Story Transcript
Genética Médica – Tema 2
Estructura y organización del genoma humano: genes, familias génicas y polimorfismos del DNA Bibliografía: Griffits AJ et al. (2000) pp23-28; pp376-378 Tamarin RH (1996) pp203-220, pp414-419 Klug WS y Cummings MR (1999) pp277-298, pp528-539
Inma Martín Burriel Curso 2008-09
Genética Médica. Tema 2 Estructura y organización del genoma
Tema 2 • Estructura y organización del Genoma • Polimorfismos genéticos: – Variaciones en el número de repeticiones – Mutaciones puntuales
• Aplicaciones de los polimorfismos genéticos en Medicina
1
Estructura en doble hélice del DNA:
10pb /vuelta Destrógira Bases apiladas perpendicularmente
Genoma
DNA eucariótico Genes funcionales de copia única
DNA de secuencia repetida
DNA separador
Secuencias sin función conocida
Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes
Repeticiones heterocromatina Del centrómero
Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)
VNTR
Familias de genes dispersos
Secuencias derivadas De transposiciones
Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones
2
Genoma
DNA eucariótico Genes funcionales de copia única
DNA de secuencia repetida
DNA separador
Secuencias sin función conocida
Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes
Repeticiones heterocromatina Del centrómero
Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)
VNTR
Familias de genes dispersos
Secuencias derivadas De transposiciones
Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones
Genes de copia única Gen eucariota Inicio transcripción Promotor
Región reguladora aguas arriba
Exón 1
5’UTR
Intrón 1
Intrón 2
Exón 2
Exón 3
Región reguladora interna
Intrón 3
Fin transcripción
Exón 4
Región reguladora aguas abajo
Unidad de transcripción
• Codifican para una única proteína • Se encuentran en una única posición del genoma (un individuoÆ 2 copias)
3
Genoma
DNA eucariótico Genes funcionales de copia única
DNA de secuencia repetida
DNA separador
Secuencias sin función conocida
Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes
Repeticiones heterocromatina Del centrómero
Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)
VNTR
Familias de genes dispersos
Secuencias derivadas De transposiciones
Familias de genes en tándem Transposones Retrotransposones
Familias génicas • Familia génica: – “grupo de genes de un genoma que derivan de un ancestro común” ¾Familia de las globinas (beta globina): 5 loci en HSA11 Orden según la expresión en el desarrollo Posición y longitud de intrones similar Evolución concertada
4
Familias de genes en tándem – Genes cuyos productos son requeridos en grandes cantidades: • Organizador Nucleolar (NO): – Localizado en los brazos cortos de cromosomas acrocéntricos (13, 14, 15, 21 y 22) aunque pueden traslocarse – Contiene hasta 800 copias del gen del rRNA (18S + 28S)
• Genes del RNAt: – 50 sitios cromosómicos – 10 a 100 copias/sitio
• Genes de las Histonas
– Se mantiene la identidad de secuencia
5
Familia de genes dispersos • Familias de genes dispersos: – – – – – – –
Actinas: de 5 a 30 genes Queratinas: + de 20 Cadena pesada de la Miosina: 5-10 Tubulinas: 3-15 Globinas: hasta 5 Región variable de las inmunoglobulinas: 500 Histonas: 100-1000
• Las secuencias entre genes pueden variar • Genes homólogos pueden tener funciones diferentes • Algunos pierden la función Æ pseudogenes
Genoma
DNA eucariótico Genes funcionales de copia única
DNA de secuencia repetida
DNA separador
Secuencias sin función conocida
Secuencias funcionales Secuencias funcionales No codificantes
Repeticiones heterocromatina Del centrómero
Familias de genes codificantes (y pseudogenes asociados)
VNTR
Familias de genes dispersos Secuencias derivadas De transposiciones Familias de genes en tándem Transposones
Retrotransposones
6
DNA repetido Secuencias de DNA no codificante dispersas y repetidas en tándem
¿DNA basura? - ¿Regulación de la expresión? - ¿Mecanismo de reparación? - ¿Puntos de recombinación?
Variación en el número de repeticiones
Entrecruzamiento desigual
Fallo en la alineación de cadenas de DNA en la replicación
7
DNA repetido en tándem • DNA satélite:
– repeticiones de formaciones muy grandes (100 kb y algunas Mb) – DNA no transcrito – Regiones de heterocromatina, principalmente en centrómeros (DNA alfoide)
Modelos de organización centromérica
DNA repetido en tándem • DNA minisatélite (VNTR) – – – –
Repeticiones de tamaño moderado (60pb) Distribuidas por todo el genoma, principalmente en telómeros Normalmente no se transcriben Tipos: • DNA minisatélite hipervariable • DNA telomérico
Función DNA telomérico: Solucionar los problemas de replicación de los extremos del cromosoma
8
DNA repetido en tándem • DNA microsatélite (STR): – Short Tandem Repeat – Pequeñas formaciones (generalmente < 150pb) de repeticiones en tándem de secuencias muy simples (de 1 a 4 nucleótidos) – Repartidas por todo el genoma, normalmente en intrones. Frecuentes y altamente polimóficos (número medio de alelos 10) – Herencia mendeliana codominante Alelo 1 Alelo 2
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
CA
DNA repetido en tándem VNTR
Tamaño (Kb)
Unidad repetición
Método detección
Satélites
100-500
20 kb
Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados
Minisatélites (VNTR)
0,1-20
20-40 pb
Elec. agarosa
1-4pb
Elec. Acrilamida Secuenciación
Microsatélites pb (STR)
9
DNA repetido en tándem VNTR
Tamaño (Kb)
Unidad repetición
Método detección
Satélites
100-500
20 kb
Centrifugación ClCs Elec. campos pulsados
Minisatélites (VNTR)
0,1-20
20-40 pb 14-100 pb
Elec. agarosa
1-4pb
Elec. Acrilamida Secuenciación
Microsatélites pb (STR)
Polimorfismos de DNA: Presencia de distintos alelos en la población
Genética Médica
• Polimorfismo genético: – Cuando un locus presenta al menos 2 alelos y la frecuencia alélica del más raro es > 1% Æ locus polimórfico. – El polimorfismo (la variación) garantiza la adaptación de una especie a condiciones ambientales cambiantes, a expensas de producir mutaciones graves causantes de una enfermedad.
10
DNA minisatélite hipervariable
• Localización dispersa en todos los cromosomas, entre 0,1-20 kb de longitud, de repeticiones en tándem cortas • Secuencia repetida común (core): GGGCAGGAXG • Son muy polimórficas • Se encuentran en intrones • Estas secuencias se han empleado como “huellas dactilares”
DNA minisatélite hipervariable Detección del polimorfismo: RFLP + Southern (hibridación con sonda)
11
INDIVIDUO 2
4 5
6
7
8
9 10
11
INDIVIDUO 1
1
1’
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 2 3 4 5 6 7
2
2’
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1 2 3 4 5
1 2 3 4
3’
1 2 3 4
1
1’
2
2’
3
3’
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7 8
1 2 3 4 5 6 7
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
1 2 3 4 5
INDIVIDUO 2
VNTRs
INDIVIDUO 1
3
12
DNA minisatélite hipervariable • Funciones de los VNTRs: – Regulación de puntos activos de recombinación – Control de segregación de los cromosomas (por su localización centromérica) – Estabilización de los cromosomas durante la replicación (por su localización en telómeros) – Podrían dar estabilidad a los cromosomas
• Aplicaciones: – Identificación individual (medicina forense)
13
DNA microsatélite
• Localización dispersa en todos los cromosomas • Se encuentran en intrones y DNA espaciador, raramente en secuencia codificante. • A veces asociados a secuencias repetidas dispersas por el genoma (SINES o LINES). • Secuencia repetida de 1 a 4 pb. • Las secuencias flanqueantes a la repetición son únicas. • Son muy polimórficas.
Detección del polimorfismo: PCR
14
DNA microsatélite • Visualización de los microsatélites: – http://www.unizar.es/lagenbio/recursos/ Secuenciación:
Genotipado:
ACGT
DNA microsatélite • Implicaciones de las secuencias microsatélites en medicina: – Expansión de microsatélites de trinucleótidos: • Síndrome de X frágil (FMR-1) (CCG)n • Distrofia miotónica (DM) (CTG)n • Enfermedad de Huntington (HD) (CAG)n • Ataxia de Friedreich (FA) • Nueve formas de ataxia espinocerebelar (SCA)
– Expansión de tetranucleótidos: DM2 – Expansión de pentanucleótidos: SCA10
15
DNA microsatélite • Mecanismos de patogeneicidad de los microsatélites: – Enfermedades de herencia recesiva ligada al X Æ expansión de tripletes que interfiere la transcripción del gen mutado (no proteína) – Enfermedades con herencia dominante Æ expansión de tripletes produce una proteína alterada – Enfermedades con herencia dominante producidas por expansiones en regiones no codificantes Æ expansiones en el ARN Æ función celular alterada?
DNA microsatélite
• Aplicaciones: – Identificación individual – Análisis evolutivo de poblaciones – Diagnóstico directo en enfermedades genéticas causadas por expansión de trinucleótidos – Diagnóstico indirecto de enfermedades genéticas: • Ligamiento entre microsatélites polimórficos y genes causantes de enfermedad.
16
Diagnóstico individual
Análisis de 15 marcadores microsatélites
Diagnóstico directo Ejemplo: Diagnóstico corea de Huntington Nº repet
Clasificación
E.H.
39
Penetrancia T
Si
45
1
2
22 20
18 3
4
5
6
16
7
12
1
2
3
4
5
6
7
17
Diagnóstico indirecto Ejemplo: Diagnóstico portadores enfermedades recesivas
Fibrosis quística HSA7
Ms1 CFTR Ms2 Ms3
127
125
123
?
?
CFTR*
222 152
220
220
154
150
125
CFTR* CFTR*
220
220
154
150
2
1
125
123
CFTR*
127
129
?
?
220
222
154
152
3
129
123 ?
?
218
218
222
152
150
152
152
5
?
?
220
4
129
127
218 152
6
Resumen de polimorfismos genéticos
Etiología Microsatélites
errores de DNAp
(short tandem repeats)
slippage
Minisatélites
entrecruzamiento no equilibrado
Detección PCR
Frecuencia genómica 1/30.000 bp
STRs
(variable no of tandem repeats)
VNTRs
Southern
variable, baja
unequal crossing over
RFLPs
mutaciones
SNPs
mutaciones
Southern-PCR
baja
(restriction fragment length polymorphisms)
PCR
1/1000 bp
(Single nucleotide Polymorphisms)
18
Mutaciones Puntuales Polimorfismos debidos a mutaciones puntuales: • Variación de un nucleótido en una posición determinada.
• Frecuencia:1/1000pb • También conocidos como SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) Alelo 1 Alelo 2
TACGAGCTA TACGGGCTA
En regiones codificantes:
Mutaciones: - Cambio de base - Inserción - Deleción
¾Mutaciones con cambio aminoacídico GCA (Ala) Æ GTA (Val) ¾Mutaciones sin sentido AAA (Lys) Æ TAA (stop) ¾Mutaciones silentes GCA (Ala) Æ GCC (Ala)
Metodología para determinar mutaciones puntuales • RFLPs: – Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. – Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting – PCR + enzima de restricción – Baja variabilidad (2 alelos). – Localización: • Exones • Genes de copia única
• SNP:
– Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: • Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) • Secuenciación • Minisecuenciación • Sondas específicas • SSCPs • PCR en tiempo real…
– Baja variabilidad (2 alelos)
– Localización: • Exones • DNA de copia única
19
RFLPs
Determinación mediante Southern
Diagnóstico genético por RFLPs RFLP
Polimorfismo debido mutaciones puntuales
(Restriction fragment lenght polymorfism) Ms t I I
RE
RE
RE
RE
A
RE
a
A
a
AA Aa
Aa
aa
Aa
AA
aa
aa
Aa
aa
Aa
AA
aa
a
En el gen de la globina normal la secuencia correspondiente al 5th7th aminoácido del péptido betaglobina es CCTGAGGAG que es reconocida por la enzima de restricción MstII. En la variable patológica de la anemia falciforme, eritrocitos en hoz-sickle, se produce una mutación puntual de A a T, lo que invalida el reconocimiento por MstII. En la correspondiente digestión enzimática se genera un único fragmento de 1,3 kb en lugar de los dos fragmentos de 0,2 kb y 1,1 kb propios del gen normal. Los diferentes fragmentos se detectan por técnica de Southern blotting
20
Determinación de PCR-RFLPs Mutación: Alelo 1 Alelo 2
Aat II
TGGACGTCT TGGATGTCT
PCR: TGGACGTCT TGGAGGTCT
Fragmento PCR
Electroforesis PCR
Alelo 1 Alelo 2
Genética Médica Según metodología de detección
• RFLPs: – Mutaciones puntuales que se localizan en una secuencia reconocida por una enzima de restricción. – Detección mediante enzimas de restricción y Southern Blotting – PCR + enzima de restricción – Baja variabilidad (2 alelos). – Localización: • Exones • Genes de copia única
• SNP:
– Mutaciones puntuales detectable por un variado número de técnicas: • Como los RFLP (si producen/eliminan un sitio de corte) • Secuenciación • Minisecuenciación • Sondas específicas • SSCPs • PCR en tiempo real…
– Baja variabilidad (2 alelos)
– Localización: • Exones • DNA de copia única
21
SNPs • SNP: Single Nucleotide Polymorphisms: – Presentación muy frecuente (1/300 pb) – 10 a 30 millones de SNP en el genoma humano – Dos posibles alternativas en cada individuo – Herencia es muy estable (baja tasa de mutación 10-6 vs 10-3 de los microsatélites) – Fácil estandarización – Aplicaciones en la determinación de enfermedades y en farmacogenética
Secuenciación:
Determinación de SNPs
MCL1
PCR en tiempo real con sondas alelo específicas:
Minisecuenciación:
22
Mutaciones puntuales • Implicaciones de las mutaciones puntuales en medicina: – Pueden originar diferencias muy sutiles o provocar la muerte – Mutaciones en líneas germinales: • Neurofibromatosis (dominante) • Acondroplasia (dominante) • Hemofilia (Factor VII, ligado al X) – Mutaciones somáticas: • Cáncer: mutaciones de protooncogenes – Origen: fallo en la reparación del DNA o agentes mutágenos
Genética Médica
• Aplicaciones de los polimorfismos del DNA: – Identificación individual (Medicina forense) – Construcción de los mapas génicos – Ligamiento con fenotipos
23
Ejemplo: Determinación de portadores de Fibrosis Quística Nora Riveros Ka, Juan Ríos Hb (2005). Detección indirecta de portadores de fibrosis quística en dos familias chilenas mediante análisis de polimorfismos en el ADN asociados fuertemente al gen CFTR. Rev Méd Chile 2005; 133: 648-654
24