CRECIMIENTO IN VITRO Y CAPACIDAD MICORRÍCICA DE VARIOS AISLAMIENTOS DE LACTARIUS DELICIOSUS Mesa 2 ANTONIO DAZA (1); JOSÉ LUÍS MANJÓN (2); AGUSTINA AGUILAR (1); MARIETA BERNEDO (2); MARÍA CAMACHO (1); LUIS ROMERO DE LA OSA (3); CARMEN SANTAMARÍA (1). (1) CIFA “Las Torres y Tomejil”, Apartado Oficial, 41200 Alcalá del Río, Sevilla, Spain E-mail: mariac.santamarí[email protected] (2) Dpto. Biología Vegetal, Universidad de Alcalá, 28871 Alcalá de Henares, Madrid, Spain (3) Delegación Provincial de Agricultura, Ofic. Com. Agr., 21200 Aracena, Huelva, Spain Resumen Se han obtenido varios aislamientos en el laboratorio de la especie Lactarius deliciosus (L.: Fr.) a partir de carpóforos recolectados de pinares de Pinus pinaster y Pinus pinea en el suroeste de España. Se han optimizado las condiciones de crecimiento en medios sintéticos de estos aislamientos y de Lactarius deliciosus CECT 2975 (Colección Española de Cultivos Tipo). La maltosa y la sacarosa fueron las fuentes de carbono con las que se obtuvo un mayor diámetro de crecimiento, mientras que las mayores biomasas miceliares se alcanzaron con glucosa y fructosa. El extracto de levadura fue la mejor fuente compleja de nitrógeno, y el amonio fue utilizado más eficientemente que el nitrato. La temperatura y el pH óptimos de crecimiento fueron 24ºC y 5-6, respectivamente. Se ha producido inoculante miceliar de tres cepas en una mezcla sólida de turba, perlita, vermiculita y solución nutritiva y se han obtenido plantas micorrizadas de P. Pinea en condiciones de vivero. Palabras clave: ectomicorriza, cultivo in vitro, inoculante miceliar, Lactarius deliciosus, Pinus spp. Abstract Several isolates were obtained from sporocarps of Lactarius deliciosus (L.: Fr.) associated with Pinus pinaster and Pinus pinea coming from Southwest of Spain. Culture conditions were optimised for these isolates and the strain CECT 2975 (Spanish Type Culture Collection). Maltose and sucrose produced highest patch diameters, whereas glucose and fructose yielded highest mycelium dry weights. Yeast extract resulted the best complex nitrogen source, and ammonium was better than nitrate. 24ºC and pH 5-6 were the optimal growth temperature and pH values, respectively. Mycelial inoculant of three isolates produced on a solid mixture of peat + perlite + vermiculite + nutritive solution was inoculated onto P. pinea containerized plants and mycorrhization was obtained. Key words: ectomycorrhiza, in vitro culture, mycelial inoculant, Lactarius deliciosus, Pinus spp.

INTRODUCIÓN En la naturaleza son diversos los factores ecológicos y fisiológicos que afectan al crecimiento y funcionamiento de los hongos micorrícicos (BOWEN, 1994). Las características físicas del suelo y los nutrientes, especialmente las fuentes de carbono y nitrógeno, influyen no sólo en el establecimiento y crecimiento de los hongos ectomicorrícicos en el campo sino también en condiciones controladas en el laboratorio (FRANCE & REID, 1983; LILLESKOV et al., 2002). Durante años se ha estudiado la influencia del nitrógeno (DICKIE et al., 1998; FINLAY et al., 1992; FRANCE & REID, 1984; KELLER, 1996; RANGEL-CASTRO et al., 2002; SARJALA, 1999), y del carbono (FERRY & DASS, 1968; LAMB, 1974; PALMER & HACSKAYLO, 1970) en el crecimiento de los hongos ectomicorrícicos. La influencia de la temperatura (HACSKAYLO et al., 1965; SÁNCHEZ et al., 2001), del pH (HUNG & TRAPPE, 1983) y del estrés hídrico (MACHADO & BRAGANÇA, 1994; MEXAL & REID, 1973) también han sido objeto de estudio. Las especies del género Lactarius presentan una distribución cosmopolita y parece que juegan un importante papel como hongos ectomicorrícicos colonizadores de etapas medias y tardías de Pináceas

especialmente en ecosistemas templados de montaña (MARX, 1969). Además de los beneficios que aportan a los árboles, los carpóforos de algunas especies de Lactarius son muy apreciados por sus propiedades culinarias (BERTAUX, 1962). HUTCHISON (1999) compiló los conocimientos taxonómicos, ecológicos y fisiológicos de este género, siendo considerada Lactarius deliciosus (L.: Fr.) como la especie tipo (HESLER & SMITH, 1979). GUERIN-LAGUETTE et al. (2000, 2003) estudiaron la formación de ectomicorrizas entre L. deliciosus y Pinus sylvestris. Los estudios sobre el crecimiento de L. deliciosus en condiciones controladas son escasos. OORT (1981) estudió el crecimiento in vitro de varias especies de este género, en el que se incluyeron dos cepas L. deliciosus. SÁNCHEZ et al., (2001) estudiaron el efecto del pH, el estrés hídrico y la temperatura sobre el crecimiento de diferentes hongos ectomicorrícicos, incluyendo una cepa de L. deliciosus aislada en el norte de España. En este trabajo hemos estudiado el efecto de diferentes parámetros (fuentes de carbono y nitrógeno, pH y temperatura) sobre el crecimiento de siete aislamientos of L. deliciosus con el objeto de optimizar el crecimiento y determinar las variaciones intraespecíficas. También se incluyen resultados de producción de inoculantes y ensayos de micorrización in vivo.

MATERIALES Y MÉTODOS Aislamiento y condiciones de cultivo Los esporocarpos se recolectaron en las provincias de Huelva y Sevilla, en otoño de 1997 y 1999 (Tabla 1). Los aislamientos miceliares se obtuvieron por siembra de trozos de carpóforos en medio MMN (MARX, 1969) y se mantuvieron viables mediante subcultivos cada 4 meses (MOLINA & PALMER, 1982). Tabla 1. Aislamientos de Lactarius deliciosus obtenidos de esporocarpos recogidos en el suroeste español y utilizados en este trabajo. Cepa

Hospedador

Localización

pH del suelo

Año

Origen

CT1

Pinus pinea

CT2

Pinus pinaster

El Garrobo (Sevilla)

6.25

1997

Este trabajo

Los Marines (Huelva)

5.94

1999

Este trabajo

CT3

Pinus pinaster

Aracena (Huelva)

6.02

1999

Este trabajo

CT4

Pinus pinaster

Aracena (Huelva)

5.78

1999

Este trabajo

CT5

Pinus pinea

Hinojos (Huelva)

6.32

1999

Este trabajo

CT6

Pinus pinaster

Aracena (Huelva)

6.03

1999

Este trabajo

Holanda

ncb

1961

CECTa

2975

n

cb

a

CECT, Colección Española de Cultivos Tipo; bnc, no citada

El medio de cultivo utilizado para la caracterización de los aislamientos fue una modificación del medio MMN conteniendo glucosa al 2% y 1 g/L de extracto de levadura (medio MMN*). Los parámetros utilizados como medida del crecimiento fueron el peso seco y/o el diámetro del micelio. El estudio de la influencia de la temperatura en el crecimiento de L. deliciosus se realizó por incubación a 20, 24 y 28ºC. Para la determinación del pH óptimo se ajustó el medio MMN* a diferentes pHs (5, 6, 7 y 8) con KOH o ClH antes de su esterilización y se verificó después de la misma. Las fuentes de carbono (20 g/L) ensayadas fueron las siguientes: almidón, malato, glucosa, maltosa, manitol y sacarosa, incluyéndose controles sin fuente de carbono. Se estudió la utilización como fuente de nitrógeno de los siguientes compuestos: Bacto-casamino ácidos, albúmina bovina (Fracción V), extracto de levadura, KNO3, y (NH4)2HPO4 (53 mg N/L); se incluyeron controles sin fuente de nitrógeno. Producción de inoculantes y estudios de micorrización. Los inoculantes fúngicos se obtuvieron en un soporte sólido formado por una mezcla de turba (1

L) + vermiculita (2 L) + perlita (1 L) + medio MMN* líquido, pH 6 (800 mL). Cada frasco Magenta (Magenta Corporation, Chicago, IL) con 200 ml de esta mezcla estéril se inoculó con porciones de micelio procedentes de cultivos en crecimiento activo y se incubaron en oscuridad a 24ºC durante 60 días. Después de la incubación se comprobó la viabilidad del inoculante. Los ensayos de micorrización se realizaron en plantas de P. pinea. Las semillas desinfectadas se sembraron y germinaron en bandejas con 100 alvéolos (20mL por alvéolo) con una mezcla estéril de turba y vermiculita (88:12 v/v). A los 75 días de la siembra las plantas se transplantaron a bandejas con 50 alvéolos (100 mL por alvéolo), y se inocularon con 10 mL del inoculante. Cada cepa se inoculó en 200 plantas. A los 5 meses se recogieron 50 plantas por tratamiento y se evaluó el grado de micorrización observando, bajo microscopio estereoscópico, 150 ápices radicales por planta. Los datos se expresan como porcentaje de ápices radicales micorrizados (PARLADÉ et al., 1996). Análisis estadísticos Los análisis estadísticos se hicieron utilizando el programa Statistix (versión 1.0, NH Analytical Software, USA). Para el análisis de los datos experimentales se utilizó el análisis de la varianza. Si el test fue significativo (expresado al nivel P