“Control inmunológico de Rhipicephalus (Boophilus) microplus: Desarrollo de una vacuna para su aplicación en Uruguay”

Uruguayito Benavides Prof. Adj. de Inmunología Departamento de Ciencias Microbiológicas Facultad de Veterinaria Universidad de la Republica

Porque pensamos en el Control Inmunológico VACUNAS ?

Uso de Acaricidas tiene algunos inconvenientes: a) desarrollan resistencia. b) aumentan las pérdidas económicas. c) crean residuos químicos en los animales y el ambiente. d) arriesgan la salud pública. (Willadsen et. al. 2006; Nari A. 1995; Redondo et. al, 1999; Willadsen et. al. 1999; Willadsen et .al. 2006; De La Fuente et . Al. 2000 and Kocan et. al. 2006,)

• La aplicación de un Control Integrado (CI) usando otras tecnologías basadas en el control inmunológico, genético y biológico es necesario. (Willadsen et. al. 2006; Nari A.et. al. 1995, Redondo et. al. 1999).

Control Inmunológico Pensar en una vacuna comercial disponible. Identificar nuevos antigenos de B. microplus que induzcan inmunidad protectiva en los bovinos cuando se los incluya en una vacuna. ( Willadsen et. al. 1999, Willadsen et. al. 2006, De La Fuente J. et. al. 2000, de La Fuente and Kocan, 2006,).

Antígenos de B. microplus Ocultos: Células intestinales: (Bm86). Glándulas salivales: Hq05. Antígeno de embriogénesis: VTDCE = (Vitelin-Degrading Cysteine Endopeptidase

Expuestos: Foto tomada de la presentación de: Dr. Peter Willadsen CSIRO Livestock Industries Queensland Biosciences Precinct Brisbane- Australia

Antígenos de la saliva. Antígeno liberador de histamina HRF entre otros.

Nuttall PA et. Al. Parasite Immunology, 2006, 28: 155–163

Antígenos • Antígenos ocultos: Son aquellos que no inducen una respuesta del sistema inmune por infestacion natural.

• Inmunidad es de corta duración. • El parásito no evade la respuesta inmunologica por presión evolutiva sobre el sistema inmune del huésped. Nuttall PA et. Al. Parasite Immunology, 2006, 28: 155–163

Antígenos • Antígenos expuestos:Inducen respuesta del sistema inmune adaptativo en animales infestados. • Inmunidad de larga duración • El parásito evoluciona y evade los mecanismos efectores del sistema inmune del hospedero.

Nuttall PA et. Al. Parasite Immunology, 2006, 28: 155–163

Origen de las vacunas comerciales (Bm86) • Las mismas se diseñaron en base a una proteina presente en el epitelio intestinal de la garrapata, denominada luego Bm86 (antígeno oculto)

•L. A. Jackson & J. P. Opdebeeck; Immunology (1989); 68: 272-276

Componentes del sistema inmune que entran dentro de la garrapata cuando la garrapata se alimenta

Componentes: Linfocitos. Anticuerpos. Proteínas del complemento.

Mecanismo de acción: Acción conjunta de las proteínas del complemento y de los anticuerpos dañarían los organos de la garrapata.

Anticuerpos de los bovinos llegan a la hemolinfa de la garrapata con la alimentación. 20 18

15.88 ± 1.73

16 14

[ ] Ig mg/ml

12 10 8 6 4 2

0.21 ± 0.05

0.44 ± 0.11

Hemolymph A

Hemolymph B

0 Serum

Itabajara da Silva Vaz Jr. et al. / Veterinary Parasitology 62 (1996) 155-160

Primeros experimentos: vacunación con membrana intestinal – Antígeno nativo L. A. Jackson & J. P. Opdebeeck, Department of Parasitology, University of Queensland, St Lucia, Queensland, Australia

•L. A. Jackson & J. P. Opdebeeck; Immunology (1989); 68: 272-276

Vacunación con antigeno nativos Niveles de anticuerpos 7 dias post-vacunacion

L. A. Jackson & J. P. Opdebeeck; Immunology (1989); 68: 272-276

Clonaron Bm86 y produjeron una proteína recombinante de 599 aminoácidos con betagalactosidasa expresada en E. coli como cuerpos de inclusión. Posteriormente inmunizaron con los cuerpos de inclusion y los efectos sobre las garrapatas fueron contundentes.

Mecanismos efectores protectores de los anticuerpos específicos desarrollado en los animales mediante el antígeno “oculto” Bm86. • a) Interfieren en la endocitosis de los alimentos e inhiben rápidamente la digestión. • b) Activan el complemento sobre la membrana de las células epiteliales produciendo la lisis de la misma (Gough et. al, 1993). • Una vez dañada la pared intestinal, los anticuerpos como otras moléculas efectoras del sistema inmune (SI), los neutrófilos y otras células del SI invaden el hemocele atacando músculos y túbulos de Malpighi.

Del intestino crudo (Ag. nativo) al Bm86 recombinante (Bm86-r) • Existen en el mundo dos vacunas recombinantes comerciales: • 1) Cubana (GavacTM) (Rodriguez et al., 1995) • 2) Australiana (TickGARDTM) (Willadsen et al., 1995).

Efecto de TickGARD (vacuna australiana) Vacunados/no vacunados: • •

Vacunados: 16 Septiembre, 14 Octubre, y 22 Diciembre 1997.

•

Ganado lechero.

•

56% reducción en el número de garrapatas en vacunados.

•

72% en la reducción de la capacidad reproductive de la garrapata.

•

Ganancia de peso en 27 semanas fué de 18.6 Kg mayor en los vacunados comparados con el grupo control no vacunado. Jonsson et al 1999.

Efecto de TickGARD (vacuna australiana)

Vacunados/no vacunados: • • • • • •

Vacunados: 16 Septiembre, 14 Octubre, y 22 Diciembre 1997. Animales fueron expuestos a garrapatas previamente. 56% reducción en el número de garrapatas en vacunados. 72% en la reducción de la capacidad reproductive de la garrapata. Ganancia de peso en 27 semanas fué de 18.6 Kg mayor en los vacunados comparados con el grupo control no vacunado.

Jonsson et al 1999.

• TickGARD (Bm86) vacuna australiana

• Luego de 12 años de investigación y ensayos de campo usando Bm86, la vacuna fué lanzada al comercio.

Se utilizaron 2 rodeos: 1- 116 animales 2) 98 animales El de 98 animales se dejaron como controles no vacunas. Se evaluó el efecto de la vacuna sobre las garrapatas y sobre la reinfcción En 33 semana.

Primeros Ensayos con Gavac TM, Bm86-r

Peso de las garrapatas

Respuesta Inmune

Peso de huevos

M. Rodriguez et al. / Veterinary Parasitology 57 (1995) 339-349

Diseño Experimental: Un total of 588,573 animales distribuidos a lo largo de 14 provinces de Cuba fueron incluidos en el programa de control integrado con GavacTM. Organophosphorate (Esteladon, CIBA–Geigy, Switzerland), Amidine (Bobitraz,Bayer, Germany) or Pyrethroid (Bayticol, Bayer, Germany). Fueron tratados cuando los animals presentaban más de 10 garrapatas. Vacunados con GAVAC: semana 1,4 y 7 y boster cada 6 meses. 9 años de experimento.

Disminución del número de tratamiento con y sin vacunación

Reducción del consumo de acaricidas por el uso del Programa Nacional de Control Integrado con Gavac TM, partir de 1995

.

Rodriguez Valle M. et. Al ( 2004). Experimental and Applied Acarology 34: 375–382, 2004.

Respuesta inmune inducida por la vacuna Gavac TM

Rodriguez Valle M. et. Al ( 2004). Experimental and Applied Acarology 34: 375–382, 2004.

Morbilidad (a) y mortlidad (b) debido a babesiosis antes y después de aplicar vacunas

Triángulos representa áreas con vacunación. Cuadrados representa tratamiento con acaricidas sin vacunación.. Rodriguez Valle M. et. Al ( 2004). Experimental and Applied Acarology 34: 375–382, 2004.

• La reducción del número de tratamiento con acaricidas fué del 87% por un período de 8 años (1995–2003) que duraron los estudios. • La incidencia de babesiosis se redujo de 54 casos por 1000 a • 1.9 casos por 1000.

• TickGARD (Bm86) en Australia • Bloquea la transmisión de Babesia bigémina y reduce la transmisión de Babesia bovis transmitida por Boophilus annulatus: (Pipano et al.,2003) • Gavac TM en Cuba • Reduce la incidencia de la anaplasmosis y babesiosis: (Garcia Garcia et al., 1998).

Bm95: El Bm86 protector de las garraptas resistentes – Algunas poblaciones de garrapatas de Argentina mostrron una muy baja susceptibilidad a la vacunación por Bm86. – De esas poblaciones resistente de garrapatas se aisló el gen Bm86 al cual se le denominó Bm95 y se produjo la proteina recombinante Bm95-r en Pitchia pastoris. – La vacunación con Bm95 fué eficiente contra todas las poblaciones de garrapatas, las susceptibles y las resistentes a la vacunación con la Bm86. – Se postula a Bm95 como un antígenos universal que protegería contra la infestación por cualquier población de B. microplus en diferentes localidades geográficas.

García- Garecía et. al. Vaccine. 2000 Apr 28;18(21):2275-87

PEPTIDO SINTETICO SBm7462 potencial ANTIGENO

Peconick AP, Sossai S, Girão FA, Rodrigues MQ, Souza E Silva CH, Guzman Q F, Patarroyo V AM, Vargas MI, Patarroyo JH. Laboratório de Biologia e Controle de Hematozoários e Vetores, DVT, Instituto de Biotecnologia Aplicada A AgropecuáriaBIOAGRO, Universidade Federal de Viçosa-BIOAGRO, Campus Universitario, 36570-000 Viçosa, MG, Brazil.

Vacuna sintetica usando un epitope sintetico de Bm86 conservado en diferentes cepas (poblaciones) de Brazil, Argentina, Colombia y Uruguay, denominado SBm7462. Esto evitaria la falla de la eficacia de la vacuna por el polimorfismo del gen Bm86

Exp Parasitol. 2008 May;119(1):37-43.

– A ten-year review of commercial vaccine performance for control of tick infestations on cattle. –

de la Fuente J, Almazán C, Canales M, Pérez de la Lastra JM, Kocan KM, Willadsen P.

–

Center for Veterinary Health Sciences, Department of Veterinary Pathobiology, Oklahoma State University, Stillwater, OK 74078-2007, USA. [email protected]

– BUENA HERRAMIENTA DE CONTROL – El desarrollo de nuevas vacunas dependerán del desarrollo y eficiencia de la tecnología molecular para descubrir nuevos antígenos para aumentar la eficacia de las vacunas sobre todo pensando en aquellos lugares dónde hay una alta resistencia a los acaricidas. Anim Health Res Rev. 2007 Jun;8(1):23-8.

– Antigen cocktails: valid hypothesis or unsubstantiated hope? – Willadsen P. –

CSIRO Livestock Industries, Queensland Bioscience Precinct, 306 Carmody Road, St. Lucia, Queensland 4067, Australia. [email protected] [email protected]

A mas de 3 decadas en el desarrollo de vacunas contra garrapatas no se ha encontrado una vacuna totalmente eficaz contra B. microplus, a pesar que se han identificaco y obtenido un gran numero de antigenos. “Cocteles multiantigenos” deberian ser usados en el futuro para obtener una vacuna mas eficaz.

Trends Parasitol. 2008 Apr;24(4):164-7.

VACUNAS NO SUPRIMEN EL USO DE ACARICIDAS Parizi LF, Pohl PC, Masuda A, Vaz Junior Ida S. Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS Av. Bento Gonçalves 9.500, Prédio 43421, CEP 91501-970 Porto Alegre - RS, Brazil. [email protected].

LOS ANTIGENOS DESCRIPTOS HASTA EL MOMENTO NO INDUCEN LA NECESARIA PROTECCION POR SI SOLO PARA SUPRIMIR EL USO DE LOS ACARICIDAS. ES NECESARIO BUSCAR OTRAS MOLECULAS ANTIGENICAMENTE CAPACES DE INDUCIR UNA BUENA INMUNIDAD PROTECTIVA Y BUSCAR LOS MEJORES ADYUVANTES. Rev Bras Parasitol Vet. 2009 Jan-Mar;18(1):1-7.

Vacunas comerciales (Bm86) • Existen en el mundo dos vacunas recombinantes comerciales que tienen como inmunógeno a Bm86 y que están siendo incluidas en los planes de control integrado de B. micoplus, en Cuba (GavacTM) (Rodriguez et al., 1995) y en Australia (TickGARDTM) (Willadsen et al., 1995).

• En Uruguay, no mostraron niveles aceptables de protección, por lo cual no contamos con vacunas aplicables al control de la garrapata en nuestro país. (resultados no publicados DILAVE-MGAP).

Porqué falla la vacuna comercial ? • Estudios comparando las secuencias del locus Bm86 de B. microplus de cepas de garrapatas de Australia, comparada con cepas de Mexico, Cuba, Argentina y Venezuela se observó una variación mutación del locus, Garcia-Garcia et al (1999)

Porqué falla la vacuna comercial ? • El análisis del locus Bm86 de 30 cepas de Boophilus microplus de varias regions geográficas de Brasil, Argentina, Uruguay, Venezuela y Colombia fueron analizados.

• Los resultados mostraron que: • Variaciones de 1.76 to 3.65% en la secuencia genómica del locus de Bm86, producían una variación de 3.4– 6.08% en la secuencia de aminoácidos para la proteína intestinal Bm86.

Porqué falla la vacuna comercial ? • Varios autores coinciden que las mutaciones del locus Bm86 y por ende el polimorfismo que presenta es debido a las variaciones geográficas, (García-García et al. 1990, 2000; Baxter and Barker 1998; Hernandez et al. 1998, 2000; Passos et al. 1999; De La Fuente et al. 2000; Guerrero et al. 2001).

Vacunas comerciales • Por otra parte no existen en el mundo otras vacunas comerciales que estén disponibles. • Están en una etapa de experimentación inicial de búsqueda de antígenos que desarrollen una buena inmunidad protectora y/o siendo probadas.

• La identificacion y desarrollo de buenos antígenos protectores nativos y su recombinante es la primera limitación en la búsqueda de nuevas vacunas. (Willadsen, P, 1997, Nuttall et al, 2006).

• Por lo tanto, podemos decir que si queremos aplicar en nuestro país la vacunacion en un Programa de Control Integrado contra B. microplus, tenemos un importante problema que resolver: • • Buscar los antigenos apropiados para nuestras poblaciones de garrapatas y nuevas moléculas antigénicamente activas que puedan ser usadas solas o incluidas en “cocteles antigenicos”.

Experiencia en Uruguay • Usamos dos antígenos: • 1) Antígeno oculto. • 2) Antígeno salival.

: Diseño Experimental del Ensayo de vacunación usando Bm86uy-r y Bm05-r

Antígeno oculto 100 ug por dosis Antígeno secretado 200 ug por dosis

Resultados: Eficacia de la vacuna Coeficiente de reducción de la repleción (CRT). CRT = Peso promedio de las teleóginas en el grupo vacunado Peso promedio de las teleóginas en el grupo control • Coeficiente de reducción de la oviposición (CRO). CRO = Peso promedio del aove de las teleóginas en el grupo vacunado Peso promedio del aove de las teleóginas en el grupo control Coeficiente de reducción de la eclosión (CRE). CRE = Porcentaje de eclosión del aove en el grupo vacunado Porcentaje de eclosión del aove en el grupo control

Cálculo de Eficacia Global Se aplica la fórmula: %Eficacia = 100 (1-CRTxCROxCRE)

CRT CRO CRE % DE EFICACIA VACUNA

0,211678832 0,811921891 0,41025641 DE

LA

92,94905938

Resultados: Disminución del número de garrapatas

NÚMERO DE GARRAPATAS

800 700

CONTROLES VACUNADOS

600 500 400 300 200 100

0 -100

0 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

DIAS

• Esta vacuna está siendo patentada en éste momento en Brasil y Uruguay.

DISEÑO 2- EXPERIMENTAL AGO

SET

OCT

NOV

DIC

ENE

FEB

MAR

VAC 3 dosis (original)

PICO DE INFEST.

SANGRADO

SANGRADO

CONTEO GARRAPATAS G2

CONTEO GARRAPATAS G3

ABRIL

MAY