TEMA IV CULTIVO, AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Cualquier ser vivo necesita tomar del ambiente una serie de compuestos que se emplean como fuente de energía, y para sintetizar los constituyentes celulares. Estos compuestos son los nutrientes. Los nutrientes deben contener agua, C, N, S, P, Ca, K, Na, Mg, Mo, Cu y Zn. REQUERIMIENTOS DE LOS MICROORGANISMOS REQUERIMIENTOS ENERGÉTICOS En función de la fuente de energía, los microorganismos se clasifican en : • Fotótrofos • Quimiótrofos: Oxidan compuestos químicos. REQUERIMIENTOS DE CARBONO En función de la fuente de carbono, los microorganismos se clasifian en : • Autótrofos: CO2 • Heterótrofos: Compuestos orgánicos carbonados. Uniendo ambas clasificaciones, podemos clasificar los microorganismos en cuatro grupos: • Fotoautótrofos: Luz + CO2. Bacterias fotosintéticas. • Fotoheterótrofos: Algunas bacterias fotosintéticas. • Quimioautótrofos o quimiolitotrofos: Descubiertos por Winogradsky, usan como fuente de energía compuestos inorgánicos reducidos: NH4, NO2, H2, SH2, Fe++... REQUERIMIENTOS DE NITRÓGENO Los microorganismos son muy versátiles en cuanto a la forma de conseguir el N: Algunos organismos son capaces de fijar nitrógeno atmosférico (N2). Otros lo toman en forma de NH4+. Otros son capaces de usar NO3− o NO2− como fuente de amonio, reduciéndolo. Algunos son capaces de utilizar aminoácidos como fuente de nitrógeno. REQUERIMIENTOS DE AZUFRE El azufre forma parte de dos aminoácidos; es esencial. Los microorganismos lo obtienen: En forma S. En forma de SO42−. En forma orgánica (aminoácidos)

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REQUERIMIENTOS DE FÓSFORO Los microorganismos lo toman a partir de fosfatos disueltos en el medio. REQUERIMIENTO DE MACRO Y MICRONUTRIENTES Los macronutrientes son requeridos por los microorganismos en concentraciones de entre 10−3 y 10−4 molar. Son Ca, Na, K y Mg . Son asimilados en forma de sales: MgSO4, CaCl2, etc. Los micronutrientes (oligoelementos) son: Cu, Zn, Mo, Mn, Cr, Fe, etc. Y son necesarios en concentraciones de 10−5 a 10−6 molar. Se aportan a los medios de cultivo añadiendo una solución de elementos traza. REQUERIMIENTO DE FACTORES DE CRECIMIENTO Los factores de crecimiento son componentes que los microorganismos utilizan como precursores o constituyentes de su materia celular, y que pueden sintetizar a partir de formas de carbono más sencillas. Son esenciales y deben ser añadidos como nutrientes en función del microorganismo que cultivemos: • Aminoácidos. • Bases púricas y pirimidínicas. • Vitaminas, que actúan como coenzimas de distintos complejos enzimáticos. Ej. B2 (riboflavina) es esencial para la síntesis de FAD. La necesidad de un factor de crecimiento se denomina auxotrofía, y la prototrofía implica que un microorganismo no requiere ningún factor de crecimiento para desarrollarse. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo pueden ser: • Líquidos • Sólidos • Semisólidos MEDIOS LÍQUIDOS Se preparan todos los constituyentes en una disolución acuosa (agua destilada). Una vez disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor. MEDIOS SÓLIDOS Hacemos lo mismo que para los medios líquidos, pero, al disolver en agua destilada, añadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas petri cuando está a unos 60º. Cuando alcance los 50º, ya será sólido. MEDIOS SEMISÓLIDOS Su apariencia es de gel. Sólo llevan 5 g/l de agar. RELACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS CON EL OXÍGENO

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El oxígeno, como constituyente del agua, es esencial para todos los organismos. Sin embargo, el oxígeno molecular es requerido de diferentes maneras por los microorganismos: MICROORGANISMOS AEROBIOS El oxígeno actúa como aceptor final de electrones en la respiración aeróbica. Existen dos grupos de organismos aeróbicos: Aerobios estrictos. Requieren oxígeno en concentraciones similares a la atmosférica (20%) Aerobios microaerófilos. Requieren oxígeno en concentraciones inferiores a las de la atmósfera; 5−10%. Presentan enzimas como la hidrogenasa, que son activadas por las presiones parciales del oxígeno. La hidrogenasa proporciona energía para crecer. En concentración atmosférica, la hidrogenasa no se activa y la célula no crece y muere. MICROORGANISMOS ANAEROBIOS Son aquellos organismos que no requieren oxígeno. Distinguimos entre: Anaerobios facultativos. Crecen en ausencia y en presencia de oxígeno, pero crecen mejor con oxígeno. En ausencia, realizan la fermentación, y en presencia, la respiración aeróbia. Esta última es mucho más rentable, y por ello crecen mejor. Anaerobios estrictos. Aquellos que, no solo no requieren oxígeno, sino que su presencia los destruye. Su metabolismo no requiere oxígeno, o realizan fermentación o respiración anaerobia. Anaerobios aerotolerantes. Aquellos que no requieren oxígeno pero lo toleran; no mueren en su presencia. Son microorganismos fermentativos, y se diferencian de los facultativos en que no crecen más con oxígeno. CULTIVO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS ESTRICTOS En placas petri sobre medios sólidos. La superficie del medio de cultivo está en contacto con el oxígeno atmosférico, luego no hay ningún problema para cultivar este tipo de microorganismos. En medio líquido, el microorganismo crece en la disolución, donde la concentración de oxígeno es menor, y disminuye en función del crecimiento del microorganismo. Para evitar esa disminución de oxígeno, utilizamos dos recursos: • Agitación • Adición de aire u O2 estéril mediante burbujeo CULTIVO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS ESTRICTOS En medio líquido, añadimos al medio de cultivo agentes reductores que toman el O2 disuelto en el agua y forman H2o. Estos agentes son cisteína o tioglicolato, por ejemplo. Otra manera es bombeando CO2 o N2 libre de 02 al medio, mediante burbujeo. En medio sólido, se emplean jarras de anaerobiosis o jarras de Gas−Pak. Su tamaño es similar al de un termo. En su interior se colocan las placas petri invertidas. El recipiente se cierra con una tapa hermética. En la parte inferior hay un catalizador de paladio. Para conseguir la anaerobiosis, introducimos sobres de anaerobiosis, que contienen NaCO3 y borohidruro de sodio. Al añadir agua al sobre, se libera H2 y CO2. El oxígeno presente se reduce a agua. Para verificar la anaerobiosis hay un indicador, que consiste en una tira de 3

papel impregnada con azul de metileno. En condiciones aeróbicas, la tira es azul, pero sino, es transparente. En la tapa hay un manómetro con el que medimos la presión interna, ya que se están desprendiendo CO2 y H2. MEDIOS DE CULTIVO En función de su composición, distinguimos dos grupos de medios de cultivo: • Medios sintéticos o definidos: Son aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias orgánicas e inorgánicas puras disueltas en agua destilada. • Medios complejos o indefinidos: Contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composición indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril... La ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en él gran número de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo está consumiendo. Ejemplos: Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar. CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO MEDIOS ENRIQUECIDOS Algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo normales. Para cultivarlos necesitamos añadir sustancias altamente nutritivas como sangre, suero, extractos de tejidos animales... Estos medios son los medios enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microorganismos exigentes o fastidiosos. Ejemplo: agar−sangre. MEDIOS SELECTIVOS Contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos. Ej: El cristal violeta inhibe las gram +. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituímos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla. MEDIOS DIFERENCIALES Contienen distintos compuestos químicos o indicadores sobre los que determinados microorganismos adquiere coloraciones específicas o reaccionan de una manera determinada. Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten diferenciar a las colonias que viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde claro, mientras que enterobacter forma colonias de color rosa salmón. MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES Ejemplo: Agar Mclonkey tiene cristal violeta y sales biliares. Es un medio específico para enterobacterias. Cristal violeta inhibe a las gram +. Las sales biliares hace que sólo se desarrollen las gram − que puedan tolerar estas sales; las enterobacterias. El indicador es el rojo neutro, que es rojo a pH ácido e incoloro a pH básico. Como fuente de carbono se utilizan peptona y lactosa. Se usa para detectar E. Coli y Salmonella. E. Coli es tolerante a la lactosa. Al digerirla, libera ácidos, por lo 4

que se crea un medio ácido y el indicador se pone rojo. Salmonella no tolera la lactosa, por lo que no formará ácidos y formará colonias incoloras. CULTIVOS PUROS: MEDIOS DE OBTENCIÓN Los microorganismos en estado natural crecen de forma heterogénea o mixta. Cuando queremos estudiar un microorganismo dado, debemos aislarlo. Un cultivo puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo. El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias aisladas, que provienen de una sola célula (son clones). Hay diferentes métodos para obtenerlas: MÉTODO DE SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O EN ESTRÍA Necesitamos: • Placa petri con medio de cultivo • Muestra (sólida o líquida) • Asa de siembra de platino Con el asa estéril tomamos la muestra y hacemos extensiones en la placa. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y extendemos parte de la extensión anterior en otra dirección. Volvemos a esterilizar el asa de siembra y volvemos a extender parte de la segunda extensión en otra dirección. Esterilizamos y repetimos la operación. Incubamos a 37 º durante 24 horas y, en la primera zona, habrá un amasijo de células. En la segunda, parte de la primera zona estará mejor extendida, y en la tercera y en la 4ª mejor aún. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro. MÉTODO DE LAS DILUCIONES SUCESIVAS Consiste en diluir una muestra hasta conseguir muy pocas células que, tras inocularse en un medio de cultivo, generen colonias aisladas. Metodología: Ahora tomamos 0.1 ml de cada tubo y lo depositamos en una placa petri con medio de cultivo. Con un asa de vidrio se extiende esa cantidad sobre la placa, e incubams a 37 ºC durante 24 horas. En la primera dilución habrá un amasijo de colonias. En la siguiente habrá diez veces menos número de colonias, y así sucesivamente hasta conseguir colonias aisladas. Este método nos permite calcular el número de microorganismos viables que existen en la muestra que estamos analizando: N=C · 1/D · 1/i donde: N es el número de microorganismos presentes en la muestra C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de colonias) D es la dilución

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I es el inóculo Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo (puede tratarse de una contaminación) y, si hay más, no están aisladas. TÉCNICA DEL CULTIVO POR ENRIQUECIMIENTO Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el microorganismo que nos interesa aislar. Ejemplo: Nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las bacterias fotoautótrofas. Ejemplo 2: Queremos aislar bacterias quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar fotoautótrofos. Para incubar enterobactrias como enterobacter hay que incubar a 37º, mientras que para incubar otra enterobacteria, E. Coli, hay que incubar a 45º. CONSERVACIÓN DE CULTIVOS PUROS ALMACENAMIENTO A TEMPERATURAS BAJAS Ponemos las bacterias con glicerol al 20 − 50% a −70º y podemos mantenerlas así durante años, décadas... LIOFILIZACIÓN Es un método más eficaz. En un vial de liofilización ponemos leche desnatada y las bacterias, lo congelamos, lo llevamos al liofilizador y lo sometemos al proceso de liofilización. La liofilización es una evaporación por condensación. Se basa en el punto triple del agua; podemos pasar de sólido a gas. El agua se evapora y queda un polvillo formado por la leche y las bacterias. Cerramos el bote y podemos almacenar el cultivo durante décadas. COLECCIONES DE CULTIVO En todos los países hay organizaciones que preparan o almacenan colecciones de cultivos puros o tipo. En España existe la C.E.C.T (Colección española de cultivos tipo), que está en Valencia. La más grande del mundo es la americana, A.T.C.C. (American type cultive collection).

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