Máster en Zootecnia y gestión sostenible: Ganadería ecológica e integrada

AVANCES DEL PROGRAMA DE SELECCIÓN/CONSERVACIÓN DE LA OVEJA ROJA MALLORQUINA

Curso: 2010-11 Tutor: Juan Vicente Delgado Bermejo Alumna: Mercè Tobaruela Arbona

Máster en Zootecnia y gestión sostenible

INDICE 1.- INTRODUCCIÓN ............................................................................................... ................ 2 1.1.-Características de la oveja roja mallorquina .........................................................................2

2.- PROGRAMA DE SELECCIÓN Y MEJORA GENÉTICA .............................. .............. .................. 4 2.1- Antecedentes .................................................................................................... .................. 4 2.2- Desarrollo de programas de mejora y conservación ......................................... .................. 4 2.3- Programa de mejora genética de la raza ovina Roja Mallorquina........ .................... ...........6

3.- INFORME TÉCNICO SOBRE LAS ACTUACIONES REALIZADAS EN EL ÁREA DE GENÉTICA MOLECULAR ................................................................................................. .................. 9

4.- CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE LA RAZAS OVINAS MALLORQUINA, ROJA MALLORQUINA, MENORQUINA E IBICENCA CON MICROSATÉLITES DE ADN ................................................................................................................................ ......... .......10 4.1- Metodología,............................................................................. .................... .....................10 4.2- Resultados................................................................................ .................... ......................12

5.-CONTROL GENALÓGICO DE LA RAZA OVINA ...................................................... ................ 13 5.1- Probabilidad de exclusión...................................... .................... ........................................15 5.2- Metodología del control genealógico....................................... ..................... .....................17

6.- ASIGNACIÓN DE INDIVIDUOS A LAS RAZAS OVINAS DE LAS ISLAS BALEARES ........ 19 6.1- Metodología ....................................................................................................................... 21 6.2- Resultados ........................................................................................................................... 21

7.- BIBLIOGRAFIA... ........................................................................................................................... 38

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1.-INTRODUCCIÓN

1.1.-Características de la oveja roja mallorquina La oveja roja mallorquina es una raza autóctona de las islas baleares, esta incluida como raza autóctona de protección especial en el Catálogo de ganado de España, que se aprobó mediante el Real Decreto 1682/1997 del 7 de noviembre, actualizada por la orden APA/661/2006, de 3 de marzo. Es un raza que deriva del cruce de dos troncos de ganado ovino, uno procedente del sur del continente europeo y el otro de los países del norte de África, aportando las características diferenciales de esta raza, como son l coloración roja, la lana entrefina i la cola ancha. La raza se ubica en la isla de Mallorca. Es un animal fundamentalmente de pastoreo, muy rústico, acomodado en los terrenos de climatología seca, capaces de aguantar las épocas de sequía, hecho que hace que históricamente fuera muy apreciada en las áreas del sur de Mallorca, especialmente en el municipio de Llucmajor, aunque actualmente se ha extendido por toda la isla. El sistema de explotación es extensivo, en su mayoría son pequeños rebaños explotados de forma no especializada, siendo en este punto de vital importancia su adaptabilidad al medio y sistema de explotación. El número total de animales inscritos en el libro genealógico es de 3.596 animales, en un total de56 ganaderías con una media de 64 animales por ganadería. Como consecuencia de su regresión, se encuentra en peligro de extinción, por lo que tiene que ser objeto de estudio i de actuaciones que contribuyan a la prevención y a su posterior desarrollo.

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2.-PROGRAMA DE SELECCIÓN Y MEJORA GENÉTICA 2.1- Antecedentes En el último quinquenio se ha establecido una colaboración científica entre el Instituto Balear de Biología Animal (IBABSA), y el Grupo de investigación “Mejora y Conservación de los Recursos Genéticos de los Animales Domésticos” (Grupo PAI AGR-218), así como con su empresa de base tecnológica Animal Breeding Consulting Sociedad Limitda (ABC, SL), con la intención de fomentar el desarrollo de programas genéticos sobre las razas ovinas autóctonas de las Islas Baleares. Actualmente, las Isla Baleares cuentan con cuatro razas ovinas reconocidas oficialmente en el Catálogo Oficial de Razas de Ganado de España, en cuya última actualización se encuentran incluidas en la categoría de “razas autóctonas en peligro de extinción”, si bien los estudios que hemos venido desarrollando sobre ellas nos indican, que aunque si es cierta la amenaza de extinción que se cierne sobre ellas, el nivel de amenaza no es el mismo para todas ellas. Las razas Roja Mallorquina, Mallorquina y Menorquina, disponen de censos y número de explotaciones suficientes para planificar su gestión genética en un programa de mejora, por el contrario, la situación de la oveja Ibicenca es absolutamente dramática, por lo que con ella se planteó un agresivo programa de conservación.

2.2- Desarrollo de programas de mejora y conservación Para el desarrollo de los programas de gestión genética modernos, sean de mejora o de conservación, se necesita una serie de información indispensable, así como unos mecanismos ágiles para la circulación de la misma desde su origen en las ganaderías hasta el laboratorio de análisis genético y viceversa, pasando por todos los estratos integrados en los programas como son las asociaciones, los técnicos locales, las administraciones... Estos últimos años se han dedicado a poner en marcha todos los mecanismos mencionados de recogida y transito de la información en sentido ascendente (Información bruta) y descendente (Informes y demás información elaborada).

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible La información necesaria para los programas genéticos es la siguiente: 1. Identificación animal. Cada individuo tiene que disponer de una identificación individual indeleble y permanente que le acompañe durante toda su vida, incluso cuando se trata de corderos destinados al sacrificio. Este punto es de vital importancia debido a que toda la información restante va a ir referida a esta identificación, por tanto, sin una buena identificación es imposible desarrollar un programa. La identificación que se realiza en las razas ovinas de las Baleares es el bolo ruminal y un crotal con la misma numeración que el bolo. 2. Control de rendimientos. Se trata de todos los mecanismos a desarrollar para la recogida de información productiva, morfológica y ambiental en las explotaciones. España es miembro de la Internacional Society for Animal Recording (ICAR), con sede en Roma, institución encargada de fijar las condiciones del control de rendimientos. En este apartado hemos tenido que realizar una completa labor de formación continua tanto de técnicos como de ganaderos, ya que el comienzo de los programas, carecían por completo de preparación específica para el desarrollo de programas genéticos. En tal sentido, se han desarrollado ininterrumpidamente en los últimos cuatro años, cursos de formación en las islas de Mallorca, Menorca e Ibiza, sobre temas relacionados con la estructura de los esquemas de selección y programa de conservación; con el desarrollo práctico del propio control de rendimientos, la calificación morfológica lineal y por áreas corporales, reproducción asistida e interpretación de información genealógica. En el control de rendimientos se recoge de manera rutinaria la siguiente información: a).- Información productiva compuesta por pesadas a distintas edades de referencia (nacimiento, destete precoz, destete tardío y sacrificio). b).- Información ambiental sobre las circunstancias que han concurrido en la producción de cada uno de los datos anteriores. Es decir, año de control. Estación de control, ganadería, edad de la madre, etc. c).- Declaraciones de cubrición y nacimientos, como genealogía propuesta, y también muestras biológicas perfectamente identificadas de cada animal, para ser enviadas al laboratorio de análisis genético de la Universidad de Córdoba para la verificación de la genealógica propuesta.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible d).- Calificación morfológica de los animales del núcleo selectivo a unas edades preceptivas y bajo criterios de calificación por áreas corporales. 3.- Control Genealógico. Como es lógico, para hacer genética es imprescindible el conocimiento de las relaciones genealógicas entre los animales implicados en el proceso de la mejora. El control genealógico directo es muy complicado en los pequeños rumiantes debido a que las prácticas zootécnicas exigen la utilización de varios machos para fertilizar grupos de lotes reproductivos de hembras. Este problema se ha solucionado implantando de manera rutinaria en el núcleo de selección los controles genealógicos con marcadores genéticos moleculares como son los microsatélites. Este procedimiento se encuentra completamente estandarizado en las cuatro razas. 4.- Conexión genética de los rebaños mediante el uso de la inseminación artificial con semen refrigerado. Consiste en la utilización de unos machos referencia en la inseminación artificial en diversos rebaños, de una manera planificada para que todos los rebaños resulten conectados por los descendientes de estos machos de referencia y nos permita la evaluación indirecta de los sementales propios de cada explotación. Este punto nos ha dado la oportunidad complementaria de crear bancos de germoplasma con semen congelado de animales tipo de cada raza, consiguiendo con ello, por un lado garantizar la conservación “ex-situ” y por otro lado el cumplimento de las recomendaciones de la FAO (Declaración de Interlaken 2007) y el estado español (Real Decreto 2129/2008), en este sentido Baleares se ha convertido en una de las primera autonomías que ha desarrollado el preceptivo banco de germoplasma regional.

2.3- Programa de mejora genética de la raza ovina Roja Mallorquina El núcleo de selección esta integrado por 6 ganaderías, representadas en la Tabla 1. Estas explotaciones se encuentran conectadas genéticamente por la actuación de 4 sementales que han sido entrenados en el centro de reproducción establecido.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Tabla 1. Lista de explotaciones que integran el núcleo de selección. Explotación

Nº REGA

Nº hembras

Nº machos

Morell nou i petit

042IB0088

45

5

So N’Ajaume

040IB0192

38

1

Can Pelat

058IB0196

245

7

Es Pas

031IB108

56

2

La Plana

042IB219

112

1

Can Morey-Cas Xoriguer

En la Figura 1, se muestra el diseño de las conexiones genéticas de los rebaños así como el listado de los cuatro sementales de referencia presentes en el centro en la actualidad. En código de colores se apuntan las conexiones realizadas hasta el momento por medio de la inseminación artificial.

Figura 1. Esquema de las conexiones genéticas de los rebaños del núcleo de selección de la oveja roja mallorquina realizadas en el 2010. Can Pelat 058IB0196 Can Morell nou i petit 042IB0088

Can MoreyCas Xoriguer 029IB0018

Sementales So Na Jaume 040IB0192

La Plana 042IB0219

CENTREENTRO ENTRENAMIENTO MACHOS

Can Picassa 042IB0658

61279 41226 17144 17251

Es Pas 031IB0108

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Las pesadas se realizan en los animales que nacen en los núcleos de selección, ya sea por inseminación como por monta natural con el fin de poder evaluar genéticamente los machos. Los animales integrados en el núcleo de selección han sido sometidos a control genealógico con marcadores del ADN (microsatélites), reflejándose los avances conseguidos a continuación.

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3.- INFORME TÉCNICO SOBRE LAS ACTUACIONES REALIZADAS EN EL ÁREA DE GENÉTICA MOLECULAR El Grupo de Investigación AGR-218 viene trabajando con razas ovinas autóctonas de las Islas Baleares desde hace varios años a través de un convenio de colaboración con IBABSA. En estos años se ha realizado la caracterización genética de las cuatro razas autóctonas de las Islas Baleares: Ibicenca, Mallorquina, Roja Mallorquina y Menorquina. Se han establecido las relaciones genéticas de las razas ovinas de Baleares con otras razas autóctonas españolas cuyos genotipos están en la base de datos del Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del grupo de Investigación AGR-218. También se han hecho durante los años anteriores controles de filiación de las cuatro razas ovinas, en el caso de la raza Ibicenca se hizo además un estudio de parentesco más detallado al disponer de la totalidad de la población analizada. A lo largo de estos años se ha ido mejorando la recogida de datos de los animales analizados (sexo, fecha de nacimiento, posible padre y/o madre, etc.) lo que ha permitido que año tras año se vaya completando la información disponible de los animales registrados de cada una de las razas. Actualmente están genotipados la mayoría de los animales fundadores de cada una de las razas lo que permitirá el control genealógico de las mismas con marcadores moleculares. El hecho de haber caracterizado las cuatro razas ovinas con marcadores moleculares en años anteriores y por tanto, tener el perfil genético de cada una de ellas, ha permitido poner a punto la tecnología necesaria para asignar individuos a poblaciones con altos niveles de fiabilidad mediante diferentes aplicaciones informáticas. Esta tecnología es muy útil cuando existen dudas de la pureza racial de algunos animales ya que con esta herramienta se pueden tomar decisiones a la hora de inscribir a un animal concreto en el libro genealógico de la raza o no.

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4.-

CARACTERIZACIÓN

MALLORQUINA,

ROJA

GENÉTICA

DE

MALLORQUINA,

LA

RAZAS

OVINAS

MENORQUINA

E

IBICENCA CON MICROSATÉLITES DE ADN.

4.1- Metodología Las muestras de sangre de las cuatro razas ovinas se han recibido en el Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del Grupo de Investigación AGR-218 de la Universidad de Córdoba. Cada una de las muestras se ha identificado mediante un número de laboratorio y se han almacenado en tubos de congelación para su posterior conservación. La extracción del ADN de la sangre se realiza con el Kit BLOODCLEAN de Purificación de ADN (BIOTOOLS - Biotechnological & Medical Laboratories, S.A. Madrid, España) siguiendo las indicaciones del fabricante para este kit. Se han amplificado 29 microsatélites mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la separación por tamaños de los fragmentos obtenidos se ha realizado mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en un secuenciador automático ABI 377XL (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). El análisis de los fragmentos y la tipificación alélica se ha realizado mediante los programas informáticos Genescan Analisys 3.1.2 y Genotyper 2.5 respectivamente. Las frecuencias alélicas de los 29 marcadores se han determinado mediante el programa informático GENETIX versión 4.01 (Belkhir et al., 2003). La Heterocigosidad esperada, observada, las desviaciones del equilibrio Hardy-Weinberg y las probabilidades de Exclusión a priori para el conjunto de los marcadores y para cada uno de ellos en el total de las muestras analizadas se realiza con la aplicación CERVUS versión 2.0 (Marshall et al., 1998) Se calcula el Contenido de Información Polimórfica (PIC) mediante la extensión MS Tools (Park, 2001) del programa EXCEL. Se realiza un Análisis Factorial de Correspondencia mediante el programa informático GENETIX versión 4.01. Se han calculado las distancias genéticas entre las razas de baleares y las de éstas con otras razas ovinas españolas y se han construido árboles de distancia mediante el programa POPULATIONS (Langella, 1999) Se ha realizado un análisis de asignación de los individuos a su población y de la subestructura de las razas ovinas

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Mallorquina, Roja Mallorquina, Menorquina e Ibicenca utilizando un algoritmo bayesiano del programa de análisis STRUCTURE (Pritchard et al., 2000), que emplea un modelo basado en método de cadenas Markov de Monte Carlo, que estima la distribución a posteriori de cada coeficiente de mezcla de cada individuo (q).

4.2- Resultados Los resultados detallados de la caracterización genética de cada una de las razas ovinas de Baleares se entregaron en el informe del convenio correspondiente a cada año, pero a modo de resumen, en la tabla 2 se describen los resultados de diversidad genética intra-racial de las mismas. El promedio de alelos cada población y los valores de heterocigosidad indican que todas las poblaciones muestran una diversidad genética elevada, siendo la raza Ibicenca la que presenta menor diversidad genética de las cuatro. El valor de Fis se desvía significativamente de 0 en las razas Roja Mallorquina y Menorquina, mostrando en ambos casos un exceso de homocigotos. Tabla 2.- Número de animales analizados por población, Fis, Heterocigosidad esperada, Heterocigosidad observada y número medio de alelos por población con sus correspondientes desviaciones estándar.

La variación genética debida a la diferencia entre las cuatro razas es del 7.9% mientras que el 92.1% restante se debe a diferencias entre individuos. Estos valores indican una discreta diferenciación genética entre estas 4 razas. Estos valores de diferenciación genética son similares a los encontrados en otras razas ovinas nacionales e internacionales y constatan el hecho de que la diferenciación genética entre las razas ovinas en general es pequeña, sobre todo

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible si se compara con la obtenida entre poblaciones de otras especies como bovinos o porcinos. Cuando se calcula el Fst entre pares de poblaciones se obtiene que la mayor diferenciación genética se encuentra entre las razas Ibicenca y Mallorquina, y que la raza Ibicenca es la que más se diferencia de las otras tres razas. En el análisis factorial de correspondencia de las cuatro razas de Baleares se observa que los individuos de las cuatro poblaciones forman agrupamientos bien definidos, sin que se encuentre evidencia de la existencia de mezclas entre ellas. De los árboles de distancia genética se deduce que las razas más cercanas entre sí son la Roja Mallorquina, la Menorquina y la Mallorquina, quedando más alejada la Ibicenca. La caracterización genética de razas de animales domésticos supone un primer paso que es fundamental para cualquier acción que se quiera afrontar con dichas razas. En el caso de las razas ovinas de Baleares se ha visto que la diferenciación genética de estas razas es elevada, lo que permite afrontar con garantías de éxito planes de conservación de las mismas. Se ha estudiado el comportamiento de un panel de 29 microsatélites habitualmente utilizados en estudios de diversidad genética ovina, lo que permitirá seleccionar un panel de 12 marcadores para realizar diagnósticos rutinarios de paternidad. Asimismo, se ha definido el perfil genético de las razas ovinas de Baleares lo que servirá para realizar asignaciones de individuos a dichas razas con altos valores de fiabilidad.

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5.-

CONTROL

GENALÓGICO

DE

LA

RAZA

OVINA

ROJA

MALLORQUINA. Las asociaciones de criadores de animales de razas puras, que empiezan a aparecer a partir de finales del siglo XIX, tienen como objetivo la definición de modelos raciales teóricos y el diseño de planes de selección animal que permitan conseguir dichos modelos. Para ello es indispensable la valoración y selección de los reproductores más adecuados, teniendo plena seguridad de la identificación y conocimiento de la genealogía de cada individuo. Inicialmente los métodos de identificación y selección se basaban en unos pocos caracteres morfológicos y funcionales, pero cada vez era mayor la necesidad de establecer unos parámetros más objetivos y exactos, que contribuyesen no sólo a disminuir los errores y, por que no, los fraudes en las asignaciones de paternidades, sino también a conocer mejor la estructura genética de las poblaciones y facilitar la elaboración de planes de selección animal. El establecimiento de un método que permita el control de filiación o las relaciones familiares, así como una correcta identificación individual, tiene importantes repercusiones de diversa índole como son las repercusiones científicas, sociales, legales y económicas. El interés científico se basa en la obtención de información que puede ser útil para realizar estudios microevolutivos, estudios de la estructura de poblaciones, de consanguinidad, de flujo de genes, etc. El control de filiación en humanos tiene una clara transcendencia social ya que incide en el ámbito de los derechos de la persona y permite identificar ascendientes, así como resolver problemas médicos, realizar diagnóstico precoz de algunas enfermedades. Las implicaciones legales se entienden fácilmente si se piensa en la resolución de casos en medicina forense y en criminología o en casos de disputas de paternidad. Desde el punto de vista económico se puede destacar, por un lado, la aparición de una actividad económica y profesional especializada por parte de laboratorios que ofrecen este tipo de servicio. Por otro lado, la aplicación a la mejora genética de especies ganaderas, permitiendo la identificación no solo de individuos, sino también de muestras de semen y embriones, mejorando los cálculos de los valores genéticos de reproductores al verificar su descendencia, aumentando también el valor de venta de un animal con pedigrí verificado, etc.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Los microsatélites de ADN son un tipo de marcadores muy empleados en los estudios de genética de poblaciones y son los marcadores de elección para conseguir, no sólo un método fiable de identificación individual y de control de las genealogías, sino también una mejor apreciación y caracterización de la diversidad genética de las razas. Como la forma de herencia de cada microsatélite es codominante, un individuo no puede tener un determinado alelo si éste no está presente en al menos uno de sus progenitores. Cualquier alelo no materno debe proceder del padre, y si el supuesto padre carece de este alelo, no puede ser el verdadero padre. Cuando se comparan los genotipos de un marcador, obtenidos en un individuo y en sus progenitores, las combinaciones posibles originan diversos dictámenes: Compatible, No padre ni madre, No padre, No madre, No padre o madre, Compatible sin tener en cuenta la madre o Compatible sin tener en cuenta el padre. El significado de estos dictámenes es el siguiente: Compatible.- El individuo es compatible con la madre y el padre propuestos. El genotipo del individuo es fruto de la combinación de los alelos presentes en los genotipos de ambos progenitores. No padre ni madre.- El individuo es incompatible con la madre y con el padre propuesto. El genotipo del individuo no puede de ninguna manera surgir de la combinación alélica de los genotipos de los progenitores. No padre.- El individuo es compatible con la madre propuesta pero incompatible con el padre propuesto. El padre no comparte ningún alelo con el individuo, sin embargo la madre sí lo hace. No madre.- El individuo es compatible con el padre propuesto pero incompatible con la madre propuesta. La madre no comparte ningún alelo con el individuo, sin embargo el padre si lo hace. No padre o madre.-Uno de los dos progenitores propuestos es incompatible con el individuo, pero no se puede determinar cual de ellos es el incompatible. En este caso uno de los alelos del genotipo del individuo está presente en ambos progenitores pero el otro no está en ninguno de ellos. No se puede saber cuál de ellos aportó dicho alelo.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Compatible sin tener en cuenta la madre.- El individuo es compatible con el padre pero se ha realizado el control de filiación sin tener en cuenta la madre por diversos motivos (madre muerta, desconocida, etc.). Compatible sin tener en cuenta el padre.- El individuo es compatible con la madre pero se ha realizado el control de filiación sin tener en cuenta el padre por diversos motivos (padre muerto, desconocido, etc.).

5.1- Probabilidad de exclusión Las pruebas de verificación de la paternidad tienen enfoques distintos en el hombre y los animales, a pesar de usar la misma metodología. En ambos casos la exclusión de un progenitor es cierta al 100% cuando no hay posibilidad de transmisión de un determinado alelo presente en el individuo por parte del supuesto progenitor aunque se acepta que ante la posibilidad de una mutación inesperada se debería excluir un progenitor o ambos con más de un marcador. En el caso de que no se detecte ninguna incompatibilidad en los marcadores analizados, se considera al progenitor como compatible y por lo tanto válido para figurar como tal en los registros genealógicos animales. Se podría dar el caso de la necesidad de demostrar la fiabilidad del dictamen de compatibilidad. Se trata de algo habitual en los casos de pruebas de paternidad en el hombre en los que la compatibilidad de un padre debe ir acompañada por una probabilidad de paternidad a posteriori. Es un cálculo complejo que no suele ser empleado en mundo animal y que se suple con una estrategia que consiste en la selección de una batería de marcadores con una probabilidad de exclusión a priori alta en la población a la que pertenecen los progenitores y el individuo en cuestión. Uno de los primeros planteamientos para hacer pruebas de paternidad fiables, es la necesidad de detectar la mayoría de paternidades falsas que se presenten. Para la evaluación de la capacidad de un marcador de excluir una paternidad falsa se han desarrollado fórmulas dependiendo de la necesidad de excluir un sólo progenitor o los dos. Hughet y colaboradores (1988) definen la probabilidad de exclusión a priori (PE) de un marcador genético en una población determinada, como la probabilidad de detectar una paternidad falsa en base a ese

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible marcador. La eficacia de un sistema genético para dilucidar un test de paternidad, viene determinada por la probabilidad de exclusión (PE) de dicho sistema en una raza. La combinación de las probabilidades de exclusión de los diferentes loci (PEC), tiene un valor que se utiliza para determinar la eficacia a priori de un conjunto de sistemas o marcadores genéticos para resolver casos de paternidad discutible en una población dada. A pesar de disponer de sistemas altamente informativos y con una PE alta para una raza, cuando los progenitores verdaderos y falsos están estrechamente relacionados, la PE disminuye enormemente. La Probabilidad de Exclusión a priori por marcador (PE) y para el conjunto de los marcadores (PEC) se ha calculado con el programa informático CERVUS 2.0 (Marshall et al., 1998). Aunque lo ideal sería establecer un panel de microsatélites para cada raza, a efectos prácticos se establece un panel de 12 marcadores que se usa habitualmente en razas ovinas españolas (Tabla 3). Estos marcadores se han escogido de entre los 29 empleados en la caracterización de las razas considerando criterios científicos (máxima probabilidad de exclusión) y técnicos (inclusión en una reacción múltiplex). La Probabilidad de Exclusión Combinada a priori (PEC) del panel de microsatélites empleado es 0,9998 cuando se conocen los dos progenitores, disminuyendo este valor hasta 0,9928 cuando sólo se conoce uno de ellos. Tabla 3.- Panel de 12 microsatélites, número de alelos por marcador (NA), Probabilidad de Exclusión conociendo sólo uno de los progenitores (PE1) y conociendo los dos progenitores (PE2)

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible A la vista de estos resultados se puede asegurar que con este panel de microsatélites se pueden detectar el 99,998% de las paternidades falsas cuando se conocen los dos progenitores de un animal y el 99,28% de las paternidades falsas cuando sólo se conoce uno de los progenitores. Sólo un pequeño número de controles de filiación no podrían resolverse utilizando este panel de 12 microsatélites. Para poder resolver estos casos se dispone de un panel secundario de microsatélites.

5.2- Metodología del control genealógico El protocolo establecido para realizar el control genealógico es el siguiente: -

Extracción de sangre en tubos Vautainer de 5 cc con anticoagulante (EDTA o Heparina) de los corderos en el momento de su identificación provisional.

-

Comprobación de la identificación de la madre y el padre propuesto, recogiendo muestras de los mismos en el caso de que no estén previamente genotipados.

-

Elaborar un informe en cada recogida de muestra haciendo mención a los posibles padres alternativos.

-

Refrigeración de las muestras hasta su envío al Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del Grupo AGR-218. Las muestras tienen que estar en destino en un máximo de 10 días tras la recogida.

-

Análisis molecular de todas las muestras y emisión de informes sobre compatibilidad o incompatibilidad con los progenitores propuestos y en su caso propuesta de progenitores alternativos ciertos. En los casos en los que no se conocen los progenitores, los animales quedarán como fundadores de la raza.

-

Almacenamiento de las fórmulas genéticas de todos los animales analizados en la base de datos del Laboratorio para su posterior utilización en futuros controles de filiación.

-

Actualización de la información genealógica en las bases de datos.

En el Anexo 1

se recogen todos los animales genotipados de las razas ovinas Roja

Mallorquina en el Laboratorio de Genética Molecular Aplicada del grupo de investigación

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible AGR-218 de la Universidad de Córdoba hasta el año 2009 incluido. Se ha ido mejorando progresivamente la toma de datos de los animales muestreados y actualmente todas las muestras recibidas en el laboratorio están debidamente identificadas y cada vez son menos los animales cuyos progenitores no se conocen. En algunos casos, existen registros acerca de cuales son los progenitores de los animales, pero no hay muestra disponible de los mismos por lo que estas genealogías quedan sin comprobar. Se recomienda que siempre que sea posible se recojan muestras de todos los animales de una ganadería. Estas muestras pueden quedar almacenadas en un banco de muestras del Laboratorio y sólo serán analizadas cuando sea necesario. De esta manera se podrá minimizar el problema de que no exista muestra de algunos padres o madres. Esta experiencia se está llevando a cabo en otras razas de animales domésticos con éxito, evitándose la pérdida de información producida por la no comprobación de la genealogía de muchos animales. Durante este año 2010 se ha continuado con el envío de muestras de sangre de las cuatro razas ovinas de Baleares, se han genotipado todas las recibidas hasta el momento y se han realizado controles de filiación en aquellos casos en los que se proponen progenitores y existe muestra disponible de ellos.

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6.- ASIGNACIÓN DE INDIVIDUOS A LAS RAZAS OVINAS DE LAS ISLAS BALEARES La caracterización genética de las poblaciones animales tiene varios objetivos, dentro de los que se destacan: la determinación de pureza de raza, la relación genética entre poblaciones, las relaciones filogenéticas entre razas, la caracterización de la diversidad genética de las poblaciones y en los últimos años, la asignación de un individuo o sus productos a una determinada raza. En determinadas circunstancias, lo que se pretende es, primero conocer las características de la población y en un segundo paso, asignar individuos de origen desconocido a una población determinada. En estos casos es crucial conocer la estructura de las poblaciones a las que se pretende asignar muestras o individuos. Por otra parte, en algunas ocasiones se pretende conocer la estructura “oculta” de una población que no es posible distinguir utilizando caracteres visibles, pero que puede ser significativa en términos genéticos (Pritchard et al., 2000). Actualmente las herramientas de genética molecular proporcionan un número prácticamente ilimitado de marcadores de ADN que permiten la identificación individual y, por lo tanto, la asignación de muestras anónimas a determinadas poblaciones. La asignación es probabilística y puede tener dos enfoques: 1.- La muestra problema se asigna a la población en la que su composición genética proporcione una mayor probabilidad, no se excluye la asignación del ejemplar a otras poblaciones aunque con probabilidades más bajas; 2.- Se calcula, para la muestra problema, la probabilidad de que cada una de las poblaciones consideradas en el análisis sea su población de origen, e incluso qué proporción de su genoma tiene origen en cada una de ellas. Los marcadores genéticos de ADN ofrecen la posibilidad de utilizar los genotipos individuales para determinar la población de origen de los individuos (Davies et al., 1999). El uso de marcadores microsatélites de ADN combinados con las pruebas estadísticas de asignación y métodos similares permiten la detección de cruces entre poblaciones y la comprobación de la homogeneidad intrapoblacional. En las razas ovinas esta herramienta es de gran interés por ser un método probabilístico que permite evaluar la pertenencia de un

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible individuo a una determinada raza. Hoy en día, el estudio del ADN y los análisis estadísticos derivados, son la mejor elección para contrastar las asignaciones preliminares basadas en otros caracteres. Existen varios métodos con los que podemos asignar individuos a poblaciones, es decir, saber si un cordero pertenece a la raza ovina Ibicenca, Mallorquina, Roja Mallorquina o Menorquina según el caso. También podemos decir si un producto cárnico procede de un animal puro o cruzado con otras razas ovinas. En primer lugar utilizamos un método no supervisado (Pritchard et al., 2000) que asume situación de equilibrio de Hardy-Weinberg para las frecuencias de los alelos, estimando para cada individuo incluido en el análisis la probabilidad de que pertenezca a cada una de las poblaciones consideradas ancestrales. Esta probabilidad es en realidad la distribución posterior de cada porcentaje de genoma que proviene de las poblaciones ancestrales y es calculada aplicando un enfoque bayesiano utilizando técnicas MCMC (Monte Carlo Markow Chain). Este procedimiento presenta como ventajas más destacables el no requerir especificar las frecuencias alélicas de las poblaciones ancestrales y el permitir tener en cuenta situaciones genéticas complejas, incluyendo el caso de muestras que provienen de mezcla entre varias poblaciones. Un segundo tipo de análisis que se lleva a cabo pertenece al grupo de métodos supervisados, en el que las poblaciones de referencia está determinadas a priori y representadas por un conjunto de individuos muestreados en cada una de ellas (Piry et al., 2004). De esta forma, el método supervisado nos permite validar el conjunto de poblaciones de referencia, mientras que el método no supervisado nos permitirá llevar a cabo la asignación de las muestras anónimas. Para aplicar el procedimiento no supervisado se utiliza el software STRUCTURE (Pritchard et al., 2000) que nos permite también tener una estimación del número de poblaciones que maximizan la verosimilitud de la información molecular disponible, de tal manera que es posible tener una idea del número de poblaciones ancestrales que han dado lugar a las razas de referencia muestreadas. Los métodos supervisados se llevan a cabo mediante el software GENECLASS2 (Piry et al, 2004) que permite, además de asignar cada muestra problema a las poblaciones más probables, utilizar un método de exclusión que compara la proporción de muestras simuladas cuya probabilidad de pertenencia a una población

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible es inferior que la de la muestra problema.

6.1- Metodología Para establecer las poblaciones de referencia de las razas ovinas de Baleares se han utilizado los datos obtenidos en la caracterización genética de las cuatro razas ovinas con 29 microsatélites descrita en el apartado de Caracterización Genética. Como poblaciones de referencia se han tomado 100 animales de la raza Roja Mallorquina, 80 de la raza Menorquina, 100 de la Mallorquina y 80 de la Ibicenca. Se estudia la estructura de las razas ovinas objeto del presente estudio mediante un algoritmo bayesiano del programa de análisis STRUCTURE v2.1 (Pritchard et al., 2000). Se calcula la Probabilidad de Identidad de los marcadores para las cuatro poblaciones con el programa API-CALC (Ayres and Overall, 2004) y su capacidad de discriminación. Finalmente, se realiza una asignación probabilística de individuos a poblaciones mediante los programas informáticos STRUCTURE v2.1 y GENECLASS2, partiendo de una base de datos en la que están incluidas otras poblaciones ovinas de referencia (Merino, Churra, Segureño, etc.) Con los resultados obtenidos se diseña un panel mínimo de microsatélites en función de su Probabilidad de Identidad y de Discriminación.

6.2- Resultados La selección de un panel específico para cada raza se puede realizar de una forma teórica tratando de seleccionar, en cada caso, el panel con el que se obtendría una probabilidad de discriminación máxima (alrededor de 1012). Pero esto no sería práctico para un trabajo rutinario de laboratorio pues supone trabajar con un número elevado de marcadores y de paneles diferentes según la población con la que se esté trabajando en cada momento, lo que encarece el proceso. Lo deseable sería diseñar un panel válido para todas las razas ovinas españolas, entre las que se incluirían las cuatro razas objeto de este informe. Desde hace unos años, se vienen realizando en nuestro laboratorio controles de filiación sistemáticos en razas ovinas y se han diseñado paneles de microsatélites para ello tanto en el ovino Segureño como en Ovinos precoces (Martínez et al., 2008; Martínez et al., 2007). Si probamos la eficacia de estos paneles para realizar pruebas de asignación individual, se

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible obtienen los resultados de la tabla 4. Como puede observarse, con estos marcadores se obtiene un poder de discriminación del orden 1014, valor muy superior al exigido en poblaciones animales (109). Con este panel de microsatélites se podría discriminar un individuo entre 100 billones. En la tabla 3 se recogen los valores de probabilidad de identidad (PI), es decir, la probabilidad de encontrar dos individuos iguales, y de discriminación de cada uno de los marcadores. La PI acumulada es la probabilidad de identidad que se obtiene al ir añadiendo marcadores y la probabilidad de discriminación es la inversa de la probabilidad de identidad de cada marcador.

Tabla 4.- Microsatélites seleccionados para las razas ovinas Mallorquina, Roja Mallorquina, Menorquina e Ibiocenca. Probabilidad de Identidad esperada, acumulada, Probabilidad de Discriminación (1/PI) por marcador y acumulada.

Para realizar los estudios de asignación se recurre de nuevo a la base de datos del Laboratorio de Genética Molecular del grupo de Investigación AGR-218 de la Universidad de Córdoba en la que están incluidas siete razas ovinas españolas, además de las cuatro razas objeto de este informe. Utilizando el algoritmo propuesto por Rannala & Mountain (Rannala and Mountain, 1997) mediante el programa Geneclass2, se han obtenido los resultados presentados en la Tabla 5. Con este programa se obtiene el nivel de confianza o probabilidad con la que se asigna cada uno de los individuos a su población de referencia. Por regla estadística general, con valores menores a 0,05 se rechaza la asignación a una determinada población.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible El porcentaje de individuos de la oveja Roja Mallorquina que se asignan correctamente es del 100%, de la Menorquina el 82%, de la Mallorquina el 98% y de la Ibicenca el 92,5%.

Tabla 5.- Porcentaje de individuos de cada raza asignados correctamente a su propia raza.

Se ha realizado otro análisis de asignación de los individuos a su población con el programa Structure v2.1 (Pritchard et al., 2000). Se ha utilizado un algoritmo bayesiano del programa que calcula la distribución a posteriori de cada coeficiente de mezcla de cada individuo (q). La media de esta distribución representa una estimación de la proporción que el genoma de un individuo tiene de las poblaciones parentales. Con este programa se hace un análisis de agrupamiento de los individuos estudiados en un diferente número de clusters (K) que representarían el número de poblaciones asumidas utilizando un modelo de mezcla en el cual cada individuo podría contener en su genoma porcentajes variables de las poblaciones ancestrales de las que proviene. En la figura 2 se presenta gráficamente la asignación utilizando el algoritmo de Pritchad y colaboradores (2000) con el programa informático Structure v2.1. Se ha realizado con 100000 iteraciones de Burn-in y con numero de iteraciones de Cadenas de Markov de Monte Carlo (MCMC) de 500000, con un modelo combinado y suponiendo frecuencias alélicas correlacionadas entre poblaciones. Cada individuo se muestra en una barra vertical y cada color representa la proporción del cluster correspondiente (raza en este caso) en forma proporcional.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Figura 3.- Representación gràfica de los resultados del anàlisis de la estructura genética de 11 poblaciones ovinas españolas.

Los mismos resultados de la Figura 3 se presentan en forma numérica en la Tabla 6. Se indica la proporción de cada raza asignada a cada cluster, coincidiendo en este caso el número de clusters con el número de poblaciones reales incluidas en el análisis. El 85,8% de los individuos de la Roja Mallorquina se agrupan en el mismo cluster, el 71,6% de los animales de la raza Menorquina lo hacen en otro cluster, el 83,8% de los de la raza Mallorquina y el 78,3% de los animales de la raza Ibicenca se agrupan juntos. Como en el caso anterior, el porcentaje de individuos que se asignan correctamente a su raza más bajo es en el caso de la raza Menorquina seguido del de la raza Ibicenca.

Tabla 6.- Porcentaje de individuos de cada raza asignados a cada cluster.

Los resultados obtenidos han demostrado que las cuatro poblaciones ovinas estudiadas presentan una elevada homogeneidad genética y que se diferencian claramente entre ellas,

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible facilitando este hecho las asignaciones de individuos a poblaciones con altos valores de probabilidad. Esta metodología se está utilizando ya en nuestro laboratorio para asignar animales a razas ovinas de Baleares, sobre todo de animales que, aunque morfológicamente podrían pertenecer a la raza ovina Ibicenca o Menorquina por ejemplo, se tienen dudas acerca de su ascendencia genética o se desea saber si se trata de animales puros o cruzados.

Figura 3.- Representación gràfica de los resultados del anàlisis de la estructura genética de las razas ovinas Roja Mallorquina. Menorquina, Mallorquina e Ibicenca.

Tabla 7.- Porcentaje de individuos de cada raza asignados a cada cluster.

En este caso, el porcentaje de individuos asignado menor corresponde a la raza Ibicenca, en la que un 15,6 de los individuos no se asignan a su raza. Estos animales ya fueron identificados en años anteriores como animales que habían sufrido algún tipo de cruzamiento, pero se han dejado en la población de referencia como animales control. Aunque pudiera parecer que estos animales incorrectamente asignados de la raza Ibicenca pertenecen a la raza Mallorquina, cuando se usan todas las razas ovinas (figura 2) se observa que esto no es así. En las tablas 8,9,10 y 11 pueden observarse algunos ejemplos de las probabilidades de asignación de individuos a cada una de las razas ovinas de Baleares. En función de la probabilidad de asignación individual podrá determinarse si un animal es puro o cruzado o si pertenece o no a una raza en concreto. Esta metodología sirve también para saber si un producto derivado de estos animales

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible (por ejemplo, carne) pertenece a animales de una raza determinada o no, es decir puede servir para detectar fraudes en productos de calidad protegidos por una denominación de origen o una indicación geográfica protegida por ejemplo. De hecho, esta metodología se ha empleado ya en la certificación genética de jamones de cerdo Ibérico (García et al., 2006).

El número de marcadores es determinante en la precisión de la asignación; se obtienen resultados satisfactorios cuando se utilizan 14 marcadores y la diferenciación entre las razas es superior a Fst > 0,06 (Cañón et al., 2001; Ibeagha-Awemu and Erhardt, 2005a). En el caso que nos ocupa, se utilizan 12 marcadores con un elevado poder de discriminación y el Fst entre las cuatro poblaciones es 0,079, con lo que puede concluirse que los análisis de asignación han resultado satisfactorios.

Los resultados obtenidos han demostrado que las cuatro poblaciones ovinas estudiadas presentan una elevada homogeneidad genética y que se diferencian claramente entre ellas, facilitando este hecho las asignaciones de individuos a poblaciones con altos valores de probabilidad. Esta metodología se está utilizando ya en nuestro laboratorio para asignar animales a razas ovinas de Baleares, sobre todo de animales que, aunque morfológicamente podrían pertenecer a la raza ovina Ibicenca o Menorquina por ejemplo, se tienen dudas acerca de su ascendencia genética o se desea saber si se trata de animales puros o cruzados.

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Tabla 8.-Resultados de anàlisis de Asignación Individual de la raza Roja Mallorquina, Individuo y valores de probabilidad de asignación a los clusters 1,2,3 y 4.

Tabla 9.- Resultados de anàlisis de Asignación Individual de la raza Roja Mallorquina, Individuo y valores de probabilidad de asignación a los clusters 1,2,3 y 4.

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Tabla 10.- Resultados de anàlisis de Asignación Individual de la raza Roja Mallorquina, Individuo y valores de probabilidad de asignación a los clusters 1,2,3 y 4.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Tabla 11.- .- Resultados de anàlisis de Asignación Individual de la raza Roja Mallorquina, Individuo y valores de probabilidad de asignación a los clusters 1,2,3 y 4.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Anexo 1.- Animales de la raza Roja Mallorquina analizados, sexo y ganaderia.

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Máster en Zootecnia y gestión sostenible Anexo 1.- Animales de la raza Roja Mallorquina analizados, sexo y ganaderia .

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