ESTUDIO IN VITRO Valoración de la Calidad de la Adhesión Celular y la Osteogénesis de la Superfície de Titanio de los Implantes Proclinic Ref: IMP-ELM-2015-01 implantes dentales

Índice Index Objetivo / Purpose

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Materiales y Metodología Experimental / Experimental Materials and Methodology

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Recepción de muestras / Receipt of samples

Caracterización físico-química / Physico-chemical characterisation Rugosidad superficial / Surface roughness Microscopia de barrido (SEM) / Electron microscopy (SEM) Ángulo de contacto / Angle of contact Análisis espectroscopia foto-electrónica de rayos X (XPS) / X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis

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Caracterización biológica / Biological characterisation Determinación de la adhesión celular / Determination of cell adhesion Determinación de la proliferación celular / Determination of cell proliferation Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM) / Preparation of samples for electron microscopy (SEM) Determinación de la diferenciación celular / Determination of cell differentiation

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Resultados experimentales / Experiment Results

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Caracterización fisico-química / Physico-chemical characterisation Rugosidad superficial / Surface roughness

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Microscopia de barrido (SEM) / Electron microscopy (SEM) Ángulo de contacto / Angle of contact Análisis mediante espectroscopia foto-electrónica de rayos X / X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis

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9 9 10 10

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Caracterización biológica / Biological characterisation Determinación de la adhesión celular / Determination of cell adhesion Determinación de la proliferación celular / Determination of cell proliferation Determinación de la diferenciación celular / Determination of cell differentiation Determinación de la diferenciación celular / Determination of cell differentiation

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Conclusiones / Conclusions

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Objetivo Purpose El objetivo de este informe es la caracterización superficial y la evaluación de la respuesta biológica in vitro de muestras de titanio mecanizadas y sobre las que se ha realizado un tratamiento superficial consistente en un granallado seguido de una doble pasivado ácido. Estas muestras han sido proporcionadas por la empresa Proclinic. Con este fin se ha realizado, en primer lugar, una caracterización superficial de las muestras, para conocer su morfología, composición e hidrofilicidad. En una segunda etapa del estudio se ha evaluado la respuesta biológica In vitro de las muestras con células óseas (osteoblastos).

Dirección de la investigación Research management Dra. Montse Mercadé Dr. Lluís Giner Investigador principal Primary researcher Dra. Montse Mercadé

The aim of this report is the surface characterisation and evaluation of the in vitro biological response of machined titanium samples upon which a surface treatment was performed consisting of shot blasting followed by double acid passivation. These samples have been provided by the Proclinic Company. In the first step of the study a surface characterisation was performed to know its morphology, composition and hydrophilicity. The in vitro biological response of the samples with bone cells (osteoblasts) was evaluated in the second step of the study.

Lugar del estudio Study location Universitat Internacional de Catalunya Facultad de Odontología / Faculty of Dentistry C/ Josep Trueta, s/n 08195 Sant Cugat del Vallés Barcelona

Colaboradores Contributors Dr. Francesc Xavier Gil Dr. Miquel Punset Sr. Sergi Torrent Grupo de investigación BIBITE (UPC) Coordinación Coordination Julia Gª-Valdecasas ([email protected])

implantes dentales 3

Materiales y Metodología Experimental Experimental Materials and Methodology Recepción de muestras

Receipt Of Samples

Se han recibido un total de 1000 muestras (en forma de discos de titanio) procedentes de la empresa Proclinic, que estaban divididas en dos grupos distintos: 500 muestras en estado de mecanización, que han sido utilizadas en este estudio como muestras control, junto con otro segundo lote de 500 muestras mecanizadas y posteriormente texturizadas mediante un tratamiento superficial con el fin de aumentar la osteointegración. Según la información proporcionada por el propio fabricante, el tratamiento superficial realizado sobre las muestras consta de una primera etapa de granallado seguido de un doble pasivado ácido, cuya finalidad ha sido la de aumentar el área y la rugosidad superficiales. Todas las muestras han sido recibidas en el interior de sobres individuales de esterilización (Figura 2-1), que según nuestra información ha consistido en una exposición controlada a rayos gamma. Las muestras han sido mantenidas en el interior de los sobres de esterilización hasta el momento de la medida, con el fin de preservar el estado de limpieza y esterilización en la mayor medida posible. Asimismo, para los ensayos in vitro se han mantenido las muestras en el envase hasta la siembra de células, para evitar contaminaciones o alteración de resultados.

A total of 1000 samples were received (in the form of titanium disks) from Proclinic, which were divided into two distinct groups: 500 samples in machined state, which were used as the control samples, together with a second lot of 500 machined samples that were later texturized by a surface treatment in order to increase osteointegration. According to information provided by the manufacturer, the surface treatment performed on the samples consisted of a primary shot blasting stage followed by double acid passivation, which was intended to increase the surface area and roughness. All the samples were received in individual sterilised envelopes (Figure 2-1), which according to our information consisted of controlled exposure to gamma rays. The samples were kept inside the sterilised envelopes until the time of their measurement in order to keep them as clean and sterilised as possible. In addition, the in vitro samples were kept in the container until the seeding of the cells in order to avoid contamination or alteration of the results.

Figura 2-1. Muestras recibidas (Derecha: muestras tratadas. Izquierda: muestras mecanizadas) Figure 2-1 Samples received (Right: treated samples. Left: machined samples)

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Caracterización Físico-Química

Physico-Chemical Characterisation

Rugosidad superficial

Surface roughness

La evaluación y determinación del grado de rugosidad superficial ha sido efectuada mediante la utilización de un equipo de intereferometría de luz blanca (Optical Profiling System, Wyko NT9300, Veeco Instruments, EEUU). El análisis de datos se ha llevado a cabo mediante la utilización de un software modelo “Wyko Vision 232TM (Veeco)”. Las imágenes realizadas necesitaron correcciones a través de filtros de fase del tipo Gaussiano, con el fin de permitir la corrección de la inclinación intrínseca de las muestras respecto de la rugosidad de la superficie. Las variables recogidas en todas las medidas se resumen a continuación (Tabla 2-1):

The evaluation and determination of the degree of surface roughness was performed through the use of a white light interpherometric tool (Optical Profiling System, Wyko NT9300, Veeco Instruments, USA). The data were analysed by using the “Wyko Vision 232TM (Veeco)” software model. The images taken required corrections through Gaussian type phase filters in order to allow for correcting of the intrinsic inclination of the samples in relation to the surface roughness. The variables collected in all the measurements are summarised below (Table 2-1):

Parámetros / Parameters

Descripción / Description El parámetro (Sa) representa el valor de rugosidad media del recubrimiento, que es el área comprendida entre el perfil de la rugosidad, formado por los diferentes desniveles y la línea media de este perfil, en función de la superficie medida. El parámetro (Ra) indica exactamente lo mismo que el parámetro (Sa), aunque se trata de un valor únicamente de altura.

Sa o Ra (Media aritmética de la desviación de la superficie) (Arithmetic mean of the surface deviation)

The (Sa) parameter represents the value of mean roughness of the coating. This is the area divided by the roughness profile, which is made up of the different levels of unevenness, and the midline of this profile, as a function of the surface area measured. The (Ra) parameter indicates exactly the same as the (Sa) parameter, although it only refers to height.

Se calcula a través de la desviación estándar de las distancias del plano medio al perfil de la muestra. Este parámetro es más sensible que Ra a los valores extremos debido a la operación de raíz cuadrada. Tiene un carácter estadístico.

Sq o Rq (Media aritmética de la desviación de la superficie) (Root mean squared of the surface deviations)

Rz (Media aritmética de la desviación de la superficie)

Índice entre superficies (S área Index) Index between surfaces (S area index)

Is calculated by standard deviation of the distances of the median plane in the sample profile. This parameter is more sensitive than Ra at extreme values due to the use of the square root. It is of a statistical nature.

Es la diferencia entre la media de los cinco puntos más altos y la media de los cinco puntos más profundos. Is the difference between the average of the five highest and five lowest points. Es la relación entre el área real y nominal e indica el grado de homogeneidad o planitud de la superficie. Is the ratio between the real area and the nominal area and indicates the surface’s degree of homogeneity or flatness.

Tabla 2-1. Variables topográficas descriptivas estudiadas. Table 2-1. Descriptive topographic variables studied.

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En las imágenes presentes en la (Figura 2-2) puede observarse el equipo de interferometría óptica utilizado para la evaluación superficial de los componentes analizados en este estudio.

Figure 2-2 shows the optical interpherometric microscope used for the surface evaluation of the components analysed in this study.

Electron microscopy (SEM)

Figura 2-2. Interferómetro de luz blanca (Optical Profiling System).

The analysis and characterisation of the surface marking was performed with an electron microscope, specifically using a Zeiss (Germany) Neon40 model surface scanning electron focused ion beam (FIB-SEM) microscope, as can be seen in Figure 2-3. Different images were taken at different magnifications and in different areas of the surface in order to clearly detect possible defects as well as the topography. The composition of the elements detected using energy dispersive x-ray fluorescence (EDX) techniques, which incorporates SEM, was also analysed.

Figure 2-2. White light interpherometric microscope (Optical Profiling System).

Microscopía de barrido (SEM) El análisis y la caracterización del marcaje superficial se ha efectuado mediante la utilización de microscopía electrónica de barrido, más concretamente mediante la utilización de un microscopio Surface Scanning Electron Focused Ion Beam (FIB-SEM) modelo Neon40 de la marca Zeiss (Alemania), tal y como puede observarse en la imagen de la (Figura 2-3). Se han tomado imágenes a diferentes aumentos y en diferentes zonas de la superficie, para poder detectar con claridad los posibles defectos y la topografia. También se ha analizado la composición de los elementos detectados mediante la técnica de fluorescencia de rayos X por energía dispersiva (EDX), la cual incorpora el SEM.

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Figura 2-3. Microscopio electrónico de barrido FIB-SEM modelo “Neon40, Zeiss”. Figure 2-3. Zeiss model “Neon40,” FIB-SEM electron microscope.

Ángulo de contacto

Angle of Contact

La técnica denominada como “El ángulo de Contacto (AC)” es una técnica utilizada para determinar la mojabilidad de los materiales y, como su nombre indica consiste en la determinación del ángulo que forma una gota de líquido al entrar en contacto con la superficie de un sólido. Este valor depende de la relación que existe entre las fuerzas adhesivas entre el líquido y el sólido y las fuerzas cohesivas del líquido. Cuando las fuerzas adhesivas con la superficie del sólido son mayores que las cohesivas, el ángulo de contacto es menor de 90 grados, por lo que el líquido moja la superficie. La mojabilidad es el proceso por el que una gota de un líquido se extiende sobre la superficie como resultado de la interacción de fuerzas adhesivas, entre líquido y sustrato, y fuerzas cohesivas internas del líquido. Las medidas fueron tomadas con un equipo de medición de AC de la marca DATAPHYSICS modelo OCA 15, el cual consiste en un dispensador de gotas de agua con una cámara para captar la imagen y poder medir el ángulo de contacto, tal y como puede observarse en la (Figura 2-4).

The technique known as “The Angle of Contact (AC)”, is used to determine the wetting capacity of materials and, as its name indicates, consists in determining the angle that a drop of liquid forms on making contact with the surface of a solid. This value depends on the relationship between the adhesive forces between the liquid and the solid and the cohesive force of the liquid. When the solid’s adhesive forces with the surface are greater than the cohesive, the angle of contact is less than 90 degrees, which is why the liquid wets the surface. The wetting capacity is the process by which the drop of liquid spreads over the surface as a result of the interaction of adhesive forces between liquid and solid and the internal cohesive forces of the liquid. The measurements were taken with a DATAPHYSICS model OCA 15AC measuring device, which consists of a water dropper dispenser with a camera to capture the image and measure the angle of contact, as seen in Figure 2-4. The execution parameters were the same for all of the samples: the sessile drop method (letting a drop fall on the surface) and the use of two different kinds of liquid drops: first, a polar liquid (deionised Milli-Q grade water) and a second non-polar liquid (diiodomethane), while always using a constant drop volume of 3μl. In order to obtain a statistically representative result, a total of 10 samples were analysed for each condition studied. The angle of contact can be seen as influenced by the roughness of the material under study, which is why a mathematical expression of “correction” is used called Wenzel’s correction (Figure 2-5).

γ LV

Líquido / Liquid

γ SV

θ

γ SV

Sólido / Solid Figura 2-4. Ángulo de contacto. Figure 2-4. Angle of Contact.

Los parámetros de ejecución fueron los mismos para todas las muestras: método gota “sessile” (dejar caer una gota sobre la superficie) y utilizando gotas de dos líquidos diferentes, un primer líquido polar (agua desionizada grado milie-Q) y un segundo líquido apolar (di-iodemetano), utilizando siempre un volumen de gota constante de 3μl. Con el fin de obtener un resultado estadísticamente representativo se analizaron un total de 10 muestras por cada condición estudiada. El ángulo de contacto puede verse influenciado por la rugosidad del material estudiado, razón por la que se ha utilizado una expresión matemática de “corrección”, denominada como “corrección Wenzel” (Figura 2-5).

Ecuación de Wenzel

cos ACaparente = ri · ACintrinseco Wenzel’s equation

cos ACapparent = ri · ACintrinsic

Figura 2-5. Corrección Wenzel Figure 2-5. Wenzel’s Correction.

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Análisis espectroscopia foto-electrónica de rayos X (XPS)

X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis

La evaluación y determinación de la composición superficial de las muestras se ha llevado a cabo mediante espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS), mediante la utilización de un ánodo XR 50 de Al K α (1466,7 eV) operando a 300 W y 15 kV y un diámetro de haz de 200 μm, (Figura 2-6). El detector XP utilizado fue un Phoibos 150 MCD-9. El ángulo de incidencia del haz utilizado para el estudio fue de 45 o, de modo que el haz de electrones mantuvo una incidencia perpendicular sobre la superficie del flanco, manteniéndose una presión constante de vacío de 5x10-9 torr durante todo el análisis. Con el fin de obtener un valor representativo se han analizado un total de 3 muestras para cada condición estudiada. Se adquirió un espectro general de la composición por encima de 1200 eV con paso de 40 eV y resolución de 1 eV, además de sendos análisis específicos de alta resolución (0,1 eV) para los siguientes elementos: C, Ti, Si, Al, Si y Al con pasos de 20 eV. Adicionalmente se han analizado las zonas de absorción asociadas a otros elementos que se han visto en el espectro. Las energías de enlace, áreas de pico y concentración atómica fueron obtenidos mediante el uso del programa “Prodcut Company” (Sigma Probe, thermo-VG, UK), utilizando como referencia la línea de C 1s a 284,8 eV.

The evaluation and determination of the surface composition of the samples was carried out through X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) using a XR 50 anode with Al Ka α (1466.7 eV) operating at 300 W and 15 kV and beam diameter of 200 μm, (Figure 2-6). The XP detector used was a Phoibos 150 MCD-9. The angle of incidence of the beam used for the study was 45 o, so that the electron beam maintained a perpendicular incidence on flank surface, while keeping constant vacuum pressure of 5x10-9 torr for the entire duration of the analysis. In order to obtain a representative value, a total of 3 samples for each condition studied was analysed. A general spectrum of the composition was obtained of over 1200 eV in increments of 40 eV and resolution of 1 eV, in addition to specific high resolution analysis (0.1 eV) for the following elements: C, Ti, Si, Al, Si and Al in increments of 20 eV. Furthermore, the adsorption areas associated with other elements seen in the spectrum were analysed. The bonding energy, peak and atomic concentration areas were obtained using the “Product Company” (Sigma Probe, thermo-VG, UK) programme, while using the line of C 1s a 284.8 eV as a reference.

Figura 2-6. Equipo de microscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) utilizado. Figure 2-6. X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) analysis used.

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Caracterización biológica

Biological characterisation

La caracterización biológica se ha llevado a cabo mediante ensayos en vivo. Para ello se han utilizado una línea celular procedente de sarcoma primario de origen humano (SAOS-2). Para los experimentos, las células se han reproducido en frascos de poliestireno, cuyo cultivo se ha llevado a cabo mediante la utilización de medio (McCoy’s). Se han mantenido las células durante todos los experimentos a 37°C, con una humedad relativa menor a 95% y una concentración de CO2 atmosférico del 5%. El medio se ha sustituido cada 2 o 3 días con el fin de asegurar el correcto aporte de nutrientes a las células.

The biological characterisation was carried out through in vivo trials. To do this, a primary sarcoma cellular line of human origin (SAOS-2) was used. For the experiments, the cells were reproduced in polystyrene bottles whose cultivation had been carried out through the use of medium (McCoy’s). The cells had been maintained at 37°C for the duration of the experiments with a relative humidity of less than 95% and an atmospheric CO2 concentration of 5%. The medium was replaced every 2 or 3 days to ensure correct behaviour of nutrients in the cells.

Determination of cell adhesion Determinación de la adhesión celular Para el ensayo de adhesión celular se han sembrado 12500 células sobre cada muestra analizada. Después de 6h se lisaron las células con (Mammalian Protein Extraction Reagent). Esta sustancia rompe la pared celular y el núcleo celular, liberando las enzimas que éstas contienen en su interior. Las células han sido cuantificadas utilizando la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) que se produce en el núcleo celular. Conociendo la cantidad de LDH que liberamos al entorno podemos relacionar la cantidad de células de que disponemos. La cuantificación de LDH se llevó a cabo mediante la utilización del kit Citotoxicity Detection Kit (Roche, nº 11644793001), que utiliza una reacción química que desencadena el cambio de color de los líquidos que contienen LDH, proporcional a la concentración del mismo.

Determinación de la proliferación celular La proliferación de las células se midió a 5 horas, 3 y 7 días de cultivo y los cultivos celulares se realizaron con una línea celular de osteoblastos (SaOS-2), sembrando 12500 células por pocillo. Para evaluar la proliferación celular se cuantificaron las células en los distintos tiempos de incubación. Con este fin se utilizó la medición de liberación de LDH por parte de las células mediante el kit Citotoxicity Detection Kit (Roche, nº 11644793001).

For the cell adhesion testing, 12,500 cells were seeded on each of the samples analysed. After 6 hours the cells were lysed with (Mammalian Protein Extraction Reagent). This substance breaks the cell walls and the cell nucleus, thus freeing the enzymes that they contain inside. The cells have been quantified by using a lactate hydrogenase (LDH) enzyme that is produced in the cell nucleus. By knowing the amount of LDH that we free into the surroundings, we can know the amount of cells we have available. The quantification of the LDH is carried out by using a Citotoxicity Detection Kit (Roche, nº 11644793001), which uses a chemical reaction that triggers a change in colour of the liquids containing LDH in proportion to its concentration.

Determination of cell proliferation Cell proliferation is measured at 5 hours, 3 days and 7 days from cultivation and the cultivation of the cells is done with an osteoblast cellular line (SaOS-2), by seeding 12,500 cells per dish. To evaluate the cell proliferation, the cells were quantified in the different periods of incubation. To do this, the LDH freed by the cells was measured using a Citotoxicity Detection Kit (Roche, nº 11644793001).

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Se midió la absorbencia de las muestras mediante un espectofotómetro (Densidad Óptica) que fue correlacionada mediante una curva patrón donde se conoce de antemano la cantidad de células introducida en el pocillo.

The samples’ absorbency was measured by a spectrophotometer (optical density), which was correlated through a calibration curve where the number of cells placed in the dish is known beforehand.

Preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido (SEM)

Preparation of samples for electron microscopy (SEM)

Las muestras fueron preparadas para su observación en microscopía electrónica de barrido mediante el equipo Surface Scanning Electron Focused Ion Beam Zeiss. (FIB-SEM, Zeiss, Germany) siguiendo un protocolo convencional de fijación y deshidratación. El proceso de fijación se realizó con una solución de glutaraldehido al 2,5w% en PB, por un período de 1 hora en la nevera a 4°C. El siguiente paso en el proceso de preparación de las muestras fue la deshidratación mediante la introducción de las muestras en diferentes baños de alcohol, aumentando progresivamente la concentración de alcohol en cada paso. De este modo se genera una deshidratación progresiva de las células de la muestra. Tras la realización de esta segunda etapa de preparación se procedió a la eliminación del alcohol y al secado de las mismas. Con el fin de poder realizar el análisis mediante microscopía electrónica SEM se procedió al recubrimiento de las muestras con un recubrimiento de carbono mediante Sputtering.

The samples were prepared to be observed by electron microscopy Zeiss Surface Scanning Electron Focused Ion Beam device (FIB-SEM, Zeiss, Germany), while following the conventional protocol on fixing and dewatering. The fixing process was carried out with a glutaraldehyde solution at 2.5w% in PB, for one hour in the refrigerator at 4°C. The next step in the process consisting of preparing the samples was the dewatering by placing the samples in different alcohol baths, while progressively increasing the alcohol concentration each time. In this way, there was a progressive dewatering of the cells in the sample. This second preparation stage was following by removal of the alcohol and drying. In order to perform the analysis with the SEM electron microscope, the samples were covered with a carbon sputter coating.

Determinación de la diferenciación celular Los ensayos de diferenciación celular permitieron evaluar el grado de especialización celular a través de marcadores específicos. Un indicador significativo del inicio de la diferenciación osteoblástica, que corresponden a células específicas creadoras de hueso, es la fosfatasa alcalina la cual es un enzima que indica el inicio de la formación de hueso. De nuevo se utilizó una línea celular de osteoblastos (SaOS-2). La concentración de enzima se calculó utilizando el kit “SensoLyte pNPP Alkaline Phosphatase Assay Kit *Colorimetric” con (ref 72146, Tebu bio).

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Determination of cell differentiation The cell differentiation testing allowed for evaluating the degree of cellular specialisation through specific markers. A significant indicator at the beginning of the osteoblast differentiation, which becomes the specific bone making cells, is alkaline phosphatase which is the enzyme indicating the start of bone formation. Again, an osteoblast (SaOS-2) cell line was used. The enzyme concentration was calculated by using the “SensoLyte pNPP Alkaline Phosphatase Assay Kit *Colorimetric” with (ref 72146, Tebu bio).

Resultados Experimentales Experiment Results Caracterización Físico-Química

Physico-Chemical Characterisation

Rugosidad superficial

Surface roughness

En este apartado se muestran los resultados obtenidos en la evaluación de la rugosidad superficial presente en las muestras analizadas. En la Tabla 3-1 pueden observarse los valores medios y las respectivas desviaciones estándar de los principales parámetros de rugosidad evaluados en cada una de las 10 medidas realizadas.

This section shows the results obtained in the surface roughness evaluation of the samples analysed. Table 3-1 shows the mean and standard deviation values of the main roughness parameters evaluation for each of the 10 measurements performed.

Texturizado Texturized

Ra (nm)

Rq (nm)

Rsk

Rz (nm)

Sa (nm)

Sz (nm)

SArea Index

X

956,9

1234,5

-0,41

10131,3

957,3

11316,5

1,79

o2

31,9

72,1

0,35

2565,4

32,1

3099,2

0,06

Mecanizado Machined

Ra (nm)

Rq (nm)

Rsk

Rz (nm)

Sa (nm)

Sz (nm)

SArea Index

X

336,2

425,3

0,074

3151,251

331,310

418,8

3602,4

o2

82,2

108,1

0598

880,134

90,336

118,0

893,8

Tabla 3-1. Media y desviación estándar de parámetros de rugosidad mesurado Table 3-1. Mean and standard deviation of roughness parameters measured.

Figura 3-1 Reconstrucción de la topografía superficial de las muestras texturizadas. Figure 3-1 Reconstruction of the surface topography of the texturized samples.

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Figura 3-2 Reconstrucción de la topografía superficial de las muestras mecanizadas. Figure 3-2 Reconstruction of the surface topography of the machined samples.

Las imágenes presentes en la Figura 3-1 y Figura 3-2 muestran la representación en dos dimensiones y tres dimensiones de la superficie de las muestras mecanizadas y texturizadas, respectivamente. El análisis de las imágenes de interferometría presentes en la (Figura 3-1) muestran una textura nanométrica, como resultado del ataque ácido que se le ha realizado. Durante la inspección de la superficie se ha observado que la topografía superficial es regular y uniforme en toda la superficie. Los parámetros de rugosidad más relevantes para este estudio son, en primer lugar, la gran área específica (Sarea Index) que se ha obtenido (1,79) respecto a las muestras mecanizadas (1,0). En segundo lugar, es relevante observar que (Rsk) en las muestras tratadas presenta un valor negativo, que significa que abundan más los picos que los valles en la topografía superficial.

The images in Figure 3-1 and 3-2 show the surface of the texturized and machined samples in two and three dimensions. The interferometry analysis presented in Figure 3-1 shows a nanometric texture as a result of the acid attack performed. During the inspection of the surface, it was observed that the surface topography is regular and uniform throughout the surface. The most relevant roughness parameters for this study are, first of all, the large specific area (Sarea Index) where a value of 1.79 was obtain compared to the machined samples (1.0). Secondly, it is important to notice that (Rsk) has a negative value in the treated samples, meaning that there are more peaks than valleys on the topographic surface.

Microscopía de barrido (SEM)

The topographic surface was observed during the exploration of the surface using SEM. Some of the images taken are shown below. The surface topography of the treated samples shows a texturing at a nano and micrometer scale (Figure 3-3), which give the surface a large specific area whose results perfectly correlate with the results obtained by white light interferometry. The presence of incrusted aluminium particles were observed on the surface during the exploration (Figure 3-4), which correspond to residue from the shot blasting (shot fragments) that had not been removed by the earlier chem-

Durante la exploración de la superficie mediante SEM se observó la topografía superficial. A continuación, se muestran algunas de las imágenes realizadas. La topografía superficial de las muestras tratadas muestra un texturizado a escala nano y micrométrica (Figura 3-3), que brinda a la superficie una gran área específica y cuyos resultados se correlacionan perfectamente con los resultados obtenidos por interferometría de luz blanca. Durante la exploración se observó la presencia de partículas de alúmina incrustadas en superficie (Figura 3-4), que corresponderían a residuos del 12

Electron microscopy (SEM)

Figura 3-3 Imágenes de SEM para distintos aumentos. Figure 3-3 SEM images at different magnifications.

granallado (fragmentos de granalla) que no han sido eliminados por el ataque químico posterior. Dicho aspecto es normal en este tipo de procesos de preparación superficial de implantes dentales y no interfiere en la actividad biológica de la superficie. Asimismo, la evaluación mediante microscopía SEM también se ha mostrado la presencia de residuos no conductores en las superficies estudiadas, tal y como puede observarse en la (Figura 3-5). El análisis químico semi cuantitativo mediante la utilización de la sonda EDS de este segundo tipo de residuo muestra que se trata de dos tipos de materiales poliméricos (Figura 3-5), cuyo origen se ha asociado a una posible contaminación cruzada por fricción con la superficie interna del envase de esterilización y transporte. Para evaluar su relevancia se practicó una limpieza superficial con disolventes polares y apolares, cuyo resultado que los eliminó.

ical attack. This aspect is normal in this type of surface preparation process for dental implants and does not interfere with the biological activity of the surface. In addition, the SEM evaluation also showed the presence of non-conductor residues on the surfaces studied, as can be seen in Figure 3-5. The semi-quantitative chemical analysis using the EDS gauge of the second type of residue shows that there are two types of polymeric materials (Figure 3-5), which may have occurred through contamination from rubbing against the internal surface of the sterilised container and transport. To evaluate their relevance, the surface was cleaned with polar and non-polar solvents that resulted in their removal.

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Figura 3-5. Imágenes de SEM y espectro EDX para los dos tipos de polímero detectado. Figura 3-4 Imagen SEM de una partícula de alúmina en la superficie de titanio tratado con granallado y doble pasivado ácido.

Figure 3-5 SEM and EDX spectrum images for two types of polymers detected.

Figure 3-4 SEM Image of an aluminium particle on the shot blast and acid passivated treated titanium surface.

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Como resultado del análisis de los residuos poliméricos se llega a la consideración de que estos residuos no intervienen en la respuesta biológica del material y que su presencia estaría asociada al envase utilizado para el transporte de las mismas. Por este motivo no deberían estar presentes en el producto final (implantes), que utiliza otro sistema de envasado.

As a result of the analysis of the polymer residues, it is considered that they are not part of the biological response of the material and their presence is probably associated with the packaging used for their transport. For this reason, they should not be present in the final product (the implants) since they use another type of packaging.

Ángulo de contacto

Angle of contact

A continuación se muestran los resultados obtenidos de la medida del ángulo de contacto sobre las muestras analizadas. En la figura (Figura 3-6) se puede observar los valores medios y sus respectivas desviaciones estándar de los ángulos de contacto determinados sobre las muestras tratadas y las muestras mecanizadas, para ambos medios líquidos utilizados. En primer lugar, cabe recalcar que existen diferencias estadísticamente significativas entre todas las condiciones evaluadas. Se observa que la superficie que ha sido granallada y atacada presenta menos hidrofilia, caracterizada por un elevado valor de ángulo de contacto (CA > 90º), cuyo comportamiento podría estar asociado a una baja energía superficial. Por otro lado, a pesar de aplicar una corrección del ángulo para superficies rugosas, la hidrofobicidad podría estar también asociada a la nano/micro-topografía superficial.

The results obtained from the measurement of the angle of contact on the samples analysed are shown below. In Figure 3-6, the measured values and their respective standard deviations of the angles of contact determined on the treated and machined samples can be observed for both types of liquids used.

Ángulo de Contacto (º) Angle of contact

109 75

70 45

Figura 3-6. Ángulo de contacto para muestras tratadas y mecanizadas con gotas de di-iodometano y agua ultrapura.

First of all, it should be stressed that there are statistically significant differences between all of the conditions evaluated. It can be seen that the surface that has been shot blasted and attacked has less hydrophilia, characterised by a high angle of contact (CA > 90º) value. Its behaviour could be associated with a low surface energy. On the other hand, despite applying an angle correction for rough surfaces, the hydrophobicity could also be related to the nano/micro-topographical surface.

Figure 3-6 Angle of contact for treated and machined samples tested with drops of diiodomethane and ultra-pure water.

Análisis mediante espectroscopia foto-electrónica de rayos X

X-ray photoelectron spectroscopy analysis

En este apartado se presentan los resultados del análisis de composición superficial mediante XPS. En la Tabla 3-2 se muestra el porcentaje de masa atómica para cada elemento químico detectado en las muestras de titanio tratado y granallado.

This section presents the results of the surface composition analysis using XPS. In Table 3-2 shows the percentage of atomic mass for each chemical detected in the treated and shot blasted titanium samples.

C

O

Ti

Si

Al

N

S

Ca

F

Zn

Ti Mecanizado Ti Machined

33,08

49,09

11,13

3,04

0

1,66

0,30

0,46

0,29

0,96

Ti Texturizado Ti Texturized

33,89

48,30

13,33

0,74

1,03

1,16

0,41

0,24

0,21

0,70

Tabla 3-2. Composición química superficial expresada en porcentaje de masa atómica. Table 3-2. Chemical composition of the surface expressed in the percentage of atomic mass.

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En primer lugar se observa el carbono, con un 33,08 y 33,89 % de masa atómica para las muestras mecanizadas y texturizadas, respectivamente. La presencia del carbono se considera normal y está asociada a la contaminación ambiental (CO2) y a posibles residuos superficiales tales como el polímero del embalaje. En segundo lugar se encuentra el oxígeno. La presencia de oxígeno es normal y proviene de la capa de óxido superficial del titanio (TiO2 entre otros). Se observa una diferencia relevante de composición entre las muestras mecanizadas y las tratadas, la disminución del 0,79% de oxígeno después del tratamiento se asocia al doble grabado ácido, que modifica la composición química de la capa de óxido. Se puede observar un comportamiento opuesto en el porcentaje de masa atómica de Ti, que aumenta en un 2,2% en las muestras tratadas respecto las mecanizadas. El siguiente elemento que encontramos en la tabla es silicio. Muy probablemente el silicio proviene de lubricantes de corte o grasas sintéticas utilizadas durante el mecanizado. Se puede observar que se elimina esta contaminación durante el tratamiento de granallado y doble pasivado ácido. El aluminio presente en las muestras texturizadas proviene del tratamiento de granallado, realizado con partículas de alúmina (óxido de aluminio, Al2O3), razón por la que solo encontramos presencia de aluminio en las muestras tratadas. Dichos resultados estarían en concordancia con los resultados expuestos en el análisis SEM, que ha mostrado la presencia de fragmentos de alúmina incrustados en la superficie de las muestras tratadas. El nitrógeno (N), calcio (Ca), Flúor (F) y cinc (Zn) son elementos fruto de la contaminación cruzada, todos ellos se ven reducidos durante el tratamiento de granallado y doble pasivado ácido. El nitrógeno, calcio y flúor son elementos que a menudo se observan en este tipo de muestras. En el caso del zinc, se desconoce el posible origen de este tipo de contaminación que debería ser analizado por el fabricante.

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First of all, we can see that carbon has an atomic mass of 33.08% and 33.89% for machined and textured samples respectively. The presence of carbon is considered normal and is associated with environmental contamination (CO2) and possible surface residues like polymers from the packaging. Secondly, oxygen is found. The presence of oxygen is normal and comes from the oxide layer on the titanium surface (TiO2 among others). A relevant difference in composition is observed between the machined and treated samples. The decrease of 0.79% in oxygen after treatment is associated with the double acid etching, which changes the chemical composition of the oxide layer. The opposite behaviour can be observed in the percentage of atomic mass in Ti, which increases 2.2. % in the treated samples compared to the machined samples. The next element we find in the table is silicon. The silicon most likely comes from the cutting lubricants or synthetic greases used in the machining. It can be seen that this contamination is removed during the shot blasting and double passivation acid treatment. The aluminium present in the texturized samples comes from the shot blast treatment, which is performed with alumina particles (aluminium oxide, Al2O3). This is why we only find aluminium present in the treated samples. These results are in agreement with the SEM analysis, which showed the presence of aluminium fragments incrusted in the surface of the treated samples. Nitrogen (N), calcium (Ca), fluoride (F) and zinc (Zn) are elements resulting from cross contamination. All show a decrease during shot blasting and double passivate acid treatment. Nitrogen, calcium and fluoride are elements that are often seen in these kinds of samples. In the case of zinc, the possible origin of this contamination is unknown and should be analysed by the manufacturer.

Caracterización Biológica

Biological characterisation

Determinación de la adhesión celular

Determination of cell adhesion

En la Figura 3-7 se muestran los resultados del ensayo de adhesión celular, para el que se ha utilizado la superficie del frasco de poliéster a modo de muestra control. El análisis de los resultados presentes en la (Figura 3-7) permite observar que las muestras que han sido tratadas con granallado y doble grabado ácido presentan una adhesión celular mayor que las muestras en estado de mecanización. Así pues, la realización del tratamiento de texturización superficial provoca un aumento estadísticamente significativo de la adhesión celular respecto de las muestras en estado de mecanización y de las muestras control. Los niveles de adhesión celular de las muestras tratadas prácticamente casi cuadruplican a los experimentados por las muestras en estado de mecanización. Se concluye que el texturizado superficial aumenta la adhesión celular y supone una mejora a la respuesta biológica. El resultado del experimento se ha corroborado con dos estudios independientes. El estudio estadístico realizado con un test paramétrico (ANOVA) confirma diferencias estadísticamente significativas entre la superficie texturizada y mecanizada con una confianza mayor al 95% (p