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OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Número de publicación: 2 211 540

51 Int. Cl. : A61P 19/00

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A61P 19/10 A61K 45/06 A61K 31/00 A61K 31/138 A61K 31/4535

ESPAÑA

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TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA

T3

86 Número de solicitud europea: 00926864 .0

86 Fecha de presentación: 07.04.2000

87 Número de publicación de la solicitud: 1165184

87 Fecha de publicación de la solicitud: 02.01.2002

54 Título: Receptores de estrógenos y hueso.

30 Prioridad: 09.04.1999 GB 9908235

14.07.1999 US 143716 P

45 Fecha de publicación de la mención BOPI:

16.07.2004

ES 2 211 540 T3

Novum 141 57 Huddinge, SE

72 Inventor/es: Andersson, Goran;

Ohlsson, Claes y Gustafsson, Jan Ake

45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:

16.07.2004

73 Titular/es: KARO BIO AB.

74 Agente:

Gómez-Acebo y Duque de Estrada, Ignacio

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre concesión de Patentes Europeas). Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid

ES 2 211 540 T3 DESCRIPCIÓN Receptores de estrógenos y hueso. 5

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La presente invención se refiere a la selección de moduladores del receptor de estrógenos beta (REβ) para uso en terapia hormonal de reemplazo en enfermedad metabólica del hueso. Los antagonistas y agonistas parciales del REβ se pueden usar para aumentar el contenido mineral del hueso cortical y la dureza del hueso cortical. La deficiencia de estrógenos es uno de los factores de riesgo principales para el desarrollo de osteoporosis en mujeres post-menopáusicas. En especial, este trastorno es provocado principalmente por la severa disminución de los niveles séricos de estrógenos después del cese de la función de los ovarios. La ausencia de estrógenos provoca un aumento de la resorción ósea y un balance progresivamente negativo de la remodelación ósea, conduciendo a una reducción de la masa ósea trabecular y cortical y un aumento del riesgo de fractura ósea. La osteoporosis es generalmente precedida de una condición llamada “osteopenia”. La osteopenia es considerada una condición en la que el sujeto tiene un valor de DMO (densidad mineral ósea) entre 1 y 2,5 desviaciones estándar (D.E.) por debajo de la media para un adulto joven. En la osteoporosis, el DMO se encuentra más de 2,5 D.E. por debajo de la media de un adulto joven. Se considera que la osteoporosis se ha establecido, cuando se han producido una o más fracturas óseas. En la presente solicitud, términos como “tratamiento” o “prevención” o “minimización del riesgo” de “osteoporosis” abarcan el tratamiento o prevención o minimización del riesgo de “osteopenia” u “osteoporosis establecida”. La falta de estrógenos en mujeres post-menopáusicas, provoca un aumento del recambio óseo (Turner, R.T., y col (1994) Endocr Rev 15, 275-300) y un balance negativo de la remodelación ósea, conduciendo a la pérdida de hueso y a un aumento del riesgo de fracturas. La disminución de la masa ósea se puede prevenir con el tratamiento con estrógenos (Lindsay, R., y col (1976) Lancet 1, 1038-1041). Aunque el efecto conservador del hueso del reemplazo de estrógenos es indiscutible (Turner y col citado anteriormente (1994)), el mecanismo celular de acción para este efecto hormonal no se conoce suficientemente. Los osteoblastos expresan receptores estrogénicos (Eriksen, E.F., y col (1988) Science 241, 84-86, Komm, B.S., y col (1988) Science 241, 81-84), lo que sugiere un efecto directo de los estrógenos sobre el tejido óseo. Sin embargo, no se pueden excluir otros efectos indirectos de los estrógenos sobre el hueso.

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Se ha informado que un hombre que sea homozigota para una mutación de punto inactivadora en el gen REα, presenta falta de fusión de las placas de crecimiento y severa osteopenia (Smith, E.P., y col (1994) N Engl J Med 331, 1056-1061). Sobre la base de este hallazgo clínico, se ha asumido que el REα es importante para la fusión de las placas de crecimiento y el metabolismo óseo adulto al menos en personas de sexo masculino. Por el contrario, los ratones sin un REα funcional sólo tienen anormalidades esqueléticas menores (Taki, M., y col (1997) J Rone Miner Res 12, S460), lo que sugiere que podrían ser importantes otros mecanismos o receptores para la acción de los estrógenos durante el desarrollo esquelético del ratón.

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La presencia de receptores de estrógenos (REα y β) en las células del hueso sugiere que al menos algunos efectos estrogénicos se ejercen directamente sobre el tejido óseo.

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Clonar del novedoso receptor de estrógenos REβ, sugiere que podrían existir mecanismos alternativos de acción para los estrógenos (Kuiper, G.G., y col (1996) Proc Natl Acad Sci U S A 93, 5925-5930). Nosotros y otros investigadores, hemos demostrado que el REβ está expresado en los condrocitos y osteoblastos de las placas de crecimiento, lo que indica un posible papel del REβ en la regulación del crecimiento longitudinal del hueso y/o del metabolismo óseo adulto (Onoe, Y., y col (1997) Endocrinology 138, 4509-4512, Arts, J., Kuiper, G.G., y col (1997) Endocrinology 138, 5067-5070, Vidal, O., y col (1999) J Bone Miner Res 14, 923-929, Nilsson, L.O., y col (1999) J Clin Endocrinol Metab 84, 370-373; Windahl Bone 26, 117-121 (2000)). Sin embargo, el papel fisiológico del REβ en la regulación del crecimiento y metabolismo óseo aún se desconoce. Recientemente se han investigado los diferentes mecanismos moleculares de acción para el REα y el REβ. Los REα y REβ tienen dominios de unión al ADN casi idénticos, y los estudios in vitro han demostrado que los dos receptores tienen afinidades similares para los compuestos estrogénicos (Kuiper, G.G. y col (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93, 5925-5930, Kuiper, G.G., y col (1997) Endocrinology 138, 863-870, Tremblay, G.B., y col (1997) Mol Endocrinol 11, 353-365). La secuencia de aminoácidos del REβ difiere de la del REα en las regiones trans-activadoras N- y Cterminal. Por lo tanto, la activación transcripcional mediada por el REβ puede ser distinta de la del REα (Pacch, K., y col (1997) Science 277, 1508-1510). Considerando las grandes similitudes en la especificidad de unión a ligandos y al ADN, se ha especulado que una distribución diferencial de los receptores de estrógenos debe ser importante para mediar respuestas tisulares específicas a los estrógenos (Kuiper, G.G., y Gustafsson, J.A. (1997) FEBS Lett 410, 87-90). De este modo, los dominios trans-activadores particulares de los dos subtipos de receptores, en combinación con la distinta distribución tisular, o distribución en diferentes tipos celulares dentro de un tejido, podrían ser factores importantes para determinar la respuesta a los estrógenos en los tejidos diana. Recientemente hemos generado ratones que carecen de la proteína funcional del REβ e informamos que el REβ es esencial para la eficiencia de una ovulación normal, pero no es esencial para el desarrollo sexual femenino o masculino, para la fertilidad o la lactancia (Krege, J.H., y col (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95, 15677-15682). 2

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Los ratones sin la proteína funcional del receptor REβ fueron generados mediante manipulación dirigida de genes (gene targeting) (Krege, J.H. y col Proc. Natl. Acad. Sci. (1998), 95, 15677-15682. Los estudios que apuntaban a determinar el papel fisiológico del REβ sobre la estructura ósea y el contenido mineral del hueso se realizaron usando absorciometría dual de rayos X (conocida por su sigla en inglés, DXA) y Tomografía Computada Cuantitativa Periférica (conocida por su sigla en inglés, pQCT). Estas mediciones se aplicaron a ratones machos y hembras de 4 semanas de edad (pre-puberales) y 12 semanas de edad (adultos) de genotipos salvaje (+/+) o mutante (-/-). En los ratones prepuberales, los pesos corporales, longitud y contenido mineral de los huesos largos fueron indistinguibles entre los ratones salvajes o mutantes de cualquier sexo. Sorprendentemente, en hembras adultas REβ-/-, aumentó el peso corporal, los huesos femorales fueron más largos y tuvieron un aumento del contenido mineral óseo (DXA) comparados con las hembras salvajes de la misma edad. En realidad, los huesos de las hembras REβ-/- se masculinizaron de acuerdo con los parámetros analizados. Esta alteración fenotípica del hueso no se limitó a los huesos largos, sino que también se notó en los huesos vertebrales y craneales. En el hueso largo tibial, que tuvo su crecimiento longitudinal casi completo antes del comienzo de la pubertad, el aumento del contenido mineral del hueso fue todavía observable en las hembras adultas mutantes comparadas con las salvajes, demostrando que el aumento del contenido mineral óseo fue independiente del crecimiento longitudinal del hueso. Se conoce bien que la ooforectomía en roedores jóvenes en crecimiento produce una disminución de la densidad mineral del hueso trabecular pero también un aumento del crecimiento radial del hueso cortical. Estos dos efectos se revierten con el tratamiento con estrógenos. El aumento del contenido mineral óseo en las hembras REβ-/- no se debió al aumento de la densidad mineral del hueso trabecular sino al aumento del área de sección transversal del hueso cortical asociado con el crecimiento radial del hueso. Aparentemente el hueso cortical en las hembras adultas REβ-/- demuestra una pérdida de feminización, lo que indica que el REβ es esencial para el efecto estrogénico endógeno sobre el hueso cortical (crecimiento perióstico) en las ratonas. Cuando se emplearon análisis de pQCT para distinguir si los efectos de la depleción de REβ observados afectaban la densidad mineral del hueso trabecular o cortical, los resultados sorprendentemente demostraron que el aumento de la densidad mineral ósea se limitó al hueso cortical, y que la densidad mineral volumétrica del hueso trabecular no fue afectada. Esto es diferente al efecto de la depleción estrogénica durante la menopausia o posterior a ooforectomía, donde el efecto sobresaliente es sobre la densidad mineral del hueso trabecular. Las mediciones de los parámetros del hueso cortical evidenciaron que los huesos de las hembras REβ-/-, comparadas con sus hermanos de camada salvajes, exhibieron un aumento tanto de la circunferencia perióstica como endóstica, conduciendo a un aumento del área del hueso cortical. Se calculó que este aumento del área de sección transversal cortical resultó en un aumento correspondiente de 30% en los parámetros de resistencia del hueso, es decir el momento de inercia de la sección transversal cortical y el momento de resistencia cortical. Las propiedades biomecánicas de los huesos de las hembras REβ-/- también se pueden verificar usando, por ejemplo, pruebas de flexión y torsión. El documento WO97/09348 (Karo Bio AB) describe el clonado del receptor REβ descrito en Kuiper, G. 1996 citado anteriormente. El documento WO99/05170 (Universidad de Yale) describe la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de otra forma del gen del REβ y las secuencias de las proteínas relacionadas. El documento WO98/56812 (Karo Bio AB) describe ciertos ligandos selectivos para el REα y el REβ. Barkhem, T. y col., Molecular Pharmacology 54, 105-112 (1998) describe la selectividad de ciertos compuestos para diferentes formas del receptor de estrógenos. El documento WO99/11760 (Regentes de la Universidad de California) describe procedimientos de selección de compuestos de prueba para la activación diferencial de ligandos del REα y REβ en los sitios AP1. La presente invención es como se define en las reivindicaciones anexas.

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Los procedimientos de acuerdo con la invención se describirán ahora con referencia a las siguientes ilustraciones, Figuras 1 y 2, en las que: Figura 1 muestra las mediciones por DXA de los parámetros óseos de tibias resecadas; y

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Figura 2 es una exploración por DXA de una tibia (arriba y al medio) y una vértebra (abajo) de hembras REβ-/- y salvajes. En los siguientes ejemplos se usaron los procedimientos establecidos a continuación:

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Animales Se mantuvieron los animales bajo condiciones medioambientales estandarizadas, con acceso libre a la comida y el agua. Se realizó el estudio de genotipo de ADN de la cola a las 4-5 semanas de edad usando PCR con iniciadores parcialmente diferentes descritos previamente (Krege, J.H., y col (1998) citado anteriormente. Los iniciadores usados fueron un iniciador en el intrón 2 (βNHD4-25;5,-AGAATGTTGCACTGCCCCTGCTGC-3,), uno en el intrón 3 (C1wt27;5-GGAGTAGAAACAAGCAATCCAGACATC-3,) y uno en el casete Neo (Neo-25;5,-GCAGCCTCTGTTCCACA TACACTTC-3,). El programa de PCR usado fue: 95ºC 2 min, (95ºC 30 s, 64ºC 1 min, 72ºC 1 min) durante 30 ciclos, y 72ºC 7 min. Se amplificó un producto de 650 bp (βNHD4-25 y C1wt-27) para los ratones homozigotas salvajes (+/+), se amplificó un producto de 450 bp ((βNHD4-25 y Neo-25) para los ratones homozigotas mutantes (-/-) y se amplificaron las dos bandas para los ratones heterozigotas (+/-).

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ES 2 211 540 T3 Examen histológico

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Los fémures derechos fueron fijados en paraformaldheído al 4%, embebidos en parafina, seccionados y teñidos con Alcian blue/Van Gieson. Se midió el ancho de las placas de crecimiento usando un sistema procesador de imágenes (Easy Image, Bergströms Instrument, Estocolmo, Suecia) acoplado a un microscopio. Se calculó para cada fémur el promedio de las 30 mediciones de las placas de crecimiento (3 secciones, 10 mediciones por sección). Absorciometría Dual de Rayos-X (DXA)

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Se midieron la densidad mineral ósea areal (DMO Areal; CMO/cm2 ) y el contenido mineral óseo (CMO) con el software Norland pDEXA Sabre (Fort Atkinson, WI) y el software Sabre Research (3,6). Se realizaron mediciones in vivo de animales con el objeto de determinar el CMO corporal total, de la columna vertebral y del cráneo (barrido de resolución media con interlineado fijado en 0,05 cm). Se analizaron tres ratones por vez. Un ratón que fue sacrificado al comienzo del experimento se incluyó en todas las exploraciones como un estándar interno, con el objeto de evitar variaciones entre las exploraciones. Se realizaron mediciones ex vivo del fémur y la tibia izquierdos y la vértebra L5 extraídos y colocados sobre una mesa de Plexiglas de 1 cm de espesor. Todos los huesos comparados se midieron con la misma técnica (barrido de alta resolución con interlineado fijado en 0,01 cm). Tomografía computada cuantitativa periférica (pQCT)

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Se realizaron tomografías computadas con el Stratec pQCT XCT Research M (Norland, software versión 5,4B) operando a una resolución de 70 µm (Rosen, H.N., y col (1995) Calcif Tissue Int 57, 35-39).

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Se realizaron exploraciones de pQCT en el medio de las diáfisis de fémures y tibias para determinar la densidad mineral ósea volumétrica (DMO volumétrica) cortical, el área de sección transversal cortical, la circunferencia perióstica, la circunferencia endóstica, el momento de resistencia y el momento de inercia de la sección transversal. En los ratones, la región media de la diáfisis de fémures y tibias contiene solamente hueso cortical.

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Se realizaron pQCT de los fémures y tibias izquierdos para medir la DMO volumétrica trabecular. El tomógrafo fue posicionado en la metáfisis a una distancia de la placa de crecimiento distal correspondiente al 4% de la longitud total del fémur (un área que contiene tanto hueso cortical como trabecular). La región de hueso trabecular fue definida estableciendo un umbral interno de 400 mg/mm3 . Los coeficientes de variación (CV) entre ensayos para las mediciones de pQCT fueron menores a 2%. Debe enfatizarse que la técnica de DXA mide la DMO areal, mientras que la pQCT mide la DMO volumétrica real. De este modo, la técnica de DXA indica el contenido mineral por área y no por volumen. Por lo tanto, un factor que regule las dimensiones externas de un hueso, afectará la DMO areal (DXA) pero no la DMO volumétrica (pQCT). Peso corporal y dimensiones de los huesos

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Los ratones REβ-/- y los salvajes fueron analizados a 4 semanas de edad (pre-puberales) y 11 semanas de edad (adultos). El peso corporal y la longitud de los huesos largos permanecieron sin cambios en los ratones pre-puberales REβ-/- comparados con los ratones salvajes. No se observaron diferencias significativas relacionadas al sexo entre las hembras y los machos salvajes pre-puberales (prueba de t-test). Sin embargo, los ratones machos adultos, como se esperaba, fueron más fuertes y tuvieron tibias y fémures más largos que las hembras adultas (los resultados se presentan en la Tabla 1 y en la Figura 1, prueba de t-test).

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ES 2 211 540 T3 TABLA 1 Peso corporal y dimensiones de los huesos 5

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Los ratones de 4 semanas de edad se señalan como ratones pre-puberales (n=6 para hembras S y REβ-/-; n=7 para machos S y REβ-/-). Los ratones de 11 semanas de edad se señalan como ratones adultos (n=6/7 para hembras S y REβ-/-; n=5 para machos S y REβ-/-). El ancho de la placa de crecimiento del fémur se midió en el fémur distal. Los valores se expresan como media ± SEM.

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