ESTIMACIÓN DEL POLIMORFISMO EN DOS POBLACIONES DE MEZQUITE (Prosopis laevigata) MEDIANTE RAPD Juana Juárez –Muñoz 1*, , Guillermo Carrillo-Castañeda2, Abraham Rubluo3+ Javier Contreras Moctezuma1 1 Centro de Investigaciones Forestales, Universidad Autón oma del Estado de Hidalgo. 43600 Tulancingo, Hidalgo, México. e-mail: [email protected] (*Autor para correspondencia) 2 Instituto de Recursos Genéticos y Productividad, Colegio de Postgraduados. 56230 Montecillo, México. E-mail: [email protected] 3+ Jardín Botánico, Instituto de Biología UNAM 04510 México D.F.

RESUMEN Se evaluó mediante RAPD la variación genética de dos poblaciones silvestres de Prosopis laevigata localizadas en México en los estados de Guanajuato (población 1) y Hidalgo (población 2). Así como ejemplares de referencia de P. glandulosa, P. juliflora y P. laevigata . Un total de 41 bandas fueron identificadas. Los dendrogramas mostraron que en ambas poblaciones de P. laevigata los individuos se distribuyeron en dos grupos muy relacionados entre sí por sus altos coeficientes de similitud, los cuales fueron de 0.94 (población 1) y 0.92 (población 2). En la población 1, cuatro subgrupos por grupo fueron identificados mientras

en la población 2 se identificaron en cuatro y cinco

subgrupos por grupo. Un total de once fenotipos fueron identificados de los cuales 6 fueron comunes en ambas poblaciones. El patrón polimorfito del ejemplar de referencia de P. laevigata fue igual al del subgrupo más numeroso de la población 1, el cual corresponde al segundo subgrupo más numeroso de la población 2. Entre las especies de referencia P. laevigata, P. glandulosa se observo un coeficiente de similitud de 0.79 mientras que P. Juliflora se relaciona con estas a un coeficiente de similitud de 0.63.

Palabras claves: Leguminosae, Biodiversidad, conservación, poblaciones, RAPD.

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INTRODUCCIÓN El género Prosopis (mezquite) pertenece a la familia Leguminosoidae, se piensa que se originó en África a finales del Mesozoico e inicios del periodo terciario. Actualmente se encuentra distribuido ampliamente en las zonas áridas y semiáridas de América, norte de África y suroeste de Asia. El género incluye 44 especies. En América se ubican 40 de las especies conocidas, las cuales están distribuidas desde el norte de Estados Unidos hasta Sudamérica, llegando a Chile y Argentina) En México existen de 9 de las 40 especies ( Burkart, 1976). De las nueve especies existentes en México 3 pertenecen a la sección Strombocarpa (P. palmeri, P. reptans y P. pubescens) y 6 de la sección Algorabia (P. articulata, P. tamaulipana, P. velutina, P. juliflora, P. laevigata, P. glandulosa torr ( Burkart, 1976; Rzedowski, 1988). En los estados de Hidalgo y Guanajuato P. laevigata esta ampliamente distribuida en las zonas áridas de estas entidades. Esta especie al igual que las demás que se incluyen en la sección algarobia tienen con gran potencial económico y ecológico, algunas de ellas son consideradas como un recurso natural multipropositos. Por su bajo contenido de humedad y gran estabilidad su madera se ha utilizado para la construcción, elaboración de muebles, artesanías y por su alto contenido de fibra sus hojas se utilizan como forraje (Felker et al., 2001). Desafortunadamente en las ultimas dos décadas el uso acelerado e incontrolado de este recurso y el cambio de uso de suelo a nivel mundial

ha ocasionado la

deforestación de miles de hectáreas de los bosques de Prosopis, lo cual ocasiona efectos adversos en los ecosistemas y la perdida de diversidad genética (Felker et al., 2001). Debido al importante papel ecológico que juegan en las regiones áridas en donde se desarrolla, en el cual además de participa como un nicho de colonización que permite 3

el desarrollo de especies epifitas herbáceas y leñosas, contribuyen mejorando la fertilidad y estructura de los suelos mediante la aportación de materia orgánica e incorporación de nitrógeno atmosférico al suelo. En algunos países como Ecuador India y Senegal se han introduciendo especies de Prosopis para reforestar las zonas áridas ( Agrawal, 1996; Sharma, 1996). Si bien las especies del género tienen gran potencial para la para la reforestación de áreas nuevas o nativas, para el establecimiento de programas de reforestación y explotación racional del recurso es fundamental realizar estudios para conocer la constitución y variación genética de las poblaciones naturales a nivel molecular y conocer las características morfológicas, fisiológicas y reproductivas que favorecen la variación genética. En la ultimas décadas los marcadores moleculares tales como Randomly Amplified Polymorphic DNA (RAPD) han sido utilizados para detectar polimorfismo en diferentes especies (Williams et al., 1990; Kaemmer et al., 1992; Reddy and Soliman, 1997) en la identificación de algunas especies de Prosopis de Sudamérica, Africa y Asia (Ramirez et al., 1999). Sin embargo aunque en nuestro país el mezquite es uno de los recursos vegetales de amplia distribución y utilidad, no se le ha puesto mucha atención y existe muy pocos estudios de la variabilidad intra e interpoblacional a nivel molecular de las especies existentes en nuestro país (Juárez et at, 2002), por lo que en el presente estudio se planteo analizar mediante marcadores moleculares la variación genética en dos poblaciones de P. laevigata con base al polimorfismo y coeficientes de similitud.

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MATERIALES Y MÉTODOS Material biológico En terrenos de la Universidad del Norte de Guanajuato, ubicada en Dolores Hidalgo Guanajuato, México (población 1) y en la localidad de Santiago de Anaya, Hidalgo (población 2), México, fueron colectados, por población hojas de 60 árboles adultos de P. laevigata seleccionados al azar dentro de una área de 5 Ha, en la que se trazaron cuadrantes de 25 X 25 m2 en diferentes sitios.

Aislamiento de ADN El ADN ( asido desoxirribonucleico) genómico de las plantas fue aislado a partir de 2g de tejido foliar siguiendo el método de Dellaporta (1983). La pureza y concentración del ADN se determinó por el método espectrofotométrico mediante la relación de absorbancia de 260/280. Las muestras de DNA fueron diluidas a una concentración final de 20 ng/µL con agua destilada estéril.

Amplificación del DNA y electroforesis Para estimar la variación genética se utilizo la técnica de RAPDs y se probaron inicialmente diez iniciadores (ROTH) de los cuales se seleccionaron los cinco siguientes: 01(GGT CGG AGA A); 02 (TCG GAC GTG A); 03(AGA CGT CCA C); 04 (AGC GTG TCT G) y (05 (GTG CCT AAC C) con los que se detectaron fragmentos bien definidos y reproducibles. La mezcla para la reacción de polimerización en cadena (RPC), contenía en un volumen final de 25 µL: 10 mM de Tris HCl pH 8, 50 mM de KCl (amortiguador 10x de la taq polimerasa), 3mM de MgCl2 (Gibco), 200 µM de cada dNTP

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( Gibco), 20 pmol de iniciador, 1.5 unidades de Taq DNA polimerasa, 80 ng de ADN y agua destilada estéril (Gibco). La mezcla de reacción fue cubierta con 20 µL de aceite mineral para evitar la evaporación. La amplificación se efectuó en un termociclador MJ Research modelo PTC 100, programado con un ciclo inicial de desnaturalización de 1 min. a 94 º C. Seguido de 38 ciclos cada uno con un paso de desnaturalización a 94 ºC ( por 30 seg. del ciclo 1 al 3 y de 15 seg. del ciclo 4 al 38), alineamiento a 35 ºC por 30 seg. y extensión a 72 ºC por 1. 30 min. Los productos amplificados fueron separados mediante electroforesis en geles de 1.5 % (p/v) de agarosa con amortiguador TAE (Tris, ácido acético, EDTA, pH 8). Para evidenciar las bandas los geles se tiñeron con una solución de bromuro de etidio durante 30 minutos, posteriormente fueron fotografiado y capturado en computadora utilizando el Molecular Analyst/PC gel documetation, versión 1.4.1 de Bio-Rad. Un marcador de 100 pb (Gibco) se utiliza como referencia de pesos moleculares.

Análisis de agrupamiento El tamaño de los fragmentos de ADN obtenidos con los RAPD fue calculado a partir de una curva estándar generada de los fragmentos de tamaño conocido del marcador de 100 pb. Después de definir los pesos moleculares de los patrones de bandas generados con los diferentes iniciadores se construyó una matriz en la que se codificó presencia (1) o ausencia (0) de bandas de ADN. En esta matriz los fragmentos obtenidos con los diferentes iniciadores se agruparon de mayor a menor número de pares de bases. El análisis de agrupamiento se efectuó con el método UPGMA y el

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coeficiente de similitud de Jaccard usando el software NTSYS -PC versión 1.8 (Rohlf, 1993).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN En el análisis de la variación genética de la población estudiada se detectaron un total de 41 fragmentos con alto grado de definición y un rango de tamaños de 450 a 2250 pb. Estos fueron utilizados para la construcción del dendograma, el cual se obtuvo utilizando el coeficiente de Jaccard y el método de agrupamiento UPGMA. Los dendrogramas mostraron que en ambas poblaciones de P. laevigata los individuos se distribuyeron en dos grupos muy relacionados entre sí por sus altos coeficientes de similitud, los cuales fueron de 0.94 (población 1) y 0.92 (población 2). En la población 1 los dos grupos A y B fueron constituidos por 4 subgrupos (Figura 1a, b) mientras que 4 y 5 subgrupos constituyeron los grupos C y D de la población 2 (figura 1b). El 66% de los fenotipos conformó el grupo A y el 86% el grupo D. En la población 1 el ejemplar de referencia de P. laevigata taxonómicamente bien identificado se ubicó en el subgrupo más numeroso del grupo A, mientras que en la población 2 se localizó en el segundo subgrupo de mayor tamaño del grupo D (figura 1b). Los estrechos rangos de los valores de los coeficientes de similitud observados entre los y el hecho de que 6 subgrupos de los 11 identificados estuvieran presentes en ambas poblaciones sugieren que probablemente estas tienen un origen común y que en el pasado constituían una población continua y que probablemente las condiciones ambientales no han cambiado drásticamente en cada una de las localidades. Estas ideas se apoyan en el hecho de que posee un gran número de alelos comunes detectados con base al patrón electrofo retico en este estudio y que Rzedowski (1988) ha señalado que la distribución 7

actual de P. laevigata en tres segmentos separados (Altiplanicie, Depresión del Balsas y Planicie Costera) indica que la antigüedad de esta especie se remonta a épocas en que las montañas no obstaculizaban su dispersión. Esta idea también es sustentada por los rangos de valores de coeficientes de

similitud (0.79 y 0.63) observados entre las

especies de referencia P. laevigata, P. glandulosa y P. juliflora (Juárez et al, 2005; datos no publicados) los cuales contrastan notablemente con los rangos de coeficientes de similitud (0.94 y 0.92) detectados en las dos poblaciones, lo cual indica que los valores detectados en las especies corresponden a rangos de similitud interespecíficos mientras que los valores encontrados entre los fenotipos de las poblaciones corresponden a rangos de similitud intraespecíficos.

CONCLUSIONES Mediante la técnica de RAPDs es posible detectar la variación genética existente a nivel intraespecífico, lo cual permite conocer la constitución de las poblaciones en términos de la proporción y subgrupos que la componen. Estos resultados pueden utilizarse en forma preliminar como base para plantear programas de reforestación y explotación sustentable del recurso.

AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen a PROMEP UAEHGO-PTC-196, el apoyo económico para el desarrollo de esta investigación.

LITERATURA CITADA Agrawal, A.A. 1996. Reforestation in Ecuador,s dry forest. Desert Plants 12: 12-14.

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Burkart, A. 1976. A monograph of the genus Prosopis (Leguminosae subfam. Mimosoideae). J Arnold Arbor. 57:219-249, 450-525. Dellaporta, S.L.; Wood, J.; Hicks, J.B. 1983. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1: 19-21. Felger, R.S. 1977. Mesquite in Indian cultures of southwestern North American, 150-175 pp. In. Mesquite its biology in two desert scrub ecosystems. Simpson, B.B. (Ed.).US/ IBP Juárez, J., Carrillo-Castañeda, G., Arreguín, R. and Rubluo, A. 2002. Inter and intragenetic variation of four wild populations of Prosopis using rapd-pcr fingerprints. Biodiversity Conserv. 11: 921 -930. Ramírez, L.; De la Vega, A.; Razkin, N.; Luna, V.; Harris, P.J.C. 1999 Analysis of the relationships between species of the genus Prosopis revealed by the use of molecular markers. Agronomie 19: 31-43 Reddy, P.V.; Soliman, K.M. 1997. Identification of wild and cultivated Hordeum species using tow - primer RAPD fragments. Biol Plant. 39: 543-552. Rohlf, F.J. 1993. NTSYS -PC Numerical taxonomy and multivariate analysis system, version 1.8. Applied Biostatistics Inc., New York. Rzedowski, J. 1988. Análisis de la distribución geográfica del complejo Prosopis (Leguminosae, Mimosoideae) en Norte América. Acta Bot Méx. 3: 7-19. Sharma, K.K. 1996. Agroforestry in farming systems development. Indian For. 122: 547559 Williams, J.G.K; Kubelik, A.R.; Livak, K.J.; Rafalski, J.A.; Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids. Res. 18: 6531-6535. 9

(a)

(b)

Figura 1. Dendrograma basado en el polimorfismo de 60 individuos de P. laevigata de la población Dolores Hidalgo Guanajuato (a) y Santiago de Anaya Hidalgo (b) obtenido con el coeficiente de Jaccard y el método de agrupamiento UPGMA. Las letras mayúsculas indican los grupos y las minúsculas los subgrupos. 10