Mecanismos de Resistencia a los Antibióticos ß-lactámicos y Glicopéptidos

Dra Daniela Centrón UBA/CONICET

Mecanismos de resistencia a antibióticos, 2016 *Eflujo del antibiótico *Impermeabilidad al antibiótico *Inactivación enzimática *Protección del blanco *Modificación del blanco *Vía alternativa del antibiótico *Formación del biofilm *PUEDEN SER ADQUIRIDAS POR TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES (HGT)

TIPOS DE RESISTENCIA

NATURAL: propia del microorganismo.

ADQUIRIDA: es aquel tipo de resistencia que determinada especie ha adquirido a lo largo del tiempo. TIENE MAYOR IMPACTO A NIVEL CLÍNICO

Se habla de resistencia en tres niveles Mecanismo de resistencia: codificado por la célula bacteriana Resistencia poblacional Resistencia de una población que está produciendo una infección

1-Mecanismo de resistencia Mecanismo molecular utilizado por la célula bacteriana para resistir la acción de los antimicrobianos. *Eflujo del antibiótico *Impermeabilidad al antibiótico *Inactivación enzimática *Protección del blanco *Modificación del blanco *Vía alternativa del antibiótico *Formación del biofilm

2-Resistencia poblacional

Capacidad de una cepa de resistir a la acción de una concentración dada de un antibiótico en un medio de cultivo.

3-Resistencia de una población que está produciendo una infección

Eficacia Terapéutica

Problemática de la resistencia a antibióticos

Multirresistencia y evolución a la extrema resistencia Alta frecuencia de aislamientos multirresistentes a nivel mundial Mayor porcentaje de cepas multirresistentes en nuestro país

Cepas “pan-resistentes” en nuestros hospitales

SOLUCIONES  Vigilancia epidemiológica y el control de infecciones en nuestro país USO RACIONAL DE ANTIBIOTICOS

Resistencia a los -lactámicos

Características de los -Lactámicos

Todos tienen igual blanco de acción: la inhibición de las PBPs lleva a la inhibición de la síntesis del peptidoglicano

Mecanismo de acción de Antibióticos -lactámicos Canal de Porina Abierto Lipopolisacárido

Proteína de Transp

Pared Celular

Lipoproteína

-Lactámico

Espacio Periplásmico

Βeta-Lactamasas

Peptidoglicano

Membrana Celular

Proteína de Unión a Penicilina

Proteína de Membr

 -Lactámico

Pared bacteriana

Membrana Citoplasmática

Citoplasma

PBPs

L-Ala

racemasa Péptido glicano de S. aureus

D-Ala +

PBPs

ligasa Ddl

PBPs

D-Ala-D-Ala

UDP

carboxipeptidasa transpeptidasa transglicosilasa

MurF

tripéptido L-Ala-D-Glu-L-Lys

PBPs UDP

Carrier de lípidos

glicopéptido

pentapéptido

acido N-acetilmuramico N-acetilglucosamina

Membrana Citoplasmática Pared bacteriana

Citoplasma

PBPs

L-Ala

D-Ala +

PBPs D-Ala-D-Ala

PBPs carboxipeptidasa transpeptidasa transglicosilasa

glicopéptido

PBPs UDP

pentapéptido

-lactámicos acilan el sitio activo de la serina de las PBPs, inhibiendo la formación del péptido glicano.

(a) penicilina

a) Estructura de la penicilina (R es variable).

b) La conformación tridimensional de D-Ala-D-Ala es similar a la de la penicilina.

Penicilinas Naturales (penicilina G, penicilina VK) Penicilinas Resistentes a las Penicilinasas (nafcilina, oxacilina, meticilina) Aminopenicilinas (ampicilina, amoxicilina) Carboxipenicilinas (carbenicilina, ticarcilina) Ureidopenicilinas (piperacilina, azlocilina) Primera Generación de Cefalosporinas (Cefazolina, Cefalotina (parenteral) Cefalexina (oral)) Segunda Generación de Cefalosporinas (Cefaclor, Cefuroxima (Orales), Cefamandole, Cefuroxima, Cefotetan (Parenterales), Cefoxitina) Tercera Generación de Cefalosporinas (Cefixima (Oral), Cefotaxima,Ceftazidima,Cefoperazona, Ceftriaxona) Cuarta Generación de Cefalosporinas (Cefepime) Carbapenemes (Imipenem, Meropenem) Monobactamos (Aztreonam)

Efecto Terapéutico Bactericida

Penicilina Activa frente a Cocos Gram Positivos Aerobios y Anaerobios

También es activa frente a Cocos Gram Negativos Aerobios, como por ejemplo Neisseria spp.

Cefalosporinas

 Aislada en 1948 en la costa de Cerdeña a partir de Cephalosporium acremonium  Relacionado con las penicilinas por su estructura y mecanismo de acción  Más resistente a las β-lactamasas

Clasificación de las Cefalosporinas

 Primera generación  Segunda generación  Tercera generación Cuarta generación Quinta generación

Al aumentar la generación, se incrementa la susceptibilidad a bacterias Gram -, se incrementa la resistencia a las β-lactamasas y disminuye la eficacia frente a las Gram +.

Primera Generación

 Cocos Gram +, bacilos Gram -, anaerobios de la cavidad bucal  Staphylococcus aureus MS, Proteus mirabilis, E. coli, Klebsiella pneumoniae  Cefazolina, Cefalotina (parenteral)  Cefalexina (oral)

Segunda Generación  Menos activa contra Gram+ y más contra Gram Haemophilus influenzae, Enterobacter aerogenes, Neisseria spp.  Cefaclor, Cefuroxima (Oral)  Cefamandole, Cefuroxima, Cefotetan, (Parenteral)  Cefoxitina- Bacteroides fragilis  Utilizada con aminoglucósidos en infecciones Gram -

Tercera Generación  Más bacilos Gram –, Serratia marcescens  Cefixima (Oral)  Cefotaxima  Ceftazidima  Cefoperazona  Ceftriaxona

Cuarta Generación  Espectro similar a las cefalosporinas de tercera generación  Más resistente a las β-lactamasas  Cefepime

Carbapenemes  β-lactámico sintético  Difiere de las penicilinas en un átomo azufre en el anillo tiazolidina  Imipenem Amplia el espectro de los β- lactámicos frente a los Gram+ y – productores de penicilinasas, anaerobios y Pseudomonas spp.. Mayor resistencia a la hidrólisis de las β-lactamasas.  Meropenem  Ertapenem

Monobactamos  Pequeño espectro: Enterobacteriaceae, Pseudomonas; inactivo frente a Gram + o bacterias anaeróbicas  Resistente a β-lactamasas  Aztreonam

TODOS los ATB -lactámicos Mecanismos de resistencia producción de β-lactamasas  más importante y más común  Hidroliza el anillo beta-lactámico causando inactivación

alteración en las PBPs que lleva a baja afinidad por el antibiótico -lactámico alteración de la membrana externa llevando a disminución de la entrada del antibiótico -lactámico  eflujo del ATB  vía alternativa para el antibiótico -lactámico  producción de biofilm

Mecanismo de acción de las β-lactamasas PBP

β-lactámico PBP H2O

+ Enzima PBP serin

β-lactamasas Antibiótico β-lactámico inactivo

pentapéptido

Aumento de  -lactamasas según Bush y Jacoby

GES-1, CTX-M-2 KPC-2 OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58

CMY-2 SPM-1, VIM-2, VIM-11, IMP-8, IMP-13

(Bush K and Jacoby G, AAC, 2010)

Inhibidores de las β-lactamasas

Una alternativa para resolver el problema de la resistencia a los antibióticos ß-lactámicos consiste en diseñar inhibidores enzimáticos para que puedan administrarse en combinación con un antibiótico.

Acido clavulánico, Sulbactam y Tazobactam (unión irreversible de la enzima por eso « inhibidores suicidas »).

Inhibidores de las β-lactamasas

El espectro antimicrobiano de los Inhibidores de ß-lactamasas, varía de acuerdo al ß-lactámico con el que ha sido combinado.

Número de Bacterias Viables

Control (SIN drogas) Acido clavulánico

Amoxicilina

Acido clavulánico

+ Amoxicilina

Tiempo

Frecuencia de especies aisladas en H1

Problemática de la resistencia a Antibióticos -lactámicos en las Enterobacterias (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, etc.)

Lipopolisacárido

Pared Celular

Producción de -lactamasas

Proteína de Transp

Canal de Porina Abierto

Canal de Porina Cerrado

Lipoproteína

-Lactámico Espacio Periplásmico

--Lactamasas

Peptidoglicano

Membrana Celular

Proteína de Unión a Penicilina

Proteína de Membr

-Lactámico

La familia de ß-lactamasas TEM & SHV en evolución en repuestaa la introducciónde los antibióticos semisintéticos ß-lactámicos

Ingeniería Genética "Natural" desde 1960

Resistencia a antibióticos ß-lactámicos y a los inhibidores de ß-lactamasas

Cefotaximasas CTX-M-grupo 1

ISEcp1 IS26 ISEcp1 IS Ecp1

Kluyvera cryocrescens

CTX-M-grupo 9

Orf 513 ISEcp1

Orf 513 Kluyvera ascorbata

CTX-M-grupo 2 CTX-M-grupo 25 CTX-M-grupo 8

Kluyvera georgiana

Las β-lactamasas adquiridas se localizan en

Integrones y en Transposones

Sistema Integrón/Cassettes Pc attI intI

Pc attI intI

Integrones de clase 1

intI1

blaVIM-2

VR1

qacEΔ1 sul1 orf5

Invasión de transposones en los integrones de clase 1

intI

ISCR1

blaCTX-M-2

VR2

Movilización y Asociación de elementos móviles (Arduino et al., 2002, Arduino et al., 2002, Quiroga et al., 2007)

Enterobacterias 1982-1989

Selección con Antibióticos

aac(6´)-Ib

aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

Selección con Antibióticos aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

2015

ISCR1

blaCTX-M-2 orf3

Orígenes de blaCTX-M-2 ......

aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

ISCR1

blaCTX-M-2 orf3

3000 pb

Gen ubicuo de Kluviera ascorbata TRANSFERENCIA HORIZONTAL DE GENES

Plataforma genética de blaCTX-M-2 de Argentina

aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

Tn21

Tn5036 rhsD IS4321 tnpA tnpR IRi

qacEΔ1sul1

ISCR1

blaCTX-M-2

qacEΔ1sul1 orf5

tnpA

tnpR blaTEM-1 aacC2 catA2 ΔtniB

tniA IRt merE merD

AHORA Emergencia de resistencia a carbapenemes en enterobacterias..... 1986-2008 aac(6´)-Ib blaOXA-2 orfD

aac(6´)-Ib blaOXA-9

aac(6´)-Ib-cr blaOXA-2

aadB catB3 aac(6´)-Ib

blaIMP-13aac(6´)-Ib

OCTUBRE 2008 (Pasterán F, 2008)

2008!!!Emergencia de blaKPC

RESISTENCIA A TODOS LOS ANTIBIÓTICOS ß-LACTÁMICOS!!!!! Localizada en un transposón

(Pasterán F, et al., 2008)

Perfil de susceptibilidad de cepas de K. pneumoniae productoras de blaKPC-2. Antibiótico

Antibiótico

Amikacina

I

Cloranfenicol

R

Amox/clav

R

Ciprofloxacina

R

Ampicilina

R

Ertapenem

R

Aztreonam

R

Gentamicina

R

Cefazolin

R

Imipenem

R

Cefpodoxima

R

Meropenem

R

Cefotaxima

R

Pipercilina/Tazo

R

Cetotetan

R

Tobramicina

R

Cefoxitina

R

Trimet/Sulfa

R

Ceftazidima

R

Polymyxin B

MIC >24mg/ml

Ceftriaxona

R

Colistin

MIC >24mg/ml

Cefepime

R

Tigeciclina

S

K. pneumoniae en H1 58

60

CTXM-2 50

50

porcentaje de resistencia

50

40 CTXM-2,CTXM-1 ,AmpC Plasm.

KPC EXTREMA RESISTENCIA

Cefs 3º y 4º Ciprofloxacina Imipenem Colistin

30

20

11 8

10

0 1996-1998

1999-2000

2001-2002

2003-2004 años

2005-2006

2007-2008

2009-2010

Del fenotipo al genotipo en las enterobacterias

K. pneumoniae productora de PER-2

CTX

2,5 a 3cm.

CAZ

AMC

K. pneumoniae productora de CTX-M-2

CTX

CTX- CLAV

CONFIRMACIÓN POR PCR

Del fenotipo al genotipo en las enterobacterias

IMI

EDTA, 1uM IMI

MERO

IMI + EDTA

blaVIM

Detección de las BLEE en el laboratorio...... K. productora de CTX-M-2

K. pneumoniae productora de PER-2

CTX

ATB por difusión

E-Test

2,5 a 3cm.

CAZ

AMC

CTX

6mm

CTX- CLAV

De RUTINA en el laboratorio de Bacteriología

Problemática de la resistencia a Antibióticos -lactámicos en Acinetobacter baumannii

Resistencia a Carbapenemes en Acinetobacter baumannii

Cepas de Acinetobacter spp. Resistentes a los carbapenemes en el mundo.

Los integrones y transposones que poseen los genes que codifican para las -lactamasas se localiza en la isla genómica AbaR de A. baumannii

Transformación

Chicos!! Al agua!!

El último es un Staphylococcus!!!!

Puede adquirir ADN exógeno por Transformación ya que es transformante natural (100 veces mas competente que Staphylococcus spp.)

A. baumannii en H1 100

93

90

Imipenem

80

Minociclina

Clones endémicos I, III, IV OXA-23, OXA-58

70 60 % de resistencia

50 40 30

27

57 Heteroresistencia a colistin. Casos Clínicos

Aislamientos resistentes a doxiciclina

38

20 10 0

19961998

19992000

20012002

20032004

20052006

20072008

20092010

Problemática de la resistencia a Antibióticos -lactámicos en Pseudomonas aeruginosa.

Resistencia natural en Pseudomonas aeruginosa

No ß-lactámicos Cloranfenicol Tetraciclinas Macrolidos Glicopeptidos CoTrimetoxazol Viejas quinolonas (acido nalidixico)

ß-lactámicos Aminopenicilinas (ampi, amoxi) Aminop. + inhibidores Cefalosporinas 1ra y2da (cefalotina, cefuroxima) Cefotaxima* Cefoxitina Ticarcilina-clavulánico*

* Sensibilidad in vitro, Resistencia in vivo www.pseudomonas.com

Mecanismos de la Resistencia natural

PERMEABILIDAD ALTERADA

INACTIVACIÓN ENZIMÁTICA

B-LACTAMASAS CROMOSOMICAS, etc, etc

Resistencia adquirida a -lactámicos

MODIFICACION ENZIMATICA EFLUJO

IMPERMEABILIDAD

MODIFICACION ENZIMATICA Hay más de 50 -lactamasas descriptas en P.aeruginosa localizadas en transposones e integrones que a su vez se encuentran en plásmidos conjugativos.

EFLUJO

RESISTENCIA ADQUIRIDA A AMINOGLICOSIDOS, MEROPENEM, NUEVAS QUINOLONAS -LACTAMICOS, EN FORMA CONJUNTA

(Nikaido H., Current Opin. Microbiol. 1; 516-523: 1998)

Comparación de BIC y MIC de aislamientos de P. aeruginosa (µg/ml) BIC50 Amicacina (90) Azitromicina (90)

BIC90

Rango

MIC50

MIC90

Rango

32

256

4->256

16

128

0.5->128

2

32

0.5->32

NA

NA

NA

Aztreonam (85)

>128

>128

2->128

4

32

2->64

Ceftazidima (88)

128

>128

2->128

2

16

0.5-512

16

1

4

0.25-16

Ciprofloxacina (90)

0.5

4

Claritromicina (90)

32

>32

0.5->32

NA

NA

NA

Doxiciclina (86)

>64

>64

1->64

16

32

1->32

Gentamicina (90)

16

>64

1->64

8

>32

1->32

Meropenem (87)

4

64

1->64

1

8

1-16

256

>512

16->512

4

128

1-1,024

512

>512

16->512

16

256

2->4,096

4

32

1->64

2

32

0.25->512

Piperacilina-ta zobactam (85)

Ticarcilina-cla vulanico (72) Tobramicina (92)

(Moskowitz SM, J Clin Microbiol. 2004)

Cepas “Mutators” en P. aeruginosa Existe una variable presencia de “mutators”: < 1% en las poblaciones naturales 1% en infecciones crónicas o en bacterias colonizantes 10% de clones epidémicos de N. meningitidis Serogrupo A 25% de pacientes dispépticos portadores de H. pylori 30% de P. aeruginosa en pacientes con fibrosis quística “Mutators” débiles mantienen la resistencia antibiótica La transferencia horizontal de genes y la recombinación más eficientes en estas cepas

Problemática de la resistencia a Antibióticos -lactámicos en Streptococcus pneumoniae .

Incidencia de la Resistencia a la penicilina en Streptococcus pneumoniae : FRANCIA:

36%

ESPANA:

29%

ARGENTINA:

21%

HUNGRIA, USA:

12%

PORTUGAL:

6.9%

ALEMANIA:

1.5%

SUECIA:

1.5%

La resistencia de S. pneumoniae a penicilina (CIM>2mg/l) se correlaciona con sensibilidad intermedia a amoxicilina, cefuroxima, cefotaxima y a ceftriaxona

Modificación del blanco de acción

Estructura mosaico del gen de la PBP2b de aislamientos resistentes a β-latámicos. PBP 2B Czechoslovakia (1987) South Africa (1978) USA (1983)

S. pneumoniae

= Streptococcus ?

(Science 1994;264:388-393)

ALTERACIONES EN PBPs

SENSIBILIDAD (CIM ug/ml) SENSIBLE (=2)

OXA>20 mm CIM ≤ 0.06 ug/ml

S. pneumoniae aislado en pacientes con meningitis en H2 35%

31.5%

N=19

30 25

20

Penicilina C3G

15 10

5.2%

5 0 Penicilina

C3G

De marzo 1997 a marzo 2003.

Problemática de la resistencia a Antibióticos -lactámicos en Staphylococcus aureus. .

Línea temporal de eventos S. aureus 90% mortalidad

Resistencia por  -lactamasa

Resistencia a meticilina

2015

1900

1928 Descubrimiento 1940 Penicilina de la Penicilina comienza a comercializarse, sintesis de cefalosporinas

1959 Meticilina

50% de los aislamientos clínicos resistentes a la meticilina

Mecanismo de la vía alternativa del antibiótico

Gen mecA Generalmente ligada a resistencia antibiótica acompañante:

PBP 2a

aminoglucósidos, macrólidos, quinolonas, cloranfenicol, tetraciclina, TMS.

R a TODOS los β-lactámicos

Meticilino-Resistencia

Transducción

ADN del fago Cromosoma bacteriano

Bacteria lisogénica Lisis

SAMR no solo se aisla en pacientes hospitalarios, sino que es importante agente etiológico de la comunidad. Es llamado SAMR-CA

Estudio del comportamiento epidemiológico de SAMR-CA

1999, reporte de 4 muertes pediátricas debidas a CA-MRSA

2004, reporte de 15 muertes en Uruguay

1993, pacientes de comunidades remotas del oeste de Australia

S. aureus en H1

80

76 74 68 68

68 68

70

Porcentaje de aislamientos

60

50

SAMR-AC h-VISA

40

Prevalencia Oxacilina Gentamicina

30

20

17,5

16,4

9 10

0 1996-1998

1999-2000

2001-2002

2003-2004 años

2005-2006

2007-2008

2009-2010

Resistencia a los glicopéptidos

Resistencia natural del género Enterococcus spp.

Propia de Género ß-lactámicos TMS Aminoglucósidos Viejas Quinolonas

Propia de especie E. faecium IMI AKN E. faecalis CLIN E. gallinarum E. casseliflavus E. flavescens

VAN

Problemática de la multirresistencia adquirida EVR 1990

1993

Enterococcus spp. multiresistente es declarado patógeno emergente por el CDC

EVR aislado en

pacientes de la comunidad 2002

Primer aislamiento de Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina portador del determinante de resistencia de los EVR

El origen de la resistencia a glucopéptidos en enterococos EVR

Uso de avoparcina como aditivo de la alimentación de aves

1990

1993

2002 No se halla resistencia a la vancomicina

en Suecia porque no se administran glucopéptidos con propósitos no médicos

(Endtz H, et al., J Clin Microb, 1997)

Fenotipos de Resistencia a los Glicopéptidos

• Fenotipos: EL ALFABETO VAN VAN A

VAN B

VAN C

VAN D

VAN E VAN G VAN F

•Argentina: Se reportan más casos de Enterococcus faecium VanA

VAN A

VAN B

(Casellas JM, 1997; Corso A, 2001; Courvalin, 2006; Lopardo HA, 2000; Lopreto C, 2002; Marín, E, 1998; Podestá OS, 1997; Targa L, 1997)

Mecanismo de Acción de la Vancomicina Pared celular

Membrana

Citoplasma L-Ala

carboxipeptidasa

racemasa D-Ala

transpeptidasa transglicosilasa

+

ligasa Ddl D-Ala-D-Ala

UDP

MurF

L-Ala-D-Glu-L-Lys

tripéptido

UDP Carrier de lípidos

vancomicina

pentapéptido

acido N-acetilmuramico N-acetilglucosamina

Varios genes involucrados en la Resistencia a la Vancomicina

vanR

vanS

sensor regulador

regulación

vanH

VanA

vanX

ligasa dehidrogenasa dipeptidasa

vanY

vanZ

carboxipeptidasa

genes requeridos para la proteínas resistencia a accesorias glicopéptidos

Operón de Resistencia a la vancomicina

Mecanismo de Resistencia a la Vancomicina

piruvato

G

M

G

M

vanH vanA + D-Lac D-Ala

+

ddl

vanX

Vancomicina no puede unirse al D-Ala-D-Lac

Mecanismo de Resistencia a la Vancomicina

G El dipéptido D-Ala-D-Lac sirve de sustrato par la síntesis de la pared bacteriana

Pared celular

M

G

M

Mecanismo de la Resistencia inducible a la vancomicina

VanS Membrana

P-VanS

Citoplasma ATP ADP

VanR

P-VanR

Van R

Activación PR

vanR

vanS

PH

vanH

vanA

vanX

Mecanismo de diseminación de los genes de resistencia a la vancomicina

ORF1

IRL

orf2

vanR

sensor

resolvasa transposasa

transposición

vanS

regulador

regulación

vanH

VanA

vanX

ligasa dehidrogenasa dipeptidasa

vanY

vanZ IRR

carboxipeptidasa desconocido

genes requeridos para la proteínas resistencia a accesorias glicopéptidos

Estructura de Tn1546

- Primer reporte de VRSA en 2002. - Mecanismo de resistencia: S. aureus con Tn1546 en el plásmido pLW1043 de 53kb

Conjugación entre cocos Gram-Positivos

(Weigel, L.M., et al., Science, 2003)

Además......enterococos dependientes de la vancomicina!!

Mutaciones que inactivan la síntesis del dipéptido D-alanina-Dalanina en cepas con fenotipo VanA o VanB

Estos mutantes sólo serán viables cuando, en presencia de vancomicina, se induzca la síntesis del dipéptido alternativo Dalanina-D-lactato.

(Endtz H, et al., J Clin Microb, 1997)

Enterococcus spp. en H1 35 31 30 25

porcentajes de aislamiento

25

Primer aislamiento E. faecalis vancomicina resistente

Primer aislamiento E. faecium vancomicina resistente

20

EVR Otros E.faecium

15

E.faecalis

10

5

0 1996-1998

1999-2000

2001-2002

2003-2004 años

2005-2006

2007-2008

2009-2010

En nuestras manos, las medidas de control de infecciones….

MUCHAS GRACIAS!!! [email protected]