UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA

Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo

EFECTIVIDAD DE EXTRACTOS VEGETALES EN EL MANEJO DE LA MONILIASIS (Moniliophthora roreri) DEL CACAO (Theobroma cacao L.) EN MÉXICO Sustentante: MC. SANDRA ISABEL RAMÍREZ GONZÁLEZ DIRECTOR DR. ORLANDO LÓPEZ BÁEZ

Trabajo sometido a consideración del Tribunal Evaluador como requisito al Grado de Doctora en Ciencias Naturales para el Desarrollo, con énfasis en Sistemas de Producción Agrícolas Universidad Nacional Heredia, Costa Rica 2013

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA

Sustentante: MC. SANDRA ISABEL RAMÍREZ GONZÁLEZ

TRIBUNAL EXAMINADOR:

_____________________________________ Dr. Orlando López Báez Universidad Autónoma de Chiapas – México Director de Tesis

____________________________________ Dr. Tomás de Jesús Guzmán Instituto Tecnológico de Costa Rica Asesor

___________________________________ Dra. Sayra Munguía Ulloa Universidad Nacional de Costa Rica Asesora

___________________________________ Dr. Willy Soto Acosta Representante del SEPUNA

___________________________________ Dr. Freddy Araya Rodríguez Coordinador General del DOCINADE Universidad Nacional. Heredia. Costa Rica 2013 2

DEDICATORIA

A Dios …. por que sin él nada puede pasar en mi vida. A mi familia ….. por su apoyo, paciencia y todo el cariño que me dan. A mis dos grandes amores Orlando y Carolina…. Gracias por su comprensión y amor y por ser mi soporte y mi inspiración para ser mejor cada día.

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AGRADECIMIENTOS A la Universidad Nacional de Costa Rica, el Instituto Tecnológico de Costa Rica, y la Universidad Nacional a Distancia Costa Rica, por su invaluable esfuerzo y la oportunidad que nos han brindado con la creación y puesta en Marcha del Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, un gran aporte para el desarrollo de nuestros países Latinoamericanos. A mis Profesores del DOCINADE, gracias por sus enseñanzas y los grandes aportes que me brindaron en mi formación. A la Universidad Autónoma de Chiapas, la Fundación Produce Chiapas y los productores de cacao, por su apoyo en la realización de esta investigación. Al Dr. Freddy Araya Rodríguez, Coordinador General del DOCINADE. Gracias por su apoyo y gestión enfrente del programa. Al Dr. Orlando López Báez, Director de la Tesis, gracias por su apoyo y sus grandes enseñanzas, las cuales me han permitido lograr esta meta tan importante en mi vida. Al Dr. Tomás de Jesús Guzmán, Asesor de la Tesis, de quien desde el inicio del Doctorado y a pesar de la distancia he recibido un gran apoyo y entusiasmo, gracias por sus enseñanzas y por la gran labor que ha realizado en el DOCINADE que nos ha permitido a muchos cursar un Doctorado. A la Dra. Sayra Munguía Ulloa, Asesora de la Tesis, gracias por su apoyo en el transitar del doctorado y en el desarrollo de la Tesis, pilar fundamental del DOCINADE y de quien siempre recibí comentarios oportunos para lograr culminar esta meta. Al Dr. Guillermo Pinieres Carrillo, Profesor de la Universidad Nacional Autónoma de México y del DOCINADE, gracias por su disponibilidad y apoyo en el desarrollo de la tesis. Al Dr. Benjamín Velasco Bejarano, Profesor del DOCINADE y Director del Laboratorio Nacional de Prevención y Control del Dopaje-CONAD, por su invaluable apoyo en la realización de los análisis fitoquímicos. A la M.Sc. Martha Beatriz Ramírez, Profesora de la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia, por su asesoría y apoyo en el desarrollo de la Tesis. A la QFB. Julieta Méndez Ramírez, Asistente del Laboratorio de Cacao de la UNACH, gracias por tu gran apoyo y colaboración en el desarrollo de la tesis.

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INDICE GENERAL Página DEDICATORIA AGRADECIMIENTO ÍNDICE GENERAL ÍNDICE DE CUADROS ÍNDICE DE FIGURAS ÍNDICE DE ANEXOS RESUMEN SUMMARY INTRODUCCIÓN CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO 1.1. Antecedentes 1.2. Planteamiento y definición del problema 1.3. Justificación 1.3.1. Magnitud del problema 1.3.2. Trascendencia del problema 1.4. Alcances de la investigación 1.5. Objetivos 1.5.1. Objetivo General 1.5.2. Objetivos Específicos 1.6. Supuestos o Hipótesis

CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO 2.1. El cacao, origen, distribución e importancia mundial 2.2. El cacao en México 2.2.1. Situación actual del cacao en México 2.3. La moniliasis del cacao 2.3.1. Origen y dispersión 2.3.2. Importancia económica de la moniliasis del cacao 2.3.3. Clasificación Taxonómica 2.3.4. Etiología 2.3.5. Sintomatología 2.3.6. Ciclo del hongo 2.3.7. Epidemiología 2.3.7.1. Fuentes de inóculo 2.3.7.2. Condiciones ambientales favorables a la enfermedad 2.3.7.3. Diseminación de Moniliophthora roreri 2.3.8. Tecnologías generadas para el manejo de la moniliasis 2.4. Los extractos de plantas y su poder para el manejo de problemas fitosanitarios 2.4.1. Metabolitos Secundarios CAPITULO 3. METODOLOGIA 3.1. Diseño de la investigación

iii iv v viii x xii xv xvi xvii 1 2 5 6 6 7 8 9 9 9 9

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3.2. Ubicación geográfica 3.3. Materiales 3.3.1. Material biológico 3.3.2. Material de Laboratorio 3.4. Métodos 3.4.1. Obtención de extractos vegetales 3.4.1.1. Presurizado 3.4.1.2. Hidrolato por destilación 3.4.1.3. Fermentado aeróbico 3.4.1.4. Fermentado anaeróbico 3.4.2. Aislamiento del patógeno 3.4.3. Trabajo en condiciones de laboratorio 3.4.3.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar 3.4.3.2. Método de discos de papel 3.4.3.3. Método de disco de papel Kirby-Bauer 3.4.3.4. Determinación del medio para la formación y germinación de conidias de monilia 3.4.3.5. Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de conidias de M. roreri 3.4.4. Trabajo en condiciones de campo 3.4.4.1. Determinación del ciclo de la enfermedad 3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación 3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles de cacao 3.4.5. Caracterización fitoquímica de los extractos

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CAPÍTULO 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 4.1. Fase 1. Trabajo en condiciones de laboratorio 4.1.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar 4.1.1.1. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) 4.1.2. Evaluación de extractos sobre M. roreri mediante el método de discos de papel 4.1.2.1. Determinación de un control químico 4.1.3. Evaluación de los extractos sobre M. roreri mediante el método de discos de papel Kirby-Bauer 4.1.3.1. Determinación de un control químico 4.1.4. Determinación del medio para la germinación de conidias de monilia 4.1.5 Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de conidias de M. roreri 4.2. Fase 2. Trabajo en condiciones de campo 4.2.1. Determinación del ciclo de la enfermedad 4.2.1.1. Síntomas y signos de la moniliasis en frutos inoculados con M. roreri 4.2.1.2. Porcentaje de la ocurrencia de síntomas y signos desarrollados por la inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao

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4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M. Roreri 4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación 4.2.2.1. Incidencia de M. roreri 4.2.2.2. Severidad externa ocasionada por la inoculación de M. Roreri 4.2.2.3. Severidad interna ocasionada por la inoculación de M. Roreri 4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles de cacao 4.2.3.1. Incidencia de la enfermedad 4.2.3.2. Producción de cacao 4.3. Análisis económico 4.4. Análisis de los compuestos de los extractos CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA ANEXOS

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INDICE DE CUADROS Página Cuadro 1. Tratamientos a evaluar. Cuadro 2. Comparación de tres Métodos de evaluación de la efectividad reguladora de extractos de plantas y productos de síntesis química sobre el crecimiento de M. roreri. Cuadro 3. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre la cantidad de conidias totales de M. roreri. Cuadro 4. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre la cantidad de conidias germinadas de M. roreri. Cuadro 5. Tiempo de aparición de síntomas y signos en frutos de cacao inoculados con M. roreri. Cuadro 6. Porcentaje de ocurrencia de síntomas y signos desarrollados por la inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao. Cuadro 7. Índice de severidad interna en frutos inoculados con M. roreri. Cuadro 8. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del Índice de Severidad Externa del efecto de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri. Cuadro 9. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del Índice de Severidad Interna del efecto de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri. Cuadro 10. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao. Cuadro 11. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del efecto en la producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri, en una plantación comercial. Cuadro 12. Costo de labores culturales desarrolladas en una hectárea de cacao del Clon UNACH 130. Cuadro 13. Costo de aplicación por hectárea de los tratamientos sobre el clon de cacao UNACH 130. Cuadro 14. Ingresos por venta de semillas de cacao seco producido en cada uno de los tratamientos aplicados sobre el Clon UNACH 130. Cuadro 15. Análisis económico de cada uno de los tratamientos aplicados sobre el Clon UNACH 130.

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Cuadro 16. Comparación de los tiempos de retención (TR) y porcentaje de abundancia obtenidos en GC-MS de los extractos de canela y clavo. Cuadro 17. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada por el equipo de GC-MS del hidrolato de canela. Cuadro 18. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada por el equipo de GC-MS del Hidrolato de clavo.

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INDICE DE FIGURAS Página Figura 1. Conidióforos de M. roreri aislados de frutos infectados en plantaciones de Pichucalco, Chiapas – México. Figura 2. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre el crecimiento de M. roreri. Figura 3. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri. Figura 4. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre la formación de conidias de M. roreri. Figura 5. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre la formación de conidias de M. roreri. Figura 6. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C. zeylanicum sobre el crecimiento de M. roreri. Figura 7. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P. dioica sobre el crecimiento de M. roreri. Figura 8. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S. aromaticum sobre el crecimiento de M. roreri. Figura 9. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O. vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri. Figura 10. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C. zeylanicum sobre la producción de conidias de M. roreri. Figura 11. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P. dioica sobre la producción de conidias de M. roreri. Figura 12. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S. aromaticum sobre la producción de conidias de M. roreri. Figura 13. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O. vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre la producción de conidias de M. roreri. Figura 14. Efecto de los tratamientos sobre la formación de conidias de M. roreri. Figura 15. Efecto de los tratamientos sobre la germinación de conidias de M. roreri. Figura 16. Síntomas y signos presentes en frutos de cacao infectados con Moniliophthora roreri. Figura 17. Ciclo de M. roreri sobre clon UNACH 130, en condiciones de Tapachula, Chiapas – México. Figura 18. Efecto de extractos vegetales sobre la Incidencia de M. roreri en cacao por inoculación artificial. Figura 20. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral sobre la severidad externa producida por M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial. Figura 21. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral sobre la severidad interna producida por M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial. Figura 22. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y

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pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en chilillos de cacao. Figura 23. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre mazorcas de cacao. Figura 24. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre frutos de cacao. Figura 25. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en una plantación de cacao. Figura 26. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral sobre la producción de cacao. Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes solventes. Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes solventes. Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de canela: Aldehído cinámico. Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de clavo: Acetato de eugenol. Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del hidrolato de clavo.

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INDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Produccion Mundial de cacao. Anexo 2. Producción de cacao en México. Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre el crecimiento de M. roreri. Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey (P