Centro de Investigaciones Marinas Universidad de la Habana

Aislamiento, clonaje y caracterización biológica del ADN complementario de la Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos de Litopenaeus schmitti (Decapoda: Penaeidae)

Tesis presentada en opción al Título Académico de Master en Biología Marina y Acuicultura con Mención en Acuicultura

Autor: Lic. Yuliet Morera Darias Tutores: Dra. Laida Ramos Trujillo Dr. Mario Pablo Estrada García

Centro de Investigaciones Marinas Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología

Ciudad de la Habana -2009-

A mi niña

Quisiera agradecer a todas las personas que colaboraron con la realización de este trabajo, especialmente:

A la Lic. Juana Maria Lugo, o mejor, Joana, mi compañera y amiga con quien he contado desde mis inicios en el CIGB. Siempre brindándome sus experiencias y salvando mis novatadas. A quien le agradezco la revisión minuciosa de este documento y le deseo una excelente defensa de doctorado. A mi tutora, la Dra. Laida Ramos por iniciarme en el mundo de la camaronicultura, brindarme sus conocimientos y enseñarme a seguir pa´lante pese a las dificultades. A mi tutor Dr. Mario Pablo Estrada a quien admiro y respeto por su sabiduría y ser un ejemplo de jefe. A la Mcs. Yamila Carpio por aceptar la oponencia de la tesis y a quien le deseo una excelente defensa de doctorado. A mis compañeros del CIM, Tania, Yami, Sylvi, Tsai, Bécquer, Joycie, Erick P, German, Olivia, Lázaro, Leandro, Raul, Ivan, Niurka, por ofrecerme el área experimental y ayudarme tanto. A mis compañeros del CIGB, Alina, Jannel, Yami, Aymee, Boris, Lili, Rebeca, Tony, Fide, Osmany por su colaboración y a Reynold por el ¨tiempo de máquina¨. A los compañeros de síntesis de oligonucleótidos del CIGB por los servicios prestados. A la empresa GEDECAM (particularmente a Natacha) y al Centro de Desove de Yaguanabo por la donación de los camarones. A mi familia y amigos por su ayuda incondicional, porque sin ellos habría sido muy difícil seguir adelante. A mi niña por darme momentos especiales y a quien dedico este trabajo.

Resumen El desarrollo alcanzado en la camaronicultura hasta el presente exige estudios cada vez más novedosos en vista a enfrentar nuevos retos. En este sentido resulta necesario el conocimiento de la estructura-función de los neuropéptidos de la familia de la Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos (familia HHC). Ella juega un importante papel en el metabolismo y la fisiología influyendo directamente sobre la muda, el crecimiento, la reproducción, el metabolismo de la glucosa y lípidos, entre otras. La Hormona Hiperglucemiante de Crustáceos (HHC) es el componente mayoritario de la familia HHC y el único neuropéptido aislado y secuenciado hasta el presente. Ella es una hormona pleiotrópica y su función principal es regular el nivel de glucosa en la hemolinfa. La purificación de los neuropéptidos a partir de su fuente natural de expresión requiere de cientos de pedúnculos oculares de camarón. Mientras que la obtención del ADN complementario (ADNc) que codifica para la HHC de pedúnculo ocular es una alternativa para obtener la HHC en cantidades suficientes y biológicamente activa para posteriores estudios biológicos en camarones peneidos. En este trabajo, conociendo la secuencia aminoacídica de la HHC de Litopenaeus schmitti, se diseñaron oligonucleótidos degenerados capaces de aislar el ADNc de la HHC en camarones peneidos. Como resultado se obtuvo por primera vez el ADNc de 216 pares de bases que codifica para la región madura de la HHC de L. schmitti. Los análisis de secuencia del fragmento amplificado por TR-RCP revelaron una alta homología con otras HHC en camarones peneidos. El análisis de la expresión tejido-específica de la HHC por Northern blot, mostró que el ARN mensajero (ARNm) de la HHC está presente en el pedúnculo ocular pero no se encuentra en músculo y estómago. Sin embargo, el análisis semicuantitativo de TR-RCP reveló su presencia en los tres tejidos. Para contar con suficiente cantidad de la HHC biológicamente activa, en este trabajo se clonó el ADNc (216pb) de la HHC de L. schmitti en el vector de expresión pTYB2. Como resultado se obtuvo la HHC recombinante expresada en E. coli como proteína de fusión a la inteina y formando parte de los cuerpos de inclusión. La purificación de la proteína de fusión se realizó por el método de electroelusión. La HHC recombinante mostró capacidad para incrementar el nivel de glucosa en la hemolinfa in vivo en Litopenaeus vannamei. Los animales con ablación bilateral del pedúnculo ocular inyectados con la HHC recombinante mostraron una actividad hiperglicémica semejante a la mostrada por el grupo control positivo (animales sin ablación inyectados con PBS). Mientras que, se observaron diferencias significativas en la concentración de glucosa respecto a los grupos control negativo que consistieron en animales con ablación bilateral del pedúnculo ocular inyectados con la proteína inteina (p