MICROPROPAGACIÓN CULTIVO IN VITRO DE MERISTEMAS PREFLORALES DE COLIFLOR

La coliflor (Brassica oleraceae var. botrytis, família Brassicaceae) es una variedad de col silvestre, originada en el Mediterráneo oriental entre 1500 y 2000 años atrás. Se trata de una planta herbácea bianual, que se reproduce por semillas. La parte comestible (“cabeza”) es una inflorescencia inmadura redondeada que se inserta en un tallo corto. El color es blanco, amarillo o crema, pero también se comercializan coliflores verdes o rosas. Por ser un órgano meristemático, la cabeza desarrolla tallos con flores amarillas o blancas cuando la planta madura. Esas inflorescencias pueden llegar a medir 100 cm. En condiciones experimentales, los meristemas revierten hacia la fase vegetativa y se desarrollan como brotes con hojas. Las plantas regeneradas a partir de dichos brotes se usan para la producción de semillas. Por ser un material barato y fácil de obtener, varios protocolos para el cultivo in vitro de coliflor en el laboratorio de enseñanza se encuentran en Internet. Las pocas diferencias entre ellos parecen depender de la estructura del laboratorio y de la experiencia personal.

BIBLIOGRAFÍA MALAJOVICH M.A. e MANN V.S. MALAJOVICH M.A. e MANN V.S. Micropropagación. Guía 80: El laboratorio de enseñanza; Guía 85: Desinfección de los instrumentos; Guía 90: Desinfección de los explantes y Guía 96: Los medios de cultivo. http://www.bteduc.bio.br THE ASSOCIATION FOR SCIENCE EDUCATION. Experimenting with industry. 13. Plant Tissue Culture. SCSST, 1985. http://www.ncbe.reading.ac.uk/ncbe/protocols/PDF/PTC2002.pdf Esta es la primera publicación destinada a enseñanza, ahora en Internet.

Guía 104

María Antonia Malajovich / Guías de actividades Biotecnología: enseñanza y divulgación http://www.bteduc.bio.br

MICROPROPAGACIÓN / CULTIVO IN VITRO DE COLIFLOR

ACTIVIDAD PRÁCTICA OBJETIVO Cultivo in vitro de coliflor a partir de meristemas preflorales.

MATERIALES

Coliflor, azulejo, cuchillo, 1 frasco con agua sanitaria diluida al medio, 3 frascos con agua estéril, placa de Petri con papel toalla estéril, bisturí estéril, 6 tubos de ensayo o frascos pequeños con medio nutritivo* estéril, palitos estériles, mechero Bunsen (opcional).

* El medio nutritivo (Murashige & Skoog o Taji) es una solución de sales minerales a las cuales se adiciona sacarosa (1 a 5%), agar (0,7%) y agua de coco, como se indica en las Guías 111: Micropropagación: medios clásicos y 112: Micropropagación: medios alternativos.

PROCEDIMIENTO La limpieza del lugar de trabajo es fundamental, así como la higiene de las manos. El lugar de trabajo será desinfectado con alcohol 70º. Los participantes se lavarán muy bien las manos y los antebrazos con agua y jabón, antes de pasarse alcohol 70º. Cuidado! El alcohol es inflamable. Esterilizar el material contaminado antes de descartarlo.

A. ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ASÉPTICO

1. Separación de los explantes En un azulejo bien limpio, disecar con un cuchillo varias florcitas de coliflor (tamaño 3 x 5 x 5 mm). Lavar muy bien esos explantes.

2. Desinfección de la superficie de los explantes Pasar rápidamente el material por alcohol 70º y sumergir el explante durante 10 minutos, en una solución de agua sanitaria diluida al medio adicionada con 1 gota de detergente. Agitar suavemente durante todo el proceso de desinfección.

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3. Lavados en agua destilada estéril Hacer tres lavados de 1, 3 y 5 minutos, con agitación suave.

4. Establecimiento del cultivo En condiciones asépticas, transferir los explantes a los recipientes con medio nutritivo.

5. Incubación A 20-28ºC, en presencia de luz.

6. Seguimiento Registrar semanalmente las observaciones.

B. REGENERACIÓN DE LA PLANTA Luego del crecimiento y propagación, dividir el material y transferirlo a un medio fresco, de modo de obtener numerosos subcultivos. Una vez desarrollas, transferir las plántulas de los subcultivos a un medio de enraizamiento sin agua de coco, donde, además de desarrollarse las raíces, se fortalecerá y comenzará a fotosintetizar. Siempre en condiciones asépticas. Antes de transferir la planta a tierra, eliminar por lavado el agar y los vestigios de azúcar. Controlar la humedad por un tiempo y proteger las plantas de la iluminación solar directa hasta su adaptación a las condiciones ambientales.

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NUESTRO COMENTARIO La primer medida es conseguir en el comercio una coliflor fresca, compacta y firme, sin manchas amarronadas. En caso de no encontrarse, sustituir por brócoli que es otra variedad de Brassica oleraceae de la cual se consumen los brotes florales (Figura 1). La segunda es una buena desinfección del explante, en agua sanitaria diluida al medio. Incluso con una buena apariencia, la coliflor procedente del supermercado puede estar muy contaminada, siendo algunas veces necesario aumentar el tiempo de inmersión en el desinfectante y lavar con Clor-in en vez de agua destilada estéril. Después de dicho tratamiento conviene cortar la extremidad quemada del explante. Sin embargo y a pesar de todos los cuidados, las contaminaciones podrán aparecer una semana después del sembrado, una vez que el explante crece y comienza a abrirse permitiendo el contacto con el medio de las zonas que no fueron alcanzadas por el desinfectante. Los cultivos y subcultivos bien establecidos son espectaculares (Figura 2). Además del crecimiento de hojas y raíces, en algunos casos se observa la aparición de antocianinas que dan al explante una coloración rosa muy bonita (Figura 3).

¿CÓMO MONTAR UN PROYECTO?

Comparar el crecimiento en diferentes medios de cultivo.

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Figura 1. Crecimiento de explantes de brócoli.

Figura 2. Crecimiento de explantes de coliflor, fotografiados con 10 días de diferencia.

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Figura 3. Producción de antocianinas en explantes de coliflor.

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