Bacteriofago Lambda (λ λ) Capítulo 8 Molecular Genetics of Bacteria. 3ed. L. Snyder & W. Champness ASM Press. Washington, D.C.

19/09/2016 Lautaro Diacovich

Bacteriófagos - Ciclo Vital

. Virulentos Crecen de manera Lítica
lisis de Hospedador (T4, T7) . Atemperados Capaces de formar LISÓ LISÓGENOS Integran su ADN al cromosoma bacteriano (λ, P1) Existen de manera latente o quiescente como PROFAGO Estímulo
Inducción
crecimiento LÍTICO

Organización génica del Fago λ - Genoma: dsDNA lineal (48.514 pb)
46 genes - Extremos cohesivos 5’ protruding (12 b, ssDNA) cos - Infección
se circulariza - DNA ligasa del húesped
DNA circular unido covalentemente - Genes agrupados según su función (Clusters) - Proteínas que actúan sobre el DNA, en regiones cercana a su gen

Vía lítica y lisogénica del Fago λ

Mapa genético del Fago λ

Mapa genético del Fago λ circularizado luego de la unión de los sitios cos

Ciclo lítico del Fago λ Tiempo del ciclo de vida (en min a 37ºC)

t=0

Adsorción del Fago, inyección del ADN

t=3

1er Síntesis del ARNm (pre-early)

t=5

Se sintetizan 2 clases de ARNm tempranos

t=6

Comienza la replicación del ADN

t=9

Comienza la síntesis de ARNm tardíos

t = 10 Comienza la producción de proteínas estructurales t = 22 Se completa la 1er partícula fágica t = 45 Lisis y salida de la progenie fágica

Productos génicos y sitios codificados por el ADN de λ

Regulación de la transcripción por anti-terminación (Proteína N) . ADN λ entra a la célula
Transcripción normal 2 ARNm cortos Sitios de terminación

. Proteína Cro
Inhibidor de la síntesis de un represor . Proteína N
Factor de anti-terminación Permite que la ARNpol continúe a lo largo del ADN

. Sitios nut
Necesarios para la acción de N . Mutaciones en los sitios nut
Previenen la expresión de los genes siguientes (cis acting) a los terminadores

D

. La unión de N con nut es con el ARNm y no con el ADN nutR nutR

. Proteínas del hospedador (Nus) asisten la unión. (mutaciones en E. coli que previene la muerte por λ) - Nus A – G también intervienen en mecanismos de anti-terminación en el hospedador no infectado

nutR

Esquema de la interacción RNApol – Proteína N – Proteínas Nus - RNAm

Regulación por anti-terminación – Sitios nut

Hairpin Box B
importante para la unión de N con el RNAm

Consecuencias . Complejo de Anti-terminación
Transcribe sobre tR1
genes O y P
Replicación . Producto del gen Q
Transcripción de genes tardíos . nutL
transcripción de genes gam y red
Recombinación

Regulación por anti-terminación (Proteína Q) Cascada de Regulatoria Anti-term N
gen Q
Anti-term Q
Transcripción de genes tardíos (cabeza, cola) . ARNpol
Transcribe una ARN corto (16-17 nt) a partir de promotor pR’ y para (sitio de pausa) . Sitio de pausa
región -10 ~ al promotor . Protína Q se carga sobre la ARNpol en pausa
permite que la ARNpol continúe . Transcripción de genes tardíos

Particularidades:

- Secuencia cercana a promotor, sitio qut - Proteína Q se une al ADN (no en el ARNm) - ARNpol en el sitio de pausa

Otros ejemplos de regulación por anti-terminación . . . . .

P22 Genes Bacterianos (operon bgl E. coli – genes de aminoacil-ARNt sintetasa B.subtilis) Secuencias similares nut Regulación de genes eucariotas (oncogen myc en mamíferos) Virus del SIDA

Desarrollo Lítico del Fago λ Organización génica del Fago λ

Q

3 ETAPAS • Expresión de genes N y cro • Expresión de genes con roles en Replicación y Recombinación • Expresión de genes tardíos: - Proteínas cabeza y cola de la partícula fágica - Enzimas de lisis celular

Replicación del ADN de λ ADN λ
lineal
Circular (extremos cohesivos o sitios cos) “sticky” ADN ligasa
unión covalente

. . . . .

Corte en sitios cos Sistema Ter EMPAQUETAMIENTO

O y P
ADN priming (ori) O
torsión del ADN (~ DnaA) O  P
DnaB (helicasa) P “Pirate” (~ DnaC) Síntesis de ARN (pR) Separación de hebras Primer Replicación a la derecha

. Horquilla de Replicación en ambas direcciones Hebra Lider Hebra Retrasada . Gam

Fago λ como herramienta de clonado Vectores de clonado derivados del fago λ . Multiplicidad de

λ y alto número de copias

. Síntesis de grandes cantidades de ADN y Proteínas . Proteínas tóxicas (no sintetizada hasta que el fago no infecta la célula) . Bibliotecas de fagos fáciles de almacenar (cabeza estable de λ)

Cósmidos . Empaquetamiento del ADN de λ
reconocimiento de sitios cos . Cualquier ADN ~ 50 Kb con 2 sitios cos puede ser empaquetado en la cabeza de λ . Plásmidos con sitios cos (ventaja para uso en ingeniería genética) . Empaquetamiento in vitro en tubo (plásmidos - extractos de cél. infectadas con λ - cabeza-cola) . Utilizadas para introducir cósmidos en células por infección (↑ eficiencia) . Tamaño limitado del ADN (fragmento de similar tamaño
Librerías de ADN)

Lisogenia . Estado lisogénico de λ
muy pocos genes se expresan . Evidencia
Las células conteniendo el profago son inmunes a la super-infección por λ . Placas de λ características . λ mutantes (cI, cII, cIII)
Previenen la formación del lisógeno (placas claras)

Placas de Lisis (placas claras)

Lisogenia – Producto del gen cII . Competencia entre CII y los productos de los genes líticos (1% Lisogenia) . Factores ambientales y riqueza del medio . CIII
Inhibe la degradación de CII por una proteasa celular (rol indirecto)

ACTIVADOR

REPRESOR

Integración del fago λ . . . . .

Int
Recombinasa sitio-específia (Y recombinase family – Tyr) Integración en región no esencial del cromosoma de E. coli (no hay fenotipo) Otros fagos se integran en genes esenciales (adaptaciones) Sitio attP (interno)
Mapa del profago diferente al λ empaquetado Recombinación sitio-específica
att no similares (modelo Campbell)

secuencia O (15 pb) GCTT T(TTTATAC)TAA

Mantenimiento de la Lisogenia . Lisogenia establecida
el gen del represor cI es un de los pocos transcriptos . CI
se une a 2 regiones operadores (oR y oL – pR y pL) . Previene la transcripción de la mayoría de los genes de

λ

. En estado profágico
se transcribe el gen represor cI a partir del pRM y no de pRE

￬ ￬ CI ⇒ Transcripción de genes líticos . Niveles óptimos de CI

↑ ↑ CI ⇒ Dificultad para inducir el profago Desperdicio energético por síntesis de CI

. Mecanismo de regulación de síntesis del represor en Lisogenia
Modelo de otros sistemas . Represor CI
2 dominios (dimerización – unión) Modelo: Proteína con dominios separables C-terminal: Promueve la formación de dímeros y tetrámeros N-terminal: Se une a la secuencia operadora del ADN . CI
puede actuar como ACTIVADOR según la circunstancia

Mantenimiento de la Lisogenia Regulación de la Síntesis del Represor CI

CI previene la transcripción de genes O y P

CI Regula su propia transcripción ACTIVADOR

Débil unión de CI con OR3 y OL3

Represión de la transcripción de los genes de λ REPRESOR TORSIÓN del ADN

Estabilización por Tetramerización

Regulación Robusta Unión Cooperativa

CI

Crystal structure of the lambda repressor and a model for pairwise cooperative operator binding. Stayrook, S.E., Jaru-Ampornpan, P., Ni, J., Hochschild, A., Lewis, M. Journal: (2008) Nature 452: 1022-1025

N-Terminal CI

DNA

Inmunidad a la Superinfección Durante la lisogenia: . Represor CI

Previene la transcripción de genes de λ por unión a los sitios operadores Previene la re-infección por otro fago por unión a sus sitios operadores

. Bacteria Lisogénica
Inmune a la superinfección con λ Puede ser infectada con otros fagos con sitios operadores diferentes (CI no puede unirse)

FAGOS

. Heteroinmunes
Secuencias operadoras diferentes . Homoinmunes


Secuencias operadoras iguales

(Independientemente de la similitud o diferencia en el resto de los genes)

Inducción del fago λ . Profago
ADN de la célula hospedadora sufre un daño severo por irradiación o químicos Inducción del profago
Ciclo Lítico Proceso de Reparación

Auto-

Inducción del fago λ - Proteína Cro . Temprano durante la Inducción
Continua la síntesis del Represor CI: ● Interfiere con el desarrollo lítico ● Podría provocar el reestablecimiento de la lisogenia . Cro previene la síntesis de CI

- Previene la represión por CI - Activa su propia síntesis

- Previene la unión de CI - = Operadores OL - pL
no reprimido Síntesis de Int y Xis

Affinity of oR for Cro: oR3 > oR2 = oR1

Unión de la proteína Cro a la región operadora del ADN

Inducción del fago λ – Escisión . Represor sin acción
Transcripción a partir de pL y pR
Escisión del ADN λ del cromosoma . Recombinación sitio específica
Sitios híbridos attP-attB
Int y Xis (luego de la Inducción)

- Transcripción conjunta - Xis no es necesaria - Provocaría la escisión luego de la integración Exonucleasa 3’-5’

Retro-regulación Regulación por secuencias downstream (mutaciones estabilizan el ARNm)

Regulación postranscripcional No hay secuencia nutL No se une N

Activación por CII

. Int/Xis
Escisión ADN . O y P se transcriben (pR) . Replicación de λ ADN . ADN dañado (min)
Ciclo lítico

. Nivel CI ￬￬

. Lisis celular
100 fagos (1h) (medio y temp)

Competición entre Ciclo Lítico y Lisogénico

No hay CI

Competencia entre el activador CII y Cro

(MOI – Estado metabólico de la célula Medio de crecimiento – temp)

(0,1%)

Medio rico Proteasas Se degrada CII

Medio pobre Proteasas No se degrada CII

DNA dilutes out the CI repressor

ARN antisentido activado por CII

Competición entre Ciclo Lítico y Lisogénico Table 8.3

Steps leading to lytic growth and lysogeny

Steps leading to lytic growth

Steps leading to lysogeny

1. Transcription from pL and pR

1. Same as for lytic growth

2. N and Cro are made

2. Same as for lytic growth

3. N allows CII expression

3. Same as for lytic growth

4. CII degraded

4. CII stable

5. Low CII concentration means

5a. High CII concentration activates pI, and so Int is made and λ DNA integrates

that little CI is made

5b. High CII concentration activates pRE, 6. Cro binds at OR3 and OL3, blocking binding by any low

and so CI is made 6. CI outcompetes Cro, and so CI binding at OR3 and OL3 both represses pL and pR

level of CI that is made 7. Meanwhile, N allows O and P replication gen transcription

and positively autoregulates at pRM, mantaining lysogeny

8. A second antiterminator, Q, allows late-gene transcription, and so λ phage particles are made

Transducción Especializada . Transducción generalizada
el fago porta y puede transducir DNA de la células hospedadora (cualquier región y solo ADN de la célula) . Transducción especializada
el fago porta solo genes cercanos a la región de attachment (transporta tanto genes de la célula como fágicos)

Transducción Especializada

Di-lisógeno

Otros fagos que forman lisógenos (P2, P4, Mu)

Utilización de la forma lisogénica de fagos como vectores de clonado . Fagos atemperados
pueden multiplicarse como fagos
grandes cantidades de ADN . Se integra al cromosoma
Estudios de complementación (2 copias del mismo gen) . Facilita el mapeo genético y reemplazo de genes: - Fago sin sitio att
con un fácil marcador de selección (ATBR) - Mapeo genético – genes sin fenotipo - Gen de interés clonado en el ADN del fago - Se introduce por empaquetamiento in vitro en infección o transfección - Recombinación

Conversión Lisogénica y Patogénesis Bacteriana Como los fagos pueden contribuir a la patogenicidad de bacterias

. Profagos pueden portar factores de virulencia o toxinas
Patogenia de la bacteria lisogénica . Morons (more DNA): Se pueden expresar a partir de su propio promotor aunque otros genes del fago estén reprimidos Ejemplos . E. coli y Disentería: Toxina Shiga (diarrea hemorrágica) φ361
E. coli O157:H7 . Corynebacterium diphtheriae (difteria)
Lisógeno de fago β
gen tox
Enz. mata cel. euc. . Vibrio cholerae (cólera)
CTXφ φ fago filamentoso ssADN
genes ctxA y ctxB . Clostridium
botulismo y tétanos

Experimentos Genéticos con fago λ Genética de la Lisogenia de λ . Aislamiento de mutantes involucradas en la lisogenia
Placas claras (mutantes de tipo C) . Infección con 2 fagos mutantes
Test de Complementación (ambos forman placas claras)
Monitoreo de formación de lisógeno
Inmunidad a la infección . Identificación de mutantes: cI, cII, cIII, Int (trans), vir (oR y oL) (cis) - CII y CIII necesarias para generar el lisógeno, pero no para mantenerlo - CI estrictamente requerido para generar y mantener el lisógeno Genética del represor CI . Proteína Modular . Complementación intragénica . Célula lisogénica con fago con una mutación termosensible en cI Infectado con fagos con diferentes mutaciones termosensible en cI . TEMP. NO PERMISIVA
Lisis
Represor CI inactivado
Lisógeno
mutaciones complementarias (sólo unas pocas bacterias) . Mutaciones
C-terminal
Unión al ADN
N-terminal
Formación de dímero

Experimentos Genéticos con fago λ Genética del represor CI