Utilidad y Valoración de los Test Inmunológicos Inmunológicos en el Diagnóstico de las Enfermedades Difusas del Tejido Conectivo Conectivo (CTDs)

Antecedentes:

En 1941, Klemperer, Pollack y Baehr fueron los primeros que describieron Lupus Eritematoso Sistémico (LES) como una de las Enfermedades de Tejido Conectivo.

Luego en 1948 Malcom Hargrave, Helen Richmond y Robert Morton notaron la presencia de células LE previamente desconocidas en la médula ósea de un paciente con LES.(1)

Desde entonces los ANAs han sido divididos en subtipos específicos basándose en el componente nuclear citoplasmático que atacan. Ejm :anti-DNA, anti-histonas, etc Niveles elevados de anticuerpos antiDNAds

se consideran confirmatorios en el

diagnóstico de LES. Los anti histonas son indicadores de LES indicado por drogas. Además del DNA e histonas los autoanticuerpos también pueden tener como blanco otros antígenos nucleares, que fueron llamados ENAs porque originalmente fueron extraídos del núcleo con salino.

El autoanticuerpo al antígeno Smith (Sm) el cual se considera específico de LES fue el primer anti-ENA detectado en 1966 .Luego otros subtipos de ENA como ribonucleoproteínas (RNP), SSA/Ro, SSB/La, Scl 70, Jo-1 y MP1 fueron identificados.

Aunque la mayoría de estos ENA son específicos de enfermedad todavía existe un solapamiento importante. La sensibilidad y la especificidad también varían dependiendo del tipo de CTD subyacente.

La presencia de autoanticuerpos en el suero de los pacientes constituye uno de los criterios usados en el diagnóstico de CTD. Además del diagnóstico clínico los

1

subtipos de ANA también ayudan a identificar un CTD específico. Aunque una batería de análisis de laboratorio están disponibles para la detección de ANAs ,el test anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta (IFI-ANA) y el inmunoensayo enzimático (EIA)/ensayo inmunosorbente ligado a enzima(ELISA) son los más comúnmente usados en la práctica diaria. Algunos de ellos son considerados desactualizados mientras que otros como la citometría de flujo y recientemente la nanotecnología introducida que envuelve arrays de antígenos están aún en etapas experimentales.

El IFI- ANA fue diseñado por George Friou en 1957, desde entonces ha sido la más ampliamente usada para el diagnóstico de CTD .Es barata y fácil de realizar , con alta sensibilidad y especificidad. El test detecta la presencia de ANAs en la sangre del paciente los cuales se adhieren a las células del substrato formando diferentes patrones de fluorescencia que están asociados con ciertas enfermedades autoinmunes. En 1975 las células Hep-2 fueron introducidas porque incrementaban la sensibilidad del test. Estas eran células cultivadas de carcinoma celular escamoso laríngeo y están disponibles comercialmente, prefijadas sobre portas de vidrio. La mayoría de laboratorios alrededor del mundo usan células Hep 2 como sustrato.

La correcta interpretación de los resultados del IFI-ANA es importante y debe ser siempre correlacionada con los signos y síntomas de paciente. En el informe del IFIANA tres parámetros son evaluados, éstos incluyen el patrón de fluorescencia, sustrato usado y el título de un test positivo. Un resultado de IFI-ANA negativo esencialmente excluye la posibilidad de CTD activa. Diferentes patrones de inmunofluorescencia son reportados y dan una idea de la significancia del ANA y el tipo de CTD.

Los patrones nucleares más comunes: homogéneo, moteado (fino y grueso) ,periférico(rim),

nucleolar,

centromérico,

PCNA

(antígeno

nuclear

de

proliferación),manchas nucleares y, membrana nuclear, y granulado difuso.

Los patrones citoplasmáticos: moteado mitocondrial, ribosomal, aparato de Golgi, lisosomal, filamentos del citoesqueleto (actina, vicentina y citoqueratina)

2

Los patrones mitóticos: Huso mitótico, centrosomas, Numa (aparato mitótico nuclear), midbody , CENP-F(proteína del centrómero). Entre estos los patrones homogéneo, moteado, periférico y nucleolar son los más comúnmente observados y de importancia clínica.

La intensidad de la fluorescencia debe darse con una escala cualitativa o semicuantitativa de valores , esta intensidad es generalmente proporcional a la concentración de anticuerpo y predice la severidad de la CTD.

Los anticuerpos antinucleares (ANA) son los marcadores serológicos del Lupus Eritematoso Sistémico (LES) descrito originalmente en 1957 usando un ensayo inmunofluorescente con tejido de hígado de roedor como sustrato.

Los ANAs son una clase específica de autoanticuerpos que tienen la capacidad de unirse y destruir ciertas estructuras dentro del núcleo de las células. Si bien cantidades más bajas pueden ser vistos también en población normal, un aumento en los títulos es visto en pacientes con CTDs. No sólo estos anticuerpos explican la patogénesis de la enfermedad sino también constituyen la base para el diagnóstico y tratamiento de los CTDs

Varios métodos de detección están en uso y hay una continua producción de nuevas técnicas para facilitar el diagnóstico y monitoreo del tratamiento en pacientes con CTDs.

El título de ANA es directamente proporcional a la concentración de anticuerpos y expresado con una escala cuantitativa de valores. Un título bajo es menos significativo que uno alto y puede ser visto en individuos sanos. Muchos estudios han intentado determinar la dilución óptima de screening en suero para testar ANA. Un título de 1/160 es tomado como significativo para el diagnóstico de CTDs en la mayoría de laboratorios.

Aunque el IFI-ANA es ampliamente usado y considerado el gold standard, muchas veces los resultados son malinterpretados, porque reacciones cruzadas entre los diferentes anticuerpos pueden ocurrir, así mas del 3% de la población normal puede dar 3

falsos positivos. También los títulos de ANAs aumentan cuando los síntomas florecen y caen frecuentemente a niveles indetectables cuando los síntomas son leves o el paciente entra en remisión. Además cada CTD tiene anticuerpos específicos asociados con ésta y a veces es difícil especificar o categorizar un autoanticuerpo. Algunos patrones como el nucleolar y centromérico están peor definidos para el IFI-ANA. El test IFI-ANA es usado principalmente como screening más que para diagnóstico de CTD.

La citometría de flujo con microesferas fluorescentes cubiertas de autoantígenos ha ido ganando popularidad en años recientes, ésta da resultados cuantitativos basados en la reactividad con un set de microesferas marcadas cada una con una única combinación de señal fluorescente interna y antígeno. Las técnicas basadas en microesferas fluorescentes

también referidas como Ana réflex, tienen múltiples

ventajas como un testeo simultáneo para reconocimiento de varios antígenos, automatización, costo efectividad y alta sensibilidad. Frecuentemente las pruebas múltiples son necesarias debido a que son capaces de informar un repertorio completo de autoanticuerpos requeridos.

El suero de algunos pacientes con LES puede ser negativo sobre sustratos animales como riñón de ratón o hígado de rata pero positivos sobre sustrato humano como células Hep 2.Debido a esta sensibilidad variable con el sustrato usado es esencial reportar el tipo de sustrato que está siendo usado por el laboratorio.

Desde que diferentes ANAs están asociados a una u otra CTDs, una aproximación sistemática es seguida mientras se realizan estos test. Un screening inicial es realizado por IFI ANA o ELISA y si es positivo más pruebas específicas son realizadas basadas en los hallazgos clínicos y los patrones del IFI ANA.

Los autoanticuerpos para dsDNA son específicos y diagnósticos de LES y sus niveles están elevados durante la enfermedad activa. Si un caso de patrón homogéneo sospechoso de LES es observado en el IFI-ANA, test adicionales como CLIF, ELISA, Test de inmunoblot, etc deben ser hechas para confirmar el dsDNA. Igualmente el Sm es altamente específico para LES y necesita confirmación por otros test como el Blotting, pero está presente en sólo el 10% de los casos de LES.

4

Los Anti SSA/Ro aunque más comunes en Sindrome de Sjogren también pueden verse en 30% casos de LES con compromiso cutáneo. Por consiguiente si el IFI-ANA presenta patrón periférico/ moteado pruebas adicionales como Blotting o MIA son necesarias para detectar los anticuerpos anti SSA/Ro. La significancia clínica y los métodos de detección de SSB/La son similares que para SSA/Ro excepto que es menos frecuente y puede indicar un curso menor de enfermedad. Mientras que la presencia de estos 2 autoanticuerpos apoya el diagnóstico de Sindrome Sjogren, ellos no son necesarios para el diagnóstico. EL anti-Scl70 hallado en esclerodermia (SS) da un patrón moteado fino en el IFI-ANA y puede ser confirmado por técnicas de inmunodifusión, pero su detección tampoco es necesaria para el diagnóstico.

Los test de ANA no son útiles para confirmar el diagnóstico de artritis reumatoidea u osteoartritis por lo que no debería ser usado en estas condiciones.

Los test de ANA no están recomendados para evaluar fatiga, dolor de espalda u otros dolores músculoesqueléticos al menos que esté acompañado por uno o más síntomas clínicos a favor de CTD. Los test de ANA deben ser solicitados una sola vez.

Los test de ANA positivos no necesitan ser repetidos; los test de ANA negativos necesitan ser repetidos sólo si hay una fuerte sospecha de CTD envuelta o un cambio en la enfermedad del paciente que sugeriría una revisión del diagnóstico. Un test de ANA positivo sólo es importante junto con la evaluación clínica y en ausencia de síntomas y signos de CTD sólo confunde el diagnóstico. Un test de ANA positivo también pude ser visto en individuos sanos, particularmente mayores de edad y en un amplio rango de enfermedades diferentes de CTD, donde no tiene valor pronóstico ni diagnóstico.

Desde su descripción original la técnica ha sufrido considerables cambios metodológicos y el sustrato de tejido de ratón ha sido reemplazado con líneas celulares epiteliales humanas tales como las células epiteliales humanas Hep 2. Estas tienen las ventajas de incrementada sensibilidad, más fácil identificación de diferentes patrones de reactividad y reconocimiento de anticuerpos específicos que reaccionan con antígenos asociados de células en división. Los ensayos caseros han sido reemplazados por kits comerciales. Estos kits contienen portas cubiertos de Hep2 ,conjugados de anticuerpos y suero de referencia .Algunos incrementos en sensibilidad comprometen 5

especificidad , esto es particularmente importante en el caso de detección de ANA desde que el test es positivo en una amplia variedad de Enfermedades de Tejido Conectivo además del LES, tales como Enfermedad Mixta de Tejido Conectivo, Síndrome de Sjogren primario, artritis reumatoidea y en enfermedades infecciosas y malignas. .(6)

Objetivo: Determinar la utilidad de los Test inmunológicos de laboratorio en pacientes con enfermedades difusas de tejido conectivo (CTDs)

Materiales y Métodos

Medición de ANA

Se valoraron 102 pacientes sanos consecutivos que acudieron a la consulta de medicina preventiva del Hospital General de Castellón (HGC),sin antecedentes analíticos patológicos y 84 pacientes con enfermedades difusas de tejido conectivo de la consulta

de reumatología del HGC. Todos los sueros fueron testados para ANA

(anticuerpos antinucleares) por

la técnica tradicional de IFI (Inmunofluorescencia

indirecta) sobre sustrato de células Hep-2 e Inmunenensayo Multiplexo con microesferas cubiertas con autoantígenos ( Sistema Athena Multi-lyte)

El sistema Athena Multi-lyte

es capaz de evaluar diferentes analitos

simultáneamente en un formato de inmunoensayo multiplexo; puede evaluar en una misma muestra del paciente una multitud de autoantígenos al mismo tiempo, en un único pocillo, utiliza la tecnología de

citometría de flujo con microesferas de

poliestireno que son cubiertas con los siguientes autoantígenos: SSA/Ro, SSB/La , Scl 70,Jo-1,Sm, U snRNP B/B, U1 snRNP 68, U1 snRNP A, U1 snRNP C, ds DNA y Centrómero-B, Histona H e Histona HLY.

El método ANA- IFI usado será el NOVA Lite Hep-2 de INOVA Diagnostics, un set de reactivos que utiliza células Hep-2 como sustrato y una mezcla de isotiocianato de fluoresceína unida a inmunoglobulinas anti-humanas de ratón (IgG, IgA, IgM) como anticuerpo secundario o conjugado. Las muestras fueron diluídas 1:20 6

y 1:40 con la solución buffer incluída en el Kit de reactivo (PBS) y si los especimenes diluidos 1:40 fuesen todavía positivos las muestras serán diluídas de 1:80 hasta 1:5120 para reanalizar. El título de anticuerpos fue expresado como la dilución final donde todavía se observa fluorescencia. Las muestras fueron teñidas según las instrucciones del manual operativo y serán examinadas con un microscopio epifluorescente a 40x de magnificación. Todas las muestras fueron examinadas bajo el microscopio por 2 técnicos de laboratorio, para el control de calidad controles positivos y negativos con títulos de anticuerpos conocidos serán usados en cada ensayo para asegurar la precisión.

Nosotros analizamos 8 anticuerpos a antígenos nucleares extraíbles específicos (ENAs) de enfermedad usando un set de reactivos basado en citometría de flujo de microesferas de inmunoensayo multiplexo con los antígenos indicados: anti-U1 RNP, anticuerpos anti-Sm; anticuerpos anti- SSA/Ro, anticuerpo anti SSB/La ; anticuerpo anti Scl – 70, , anticuerpo anti-Jo-1,antiHistona y anticuerpo anti-ds DNA

Selección de pacientes y controles

Se incluyen pacientes sanos para determinar con precisión el intervalo de referencia, porque es sabido que algunos individuos sanos serán positivos para anticuerpos antinucleares.

Nosotros incluímos como pacientes sanos en este estudio a 102 pacientes consecutivos que acudieron a la consulta de Medicina Preventiva del HGC quienes no exhibían hallazgos anormales en ninguno de los test como análisis de orina, estudio hematológico de rutina y pruebas de bioquímica sanguínea; pero los ANAs no estaban incluidos. Los resultados obtenidos por IFI y el Athena Luminex fueron analizados en estos individuos. También examinamos el suero de aprox 84 pacientes con CTD (conective tissue diseases) que acudieron a la consulta de reumatología del HGC entre Mayo 2008 y Diciembre 2009.

7

Las enfermedades de los pacientes fueron definidas por los criterios establecidos para cada enfermedad. Los números de pacientes fueron los siguientes: pacientes 20 con LES; 17 pacientes con Síndrome Sjogren; 3 pacientes con Esclerosis Sistémica; 5 pacientes con Polimiosistis- Dermatomiositis; 3 con Enfermedad Mixta de Tejido Conectivo (EMTC) , 17 pacientes con Artritis Reumatoide (AR), 12 con CREST-Raynaud y 7 con Sd Anticardiolipinas.(ACL)

Después de la separación del suero por centrifugación ,las muestras séricas fueron almacenadas a –40 ªC. Todas las muestras recogidas de pacientes con CTD e individuos sanos fueron numeradas aleatoriamente y examinadas de modo ciego para el IFI-ANA y fueron también analizadas para 8 ENAs específicos de enfermedad por Inmunoensayo Multiplexo con bolas fluorescentes (Athena Luminex)

Análisis de Datos

Análisis ROC fueron realizados para los grupos de pacientes, utilizando individuos sanos como grupo de referencia. La sensibilidad,especificidad, VPP, VPN ,LR+ y LR- del IFI-ANA y del Inmunoensayo Multiplexo por el Athena ENA fueron determinados y se valoraron los cutoff para definir el más adecuado. Para el análisis de curvas ROC se usó el programa de software estadístico SPSS Versión 15.0.

La correlación entre la positividad del Inmunoensayo Multiplexo por Athena ENA e IFI-ANA entre pacientes con CTDs fue evaluado por la prueba de coeficiente de correlación de Spearmam.

La concordancia cualitativa entre los dos métodos fue determinada por la estadística kappa de Cohen .

8

Resultados:

Distribución de controles sanos por sexo y edad (n=102)

39

40 35 28

30 25 20

hombre

18

mujer

15

12

10 5 0

0 60

Títulos IFI-ANA positivos en controles sanos (n=13)

9

Distribución de Patrones IFI-ANA positivos en controles sanos

(n=13),

cutoff≥1/40

8

7

7 6 5 4

3

3

3

Nª casos

2 1

Porcentaje

53,80%

23%

0 0%

0

23%

0 las m át ico cit op

m er o ce nt ró

nu

cle

ola r

eo én Ho m og

M ot ea do

0

ENAs positivos en controles sanos (n=10), cutoff≥120

10

Intensidades ENAs positivas en controles sanos (n=10), cutoff ≥120

%

4,3 0

4,3

4,3 120-200 200-400 400-600 600-800 26

800-1000 60,9

>1000

Resultados de los Test inmunológicos en controles sanos (n=102)

100

90,2

87,3

90 80 70 60

positivo

50

negativo

40 30 20

12,7

9,8

10 0 IFI%

ENA%

11

Pacientes con CTD (n=84),distribución según diagnóstico

25

23,8 20,23

20

20,23 14,28

15 10 5

8,33

5,95

3,57

3,57 casos %

Es c le ro

Po

Sd

CR ES T an tic E M ar dio TC lip in a

iti s

at om

io s

AR

LE S lide rm

de rm ia Ge n

er ali za da Sjo gr en

0

Distribución de pacientes con CTD por sexo y edad (n=84)

80

75

70 60 50 hombre

40

33

30

24 18

20 10 0

mujer

0 0 60

total

12

Distribución de patrones IFI- ANAs positivos en pacientes con CTD (n=65)

Nª casos (n=65) 0

4

11

Moteado Homogéneo nucleolar 20

32

centrómero citoplasmático periférico

Distribución de pacientes con CTD según títulos IFI ANA positivos(n=65)

13

Distribución de ENAs positivos en pacientes CTD (n=45) cutoff≥120

% 100

100 80 60 40 20

% 19,59

17,53

10,3

19,58 8,25

6,18

10,3

8,25

al To t

s DN Ad s

Hi st on a

Jo -1

Sc l70

RN P

SM

SS B

SS A

0

Intensidades ENAs en pacientes con CTD (n=45)

% 3,09 4,12 8,25 120-200 200-400

10,3

400-600 52,57

600-800 800-1000 >1000

21,65

14

Resultados de los Test inmunológicos en pacientes con CTD (n=84)

77,4 80 70 53,58

60

46,42

50

positivo

40

negativo 22,6

30 20 10 0 IFI%

ENA%

Titulos de ANA en pacientes lúpicas.(n=20)

15

Patrones de IFI- ANAs en pacientes lúpicas (n=20)

Distribución de ENAs positivos en pacientes con LES.(n=14)

16

Intensidades ENAs positivas en pacientes con LES (n=14)

Resultados de los test inmunológicos en pacientes con LES (n=20)

17

El índice kappa de Cohen fue de 0,482 con un intervalo de confianza del 95% ( 0.35020.6138) .Error Standard de 0.0672.; por lo que la magnitud de la concordancia entre ambas técnicas (IFI y Athena ENA) para positividad y negatividad fue moderada.

El coeficiente de correlación de Spearman fue significativa r