Observados con luz visible. b, d, f y h) Mismos campos observados con luz UV. Aumento 200 x.

En cambio, cuando la transfección se hizo in situ, directamente en la placenta, no se encontraron zonas de expresión del gen reportero en los órganos de los ratones estudiados, a ningún tiempo de gestación lo que indica que la expresión del gen reportero es específica para placenta por tener el promotor del gen CYP19 de la aromatasa, el cual es activo exclusivamente en placenta. DISCUSIÓN. Para dirigir la expresión genética de genes exógenos en células específicas de un animal de experimentación, se formaron liposomas con el lípido catiónico estearil-espermina y el colesterol, como lípido ayudador, que se emplearon para formar los lipocomplejos con el plásmido pACCYP19GH, que tiene clonado el promotor específico de placenta y el gen hGH de la hormona del crecimiento humano como gen reportero. Estos liposomas catiónicos han mostrado ser buenos vehículos para transferir genes, ya que carecen de toxicidad, no son reconocidos por el sistema inmunitario al aplicarlos in vivo y son eficientes para la transfección genética, adicionalmente el lípido estearil-espermina que se requiere para formar los liposomas catiónicos se sintetiza en el Laboratorio de Biomembranas. Cuando la transfección se

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realizó por vía sistémica, los ratones hembra no tuvieron ningún cambio en su comportamiento. Después de sacrificar a los ratones hembra en estudio, 48 h postransfección y de analizar por inmunohistoquímica los embriones, las placentas y muestras de bazo, cerebro, hígado, pulmón y riñón, se encontró que el gen reportero se expresó eficientemente y de manera totalmente exclusiva en la placenta. Al no encontrarse expresión del gen reportero en los órganos de los ratones hembra preñadas, ratifica claramente que el promotor del gen CYP19 de la aromatasa es específico para placenta. La expresión genética de la transfección por la vía sistémica, fue ligeramente mayor a los 10 días de gestación, pero también se obtuvieron buenos niveles de expresión a los 17 y 19 días. Lo que indica que la placenta es muy activa en la síntesis de la aromatasa para la producción de las hormonas esteroideas durante todo el embarazo. Adicionalmente, el que se haya obtenido expresión genética en los embriones en la transfección sistémica, significa que los lipocomplejos que diseñamos para la transfección pueden atravesar la barrera placentaria. Esto es muy significativo, ya que se abre la posibilidad de poder realizar la terapia génica directamente en el embrión, administrando un gen terapéutico por vía sistémica directamente a la madre. La expresión del gen reportero en la transfección in situ reveló que la placenta presentaba regiones fluorescentes con cierta localización, problablemente estos sitios de expresión genética corresponden a los sitios de administración de los lipocomplejos por la inyección directa en la placenta. La eficiencia de la expresión del gen reportero en la placenta de los ratones hembras transfectadas por la vía sistémica fue ligeramente mayor a la transfección por vía in situ. Esto permite sugerir que la administración de un transgen para realizar terapia génica, puede ser por la vía sistémica, sin necesidad de emplear procedimientos agresivos como la cirugía, siempre que esté regido por un promotor órgano-específico que dirija su expresión genética de manera selectiva en el órgano que se requiere modificar. La estrategia diseñada en este trabajo permite proponer el uso de promotores órgano-específicos para dirigir específicamente la expresión del transgen en órganos específicos en protocolos de

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terapia génica, lo que permitiría que la proteína terapéutica se produzca exclusivamente en las células que la necesiten, sin modificar a las células sanas que no lo requieren. CONCLUSIONES.1. Los liposomas catiónicos de estearil-espermina:colesterol son vehículos genéticos, no citotóxicos al administrarlos en ratones hembras preñadas de la cepa ICR por vía sistémica o in situ. 2. El promotor CYP19 contenido en el plásmido pACCYP19GH que integra los lipocomplejos dirige la expresión del gen reportero específicamente en la placenta, sin afectar otros órganos de los ratones hembras preñadas. 3. La eficiencia de transfección fue ligeramente mayor cuando se administró por vía sistémica. 4. Los lipocomplejos atraviesan la barrera placentaria y transfectan a los embriones. BIBLIOGRAFÍA: Felgner P.L. Gadek T. R., Holm M., Roman R., Chan H.W., Wenz M. (1987). Lipofection: a highly efficient lipid mediated DNA transfection procedure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7417. Hoogerbrugge P.M., Valerio, D., Levinsky R.J., Harvey M., Moseley A., Skeoch C.H., Fairbnaks L.D., Gaspar B., Morgan G., Perignon J.L., le Deist F., Debree M., Fisher A., Van Beusechem V. W. (1996). Bone marrow-gene transfer in three patients with adenosine deaminase deficiency. Gene Ther, 179-182. Ibáñez M. A. (1981). Composición lipídica del endometrio de rata en el quinto día de preñez. Tesis de Licenciatura. ENEP Rochlitz C. F. (2000).Gene therapy of cancer. Drugs Today, 36(9):619-629. Templeton S., (2002). Liposomal Delivery of Nucleic Acids In Vivo. DNA and Cell Biology, 12(21):857-867.

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