DETERMINACIÓN DE PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO DE LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS Y SU VALOR EN LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ESPECIALIDAD EN PATOLOGÍA ANATÓMICA Y CLÍNICA BOGOTÁ D.C. 2010

DETERMINACIÓN DE PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO DE LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS Y SU VALOR EN LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL

EDWIN ABRAHAM MEDINA MEDINA CÓDIGO 05-597608

Trabajo presentado para optar al título de especialista en Patología Anatómica y Clínica

DIRIGIDO POR RAFAEL ENRIQUE ANDRADE PÉREZ ADRIANA LINARES BALLESTEROS CARLOS SAAVEDRA ANDRADE

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ESPECIALIDAD EN PATOLOGÍA ANATÓMICA Y CLÍNICA BOGOTÁ D.C. 2010

AGRADECIMIENTOS

A la sección de Oncohematología Pediátrica de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia quienes atendieron los pacientes que fueron considerados para la ejecución de este estudio. A la sección de Inmunoquímica del Laboratorio Clínico de la Fundación Santa Fe de Bogotá quienes hicieron las adquisiciones de los casos analizados y prestaron toda su colaboración en la recolección de los registros electrónicos. A Fredi Alexander Díaz Quijano MD, MSc, PhD(c), por su análisis estadístico de los datos y sus aportes conceptuales para comprender mejor la epidemiología inmersa en este trabajo. A mis directores quienes con su constante consejo permitieron llevar a feliz término esta actividad.

Edwin Medina MD

CONTENIDO 1. 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.4.1 1.1.4.2 1.1.5 1.1.5.1 1.1.5.1.1 1.1.5.1.2 1.1.5.1.3 1.1.5.1.4 1.1.5.1.5 1.1.5.2 1.1.5.2.1 1.1.5.2.2 1.1.5.2.3 1.1.5.2.4 1.1.5.2.5 1.1.6 1.1.6.1 1.1.6.2 1.1.7 1.1.7.1 1.1.7.2 1.1.7.3 1.1.7.4 1.1.7.5 1.1.7.6 1.1.7.7 1.1.7.8 1.1.7.9 1.1.8 1.2 1.2.1 1.2.1.1 1.2.1.2 1.2.1.3 1.2.1.4

INTRODUCCIÓN MARCO TEÓRICO LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA Definición Epidemiología Etiopatogenia Manifestaciones Clínicas Leucemia Linfoblástica B Leucemia Linfoblástica T Diagnóstico Leucemia Linfoblástica B Morfología Citoquímica Inmunofenotipo Genética Diagnóstico diferencial Leucemia Linfoblástica T Morfología Citoquímica Inmunofenotipo Genética Diagnóstico diferencial Estratificación de riesgo y establecimiento de pronóstico Leucemia Linfoblástica B Leucemia Linfoblástica T Tratamiento Inducción Terapia preventiva del Sistema Nervioso Central Intensificación Terapia de continuación Tratamiento de pacientes de muy alto riesgo en primera remisión completa Tratamiento de la recurrencia Transplante alogénico de células madre hematopoyéticas Complicaciones del tratamiento Nuevas perspectivas terapéuticas Polimorfismo enzimático BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA Morfología y maduración normal de médula ósea Células Madres Hematopoyéticas Línea mieloide/monocítica Línea eritroide Línea megacariocítica

Pág. 12 14 14 14 15 15 17 17 17 18 19 19 19 19 20 21 21 22 22 22 23 23 23 24 25 25 28 28 28 29 29 29 30 30 32 32 34 34 34 35 36 37

1.2.1.5 1.2.2 1.2.3 1.3 1.4 1.4.1 1.4.2 1.4.3 1.5 1.5.1 1.5.1.1 1.5.1.2 1.5.1.3 1.5.1.4 1.5.1.5 1.5.2 1.5.3 1.5.3.1 1.5.3.2 1.5.3.3 1.5.3.4 1.5.3.5 1.5.3.6 1.5.4 1.5.5 1.5.6 1.6 1.6.1 1.6.2 2. 3. 3.1 3.2 4. 4.1 4.2 4.3 4.4

Línea linfoide B Patrones morfocitométricos clínicamente relevantes Técnicas moleculares de estudio de médula ósea ESTUDIO DE SANGRE PERIFÉRICA MEDICIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL Definición Técnicas de medición Periodicidad de la medición PAPEL DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD RESIDUAL MÍNIMA Descripción de la técnica Anticuerpos Antígenos Reacción antígeno-anticuerpo Inmunofenotipificación Consideraciones generales de la aplicación clínica del estudio de inmunofenotipo por Citometría de Flujo Detección inmunofenotípica de Enfermedad Mínima Residual Fenotipos asociados a leucemia Expresión cruzada de antígenos Expresión asincrónica de antígenos Sobreexpresión de antígenos Fenotipos ectópicos Patrones anormales de dispersión de luz Vías anormales de maduración Cambios fenotípicos Sensibilidad del inmunofenotipo por citometría para la detección de Enfermedad Mínima Residual Valor clínico del inmunofenotipo en la investigación de Enfermedad Mínima Residual DETERMINACIÓN DE PLOIDIA POR CITOMETRÍA DE FLUJO Descripción de la técnica Estudios realizados JUSTIFICACIÓN OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL OBJETIVOS ESPECÍFICOS MATERIALES DISEÑO UNIVERSO MUESTRA SELECCIÓN DE CASOS

Pág. 37 38 41 41 41 42 43 45 50 50 51 52 52 53 54 60 63 64 65 65 66 66 66 66 67 67 68 68 69 71 73 73 73 74 74 74 74 74

4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12 5. 5.1 5.1.1 5.1.2 5.2 5.3 5.4 6. 7. 8. 9. 10. 10.1 10.2 10.3

10.4 10.5 11.

CRITERIOS DE INCLUSIÓN CRITERIOS DE EXCLUSIÓN SEGUIMIENTO DE PACIENTES RESULTADOS PRIMARIOS RESULTADOS SECUNDARIOS Y SUBROGADOS ANÁLISIS ESTADÍSTICO FUENTES DE ERROR PREDECIBLES DIFUSIÓN DE RESULTADOS MÉTODOS MÉTODOS DIAGNÓSTICOS Diagnóstico Clínico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños Diagnóstico Hematopatológico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños MÉTODOS TERAPÉUTICOS MÉTODOS DE SEGUIMIENTO MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA EJECUCIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES CONSIDERACIONES ÉTICAS E IMPACTO AMBIENTAL PROPIEDAD INTELECTUAL PRESUPUESTO RESULTADOS PERFILES INMUNOFENOTIPOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA EN NIÑOS UTILIDAD DEL ESTUDIO DE INMUNOFENOTIPO POR CITOMETRÍA DE FLUJO PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL PARÁMETROS DE ALTERACIONES FENOTÍPICAS ÚTILES PARA LA APROXIMACIÓN DIAGNÓSTICA Y DE SEGUIMIENTO EN LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR Y REPRODUCIBILIDAD METODOLÓGICA DISCUSIÓN DE RESULTADOS CONCLUSIONES REFERENCIAS ANEXOS

Pág. 74 75 75 75 75 75 75 76 77 77 77 77 80 80 81 83 84 86 87 88 88 95

96 99 101 104 106 114

INDICE DE TABLAS Tabla 1.1 Tabla 1.2 Tabla 1.3

Síntomas de presentación de LLA por grupos de edad Caracterización de LLA acorde a morfología Caracterización de pronóstico en LLA acorde a variables clínicas Tabla 1.4 Medicamentos empleados en terapéutica de LLA Tabla 1.5 Anticuerpos monoclonales de importancia terapéutica Tabla 1.6 Metodologías útiles en detección de Enfermedad Mínima Residual Tabla 1.7 Calendario de evaluación de médula ósea para detección de EMR Tabla 1.8 Inmunofenotipo básico de líneas hematológicas normales Tabla 1.9 Problemas comunes de la citometría de flujo Tabla 1.10 Aberraciones fenotípicas de mayor utilidad en detección de EMR Tabla 6.1 Cronograma (años 2006-2010) Tabla 9.1 Presupuesto global (en miles de $) Tabla 9.2 Descripción de los equipos por adquirir (en miles de $) Tabla 9.3 Servicios Técnicos (en miles de $) Tabla 9.4 Publicaciones y Patentes (en miles de $) Tabla 10.1 Caracterización de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda 2005-2009 Tabla 10.2 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo B Tabla 10.3 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo T Tabla 10.4 Perfil de antígenos infrecuentes en Leucemia Linfoblástica Aguda de niños 2005-2009 Tabla 10.5 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009 que presentaron eventos adversos Tabla 10.6 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009 que presentaron eventos adversos acorde a la presencia de alteraciones fenotípicas Tabla 10.7 Antígenos asociados con la aparición de eventos sobre el total de pacientes Tabla 10.8 Antígenos asociados con la aparición de eventos en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda prepreB Tabla 10.9 Características operativas de definiciones de fenotipo según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA general) Tabla 10.10 Características operativas de definiciones de fenotipo según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA prepreB) Tabla 10.11 Niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual asociados a eventos

Pág. 18 18 25 27 32 44 45 54 60 64 83 87 87 87 87 88 89 89 91 92 93 93 94 94 95 96

Tabla 10.12 Distribución de alteraciones fenotípicas útiles para la aproximación diagnóstica y de seguimiento de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños Tabla 10.13 Distribución de infraexpresión de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños Tabla 10.14 Distribución de sobreexpresión de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños Tabla 10.15 Distribución de expresión cruzada de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños Tabla 10.16 Distribución de expresión asincrónica de antígenos en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños Tabla 10.17 Concordancia interobservadores en la detección de blastos en estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA

Pág. 97 97 98 98 98 100

INDICE DE GRÁFICAS Gráfica 10.1 Niveles de detección de blastos en estudios de seguimiento de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en el Hospital La Misericordia 2005-2009 Gráfica 10.2 Regresión logística de acuerdo entre datos reportados y observados de estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA

Pág.

96 99

INTRODUCCIÓN Las neoplasias hematolinfoides son un gran grupo de enfermedades que constituyen una de las principales causas de morbimortalidad en niños y adultos. En el grupo pediátrico generan más de 3000 nuevos casos anuales de enfermedad en los Estados Unidos, acarreando costos en tratamiento superiores a cien mil dólares paciente/año, sin contar el impacto afectivo que genera en los pacientes y sus familiares, y en la comunidad, en la que usualmente se promueven movimientos en pro de la salud de los menores. Los padres, por lo general organizados en sociedades de lucha contra el cáncer, buscan todos los medios para brindar al menor las condiciones que le permitan llevar de la mejor forma posible las penurias y dolencias de su enfermedad. A pesar de los esfuerzos en estudiar e investigar sobre neoplasias infantiles, sólo hasta los últimos años, en los cuales el análisis a nivel molecular de las enfermedades ha logrado un sitial importante, su conocimiento era bastante escaso; sin embargo, ya se conocen genes relacionados con gran cantidad de neoplasias y los factores que desencadenan los cambios celulares necesarios para el desarrollo de un gran número de enfermedades. Igualmente, existe gran interés por establecer las alteraciones del microambiente uterino que predisponen al desarrollo de cáncer posnatal, así como el desarrollo de neoplasias in-útero. En general, el estudio del cáncer en niños es un área de interés creciente y sobre el cual queda aún mucho por decir. En lo particular de las neoplasias hematolinfoides, se ha avanzado mucho con el conocimiento del proceso de maduración en múltiples pasos y se ha comprendido mejor las alteraciones que ocurren para el desarrollo de leucemias. Específicamente, el desarrollo de técnicas moleculares y el estudio de inmunofenotipo ha cambiado por completo los enfoques diagnóstico, terapéutico y pronóstico de las leucemias, y se ha incrementado el interés por establecer los niveles de enfermedad mínima residual. Sin embargo, nuestro conocimiento sobre enfermedad mínima residual es escaso, y nuestro medio carece de estudios propios en los cuales se haya demostrado la real utilidad de estas técnicas en lo concerniente a rendimiento operativo y correlación clínica. Esta coyuntura abre un espacio para la investigación clínica con orientación básica como la que se quiere desarrollar con el presente estudio. El presente trabajo se articula sobre una somera revisión sobre los tópicos más relevantes en la comprensión de leucemia linfoblástica, su estudio diagnóstico y pronóstico, técnicas de estudio de enfermedad residual y brevemente algunos conceptos de terapéutica. Se hace especial énfasis en el estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo y su utilidad en medición de enfermedad mínima residual, debido a que es el enfoque especial del trabajo. Continúa con la

descripción de los puntos más importantes del diseño de la propuesta de investigación y finaliza con los resultados esperados. Se espera que los resultados del presente trabajo permitan a nuestra comunidad médica mejorar los estándares de tratamiento y establecer nuestra definición de riesgo, aplicable a los pacientes, para orientar la terapéutica con base en éste.

1. MARCO TEÓRICO La siguiente revisión engloba los elementos más relevantes para comprender la enfermedad objeto de nuestro estudio. No se busca agotar el tema, puesto que es excesivamente extenso, y resultaría inoficioso recoger la totalidad de conceptos expresados en relación con la enfermedad. Considerando lo anterior, la revisión se orienta a comprender la enfermedad, cómo afecta a la población y cuáles son los puntos básicos en los cuales se presentan las alteraciones que desencadenan el desarrollo de la neoplasia, con una brevísima revisión de los conceptos actuales de terapia y pronóstico basados en el riesgo. 1.1 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA Las neoplasias hematolinfoides han sido consideradas históricamente como un gran grupo de enfermedades que comparten entre sí el compromiso de médula ósea, y otros órganos, por la expansión clonal y desordenada de una, o varias, líneas celulares originadas de una célula alterada. Desde las clasificaciones más antiguas, pasando por FAB y REAL, y la actual clasificación de OMS, se ha demostrado la dificultad que plantean estas neoplasias en su comprensión y el incremento en la información disponible para su diagnóstico, pronóstico y tratamiento. Algunos de los avances más significativos en la terapia de leucemias en los últimos veinte años han ocurrido con las leucemias linfoblásticas agudas B y T. La “tasa de cura”, o períodos libres de enfermedad a cinco años, supera para algunas leucemias B el 80%. Sin embargo, algunos tipos están relacionados con bajas tasas de remisión y altas tasas de recurrencia. Los perfiles citogenéticos, el genotipo y el inmunofenotipo de las células malignas han tenido considerable impacto en el reconocimiento de la estratificación de riesgo con el reconocimiento de grupos de bajo y alto riesgos. Esta estratificación ha permitido el desarrollo de regímenes terapéuticos más específicos, logrando tasas de remisión más altas en grupos de alto riesgo, y reduciendo la toxicidad en los grupos de bajo riesgo. (Brunning 2001, Campana 2004, Pui 2000) 1.1.1 Definición. La Leucemia Linfoblástica de precursores B (LLA-B), así como el linfoma linfoblástico, es una neoplasia que compromete el linaje de células B, compuesto de células blásticas de tamaño pequeño a mediano, con escaso citoplasma, cromatinas dispersas o moderadamente condensadas y nucléolos mínimos, que involucra la médula ósea y la sangre. Similar descripción cobija a las neoplasias de precursores T. (Brunning 2001) La Leucemia Linfoblástica y el Linfoma Linfoblástico comparten la misma unidad biológica, por lo que en muchos pacientes la diferenciación entre ellos no se realiza, o se basa simplemente en el compromiso preferente de médula ósea

(leucemia) o ganglios linfáticos (linfoma). Cuando al momento de la presentación el paciente presenta masa o blastos de menos del 25% en médula ósea, se prefiere el término de linfoma. (Brunning 2001) 1.1.2 Epidemiología. La leucemia linfoblástica aguda es la forma más frecuente de neoplasia en niños y jóvenes, representando el 32% de las neoplasias en menores de 15 años y 26% en menores de 20 años. (Ravindranath 2003) El pico de incidencia ocurre entre los 2 y 5 años de edad y es más común en varones blancos, situación que se ha incrementado en las últimas 2 décadas. (Chan 2002) El riesgo de leucemia es más alto en países industrializados como se observa en EEUU, Italia, Australia, Suiza y Japón, y más bajo en África y Asia. (Redaelli 2005) La leucemia representa cerca de la tercera parte de las neoplasias en niños, correspondiendo hasta el 80% a leucemia linfoblástica B, 17% a leucemia mieloide aguda, y el porcentaje restante a leucemias agudas y crónicas poco frecuentes. (Ziegler 2005) La leucemia linfoblástica (LLA) es una enfermedad principalmente de niños y adolescentes, sin embargo un segundo pico más pequeño se observa en mayores de 70 años. (Redaelli 2005) Se estima una incidencia anual en EEUU de 3200 casos, de los cuales el 80-85% corresponde a precursores de fenotipo B, y sólo 15% de precursores T. (Brunning 2001, Ravindranath 2003) Ajustado por edad el riesgo de desarrollo de leucemia en EEUU para el 2000 es de 1.4 por 100000 habitantes en población general, y se eleva a 3 por 100000 en menores de 19 años. (Redaelli 2005) El 75% de las LLA de precursores B se presenta en niños menores de 6 años, sin predominio de ningún género. Por el contrario, las LLA de precursores T se presentan con mayor frecuencia en adolescentes y niños mayores, con predominio de género masculino. (Brunning 2001) En relación con la raza, la LLA es más frecuente en población blanca que negra con razón 10:6, y en los EEUU se observa con mayor frecuencia entre los latinos de Los Ángeles. (Redaelli 2005) Las leucemias linfoblásticas presentan tasas de curación de hasta el 80%, mientras que su contraparte mieloide alcanza escasamente el 40-50% de éxito. (Ravindranath 2003) La mortalidad ha sido calculada en 0.5 por 100000 habitantes ajustado por edad, con ligero incrementó en el género masculino con 0.6 por 100000. La tendencia de incidencia se mantiene para la mortalidad en lo concerniente a raza. (Redaelli 2005) 1.1.3 Etiopatogenia. La etiología de las leucemias linfoblásticas es aún poco conocida, pero se ha postulado que el interjuego de las regulaciones a la baja de genes supresores de tumor y a la alta de oncogenes sumado a un desencadenante medioambiental generan el cambio neoplásico en las células. (Redaelli 2005) Hay evidencia que sugiere un factor genético en algunos casos (Brunning 2001), y otras que están relacionadas con enfermedades específicas

como el síndrome de Down o la anemia de Fanconi, pero ellos cuentan sólo para la minoría de casos. (Ziegler 2005, Chan 2002) Aparentemente, la leucemia se inicia con un evento in-utero, el cual se ha demostrado por análisis molecular de células mononucleares de muestras de sangre de cordón luego del nacimiento; dichas alteraciones, luego de varios años, son expresadas de igual modo en el fenotipo neoplásico. (Ziegler 2005, Rubnitz 2003, Ravindranath 2003) Se ha establecido que el uso por la gestante de ciertas sustancias como marihuana, antihistamínicos, anfetaminas, entre otras, pueden incrementar el riesgo en el hijo de presentar leucemia en la niñez, mientras que el uso sistemático de folato durante el embarazo ha reducido hasta en 60% los casos de neoplasia. (Ziegler 2005) No se ha podido establecer el papel de factores medioambientales tales como campos electromagnéticos, exposición a radón, pesticidas y tabaquismo materno en el desarrollo de la enfermedad. (Chan 2002) Otros factores posiblemente implicados incluyen exposición nuclear residencial u ocupacional en los niños o los padres, radiaciones no ionizantes, pesticidas, benceno, vitamina K, aceite de hígado de bacalao, inhibidores de la topoisomerasa II naturales y manufacturados, nitratos de la dieta (“hot dogs”) y el consumo de agua contaminada con tricloroetilieno. (Redaelli 2005) El estudio por técnicas de citogenética de sangre de cordón ha demostrado translocaciones específicas de leucemia t(12;21) ó la fusión TEL-AML1 hasta en el 1% de los recién nacidos. Se ha reportado similar presentación de lesiones premalignas del neuroblastoma y tumor de Wilms, con lo que se sugiere que la mayoría de las neoplasias infantiles se origina in-utero, pero tienen baja penetrancia (50 Estos hallazgos son de importancia pronóstica y son usados para modificar tratamientos en enfermedad pediátrica. Con los tratamientos actuales, los grupos de buen pronóstico son: hiperploidía entre 51 y 65 cromosomas, correspondiente a DI (contenido de DNA) por citometría de flujo de 1.16 a 1.6; y t(12;21)(p12;q22), la cual es resultado de la fusión del gene TEL en 12p13 con el gen del factor codificante de transcripción AML1 en 21q22. Los hallazgos relacionados con pobre pronóstico son: 1) t(9;22), la cual resulta de la fusión de BCR en 22q11.2 y el gen de tirosina quinasa citoplásmica ABL en 9q34, y produce una proteína de fusión en niños p190kd BCR/ABL y en la mitad de casos de adultos p210kd y los restantes p190 (predomina en LMC). 2) LLA de precursores B en estados tempranos de diferenciación pueden tener t(4;11) con fusión del gen MLL en 11q23 que codifica una proteína putativa que liga DNA y AF4 en 4q21; otra translocación en 11q23 resulta de la fusión del locus MLL con otras parejas de genes. LLA con anormalidades 11q23 pueden surgir también relacionadas a la terapia de leucemia secundaria a etopósido. 3) t(1;19), encontrada en el 25% de las LLA-B de niños con expresión citoplásmica de mu, fusiona el gen que codifica el factor de transcripción E2A en 19p13.3 con PBX en 1q23, asociado con pobre pronóstico. 4)

Hipodiploidía está asociada con pobre pronóstico. Otras anormalidades (del(6q), del(9p), del(12p), hiperploidías 0,01% implicaba riesgo de recurrencia en 3 años de 42,1% frente al 6,6% de los pacientes sin EMR, en un primer reporte, y en un segundo reporte los valores se incrementaron a 68% de recurrencia en grupo EMR positivo, y en 10% en el grupo negativo. También anota que detectar niveles absolutos de >10 blastos/µl en el día 33 y >1 blasto/µl en la semana 12 se asoció con recurrencia del 100% comparado con el 6% en pacientes con estudio negativo. En relación con el trasplante de células madre señala que la detección de EMR >10-3 se correlaciona con recurrencia general, mientras que EMR entre 10-3-10-5 se relaciona con recurrencia de 27%. Igualmente, anota que gran parte de las controversias surgidas entre los autores radican en las diferencias propias de las técnicas y el momento de la realización del estudio; cuando el estudio es realizado al final de la inducción, diferencias sutiles en la sensibilidad de la prueba (v.g. 10-4 Vs. 10-4.3) pueden significar diferencias porcentuales de detección de pacientes del 40 al 60%. (Moppett 2003) Sievers publicó en su artículo que la detección de EMR a los 1, 3 y 5 meses en pacientes con recurrencia fue de 82%, 60% y 42%, respectivamente, mientras que en los pacientes que no recurrieron se detectaron niveles de EMR en 32%, 10% y 0%, respectivamente. Igualmente, pacientes con niveles de EMR mayores de 1% al final de la inducción, mayores de 0,1% en la semana 14 son marcadores de alto riesgo y requieren intensificación de la terapéutica. (Sievers 2000, Izraeli 2004) Sandlund estudió la utilidad del análisis de EMR en médula ósea en los días 15 y 22-25 de la terapia. Encontró que la persistencia de >1% de linfoblastos en el día 15 tenían menos remisión completa al día 43 (89%) que los pacientes sin esa condición (99%), y que la presencia del mismo nivel de linfoblastos entre los días 22-25, la remisión completa era del 59%. La supervivencia sin eventos a 5 años en pacientes con y sin EMR>1% al día 15 fue de 40% y 78%, respectivamente, y en los días 22-25 fue de 4% y 76%, respectivamente. En conclusión, el riesgo de recurrencia se consideró entre 3 y 10 veces superior en presencia de EMR a los días 15 y 22-25, respectivamente. (Sandlund 2002) zur Stadt analizó una serie de pacientes al final de la inducción para determinar EMR encontrando niveles de 10-4 en 21% de los pacientes, 10-2-10-3 en 36.8%, y >10-2 en 26.3%, y el estudio fue negativo en 15.8% de los pacientes. Estos datos se obtuvieron por técnicas moleculares y se compararon con los resultados obtenidos por otros autores. (zur Stadt 2001) Seeger trató de identificar la utilidad del estudio de EMR por técnicas moleculares en pacientes de alto riesgo quienes presentan el producto de fusión génica TELAML1. Estudió para tal fin muestras de médula ósea al momento del diagnóstico,

durante la inducción (días 15 y 33) y antes de la reintensificación (día 148). El estudio se negativizó en el 35% de los pacientes el día 15, en el 78% después de la inducción (día 33); sólo el 6% de los pacientes siguieron siendo positivos luego de la consolidación. Los pacientes que fueron negativos siguieron siendo negativos por el resto del seguimiento. El papel pronóstico del estudio de EMR en pacientes de alto riesgo no es tan fundamental como en pacientes de riesgo bajo, puesto que en los primeros los otros factores que les imprimen alto riesgo son más ominosos que la misma detección de EMR. (Seeger 2001) Luego de recaída, detectar EMR es también de importancia pronóstica. En la segunda remisión al final de la inducción, 46% fueron EMR negativos, mientras que 54% fueron >0,01%. Se estableció recurrencia de 70,2% en los niños con EMR en la segunda remisión contra el 18,2% de casos negativos, excluyendo las recurrencias extramedulares. El riesgo de recurrencia luego de recurrenciaremisión con EMR fue de 49,1% a 2 años contra 0 en los negativos. En este estudio se estableció que la recurrencia en sí misma constituye un factor de mal pronóstico más fuerte que la detección de EMR. Detectar EMR al final de la segunda remisión es indicativa de trasplante autólogo y EMR negativa al final de la segunda remisión es de buen pronóstico. (Mandrell 2006) Pui y Campana han tratado de establecer el concepto de remisión a partir de EMR, sin embargo, es difícil debido a que no a todos los niños se les realiza el estudio durante la terapia y que falta por establecer un nivel estándar de EMR. Antes se había descrito que niños con >1% al final de la inducción ó >0,1% posteriormente, tenían altísimo riesgo de recurrencia. Otro estudio encontró que EMR >0,01% al día 19, al final de la inducción, y a las semanas 14, 32 y 56 tenían alto riesgo de recurrencia, así como niveles >1% postinducción ó >0,1% a la semana 14 como de pobre resultado. Además, se demostró que en las primeras 2 semanas el 50% de los estudios son EMR negativos, así como el 75% al final de la inducción; de igual modo, los resultados para las semanas 14 y 32 donde seguían positivos 13 y 4%, respectivamente. Todos los EMR a la semana 32 recurrieron. Se podría intuir que niveles de EMR 10-2 tienen alto riesgo de recurrir. (Mandrell 2006) La detección de Enfermedad Mínima Residual es también de importancia en la monitorización del trasplante autólogo. Goulden estudió la utilidad del análisis a los 1, 3, 6, 12, 18 y 24 meses luego del trasplante, pero encontró limitaciones pues la enfermedad fue detectada en el nivel más bajo. En caso de recurrencia, también se analizó la utilidad del estudio en los primeros 2 meses donde se encontró que todas las recurrencias habían sido precedidos por al menos un estudio de EMR positivo. (Goulden 2002)

1.5 PAPEL DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL

EN EL

ESTUDIO

DE

La citometría de flujo es una herramienta útil para el estudio de Enfermedad Mínima Residual pues permite identificar las células neoplásicas entre poblaciones grandes de médulas óseas en regeneración o postrasplante. En condiciones óptimas, los niveles de detección son similares a las técnicas moleculares, sin embargo, en términos reales dichos niveles no son alcanzables puesto que los volúmenes de células obtenidos por punción de médula ósea son del orden de 106, y se requieren entre 10 y 20 eventos para que la técnica de citometría tenga capacidad de diferenciar los grupos de eventos adecuadamente, por lo que la sensibilidad alcanzable es del orden cercano a 105 en los mejores escenarios. Sin embargo, debido a los cambios sufridos por la población celular por el efecto de la terapéutica, los niveles de EMR detectables por citometría de flujo se consideran ligeramente superiores a 104. (Campana 2004) Las ventajas principales del uso del inmunofenotipo para la detección de enfermedad mínima residual se resumen en: (Izraeli 2004) 1. Adecuada sensibilidad de la técnica (detección de 1 célula en 104). 2. El análisis se realiza con equipos que ya están siendo usados rutinariamente para tipificar leucemias. 3. Capacidad de distinción entre células muertas y vivas. 4. Método rápido y relativamente barato. Algunas de las desventajas anotadas a la técnica incluyen: (Izraeli 2004) 1. El análisis es complejo y depende de la experticia del operador. 2. Es difícil distinguir entre precursores de médula ósea en regeneración de blastos leucémicos pre-B (el tipo más común de leucemia). 3. El análisis debe ser realizado sobre muestras frescas por lo que se requiere cercanía entre el centro de tratamiento y el centro de estudio de las muestras. 4. Inestabilidad en la expresión de antígenos en células leucémicas (cambio de linaje, pérdida de antígenos) durante o posterior al tratamiento. Sin embargo, ya existen algunas luces para resolver algunas de dichas desventajas. Para el ítem 2, van Wering en su estudio presenta los resultados del análisis de múltiples muestras que detectadas por inmunofenotipo y comparadas con los resultados de estudios moleculares logra identificar las células tumorales residuales por su expresión aumentada de CD34 y TdT, frente a la expresión baja de estos antígenos en precursores normales, los cuales son predominantemente CD10 y CD19. (van Wering 2000) 1.5.1 Descripción de la técnica. La citometría de flujo es una técnica descrita hace más de 30 años que permite realizar una evaluación cuantitativas de las propiedades celulares basado en sus propiedades de dispersión de la luz y

características fenotípicas que pueden ser determinadas usando marcadores fluorescentes. Inicialmente, la técnica fue desarrollada con fines de investigación y los primeros instrumentos eran muy grandes, costosos y requerían alta especialización por parte de sus operarios. Diez años después, hacia el inicio de la década del 80, se introdujo en el laboratorio clínico la técnica gracias al desarrollo de anticuerpos monoclonales más baratos, instrumentos más pequeños, asequibles y operables. La técnica se basa en la determinación del inmunofenotipo celular por medio del uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos para proteínas expresadas por las células. Para comprender mejor la técnica es útil recordar los conceptos de antígeno, anticuerpo y su interacción. 1.5.1.1 Anticuerpos. Los anticuerpos pertenecen a la clase de proteínas globulares conocidas como inmunoglobulinas (Ig). Su estructura básica se compone por dos cadenas pesadas (55kD) atadas entre sí por puentes disulfuro; a su vez, cada una de estas cadenas está atada a una cadena ligera (25kD) por medio de puentes disulfuro. En el humano se han identificado 5 isotipos de Ig (G, M, A, D, E) acorde a su respectiva cadena pesada (gamma, mu, alpha, delta y épsilon), y pueden ser individualizadas por análisis electroforético. A su vez, se han identificado 4 subclases de IgG, dos de IgA, y de las restantes uno, que tiene importancia en investigación, y recientemente su interés se ha incrementado en el estudio de desórdenes de la respuesta inmune. Las cadenas livianas, denominadas kappa y lambda, nunca se presentan simultáneamente en la misma inmunoglobulina, pero sí tienen normalmente expresión policlonal, es decir, se identifican las dos en moléculas distintas del mismo isotipo de Ig. (Stewart 2000) Las inmunoglobulinas al ser expuestas a la papaína, se dividen en un fragmento Fc (cristaliza a 4°C) y dos fragmentos Fab (unión a anticuerpo); si se digiere con pepsina se produce ruptura a nivel de los puentes disulfuro y se genera un fragmento con dos fracciones (F(ab’)2) aún unidas y pequeños fragmentos de Fc. (Stewart 2000) IgG es la gammaglobulina más abundante en el organismo y se encuentra circulando en plasma. Tiene un peso molecular 154kD y vida media de 23 días; cuando es clivada por la pepsina genera un fragmento F(ab’)2. (Stewart 2000) IgM se encuentra en tejidos y circulando y representa el 5-10% de las Ig. Posee un peso molecular de 900kD y vida media de 5 días. Su digestión genera cinco fragmentos F(ab’)2. (Stewart 2000) IgA ejerce su función en epitelios mucosos, aunque también se encuentra circulando. Tiene peso molecular de 160kD y vida media de 6 días. Se constituye

como un tetrámero o dímero unido a un componente secretorio producido por las células epiteliales que modifica su función. (Stewart 2000) IgE se encuentra ligado al receptor Fc de mastocitos y eosinófilos (anticuerpo reagínico). Pesa 190kD y su vida media es 2-3 días. En mastocitos se encuentra un receptor Fc de alta afinidad (FcΣR1), y en eosinófilos, algunos linfocitos B y plaquetas expresan un receptor de afinidad baja (FcΣR2 ó CD23). (Stewart 2000) IgD es una proteína transmembrana en células B maduras sin mayor componente circulante y confiere especificidad de antígenos a células B de memoria. Pesa 185kD y su vida media es de 2-3 días. (Stewart 2000) 1.5.1.2 Antígenos. Los anticuerpos en los mamíferos se forman cuando una sustancia que entran al organismo y cumple con poseer una estructura química reconocida como extraña al sistema inmune, que dicha estructura sea compleja o diversa y mayor a 100kD. Estas sustancias son conocidas como inmunógenos. Las estructuras químicas contra las cuales se generan los anticuerpos son los antígenos; todos los inmunógenos son antígenos, pero no todos los antígenos son inmunógenos. (Stewart 2000) Las pequeñas áreas o estructuras de bajo peso molecular contra las cuales se dirigen los anticuerpos se denominan epítopes, que en sí mismos son incapaces de desencadenar la producción de anticuerpos, pero cuando forma parte de grandes moléculas con múltiples epítopes, si se establece la respuesta inmune. Existen otras moléculas menos complejas con suficiente tamaño y heterogeneidad estructural que pueden desencadenar reacciones inmunes que se denominan haptenos. (Stewart 2000) 1.5.1.3 Reacción antígeno-anticuerpo. Al inmunizar a un animal con un inmunógeno se producen anticuerpos para cada epítope específicos de clones de células B que maduran en células plasmáticas con diversa afinidad y capacidad de producción de múltiples isotipos de Ig y cadenas ligeras variadas, con lo que se establece una respuesta policlonal. Cada uno de los clones celulares en expansión responde a un solo isotipo de Ig y una sola cadena ligera (respuesta monoclonal), y la suma de todas ellas constituye la respuesta policlonal. Estas células plasmáticas se pueden fusionar con células de mieloma murino generando híbridos inmortales monoclonales (hibridoma). (Stewart 2000) Dada la heterogeneidad interespecie e intraespecie de las proteínas, los epítopes son diferentes y pueden desencadenar respuesta inmune. (Stewart 2000) Se ha establecido y normalizado un sistema de denominación de los principales antígenos y anticuerpos de importancia médica que se conoce como CD (cluster of differentiation) ó grupo de diferenciación. Cada grupo es identificado por un

número que describe el anticuerpo dirigido a un antígeno celular, y no a un epítope en el antígeno. Por ejemplo, CD11a se refiere a todos los anticuerpos que ligan a cualquiera de los epítopes en la cadena alfa de LFA1. El antígeno es explícitamente nombrado, y el anticuerpo contra esa proteína es dado el número CD. La nomenclatura describe el antígeno más que el epítope, puesto que cada investigador produce su propio anticuerpo contra diferentes epítopes del mismo antígeno. (Stewart 2000) 1.5.1.4 Inmunofenotipificación. Para el estudio de inmunofenotipo existen marcadores buenos y malos, y la dificultad radica en escoger los buenos, y saber cómo interpretar los resultados de los malos cuando no hay otros disponibles. Los buenos anticuerpos se caracterizan por tener altas especificidad y afinidad de ligado por sus epítopes. En general, los anticuerpos monoclonales poseen menor afinidad que los policlonales por su proceso de selección en producción masiva. Para la producción de anticuerpos policlonales de alta especificidad se requiere del uso de animales con largos períodos de inmunización y reinmunizados para lograr la mayor afinidad. (Stewart 2000) La fijación de anticuerpos se realiza por dos mecanismos básicos: unión por la región Fab o la fracción Fc. Estos dos mecanismos son saturables a bajas concentraciones de anticuerpos, así que el incremento en la concentración de éste conduce a unión inespecífica eléctrica con otros grupos proteicos contra los cuales no está diseñado. Igualmente, dentro del mismo grupo de receptores, o antígenos, se presentan diferentes niveles de afinidad con el anticuerpo, y puede que dicha especificidad sea tan marcada que anticuerpos del mismo isotipo se liguen en forma diferencial a los receptores (Fc), como es el caso de IgG2, la cual no se une a FcRI (CD64) como si lo hace IgG1 e IgG3, y en menor medida IgG4. (Stewart 2000) Las células hematopoyéticas exhiben un repertorio único de receptores Fc, que permite su diferenciación. Al combinar estas características con la capacidad de dispersión de luz (side scatter), se logran diferenciar todos los elementos de la sangre. La siguiente tabla muestra una aproximación a este enfoque. Los anticuerpos monoclonales son seleccionados por su reacción con el antígeno (receptor) y no se analiza la capacidad de unión inespecífica a las proteínas de la superficie celular y del ambiente intracelular. Muchos anticuerpos resultan “malos” para inmunofenotipificación por esta razón. Sin embargo, los fabricantes han incrementado su interés por establecer la unión inespecífica y mejorar la afinidad de los anticuerpos. Existen múltiples pruebas que permiten identificar los anticuerpos con unión inespecífica pero se escapan al objetivo de ésta revisión. Basta con concluir, que la experiencia de trabajo es la que permite identificar los “mejores” anticuerpos. (Stewart 2000)

Tabla 1.8 Inmunofenotipo básico de líneas hematológicas normales FcRI (CD64) FcRII (CD32) FcRIII (CD16) Side scatter Baja Eritrocitos Granulocitos Basófilos ++ ++ 0 Baja Eosinófilos +/++ 0 Alta Neutrófilos ++ ++ * Alta Linfocitos Células B + Baja Células NK + Baja Células T Baja * ++ + Intermedio Monocitos ++ Intermedio Plaquetas

*Nulo en células en reposo, pero reguladas al aumento en forma variable durante la inflamación. (Tomado de Stewart 2000)

1.5.1.5 Consideraciones generales de la aplicación clínica del estudio de inmunofenotipo por Citometría de Flujo. El desarrollo de mejores fluorocromos, equipos de medición y software analítico, y en general, con una mayor comprensión del papel del inmunofenotipo en la maduración hematológica, se ha popularizado el uso de esta técnica en estudios variados para distinguir condiciones neoplásicas de condiciones benignas, diagnóstico y clasificación de linfomas y leucemias, evaluación de otros desórdenes neoplásicos y preneoplásicos tales como las discrasias de células plasmáticas y síndromes mielodisplásicos y detección de enfermedad mínima residual en pacientes con leucemias aguda y crónica. (Nguyen 2003) El estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo ha sido reconocido de gran utilidad por sus altas sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, incluso superando la morfología, que ha permitido el reconocimiento de características diagnósticas y pronósticas que se escapaban anteriormente por estudios morfológicos solos. Con base en esta apreciación, actualmente se recomienda la combinación de múltiples técnicas diagnósticas (morfología, inmunofenotipo y biología molecular), más que el uso separado de alguno. (Nguyen 2003) La metodología usual de análisis de poblaciones por citometría de flujo busca establecer el porcentaje de células positivas que expresan de determinado antígeno. Para tal fin, se seleccionan las células por dispersión de luz y se analizan los patrones de fluorescencia por histogramas de uno o múltiples parámetros (fluorocromos); en el histograma se ubica el cursor para seleccionar las células que presenten positividad superior al límite del control, establecido por medición de fluorescencia de un fluorocromo irrelevante, y se reportan los resultados como positividad de células para cada fluorocromo. Este análisis

numérico puede ser empleado como índice para definir razones poblacionales (v.g. CD4/CD8). (Nguyen 2003) A pesar de la utilidad del análisis numérico de positividad de antígenos, en ciertas ocasiones es difícil determinar el punto de corte en la mayoría de células puesto que todas tienen diferentes niveles de expresión de antígenos, y resulta más útil determinar sólo la presencia del antígeno, sin expresarlo numéricamente, puesto que esa cuantificación puede resultar ambigua. Por tanto, la definición multiparámetrica (varios fluorocromos) de una población y su cuantificación es más útil que generar porcentajes de cada antígeno. (Nguyen 2003) La estrategia de selección (gated) es empleada con alta frecuencia para establecer clonalidad. Sin embargo, muchas células con características similares pueden quedar incluidas en el área de selección y modificar los porcentajes de expresión del grupo celular que realmente representa interés. La estrategia de selección es útil para determinar clonalidad y coexpresión de otros antígenos en células B, y caracterizar blastos leucémicos en células CD45. Para lograr estos propósitos es fundamental contar con herramientas de diagnóstico con al menos 2 colores, que sumado al FSC y SSC son herramientas básicas para determinar poblaciones. (Nguyen 2003) El diagnóstico inmunofenotípico debe ser correlacionado con los hallazgos establecidos por otras técnicas, y de esa forma construir un diagnóstico total que sirva al clínico en el establecimiento de terapéutica y pronóstico. Igualmente, se deben eliminar las incongruencias que se puedan presentar entre los diversos métodos, así como emplear los métodos más costo-efectivos que se realicen en el menor tiempo posible. (Nguyen 2003) Otras aplicaciones de la citometría de flujo diferente a su utilidad diagnóstica, es la utilidad pronóstica en detección de enfermedad mínima residual. Ya se determinó su capacidad de establecer ploidía por medición de DNA en fase S en LLA, siendo este índice de alto valor pronóstico. Así mismo, de la mano con las técnicas moleculares con PCR, constituyen dos estrategias no excluyentes que permiten lograr niveles de detección de hasta 1 célula anormal en 104-105 células normales. (Nguyen 2003) Usualmente se han caracterizado los marcadores celulares empleados relacionados con líneas hematológicas en las siguientes categorías: células B, células T, células NK, mieloide/monocítico, eritroide, y antígenos no asociados a linaje (v.g. antígenos de activación CD38 y HLA-DR). Estos antígenos se establecieron con base en estudios de diferenciación y maduración, donde se determinó la presencia de CD34 en precursores, así como la ganancia progresiva con maduración de CD38 y HLA-DR, en precursores linfoides TdT. (Nguyen 2003)

El linaje B inicia con CD22 citoplásmico, el cual es positivo incluso antes que los rearreglos de inmunoglobulinas, con posterior expresión de CD10 y CD19. Prosigue con reducción de CD10 y ganancia concomitante de CD20, con posterior expresión de inmunoglobulina de superficie y silenciamiento de antígenos inmaduros (CD34 y TdT) en células maduras. Las células circulantes muestran inmunoglobulina de superficie junto con CD20 y CD22; la diferenciación ulterior se produce en ganglios linfáticos. (Nguyen 2003) El linaje T se identifica con CD3 de citoplasma, el cual aparece desde los estados tímicos más tempranos, así como CD2 y CD7, sufriendo rearreglo del receptor T durante la maduración (usualmente heterodímeros αβ siendo γδ menos del 5%) acompañado de expresión de otros antígenos asociados al linaje T (CD4, CD8, CD5). Las células γδ migran del timo fetal para ubicarse en piel y mucosas, siendo la mayoría CD4-/CD8-, y sólo la tercera parte CD8+. La determinación de células T maduras es por la carencia de expresión de antígenos inmaduros (TdT, CD1) y sobreexpresión de CD3. (Nguyen 2003) El linaje mieloide es determinado por la identificación de CD13, CD33 y CD117. La maduración a promielocitos se marca por la pérdida de CD34 y HLA-DR con expresión de CD15, CD11b y CD16 en estados mielocitos y metamielocitos. CD14 intenso es característico de monocitos, y la intensidad de expresión de CD33 y CD64 es también característica frente a otras células de la línea mieloide. (Nguyen 2003) La serie eritroide regula a la baja CD45 y sobreexpresa CD71. La glicoforina es característica de células menos maduras reconocidas como eritroblastos. (Nguyen 2003) Ciertos antígenos considerados específicos de linaje pueden ser expresados por células neoplásicas (CD15 en LLA y CD7 en LMA). De este modo el “marcador de linaje” debe ser considerado con precaución, además por la expresión compartida de antígenos (CD11b, CD15 y CD16 no se deben considerar específicos de linaje mieloide). (Nguyen 2003) Otros antígenos no específicos de linaje se han considerado de importancia, como lo es CD56 presente en células NK y neoplasia plasmática, así como en tumores neuroendocrinos y LMA. Igualmente, las células NK se establecen por el análisis combinado de antígenos T y “NK” (CD56, CD57 y CD16). (Nguyen 2003) Aseguramiento de la calidad. Como todos los procesos en el laboratorio clínico, el estudio de una muestra hematológica por citometría de flujo se compone de fases pre-analítica (toma y manejo de la muestra), analítica (corrida en el instrumento) y post-analítica (análisis de datos y entrega de resultado). Si bien, mantener los instrumentos de medición en condiciones óptimas a través de

sistemas de aseguramiento de calidad es de importancia capital, se hace fundamental el manejo adecuado de las muestras desde su toma hasta que son analizados por los equipos. La toma de la muestra, su adecuada manipulación, transporte y disposición, generan las condiciones necesarias para garantizar obtener resultados óptimos en los análisis. Se hace indispensable que los responsables de los laboratorios de citometría de flujo generen protocolos de manejos de muestra que sean distribuidos a los sitios donde se originan las muestras. (Nguyen 2003) Toma de muestras. La sangre periférica puede ser recogida en EDTA o heparina, prefiriendo la primera por su mejor preservación morfológica; se recomienda volumen de 10 mL al menos, y enviar láminas y hemograma para evitar los artefactos de preservación. La médula ósea se prefiere en EDTA y contar con láminas e improntas de la biopsia para evaluación morfológica. Algunos métodos para mejorar la obtención de células han sido descritos para ser realizadas al lado del paciente y obtener células inmaduras que suelen estar adyacentes a las trabéculas óseas. (Nguyen 2003) Los especímenes sólidos son enviados frescos en solución salina fría u otro preservante vital, y cortados para obtener fragmentos intercalados para las técnicas diagnósticas que sean necesarias (biología molecular, citometría de flujo, inmunohistoquímica, entre otras). Se recomienda obtener improntas para evaluación de morfología citológica y marcación de ser necesaria. (Nguyen 2003) Procesamiento de muestras. Las muestras son procesadas para eliminar las células no nucleadas con sustancias lisantes como cloruro de amonio, y las células restantes se pueden eliminar electrónicamente con anticuerpos específicos o “gated”. Es importante evitar la excesiva selección puesto que pueden resultar removidas células claves, como las neoplásicas que no manifiestan las mismas características de las células normales, y esta pérdida puede resultar crítica ante bajos conteos. (Nguyen 2003) La citometría también ayuda a determinar la vitalidad celular por la marcación del DNA con tinciones tales como yoduro de propidio o 7-amino-actinomicina D que son afines a células muertas. Otra metodología empleada es exclusión con azul de tripán. También es útil recordar que las poblaciones heterogéneas donde las células neoplásicas constituyen grupos celulares grandes susceptibles a daño por el procesamiento, lavados y centrifugación, y que los tejidos suelen presentar menor viabilidad que los líquidos, sin embargo, no existe un umbral de viabilidad para establecer cuales muestran resultarán útiles para estudio en citometría de flujo. (Nguyen 2003) Las muestras deben ser procesadas tan pronto como la lisis ha sido completada. Demoras en este procesamiento inducirán modificación de la viabilidad celular y en el resultado de la prueba. La tinción se realiza con fluorocromos estándares

comercialmente asequibles, bajo rutinas de procedimiento normalizadas que permiten garantizar la adecuada interacción de los antígenos con los anticuerpos. La metodología para antígenos de superficie es más sencilla que la necesaria para anticuerpos intracelulares, esta última requiriendo fijación y permeación celular, y a la vez que evite la agregación de la muestra. Cuando se requiere tinción de superficie e intracelular, primero se tiñe superficie, luego se fija y se tiñe internamente. Se prefiere emplear fluorocromos de tamaño pequeño para las tinciones intracelulares como el FITC. (Nguyen 2003) La marcación de DNA es una técnica empleada con frecuencia por ciertos laboratorios en casos de linfomas y leucemias agudas, junto con otros antígenos intracelulares o de superficie útiles para seleccionar las células a estudiar, o simplemente con propiedades de dispersión de luz. La tinción se realiza en células frescas tan pronto como se concluya la lisis para evitar la lesión de DNA, que en últimas modificaría la relación estequiométrica con el fluorocromo. El estudio sobre material fijado incrementa falsamente los índices de DNA. El yoduro de propidio, por su capacidad de intercalarse con el DNA es el fluorocromo de elección para la metodología. Se puede preservar bien el material en etanol, con lo que pierde sus características de tinción superficial, o en paraformaldehído, con lo que puede formar puentes cruzados que incrementan el CV de las muestras. Igualmente, se puede establecer los puntos de corte de picos modales de índices de DNA corriendo muestras patrón. (Nguyen 2003) Control de calidad. Periódicamente se debe realizar calibración de los equipos con ajustes de color usando fluorocromos de importancia que sean mutuamente excluyentes (CD4, CD8, CD20 en FITC, PE y PerCP) para determinar la ganancia necesaria que debe presentar los tubos fotomultiplicadores. Cuando se corren las muestras, existen varias aproximaciones de adquisición; una es ingresar todos los eventos sin eliminar ni detritus ni células no viables y completar conteos altos (entre 30 y 70 mil), también se puede ingresar eventos que cumplan ciertas características definidas como “gated” y completar conteos menores en esos grupos, garantizando así un número suficiente de células para análisis. Luego de este proceso, se puede eliminar por selección los eventos carentes de importancia. (Nguyen 2003) Diseño de paneles. Los anticuerpos a utilizar deben ser seleccionados con base en una exhaustiva búsqueda tratando de obtener el mejor desempeño de las combinaciones de colores, así como la selección de fluorocromos como policlonales frente a monoclonales. Es importante recordar que, dada la variabilidad de ciertos antígenos, es recomendable usar anticuerpos policlonales no selectivos de cadena ligera, a menos que sea ella la que se quiere determinar. Por ejemplo, para determinar población B se recomienda emplear combinaciones de coloraciones que incluyan gamma-FITC/CD19-PE, lambda-FITC/CD19PE, gamma-FITC/CD20PE, lambda-FITC/CD20-PE, más que las populares combinaciones kappa-FITC/lambda-PE. (Nguyen 2003)

La selección de paneles de anticuerpos busca maximizar la información obtenida de corridas simples, encontrando información adicional concerniente con líneas de diferenciación, y en general la ganancia y pérdida de expresión de los antígenos de interés. Igualmente, es importante definir el tipo de fluorocromo concerniente a los niveles de emisión de luz para evitar el silenciamiento que pueda resultar de la interacción de diferentes fluorocromos que emitan en la misma longitud de onda. Algunos autores prefieren usar fluorocromos simples (FITC, PE, APC y PerCP) más que constructos más complejos (PE-Texas Red ó PE-Cy5). Sin embargo, se recomienda contar con más de un fluorocromo para determinados antígenos de importancia para aprovechar la capacidad de detección de múltiples colores y mejorar la discriminación. (Nguyen 2003) Al diseñar los paneles se busca alcanzar diversos objetivos que incluyen determinar el linaje de las células de interés, su estado de maduración, la clonalidad (si existe), el subtipo específico de alteración hematopoyética y el estado de los elementos normales. Los paneles se diseñan tratando de interpretar las enfermedades o acorde al tejido de origen, generándose así paneles estándar que se aplican a todas las muestras acorde al enfoque que se les dé. Una aproximación más lógica establece que se deben examinar morfológicamente las lesiones y aproximarse al diagnóstico, y orientar la marcación con el diagnóstico probable. Otra aproximación es generar pequeños paneles de determinados anticuerpos que buscan reconocer determinadas características que presenta la población celular. Los resultados son presentados como gráficos de puntos donde se ubican los eventos en dos ejes, y se realiza una valoración numérica de la fluorescencia en escala simple o logarítmica, prefiriéndose la última al normalizar los comportamientos de las poblaciones. (Nguyen 2003) Estrategia de análisis. El estudio de Enfermedad Mínima Residual busca establecer la presencia de células neoplásicas sobre un fondo de células normales, luego la técnica debe ser altamente sensible y específica. Una de las necesidades del estudio es establecer las características fenotípicas al momento del diagnóstico para hacer seguimiento a dichas características. Contando con dichas características, se puede hacer una adquisición piloto con 10 a 15 mil eventos y seleccionar dos ventanas: una que identifique las características fenotípicas del diagnóstico, y la otra que evidencia las características de dispersión de luz de las células anormales. Con esta información seleccionada en el citómetro, se adquiere entre 300 y 500 mil eventos guardando la información de los eventos que cumplan con esas características. (Campana 1999) Limitaciones y posibles fuentes de error. El estudio de inmunofenotipo plantea limitaciones dado el proceso manual que se requiere para preparar las células que van a ser analizadas por el citómetro. Dichos artefactos pueden inducir tanto falsos positivos como falsos negativos. La siguiente tabla resume algunos de dichos artefactos y la forma de evitarlos.

Tabla 1.9 Problemas comunes de la citometría de flujo Problema Resultado Prevención/solución Contaminación de la Falso Marcación y manejo cuidadoso de la muestra positivo muestra Filtración rutinaria y monitorización de la Impurezas en buffer de pureza de los buffer Falso lavado y sistemas de positivo Limpieza de los sistemas de flujo del flujos citómetro Saturación de receptores Fc Titulación cuidadosa de los anticuerpos Ligado inespecífico de Falso Uso de anticuerpos de control específicos anticuerpos positivo de isotipo Uso de anticuerpos en la forma de fragmentos F(ab´)2 (no es esencial) Almacenaje ordenado y lógico de los anticuerpos Contaminación o mala Falsos Marcación clara de los tubos de muestras colocación del positivo o Uso de cócteles de anticuerpos anticuerpo negativo premezclados Entorno de trabajo sin distracciones Cambios en el lote del Análisis frecuente de muestras normales Falsos anticuerpo y/o positivo o Pruebas periódicas de configuración del inestabilidad del negativo equipo instrumento Muestras de sitios Biopsia de médula ósea de varios sitios* negativos (distribución Falso heterogénea de negativo Estudios de sangre periférica* leucemia) Cambios Falso Uso de múltiples combinaciones de inmunofenotípicos negativo anticuerpo * Estudios no evaluados formalmente. Tomado de Campana 1999.

1.5.2 Detección inmunofenotípica de Enfermedad Mínima Residual. Existe un especial interés en el estudio de EMR por citometría de flujo dada su velocidad y simplicidad, y la combinación de múltiples antígenos en citometría que ha incrementado la sensibilidad y reproducibilidad del método permitiendo analizar simultáneamente varios parámetros con base en una sola célula, evaluar cuantitativamente la expresión de antígenos, permitir el estudio y almacenamiento de información de un mayor número de células dentro de un corto período de tiempo y, combinar la detección de antígenos de superficie e intracelulares. En contraposición, los principales dos defectos de la técnica son que, contadas excepciones, las células leucémicas no muestran antígenos específicos lo que podría afectar su especificidad y aplicabilidad y que, varios grupos han reportado

la existencia de cambios fenotípicos en la recurrencia que podrían impedir el uso de inmunofenotipo para la detección de EMR debido a la existencia de una proporción incrementada de resultados falsos negativos. El primer punto cuestiona la existencia de fenotipos específicos de leucemia, mientras que el segundo plantea la necesidad de establecer características fenotípicas anormales que permanezcan sin cambios durante el seguimiento. (Orfao 2000) Los parámetros biológicos (inmunofenotipo, ploidía, anormalidades cromosómicas y rearreglo de genes) y parámetros clínicos (edad, conteo de blancos) son usados para predecir comportamiento pero no son exactos, existiendo pacientes de buen riesgo que recurren y otros que se someten a tratamientos muy tóxicos innecesariamente. La variabilidad existente responde a la farmacocinética y farmacogenética que modifica el resultado, además de la susceptibilidad de las células tumorales al tratamiento. Así, el estudio de EMR en médula durante el tratamiento es útil para modular la terapia, y para predecir el riesgo de recurrencia. (Campana 2002) La citometría de flujo es el mejor método inmunofenotípico para detectar EMR, además permite establecer otros parámetros como tamaño, granularidad e intensidad de expresión, sumado a la velocidad de la adquisición de células, la posibilidad de seleccionar células para FISH, o la medición de DNA son útiles para estudiar EMR. Los citómetros con doble láser (FACSCalibur) están equipados con láser argón a 488nM (FITC 495nM, PE 480/565nM, PerCP 488nM) y 655nM diodo rojo (APC 650nM). Los analizadores de 1 láser, 3 colores, son menos eficientes; los nuevos citómetros equipados con láser UV-tinciones tal como Hoechst 33342, DAPI e Indo-1, pueden mejorar la capacidad de detección de EMR. (Campana 2002) La habilidad de detección depende de la diferenciación fenotípica y morfológica entre las células blanco y las normales, y el número de células analizadas. Adquiriendo 10000000 de células la sensibilidad de la técnica es similar al PCR, sin embargo las condiciones de estudio no son ideales y sólo se logra tener adquisiciones con 100000 o menos células logrando límites de detección máximos de 1 en 100000. Los estudios han demostrado detectar hasta 3 células en 100000, con concentraciones mayores la prueba puede presentar mayores variaciones, pero siempre detectará células neoplásicas. Es fundamental contar con el fenotipo de la leucemia para poder determinar EMR, puesto que lo contrario llevaría a la necesidad de usar múltiples antígenos para establecer el fenotipo residual resultando muy caro. El uso del método de separación de mononucleares de Ficoll mejora la sensibilidad al reducir el background inducido por PMN y plaquetas. El estudio se realiza usando los fluorocromos FITC, PE, PerCP y APC, bien sea manteniendo un marcador en cada tubo o empleando combinaciones de antígenos positivos con negativos (células T CD3/TdT CD33/HLA-DR/CD19). Se recomienda realizar un análisis a 10000 células y luego seleccionar sólo células que presenten

el fenotipo esperado para reducir el tamaño de los archivos electrónicos. (Campana 2004, Campana 2002) La capacidad de detección de CF es 10000, útil en la mayoría de estudios, pero en ocasiones se desearía mayor definición; además, los marcadores con los que se hace seguimiento pueden variar con el tiempo generando falsos negativos, igualmente, cuando la enfermedad se manifiesta en parches o luego de terapia se requiere de límites de detección superiores. (Campana 2002) La utilidad de CF en EMR se basa en la precisión por medición directa, mientras que PCR requiere análisis indirecto de la amplificación, además pudiendo discernir tamaño y granularidad celular logrando separar células viables de dañadas por quimioterapia. (Campana 2002) Se requiere evitar al máximo los artefactos que pueden surgir del buffer, del transporte, errores de pipeteo, contaminaciones, etc. (Campana 2002) Consideremos ahora los linajes celulares. El estudio de células T se basa en encontrar fenotipos tímicos fuera de esa localización (CD3/TdT, CD5/TdT). Los precursores B (hematogonias) son abundantes en pacientes jóvenes, luego de quimioterapia o trasplante y se pueden observar en sangre periférica. El objetivo es encontrar fenotipos tumorales ausentes en células normales; en neoplasias con alteraciones conocidas como BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-AF4 y TEL-AML1 es lógico buscar anticuerpos contra receptores que representen dichas alteraciones, sin embargo, no es fácil el desarrollo de dichas sustancias. (Campana 1999) El anticuerpo 7.1 reconoce células con alteración 11q23, ausente en células normales y está relacionado con leucemias de fenotipo proB (CD10 negativas); igualmente hubo gran interés por el marcador KOR-SA3544 que mostraba marcación para células con rearreglos de BCR-ABL y sumado a otros antígenos linfoides específicos resultaba de interés en el estudio de EMR, sin embargo su uso ha decaído significativamente en los últimos años. (Campana 1999) Otros antígenos aberrantes son observados. CD66c marca hasta 1/3 de las células neoplásicas B, ausente en las normales. CD21 se puede observar en células neoplásicas CD34+CD19+ lo cual no se expresa en progenitores normales. CD19, 10 y 34 se pueden sobreexpresar en casos de leucemia y CD45 y CD38 pueden reducirse. Expresión aberrante de CD45RA, CD11a y CD44 se ha mencionado. El estudio por DNAc de arreglos de oligonucleótidos ha permitido establecer la presencia de moléculas que se sobreexpresan identificando 7 proteínas (CD58, creatinkinasa B, ninjurina 1, Ref1, calpastatin, HDJ-2, annexina VI) que se expresan más en células tumorales que en células normales; CD58 se sobreexpresa también en MO con EMR y se correlaciona su análisis por CF y amplificación de rearreglos por PCR, aumentando la sensibilidad del estudio. (Campana 2004, Campana 2002, Campana 1999, Chen 2001)

La combinación de anticuerpos para leucemia T comprende uso de TdT nuclear, CD3 ó CD5 citoplasmático o membrana, cuando es negativo TdT se puede usar CD34, y la presencia de CD19/CD33/HLA-DR se usa como exclusión. (Campana 1999) En neoplasias B la expresión de CD19/CD10/CD34/TdT que logra detectar entre 30-50% de la EMR, como otros antígenos CD38, CD45, CD22 y el recientemente identificado CD58. Las diferencias cualitativas se pueden establecer con antígenos mieloides, NK o antígenos maduros B; dos adicionales son CD66c y anticuerpo 7.1 (NG2); el 90% de los casos se puede estudiar con niveles de detección 10000. (Campana 2004, Campana 2002, Campana 1999) La acción concertada europea BIOMED-I propuso en el 2001 la utilización protocolaria de 5 paneles de triple tinción constituidos por TdT/CD10/CD19, CD10/CD20/CD19, CD34/CD38/CD19, CD34/CD22/CD19 y CD19/CD34/CD45 con los cuales se logra identificar fenotipos aberrantes en el 98% de los casos de leucemia linfoblástica B, a través de la identificación de células que ocupan los espacios vacíos que surgen del conocimiento de la vía normal de maduración obtenido de la comparación de 2 fluorocromos en los ejes x/y. La identificación de dichas aberraciones es de utilidad en la determinación posterior de EMR. (Lucio 2001) Bajo igual metodología se propusieron los paneles CD7/CD5/CD3, CD7/CD4/CD8, CD7/CD2/CD3, CD7/CD38/CD34 y TdT/CD7/CD3 citoplásmico o de superficie para identificar las aberrancias en leucemia de linaje T logrando identificar más del 91% de los pacientes. (Porwit-MacDonald 2000) 1.5.3 Fenotipos asociados a leucemia. Sólo unos pocos antígenos específicos de leucemia han sido identificados resultados de la fusión de genes como el bcr/abl. Reactivos que permitan identificar sin posibilidad de error todos los casos aún no son asequibles. Sin embargo, en años recientes se han realizado estudios comparativos entre las características fenotípicas de individuos sanos y pacientes con leucemia con lo que se evidenció la existencia de múltiples aberraciones antigénicas en estos últimos. Los fenotipos que no se identifican en hematopoyesis normal bien sea por bajo conteo o inexistencia, se consideran asociados a leucemia. Esos fenotipos aberrantes usualmente resultan de expresión cruzada de antígenos (antígenos de otro linaje), expresión asincrónica de antígenos (coexpresión de antígenos de diversos estados de maduración) o, sobreexpresión de antígenos (expresión exagerada de un antígeno). La detección de estas alteraciones es obligatoria al diagnóstico para orientar la búsqueda de Enfermedad Mínima Residual al establecerse la remisión morfológica. (Orfao 2000) Existen otras situaciones en las cuales se puede determinar la presencia de Enfermedad Mínima Residual como la detección ectópica de ciertos fenotipos restringidos a tejidos, la existencia de patrones anormales de dispersión de luz y,

la existencia de una proporción aumentada de células inmaduras con patrones de maduración anormales. (Orfao 2000) La aplicabilidad del inmunofenotipo en la detección de Enfermedad Mínima Residual se fundamenta no sólo en la existencia de fenotipos anormales, sino en la frecuencia de éstos en una muestra biológica. En la literatura existe distribución de niveles de variabilidad en la incidencia de fenotipos asociados a leucemia. Esas discrepancias obedecen a fallas técnicas tales como el uso de diferentes conjugados de fluorocromos, clones de anticuerpos monoclonales, combinaciones de reactivos de múltiples tinciones, también como diferentes protocolos de preparación de muestras y diferentes muestras control. En general, a pesar de las diferencias, se ha demostrado una mejor discriminación de células por la técnica de citometría de flujo, y se ha mejorado el acceso a la técnica para el uso clínico. (Orfao 2000) La incidencia de fenotipos asociados a leucemia varía en cada uno de los subtipos de enfermedad, pero en general es de alta frecuencia que muestra utilidad diagnóstica. Una aproximación a estas proporciones se muestra en la tabla. Tabla 1.10 Aberraciones fenotípicas de mayor utilidad en detección de EMR Tipo de aberración LLA-B LLA-T LMA (%) LLC-B MM (%) (%) (%) (%) Expresión cruzada de 75 60 27 antígenos Expresión asincrónica de 39 38 80 86 49 antígenos Sobreexpresión de 35 9 32 74 antígenos Fenotipos ectópicos 70 30 Dispersión anormal de luz 28 60 Total (al menos una 85 100 88 95 87 aberración) LLA, Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA, Leucemia Mieloide Aguda; LLC, Leucemia Linfocítica Crónica; MM, Mieloma Múltiple Tomado de Orfao 2000

1.5.3.1 Expresión cruzada de antígenos. La presencia de varios antígenos leucocitarios ha sido asociada con líneas hematopoyéticas celulares específicas que pueden estar presentes o ausentes con muy bajas frecuencias y/o intensidades en otras células. Desde los primeros diseños de paneles de anticuerpos conjugados con fluorocromos, hace mucho tiempo, se demostró la expresión de antígenos leucocitarios en células tumorales de líneas no relacionadas. El conocimiento actual ha demostrado la expresión de antígenos mieloides CD13 y CD33 en linfocitos B CD19, que puede ser normal, pero a niveles muy bajos (