INTRODUCCIÓN En los procesos de análisis clínicos que involucren directamente al tejido hepático, resulta de gran utilidad el determinar los niveles sericos de Transaminasas , como lo son la alanina aminotransferasa (ALT ó TGP) y la aspartato aminotransferasa (AST ó TGO), ya que comparando los valores de actividad ALT v/s AST, es posible determinar el origen hepático, ó en su defecto cardiaco , al observar alteraciones en estos patrones enzimáticos. Por otro lado , resulta muy útil para diferenciar hepatitis alcohólicas de otras hepatitis agudas, esto relacionando AST/ALT: En las hepatitis alcohólicas(con necrosis) este índice es generalmente mayor a 1 (AST aumentada por sobre ALT), mientras que en las hepatitis virales es generalmente menor a 1 (AST disminuida ante ALT). En fin cualquiera que sea el caso , la determinación de estas enzimas adquiere importancia diagnóstica cuando sus valores son enfrentados con valores de otras enzimas de similar origen tisular, permitiendo así completar un perfil enzimático de órganos como el hígado. MÉTODO DE REFERENCIA Y DE RUTINA TGO (AST, ASPARTATO AMINOTRANFERASA) METODO DE IFCC (FEDERACION INTERNACIONAL DE QUIMICA CLINICA) Descripción. La Aspartato aminotransferasa es una enzima que se encuentra localizada tanto a nivel citoplasmático como mitocondrial, de allí que se diga que es una enzima bilocular , se encuentra ampliamente distribuida en músculo esquelético, riñón , cerebro y principalmente en higado y corazón, donde esta en mayor concentración.Cualquier alteración en estos tejidos, se vera reflejado en un aumento en el torrente circulatorio de esta enzima, el cual será directamente proporcional al daño tisular. En aquellos pacientes con afecciones hepáticas se observan las mayores elevaciones de AST, sobre todo en aquellos casos de hepatitis con necrosis. Fundamento. La reacción es catalizada por la TGO (AST), ésta desplaza la reacción hacia la formación de Oxaloacetato que reacciona con la MDH (Malato Deshidrogenasa), de modo que la velocidad de oxidación del NADH medida a 340 nm, es directamente proporcional a la actividad de TGO en la muestra. En el medio de reacción hay además LDH (Lactato Deshidrogenasa) suficiente para consumir los cetoácidos de origen endógeno, evitando así su interferencia. Reacción. TGO L−aspartato + 2−oxoglutarato Oxalacetato + L−glutamato 1

Oxalacetato + NADH + H+ L−malato + NAD+ MDH Muestra. • Suero, Plasma (Heparinizado, EDTA). • Muestras hemolizadas no se aceptan ya que poseen elevados niveles de AST dentro de los eritrocitos. Linealidad. Si el cambio por minuto de absorbancia excede de 0.160 (340nm y 334 nm) ó 0.080 (365), diluir la muestra 1+ 4 con suero fisiológico. Multiplicar el resultado por 5. La absorbancia inicial debe ser superior a 0.8 A. En caso de no serlo se puede estar en presencia de actividades enzimáticas muy elevadas y obtener resultados erróneos. Diluir la muestra y reprocesarla. Metodología de Análisis. *Lectura: Hg 365 nm, 340 nm, 334 nm. *Paso Óptico: 1 cm. *Temperatura: 37°C. *Medición: Contra aire. Los reactivos y cubetas deben ser llevados a la temperatura del ensayo, la que debe mantenerse constante durante el desarrollo del test. Valores Normales.

Hombre Mujer

37°C (U/L) Hasta 37 hasta 31

Ventajas. • Simple y Rápido Desventajas. • Resulta imposible o poco práctico modificar las mezclas reactivas preestablecidas. • Sueros hemolizados dan valores falsamente aumentados. • Los sueros con concentraciones de cetoácidos endógenos elevados generan valores falsos elevados. • Pacientes hemodializados o con hipovitaminosis u otras patologias asociadas con déficit de Piridoxal Fosfato (coenzima), generan valores falsamente disminuídos. Consideraciones. 2

• A mayor temperatura se obtiene mayor sensibilidad , pero un menor rango de linealidad . • La preincubación con parte del reactivo es para evitar interferencia con cetoacidos endógenos del suero. • El Piridoxal fosfato es una coenzima necesaria en la actividad de la TGO, por ello esta última se ve afectada en ausencia de la misma. ejemplo: pacientes hemodializados o con hipovitaminosis. • Para evitar contaminación de reactivos , usar pipetas nuevas y no intercambiar las tapas de los reactivos. MÉTODO DE RUTINA Y REFERENCIA. TGP (ALT, ALANINA AMINOTRANFERASA) METODO IFCC (FEDERACION INTERNACIONAL DE QUIMICA CLINICA) Descripción. La alanina aminotranferasa es una enzima que tiene como única localización el citoplasma , de ahí que se le denomine unilocular. Su mayor actividad la presenta en el tejido hepático y la menor actividad en músculo esquelético, corazón, riñón, páncreas y eritrocitos (en ese orden). Por lo tanto la destrucción o cambio en la permeabilidad de membrana celular provoca la liberación de ALT a la circulación sanguínea. Su aumento se debe principalmente a alteración hepática (como colestiasis, hepatitis tóxicas o virales). En hepatitis viral el aumento de ALT precede a la aparición de ictericia, si los valores están aumentados por sobre 6 semanas, nos debe hacer pensar en una hepatitis activa o el comienzo de una hepatitis crónica. Fundamento. La reacción catalizada por ALT esta desplazada hacia al formación de piruvato, que reacciona inmediatamente con la LDH (Lactato Deshidrogenasa), de modo que la velocidad de oxidación del NADH, medida a 340 nm, es proporcional a la actividad de ALT en la muestra. El exceso de LDH en el medio es para consumir cetoácidos de origen endógeno, evitando así su interferencia. Reacción. TGP L−alanina + 2−oxoglutarato Piruvato + L−glutamato Piruvato + NADH + H L−lactato + NAD+ LDH Muestra. Suero, plasma heparinizado o EDTA. El oxalato , la heparina no inhiben la actividad enzimática , pero pueden causar cierta turbidez.

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La ALT es estable en suero durante 3 dias a temperatura ambiente y hasta una semana a 4°C.En la orina se encuentra poca o ninguna actividad, por lo cual no se recomienda para el análisis. Porcentaje de pérdida de actividad. 10% 17%

Refrigerada Hasta 25°C Linealidad.

Si el cambio por minuto de absorbancia excede de 0.160 (340 nm y 334 nm) ó 0.080 (365 nm), diluir la muestra 1 + 4 con suero fisiológico. Multiplicar el resultado por 5. La absorbancia inicial debe ser superior a 0.80 A. En el caso de no serlo se puede estar en presencia de actividades enzimáticas muy elevadas y obtener resultados erróneos. Diluir la muestra y reprocesarla. Valores de referencia.

Hombre Mujer

37°C (U/L) Hasta 40 Hasta 31

Metodología de análisis. • Lectura: Hg 365 nm, 340 nm, 334 nm. • Paso Óptico: 1 cm. • Temperatura: 37°C. • Medición: contra aire. Los reactivos y cubetas deben ser llevados a la temperatura del ensayo, la que debe mantenerse constante durante el desarrollo del test. Ventajas. • Simple y Rápido. • El uso de buffer TRIS nos permite que el NADH sea más estable que en otros métodos que usan fosfato. • El piridoxal 5−Fosfato(PP) es un activador más efectivo de la ALT en buffer Tris que en el de fosfato. • Este método tiene una alta especificidad , carencia de interferencias, alta linealidda, reproductibilidad y rapidez. Desventajas. • Sueros hemolizados generan valores falsos elevados, debido a que el eritrocito contiene 3 a 5 veces más ALT que el suero. • Sueros con concentraciones de cetoácidos endogenos elevados generan valores falsamente elevados. Consideraciones. • Muestras de pacientes hemolizadializados o con hipovitaminosis u otras patologías asociadas

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con déficit de Piridoxal Fosfato generan valores falsamente disminuidos. • A mayor temperatura , mayor sensibilidad, pero menor rango de linealidad . • Una absorvancia inicial bajo 0,800 D.O., estando reactivos en condiciones, indica una • muestra con muy alta actividad de TGP. Por lo tanto es necesario diluir la muestra. • Cuando la técnica se realiza como ensayo de punto final, la reacción presenta un efecto de retroinhibición por piruvato, este disminuye la linealidad. • No es conveniente modificar la formulación de un fabricante luego de adquirir los reactivos. MÉTODOS ALTERNATIVOS. Método de Reitman y Frankel. Esta es una reacción acoplada con dinitrofenilhidrazina (DNPH). Es una técnica colorimétrica y cuantitativa. Reacción. Alanina + cetoglutarato Glutamato + Piruvato Piruvato + DNPH Complejo formado por Pir−DNP−Hidrazona. La lectura se hace a 505 nm. Es una reacción de punto final. Es necesario un tiempo de retardo de la reacción con cetoglutarato, lo que permite el consumo de cetoglutarato endógeno y todo otro proceso que consuma NADH. Este retardo no debe ser inferior a 90 segundos. Muestra. • Suero. Método de Wrodlewski y LaDue. Este es un método enzimático cuantitativo. Alanina + cetoglutarato Glutamato + Piruvato LD Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+ Esta es una medición del consumo de NADH a 340 nm. Es de uso muy frecuente. La diferencia con el método de referencia es que este método requiere un tiempo de retardo no inferior a 90 segundos antes de la reacción con cetoglutarato para permitir el consumo de cetoglutarato endogeno y todo otro proceso que consuma NADH. Además se recomienda un período de preincubación de 10 minutos con el cofactor piridoxal−5−fosfato. Muestra. • Suero 5

MÉTODO ALTERNATIVO. (método propuesto por la AACC) A propuesto un método para los laboratorios pequeños de Química Clínica, el cual se diferencia del de la IFCC en que: 1.− Se emplea un solo reactivo para evitar el procedimiento en dos pasos. 2.− La reacción se lee después de 150 segundos , durante los 180 segundos siguientes. 3.− No se agrega Fosfato de Piridoxal. BIBLIOGRAFIA Título: Procedimientos Técnicos de Laboratorio Clínico Autor : Instituto de Salud Pública de Chile Editorial: El Instituto Santiago Chile 1994 Título: Química Clínica Autor: Anderson, Shauna C. Cackyne, Susan. Editorial Interamericana. Mexico 1995 Título: Química Clínica Métodos. Autor: Pesce, Amadeo J. Kaplan, Lawrence A. Editorial Panamericana B.A 1991 Argentina.

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