DELTA9-­‐TETRAHIDROCANNABINOL   INHIBE  LA  PROGRESIÓN  DEL  CICLO   CELULAR  EN  CÉLULAS  DE  CÁNCER  DE   MAMA  HUMANO  A  TRAVÉS  DE  LA   REGULACIÓN  DE  CDC2.   REVISIÓN MCCR Se ha propuesto que los cannabinoides están implicados en el control del destino de la célula. Por lo tanto, estos compuestos pueden modular la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de diferentes maneras dependiendo del tipo de célula y de su contexto fisiopatológico. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto de los cannabinoides en el ciclo celular. Aquí, se muestra que Δ9-tetrahidrocannabinol (THC), a través de la activación de los receptores de cannabinoides CB2, reduce la proliferación de células de cáncer de mama humano mediante el bloqueo de la progresión del ciclo celular y mediante la inducción de la apoptosis. En particular, detiene las células de THC en G2-M a través de la baja regulación de Cdc2, según lo sugerido por la disminución de la sensibilidad al THC adquirida por las células que sobreexpresan Cdc2. De interés, el patrón de la proliferación de las células epiteliales mamarias humanas normales era mucho menos afectadas por el THC. También se analizaron por PCR en tiempo real cuantitativa de la expresión de los receptores CB1 y CB2 en una serie de tumores de mama humano y muestras no tumorales. Se encontró una correlación entre la expresión de CB2 y el grado histológico de los tumores. También hubo una asociación entre la expresión de CB2 y otros marcadores de valor pronóstico y predictivo, como el receptor de estrógeno, receptores de progesterona, y ERBB2/HER-2 oncogén. Es importante destacar que no se detectó expresión de CB2 significativa en el tejido no tumoral de mama. Tomados en conjunto, estos datos podrían establecer las bases para una terapia de cannabinoides para el tratamiento del cáncer de mama. Hay muy pocas decisiones críticas que las células deben tomar durante toda su vida. Básicamente, se trata de la posibilidad de proliferar, diferenciarse o morir. Una estricta 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

      regulación del ciclo celular es crucial para el control de todas estas decisiones, y su desregulación tiene consecuencias devastadoras, como el cáncer. Se ha propuesto que los cannabinoides, los componentes activos de Cannabis sativa, juegan un papel en el control de las decisiones mencionadas. Por ejemplo, pueden modular la supervivencia, proliferación, y diferenciación en función del tipo de célula y de su contexto fisiopatológico. Entre los ~ 70 cannabinoides sintetizados por C. sativa, Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) es el más importante en términos de potencia y abundancia. El THC ejerce una amplia variedad de

efectos

biológicos

mediante

la

imitación

de

compuestos

endógenos,

los

endocannabinoides anandamida y 2-araquidonoilglicerol, que activan los receptores de cannabinoides específicos. Hasta el momento, dos receptores cannabinoides específicos acoplados a la proteína G se han clonado a partir de tejidos de mamíferos: CB1, abundantemente expresado en el cerebro y en muchos sitios periféricos, y CB2, expresado casi exclusivamente en el sistema inmune. La participación de estos receptores por THC o endocannabinoides afecta a varias vías de señalización, algunos de ellos directamente implicados en el control del destino de la célula. Por ejemplo, los cannabinoides modulan las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la 3-kinase/Akt vía de supervivencia fosfatidilinositol, que tiene un papel prominente en el control del crecimiento y la diferenciación celular. Debido a la creciente evidencia de que los cannabinoides participan en el control de destino de la célula y al hecho de que el ciclo celular es un proceso clave subyacente en la regulación de decisiones de la supervivencia / proliferación / diferenciación, se decidió estudiar el efecto del THC sobre el ciclo celular y el mecanismo de acción de cannabinoides en este proceso. Debido a que los tumores de mama son una de las neoplasias humanas más comunes y una de las principales causas de muerte entre las mujeres occidentales. Por tiempo real los experimentos de PCR cuantitativa, se han observado una correlación entre la expresión de CB2 y el grado histológico de los tumores de mama. Además, la expresión de CB2 es mayor en los tumores con baja respuesta predicha a las terapias convencionales, por ejemplo ER-/PR- tumores, que son débilmente sensibles a tamoxifeno adyuvante. Además, los niveles apenas detectables de CB2 se encontraron en el tejido normal de mama. Debido a que tanto la detención del ciclo celular y la apoptosis inducida por el THC son efectos CB2 mediados, es tentador especular que los tumores con peor pronóstico (es decir, los más reacios a las terapias convencionales y, según los datos, que expresa los más altos niveles del receptor CB2), puede ser la más sensible a los cannabinoides. Además, los efectos psicotrópicos de los cannabinoides están mediados 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

      por CB1, pero no los receptores CB2, y, por lo tanto, una terapia a base de cannabinoides selectivos de los receptores CB2 sería desprovisto de los efectos secundarios asociados con el consumo de cannabis. El cáncer de mama es la enfermedad maligna más común entre las mujeres occidentales. Aunque las tasas de mortalidad de los pacientes de cáncer de mama han disminuido como resultado del diagnóstico precoz por mamografías, ciertos tumores de mama siguen siendo reacios a terapias convencionales, y los tratamientos actuales tienen efectos secundarios que afectan sustancialmente la calidad de vida del paciente. Estos hallazgos podrían sentar las bases de nuevas estrategias para el manejo del cáncer de mama. RESUMEN ABSTRACTO  

Se ha propuesto que los cannabinoides están implicados en el control del destino de la célula. Por lo tanto, estos compuestos pueden modular la proliferación, la diferenciación y la supervivencia de diferentes maneras dependiendo del tipo de célula y de su contexto fisiopatológico. Sin embargo, poco se sabe sobre el efecto de los cannabinoides en el ciclo celular, el proceso de control principal destino de las células. Aquí, se muestra que Δ9-tetrahidrocannabinol (THC), a través de la activación de los receptores de cannabinoides CB2, reduce la proliferación de células de cáncer de mama humano mediante el bloqueo de la progresión del ciclo celular y mediante la inducción de la apoptosis. En particular, detiene las células de THC en G2-M a través de la baja regulación de Cdc2, según lo sugerido por la disminución de la sensibilidad al THC adquirida por las células que sobreexpresan Cdc2. De interés, el patrón de la proliferación de las células epiteliales mamarias humanas normales era mucho menos afectado por el THC. También se analizaron por PCR en tiempo real cuantitativa de la expresión de los receptores CB1 y CB2 cannabinoides en una serie de tumor de mama humano y muestras no tumorales. Se encontró una correlación entre la expresión de CB2 y el grado histológico de los tumores. También hubo una asociación entre la expresión de CB2 y otros marcadores de valor pronóstico y predictivo, como el receptor de estrógeno, receptores de progesterona, y ERBB2/HER-2 oncogén. Es importante destacar que no se detectó expresión de CB2 significativa en el tejido no tumoral 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

 

 

 

de mama. Tomados en conjunto, estos datos podrían establecer las bases para una terapia de cannabinoides para el tratamiento del cáncer de mama. INTRODUCCIÓN  

Hay muy pocas decisiones críticas que las células deben tomar durante toda su vida. Básicamente, se trata de la posibilidad de proliferar, diferenciarse o morir. Una estricta regulación del ciclo celular es crucial para el control de todas estas decisiones, y su desregulación tiene consecuencias devastadoras, como el cáncer. Se ha propuesto que los cannabinoides, los componentes activos de Cannabis sativa, juegan un papel en el control de las decisiones mencionadas. Por ejemplo, pueden modular la supervivencia, proliferación, y diferenciación en función del tipo de célula y de su contexto fisiopatológico. Entre los ~ 70 cannabinoides sintetizados por C. sativa, Δ9-tetrahidrocannabinol (THC) es el más importante en términos de potencia y abundancia. THC ejerce una amplia variedad de efectos biológicos mediante la imitación de compuestos endógenos, los endocannabinoides anandamida y 2-araquidonoilglicerol, que activan los receptores de cannabinoides específicos. Hasta el momento, dos receptores cannabinoides específicos acoplados a la proteína G se han clonado a partir de tejidos de mamíferos: CB1, abundantemente expresado en el cerebro y en muchos sitios periféricos, y CB2, expresado casi exclusivamente en el sistema inmune. La participación de estos receptores por THC o endocannabinoides afecta a varias vías de señalización, algunos de ellos directamente implicados en el control del destino de la célula. Por ejemplo, los cannabinoides modulan las proteínas quinasas activadas por mitógenos y la 3-kinase/Akt vía de supervivencia fosfatidilinositol, que tiene un papel prominente en el control del crecimiento y la diferenciación celular. Debido a la creciente evidencia de que los cannabinoides participan en el control de destino de la célula y al hecho de que el ciclo celular es un proceso clave subyacente en la regulación de decisiones de la supervivencia / proliferación / diferenciación, se decidió estudiar el efecto del THC sobre el ciclo celular y el mecanismo de acción de cannabinoides en este proceso. Debido a que los tumores de mama son una de las neoplasias humanas más comunes y una de las principales causas de muerte entre las mujeres occidentales, decidimos concentrar nuestros estudios sobre este tipo de cáncer en particular. 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

 

 

 

MATERIALES  Y  MÉTODOS  

Cultivo de células y la viabilidad. Células MCF-7 y T-47D EVSA-T, MDA-MB-231, MDAMB-468, y SKBR3 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection. Las células se mantuvieron en RPMI 1640 o DMEM suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 5 unidades / ml de penicilina, y 5 mg / ml de estreptomicina. Células epiteliales mamarias humanas (HMEC) y se cultivaron en medio de crecimiento epitelial mamaria de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ligados cannabinoides se prepararon en DMSO. Las incubaciones de control tenían el contenido de DMSO correspondiente. No se influencia significativa de DMSO se observó sobre la viabilidad celular a la concentración final utilizado (0,1-0,2%, v / v). La viabilidad celular se determinó por el 3 – (4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5-prueba difeniltetrazolio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ANÁLISIS  DE  TRANSFERENCIA  WESTERN.  

Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, y las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno. Las transferencias se incubaron con los siguientes anticuerpos: anti-Cdc2 fosforilado (Tyr15), anti-ciclina B1, anti-Cdc25C, anti-p27, anti-caspasa-3, y anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) Anti- Cdc2 y anti-p21, anti-Wee1, anti-survivin y anti-α-tubulina como control de carga. Luminograms se obtuvieron con un kit de detección de quimioluminiscencia, y el análisis densitométrico se realizó con el software MultiAnalyst. ANÁLISIS  DEL  CICLO  CELULAR.  

Las células se permeabilizaron y se fijaron en 1% (w / v) de albúmina de suero bovino y 30% de etanol-PBS y se marcaron con 5 mg / ml de Hoechst 33342. La intensidad de fluorescencia se analizó usando un citómetro de flujo LSR. Se registraron diez mil células por análisis. APOPTOSIS.  

Las células se incubaron en tampón de unión [10 mmol / l de HEPES (pH 7,4), 2,5 mmol / l de CaCl2, 140 mmol / l de NaCl] suplementado con Anexina V-FITC. El yoduro de propidio se añadió 1 minuto antes de que el análisis de muestras. La 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

 

 

 

intensidad de fluorescencia se analizó utilizando un flujo FACS Scalibur citómetro. Para los experimentos de triple tinción, las células se marcaron con Hoechst 33342, y la apoptosis se analizó como se describe anteriormente. Se registraron diez mil células por análisis. LA  ACTIVIDAD  CASPASA-­‐3.  

Actividad de la caspasa-3/7 se determinó con un sustrato luminógeno de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La luminiscencia se determina en un lector de fluorescencia de microplacas. LAS  MUESTRAS  DE  TEJIDO.  

Las muestras se obtuvieron del Banco de Tumores Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas. El grado histológico se evaluó de acuerdo con los criterios de Elston y Ellis. La tinción inmunohistoquímica para los factores pronósticos y predictivos se realizó por el método Envision con un antígeno de la etapa de recuperación de calor inducido. Se utilizaron anticuerpos monoclonales para receptores de estrógenos (ER), receptores de progesterona (PR), p53, y Ki67. ERBB2/HER-2 expresión se evaluó usando Herceptest (DAKO). El porcentaje de células con tinción nuclear inequívoca para ER, PR, Ki67 y p53 se anotó, y un punto de corte de 5% se utilizó para la positividad de ER y PR y 15% para Ki67 y p53. Para ERBB2/HER-2, sólo los casos con 3 + tinción membranosa fue evaluado como positivo. ANÁLISIS  DE  MICROSCOPÍA  CONFOCAL  DE  LOS  RECEPTORES  CANNABINOIDES.  

se analizaron el cáncer de mama humano y de mama 5 micras secciones normales tejidos embebidos en parafina. Se utilizaron anticuerpos primarios contra los receptores CB1 y CB2. Anticuerpo secundario anti-conejo Alexa Fluor 594 era de Molecular Probes. Los núcleos celulares se tiñeron con YOYO-. Imágenes de fluorescencia confocal fueron adquiridos utilizando software de láser de Sharp 2000 (Bio-Rad). PCR  CUANTITATIVA  EN  TIEMPO  REAL.   2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

 

 

 

ARN total y ADNc se obtuvieron de tumores de mama congelados o líneas celulares como se describió anteriormente. Sondas Taqman para CB1 humano, CB2, y 18S ARN fueron de Applied Biosystems.

PLÁSMIDOS  Y  TRANSFECCIONES.  

pIRESpuro2 y pIRESpuro2-Cdc2. Las transfecciones se llevaron a cabo con Fugene 6 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron con puromicina. ANÁLISIS  ESTADÍSTICO.  

ANOVA con un análisis post hoc mediante la prueba de Student-Newman-Keuls se utilizó de forma rutinaria. Para la expresión de los receptores cannabinoides en muestras humanas, los datos de registro se transformaron para lograr la normalidad en la distribución. Una prueba F se llevó a cabo posteriormente para comparar la igualdad de las varianzas de cada grupo, y una prueba de la t clásica o en la prueba con diferentes variaciones se aplicó mediante la modificación de Welch. RESULTADOS   THC  INHIBE  LA  PROLIFERACIÓN  DE  CÉLULAS  DE  CÁNCER  DE  MAMA  HUMANO.  

Varias líneas celulares de mama humanos se incubaron con el THC, y el número de células viables se estimaron. THC disminución de la proliferación en todas las células tumorales probadas. Entre las células tumorales, los que tienen el fenotipo más agresivo (ER-) eran más sensibles al THC. Sorprendentemente, no tumoral células HMEC fueron los más resistentes al tratamiento cannabinoide. Rimonabant, un antagonista selectivo del receptor CB1, no bloqueó el efecto de THC en las células EVSA-T o cualquiera de las otras líneas celulares estudiadas. En contraste, SR144528, un antagonista selectivo del receptor CB2, impidió parcialmente la disminución inducida por el THC-de la proliferación celular EVSA-T. Tanto PCR con transcripción inversa (RT-PCR) y en tiempo real los experimentos de PCR 2015 Este documento es solo para fines educativos y uso no comercial. Más información en www.medicalcannabiscostarica.org

 

 

 

cuantitativa confirmó la expresión de ARNm de CB2 en esta línea celular, mientras que CB1 mRNA fue indetectable.

DISMINUCIÓN  INDUCIDA  POR  EL  THC-­‐DE  LA  PROLIFERACIÓN  CELULAR  ES  DEBIDO  AL   BLOQUEO  DE  LA  TRANSICIÓN  G2-­‐M.  

A continuación trató de examinar si una alteración del ciclo celular EVSA-T subyace THC efecto anti proliferativo. El cannabinoide aumentó el número de células en el compartimiento de G0-G1 y, en paralelo, se redujo el número de células en la fase S. En la concentración más alta ensayada (5 mol / L), el THC también produjo lo siguiente: (a) un incremento en el número de células en las fases G2-M y (b) la aparición de una población de células hipo diploides. Estos dos últimos efectos fueron impedidos por SR144528. Es importante destacar que, el THC no alteró el perfil del ciclo celular de las células HMEC. LA  DETENCIÓN  DEL  CICLO  CELULAR  INDUCIDA  POR  EL  THC-­‐SE  ASOCIA  CON  LA   APOPTOSIS.  

A continuación tratamos de dilucidar si la inhibición inducida por el THC de la proliferación se asocia con la muerte celular. La apoptosis inducida por cannabinoides, un proceso que fue impedido por SR144528. THC también indujo un aumento de dos veces en la actividad de la caspasa-3, un efecto que fue impedido por SR144528. Del mismo modo, se observó reducción de los niveles de ambos pro-caspasa-3 (el precursor inactivo de la caspasa-3) y PARP (un sustrato de la caspasa-3) en las células tratadas con cannabinoides. Posteriormente abordamos la cuestión de si las células apoptóticas fueron los arrestados en G2-M por THC. Hemos llevado a cabo experimentos de triple tinción para analizar el porcentaje de células apoptóticas en cada fase del ciclo celular. THC indujo apoptosis en todas las fases del ciclo celular, pero la mayoría de las células apoptóticas estaban en el compartimiento de G2-M.

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LOS  RECEPTORES  CANNABINOIDES  SE  EXPRESAN  EN  LOS  TUMORES  DE  MAMA   HUMANOS.  

La presencia de los receptores CB1 y CB2 en los tumores de mama humanos se evaluó por PCR en tiempo real cuantitativo y microscopía confocal. Se detectaron niveles más bajos de ARNm de CB1 en los tumores de bajo a medio (grado 1-2) y alta (grado 3) en comparación con el grado histológico normal, tejido de mama no canceroso (grado 1-2 en comparación con el tejido no canceroso de mama (p = 0,008), grado . 3 en comparación con el tejido no canceroso de mama (p = 0,0007) expresión de CB2 fue más alta que la expresión de CB1 en todos los tumores analizados (p = 0,00002) y parecía estar en correlación con su grado histológico (grado 1-2 frente a grado 3, P = 0,04). De interés, las transcripciones CB2 eran difícilmente detectable en el tejido normal de mama. Por otra parte, la expresión de CB2 mostró una asociación con marcadores moleculares de valor pronóstico. Por lo tanto, los tumores ER-expresaron más CB2 ARNm de tumores ER + expresión CB2 también fue mayor en PR-que en PR + muestras. ER-/PR- tumores (tasa de respuesta